Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Departamento Acadêmico de Química e Biologia

Disciplina: Biologia Celular e Microbiologia

Cultivo e Controle de Microrganismos

Profa. Lucia Regina R. Martins

novembro/2009

Cultivo de Microrganismos

� na natureza e em materiais infecciosos os microrganismos existem como culturas mistas

colônia: visível crescimento� a partir de 1 célula vegetativa, 1 esporo ougrupo de microrganismos

Meios de cultura:

• material nutriente apropriado para o cultivo de microrganismos• pode ser preparado em laboratório ou comercial• composição depende das necessidades nutricionais/tipo de microrganismo

Material inoculado no meio de cultura (inóculo)

Incubação em estufa microbiológica

Multiplicação celular

células individuais formam grande número de células = colônia

cultura pura = colônia formada a partir de ancestral único,característica homogênea

característica macroscópica da colônia = típica da espécie

Meios de cultura

Critérios:

- nutrientes necessários- água- ajuste de pH- presença de oxigênio- temperatura ótima

-Inicialmente deve ser estéril: proliferação apenas de microrganismos do inóculo -Inicialmente deve ser estéril: proliferação apenas de microrganismos do inóculo

Ágar:

�polissacarídeo complexo de algas marinhas, agente solidificante para os meios de cultura� não-degradável pela maioria de microrganismos� liquefaz a 100oC, solidifica a 40oC� tubo (ágar inclinado ou em coluna) e placas de Petri

Meios de cultura

I – Meios Quimicamente Definidos

Composição definida;Fonte de energia, fatores orgânicos e inorgânicos de crescimento- Organismos exigentes = “fastidiosos” (ex.: Neisseria gonorrhoeae, Lactobacillus)

II – Meios ComplexosII – Meios Complexos

- nutrientes: extratos de carne, plantas, leveduras, produtos de digestão protéica (peptonas)- pequenas variações na composição química exata- usado de forma geral para bactérias heterotróficas e fungos- pode ser: caldo nutriente ou ágar nutriente

Meios de cultura e Métodos para Anaeróbios

Meios de cultivo = Redutores: �reagentes que retiram oxigênio dissolvido (tioglicolato de sódio)

• recipientes fechados• aquecimento dos tubos antes da utilização (elimina O2 dissolvido)• em Placa de Petri: sistema fechado (jarras)

� retirada de oxigênio: reações químicas (NaHCO3 + NaBH4)� enzima (oxirase)� câmara com gás inerte

Técnicas Especiais de Cultivo

- Cultura de células: organismos intracelulares obrigatórios (riquétsias e clamídias)- em organismos vivos (ex.: Mycobacterium leprae)- capnofílicos (estufas de CO2 ou jarra com vela, reagentes em embalagens):

-Ex.: algumas bactérias patogênicas do TGI (Campylobacter)

Meios de cultura

1. Seletivo2. Diferencial

�utilizados para a determinação da presença de microrganismos específicos

1. MEIOS SELETIVOS

- Favorece o crescimento apenas do microrganismo de interesse- ex.: ágar sulfeto de bismuto → isolamento de Salmonella typhi em fezes- ex.: ágar sulfeto de bismuto → isolamento de Salmonella typhi em fezes

ágar verde brilhante (corante que inibe Gram-positivas, seletivo para Salmonella)ágar Sabouraud dextrose pH 5,6: favorece fungos e inibe bactérias

2. MEIOS DIFERENCIAIS

- permite identificação de colônias de bactérias de interesse, em meio a outras espécies- quando cultura pura: reações características

- ex.: ágar sangue→ identifica bactérias capazes de hemóliseStreptococcus são classificados como alfa-hemolíticos (halo esverdeado demetemoglobina), beta-hemolíticos (halo claro de hemólise ao redor da colônia),não-hemolíticos (sem alteração)

beta-hemólise alfa-hemólise

3. MEIOS SELETIVOS + DIFERENCIAS

Staphylococcus aureus – ↑ tolerância a NaCl, fermenta manitol produzindo ácido→ Meio Ágar Sal Manitol

� favorece o isolamento e reconhecimento de espécies de interesse� requer conhecimento de peculiaridades de cultivo, características bioquímicas, etc.

7,5% NaCl = seletivoindicador de pH = diferencial

Ágar MacConkey:

- contém sais biliares e cristal violeta: inibe Gram-positivas (seletivo)- lactose: diferencia Gram-negativas fermentadoras (rosa) de não-fermentadoras (incolor)- caracteriza salmonellas patogênicas

3. MEIOS SELETIVOS + DIFERENCIAS

Meios de enriquecimento

� estimula o crescimento da bactéria de interesse (estão em menor quantidade)� normalmente líquido� pode ser considerado seletivo� transferência de inóculo → estágio de crescimento → transferência de inóculo

� ex.: amostras de solo e fezes (caldo enriquecido com fenol)caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelascaldo Tioglicolato para Clostridium perfringenscaldo Tioglicolato para Clostridium perfringens

Método de esgotamento por estrias superficiais

alça de inoculação estéril e meio nutriente sólidopadrão de espalhamento do inóculo após incubação = colônias isoladas → transfere para meio nutriente = cultura pura

Obtenção de culturas puras:� utilizada na obtenção de colônias individualizadas� características homogêneas� permite a caracterização e identificação� método de semeadura é fundamental

após incubação = colônias isoladas → transfere para meio nutriente = cultura pura

Conservação de culturas puras

�curto período (dias) = refrigerador (4 a 10oC)

� longo período: congelamento rápido em líquido (freezer -50 a -95oC)liofilização (ampolas acondicionadas em temperatura ambiente)

retomam a viabilidade pela adição de meio líquido nutriente

• coleções de culturas puras (padrão) : American Type Culture Collection (ATCC)

Acompanhamento do crescimento de culturas bacterianas

Pode ser representado por gráficos de crescimento X tempo� número de microrganismos: métodos diretos (contagem)

métodos indiretos (medida da atividade metabólica)

Tipos de divisão celular bacteriana:

- fissão binária- brotamento- brotamento- conidiósporos (Actinomicetes)- fragmentação de filamentos

Acompanhamento do crescimento de culturas bacterianas

Tempo de Geração

- é o tempo necessário para uma célula se dividir - número de bactérias dobra a cada geração - número de células = 2n (n =número de gerações)- tempo de geração médio = 1 – 3 horas- números muito grandes → usa-se escala logarítmica

Escala logarítimica X aritmética para crescimento de populações bacteriana

Fases do Crescimento

� demonstrado pela Curva de Crescimento bacteriano� experimentalmente: contagem da população em intervalos regulares de tempo� inóculo = pequeno número de células → meio líquido → acompanhamento

Fases do Crescimento

1. Fase Lag

- pouca divisão celular → estado de latência- duração: horas a dias- metabolismo celular é ativo → enzimas e proteínas

2. Fase Log (crescimento exponencial)

- divisão celular ativa e intensa- tempo de geração é constante - maior atividade metabólica- grande sensibilidade a alterações ambientais

Fases do Crescimento

3. Fase estacionária

- velocidade de divisão celular decai- número de células mortas = número de células novas- atividade metabólica decresce- fatores que contribuem para seu início: escassez de nutrientes, acúmulo de metabólitos, alterações de pH- fermentadores industriais: substituem o meio de crescimento constantemente = fase Log é indefinidaé indefinida

4. Fase de declínio (morte celular)

• número de céls mortas > > número de céls novas• população se reduz a uma fração mínima ou é completamente exterminada

Quantificação do Crescimento Microbiano

� utiliza amostras pequenas (~ 1 ml de meio líquido, 1 g de meio sólido) � diluições seriadas de alíquotas de material (material concentrado)� tamanho total da população microbiana = extrapolações matemáticas

Métodos

1. Quantificação Diretaa) Contagem em Placab) Método do número mais provávelb) Método do número mais provávelc) Contagem ao microscópio

2. Quantificação Indiretaa) Turbidimetriab) Peso secoc) Atividade metabólica

1. Contagem em placa

- contagem do número de colônias (unidades formadoras de colônias - UFC)- sujeito a erros: considera cada colônia proveniente de 1 bactéria- vantagem: quantifica células viáveis- desvantagem: tempo de espera (~24h) → produção de alimentos perecíveis - padronização (FDA): somente placas com 25 – 250 colônias → diluição seriada da amostra

Quantificação Direta do Crescimento Microbiano

1. Quantificação Diretaa) Contagem em Placab) Método do número mais provávelc) Contagem ao microscópio

1. Contagem em placa – diluição seriada

Quantificação do Direta Crescimento Microbiano

� pour plate (em profundidade)� espalhamento em placa

1. Contagem em placa – técnicas para semeadura

ágar fundido a 50oC

� pour plate (em profundidade)

- volume do inóculo: 0,1 - 1,0 mL;- desvantagens: bactérias sensíveis ao calor;

aspecto das colônias pode auxiliar no diagnóstico

�espalhamento em placa

1. Contagem em placa – técnicas para semeadura

- volume do inóculo: 0,1 mL- placa com ágar solidificado- espalhamento homogêneo com alça de vidro- crescimento apenas superficial

� quando a amostra contém poucas bactérias: método de filtração

Ex.: água - bactérias são concentradas na superfície de membranas filtrantes especiais- volume amostra: ~100 mL- filtro é transferido para Placa de Petri contendo meio nutriente líquido: formação decolônias na superfície da membrana

1. Contagem em placa – técnicas para semeadura

Quantificação Direta do Crescimento Microbiano

1. Quantificação Diretaa) Contagem em Placab) Método do número mais provávelc) Contagem ao microscópio

2. Método do Número Mais Provável (MNP)

- método estatístico (95% de probabilidade)- princípio: ↑ no bactérias = ↑ no diluições para crescimento negativo- aplicação: bactérias que não crescem em meio sólido; uso de meio líquido diferencial

Quantificação Direta do Crescimento Microbiano

1. Quantificação Diretaa) Contagem em Placab) Método do número mais provávelc) Contagem ao microscópio

3. Contagem direta ao Microscópio

- utiliza lâmina especial (Petroff-Hausser) → 25 quadrados grande “quadriculados”- pequeno volume de amotra: preenchimento da câmara (pode utilizar corantes)- contagem em quadrados grandes e média- volume no quadrado grande = 1/1,25 X 106 mL- no de bactérias = no contado X 1,25 X 106 (para 1mL de amostra)

desvantagens:• bactérias móveis• céls. mortas• necessário grande no

vantagens:• não precisa incubação• resultado imediato

Quantificação do Crescimento Microbiano

2. Quantificação Indiretaa) Turbidimetriab) Peso seco (bactérias/fungos filamentosos)→ filtraçãoc) Atividade metabólica → determinação do metabólito

�Aplicação: pesquisa e indústria

a) Turbidimetria

- proliferação de bactérias em meio líquido = ↑ densidade células = ↑ turbidez

- utiliza espectrofotômetro (colorímetro): quantidade de bactérias é inversamente

proporcional à quantidade de luz que atinge o detectorproporcional à quantidade de luz que atinge o detector

- pode ser usado para gráficos de crescimento bacteriano X tempo (associado à contagem)

- desvantagem: insensível a pequena quantidade de bactérias.

Controle do Crescimento Microbiano

�Medidas utilizadas para prevenir contaminações que podem ter consequências danosas à saúde...

Você sabe o que é....

Esterilização?Esterilização?Desinfecção?Degerminação?Sanitização?Anti-sepsia?

... alguns conceitos:

1. Esterilização:

�destruição de todas as formas de vida microbiana (vegetativa e esporos)�métodos: aquecimento, filtração (líquidos e gases), gases esterilizantes (óxido de etileno)

2. Esterilização comercial:�não é completa; �utiliza técnica para destruir endosporos de Clostridium botulinum (calor)�esporos de bactérias termofílicas permanecem

3. Desinfecção:- destrói formas vegetativas de microrganismos patogênicos em superfícies ou substâncias inertes- não atinge esporos- métodos: substâncias químicas (“desinfetante”), radiação UV, água fervente ou vapor

4. Anti-sepsia- destruição de formas vegetativas de microrganismos em tecido vivo- substâncias químicas: “anti-séptico”

Sepse = contaminação bacteriana; Asséptico = objeto/área livre de patógenos

... alguns conceitos:

5. Degerminação- remoção mecânica de microrganismos em uma área delimitada- ex.: limpeza de pele com álcool antes da aplicação de injeção

6. Sanitização- processo utilizado para reduzir a contagem microbiana a níveis seguros- minimiza chances de transmissão de doenças- ex.: lavagem de talheres, copos e pratos em água quente ou seguido de aplicação de desinfetante químicoaplicação de desinfetante químico

PRODUTOS

Biocida/germicida: substância que leva à destruição de microrganismos� fungicida, bactericida, viricida

Bacteriostático, fungistático: substância que inibe o crescimento de bactérias

Taxa de Morte Bacteriana

- é a percentagem de bactérias que morrem por unidade de tempo

�normalmente: tratamento com substâncias antimicrobianas → taxa de morte constante

Fatores de Influenciam a efetividade de antimicrobianos:

1. Carga microbiana (↑ no bactérias = ↑ tempo)

2. Ambiente: presença de matéria orgânica, temperatura, pH

3. Tempo de exposição

4. Características microbianas

Métodos de Controle Microbiano

1. Físicos

• Calor (úmido, seco, pasteurização)• Filtração• Baixas temperaturas• Alta pressão• Dessecação• Pressão osmótica• Radiação

2. Químicos

• Radiação • desinfetantes e anti-sépticos• halogênios• álcoois, fenóis• agentes tensoativos• compostos quaternários de amônio• conservantes de alimentos• antibióticos• esterilizantes gasosos• agentes oxidantes• aldeídos

Métodos de Controle Microbiano

1. Físicos

• Calor (úmido, seco, pasteurização)

�Ação: desnaturação de proteínas (enzimas)

�aplicação: considerar degradação de outras substâncias/danos a materiais

Resistência ao calor tem grande variabilidade → parâmetros para esterilização:

• Ponto de Morte Térmica (PMT): menor ToC que destrói todos em 10 minutos (susp.líq)

• Tempo de Morte Térmica (TMT): menor tempo necessário para a destruição de todos

em uma certa ToC (cult. Líq.)

• Tempo de Redução Decimal (TRD): tempo necessário para destruição de 90% das

bactérias em uma certa ToC

Calor úmido

- Fervura: destrói formas vegetativas de bactérias patogênicas, fungos (e esporos) e grande parte de vírus em 10 minutos�alguns vírus (hepatite) e endosporos resistem por mais tempo...

- Autoclave: maior temperatura devido à pressão (esterilização efetiva)

Métodos Físicos de Controle Microbiano

� destrói todos os microrganismos e endosporos em 15 min

� danifica alguns materiais

1 atm = 14,7 lb/pol2

•Autoclave

�tempo de esterilização depende do volume, permeabilidade e conteúdo do material

Métodos Físicos de Controle Microbiano

�Marcadores de esterilização: etiquetas, marcadores de temperatura e tempo, uso de endosporos.

Calor úmido

- Pasteurização:

-objetivo: eliminar microrganismos patogênicos;utilizado em alimentos perecíveis (leite, sorvete, iogurte, cerveja)

- tempo de pasteurização diferente

Pasteurização do leite: (teste de fosfatase)

- clássica: 63oC por 30 min

Métodos Físicos de Controle Microbiano

- clássica: 63oC por 30 min- alta temperatura e tempo curto (HTST): 72oC por 15 s (serpentina)

Esterilização do leite: (armazenagem posterior sem refrigeração)-Tratamento de temperatura ultra-elevada (UHT)- câmara de vapor: de 74oC a 140oC → 3 s → resfriamento rápido

Tratamentos equivalentes:

↑ ToC ↓tempo = mesma eficiência

Calor seco

� Destruição por oxidação (combustão direta ou carbonização lenta)

Tipos:

- chama direta (bico de Bunsen)- incineração - em ar quente (estufa): 170oC por 2h

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Filtração:

- Membranas especiais (porosidade): 0,45 μm; 0,22 μm; 0,01μm- uso em materiais sensíveis ao calor: meios de cultura, vacinas, enzimas, etc.

Para o ar: filtros HEPA (0,3 μm)

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Baixas Temperaturas:

- Refrigeração comum = bacteriostáticos (0 – 7oC)�Listera monocytogenes: bastonete gram-positivo;infecta adultos (assintomático ou meningite – letalidade50%); transmissão pelas fezes; em gestantes(assintomático na mãe, meningite após nascimento,natimorto)

- Congelamento rápido: formas latentes (ainda viáveis)

- Congelamento lento: mais letal→ ciclos congelamento-descongelamento são usados

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Dessecação:

-liofilização: microrganismos permanecem viáveis, porém latentes na ausência de água- aplicação: preservação de espécies microbianas em laboratório,

conservação de alimentos (café)

- resistência microbiana à dessecação é variávelex.: Mycobacterium tuberculosis (meses)

Neisseria gonorrhoeae (1 hora)endosporos: indefinidoendosporos: indefinidovírus são resistentes

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Radiação:

os efeitos sobre os microrganismos dependem:- comprimento de onda- intensidade- duração da exposição

Radiações esterilizantes: - ionizante - não-ionizante

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Radiação ionizante

• raios gama, raios X, feixes de elétrons de alta energia• comprimento de onda menor que 1nm

�Principal efeito da radiação = ionização da água → radicais hidroxila reativos e tóxicos

Poder de penetração:raios gama (elementos radioativos) > raios X > feixes de elétrons

�Principal efeito da radiação = ionização da água → radicais hidroxila reativos e tóxicos� reação com componentes celulares = morte microbiana

Tempo de esterilização: feixes de elétrons (segundos de exposição) > raios gama (horas)

Aplicações:Conservação de alimentos (carnes, vegetais, etc.)Produtos farmacêuticos, materiais descartáveis de uso odontológico/médico:

-seringas, luvas, cateteres, suturas...

Métodos Físicos de Controle Microbiano

Radiação não-ionizante• comprimento de onda acima de 1nm: luz UV

� mecanismo: danifica estrutura do DNA, inibem a replicação� comprimento de onda mais eficaz ± 260 nm

Aplicação:• lâmpadas germicidas (microrganismos do ar):

-Salas cirúrgicas, enfermarias, câmaras microbiológicas• desinfecção de produtos médicos

Desvantagem:Desvantagem:• baixo poder de penetração: a exposição deve ser direta• lesão à retina humana;• exposição prolongada = queimaduras e câncer de pele.

Efeito antimicrobiano da luz solar (> 280nm):� leva à formação de oxigênio livre no citoplasma (tóxico)� pigmentos = proteção

Microondas:• não apresentam efeito direto sobre microrganismos (efeito indireto, pelo calor)