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Page 1: Calculando KM

Utilização do MS Excel para calcular KM e Vmax a partir do gráfico de Lineweaver-Burke

Rodrigo César dos Santos Vida 2008

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ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 3

2 TÓPICOS EM CINÉTICA ENZIMÁTICA.............................................................. 4 2.1 SOBRE AS ENZIMAS........................................................................................... 4 2.2 A CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN E VELOCIDADE MÁXIMA.............................. 5

3. FUNÇÕES LINEARES........................................................................................ 7

3.1 TERMOS DE UMA FUNÇÃO LINEAR....................................................................... 7 3.2 REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DE UMA FUNÇÃO ....................................................... 8 3.3 REGRESSÃO LINEAR ....................................................................................... 10

4 USANDO O MS EXCEL..................................................................................... 14

4.1 FÓRMULAS E CÁLCULOS .................................................................................. 15 4.1.1 Digitando uma fórmula .......................................................................... 15 4.1.2 Utilizando o assistente de fórmulas....................................................... 16

4.2 CALCULANDO Y EM FUNÇÃO DE X .................................................................... 18 4.3 CALCULANDO OS COEFICIENTES “A” E “B” DE UMA FUNÇÃO LINEAR ..................... 19

4.3.1 Calculando o coeficiente “A”.................................................................. 19 4.3.2 Calculando o coeficiente “B”.................................................................. 19 4.3.3 Calculando o coeficiente de correlação................................................. 19

4.4 CRIANDO GRÁFICOS DE REGRESSÃO LINEAR COM O MS EXCEL ........................ 20

5 ANALISANDO KM E VMAX .............................................................................. 22 5.1 O GRÁFICO DE LINEWEAVER-BURKE................................................................. 23

6. REFERÊNCIAS................................................................................................. 28

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1 INTRODUÇÃO

O estudo da cinética enzimática é um importante tópico dentro do

conteúdo programático da disciplina de bioquímica ou enzimologia. A regressão

linear é um assunto importante e útil em diversas áreas de conhecimentos. Com

base nela podemos montar uma curva de calibração e analisar se os dados são

ou não confiáveis.

Para compreender as regressões lineares deve-se primeiro

compreender as funções lineares, suas características e suas resoluções.

O Microsoft Excel (MS Excel) é uma ferramenta simples que pode

ser facilmente operada para a resolução de todos esses cálculos e de uma

infinidade de outros. Dentre eles, a determinação da constante de Michaelis-

Menten e da velocidade máxima observadas em uma reação, uma alternativa à

resolução em papel milimetrado, mais confiável e rápida de fazer.

Esse trabalho tem por objetivo introduzir ao leitor as facilidades de se

utilizar o MS Excel para determinação dessas constantes. Inclui rápidas

explicações sobre cinética enzimática, explicações sobre funções lineares e os

métodos de resolução de uma regressão linear manualmente e pelo MS Excel,

bem como os passos para se criar um gráfico e, finalmente, como calcular as

constantes de Michaelis-Menten e velocidade máxima.

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2 TÓPICOS EM CINÉTICA ENZIMÁTICA

A cinética enzimática, por definição, estuda os processos catalisados

por enzimas, especialmente a velocidade da reação. As enzimas são

macromoléculas protéicas com capacidade catalítica capazes de catalisar (ou

seja, acelerar) reações químicas sobre outras moléculas, denominadas substrato.

As enzimas possuem sítio de ligação com o qual se ligam ao

substrato e catalisam a reação, convertendo o substrato (S) ao produto da catálise

(P). A enzima não sofre reação durante o processo, de modo que ao fim da reação

permanece inalterada.

E + S ES EP E + P

2.1 Sobre as enzimas

As enzimas possuem sítios de ligação (centros catalíticos) para com

o substrato, muitas delas mais de um. Dessa forma, podemos concluir que ao

aumentarmos a concentração do substrato, aumenta-se também a velocidade da

reação. Isso é verdadeiro até uma determinada concentração do substrato,

quando apesar de aumentarmos a concentração do substrato (mantendo a

concentração da enzima), a velocidade da reação não se modifica. Chamamos

esse ponto de velocidade máxima (Vmax).

Os sítios catalíticos são extremamente sensíveis ao substrato com o

qual são colocados. Assim há uma especificidade por parte das enzimas para com

determinados substratos. De fato, para certos substratos há apenas uma enzima

específica capaz de catalisar uma reação com eficiência.

Algumas enzimas podem ser influenciadas por outros elementos

presentes no meio. Algumas enzimas possuem um sítio de ligação especial onde

elementos moduladores podem se ligar influenciando na reação: moduladores

negativos diminuem a velocidade da enzima, enquanto os positivos aumentam-na.

As enzimas com tal propriedade são denominadas enzimas alostéricas.

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2.2 A constante de Michaelis-Menten e velocidade máxima

Como já vimos as enzimas são saturáveis. Isso implica que um

gráfico de velocidade enzimática não será linear, mas a partir de determinada

concentração de substrato descreverá uma curva.

A concentração do substrato é, portanto, fator determinante para

atingir a velocidade máxima, como mostrado no gráfico acima. A constante de

Michaelis-Menten (KM) fornece a quantidade de substrato necessária para se

atingir a metade da velocidade máxima. A medida da velocidade máxima é a

medida da quantidade de substrato convertida em produto em dado período de

tempo, e pode ter como unidade M.min-1. A unidade de KM é a mesma para a

medida do substrato (mM, M...).

Um erro bastante comum é acreditar que KM será numericamente

igual a metade de Vmax. Observe que KM diz respeito a uma medida de

concentração de substrato, enquanto Vmax é a medida da velocidade de

transformação do substrato em produto. Podemos concluir que o quociente de KM

por Vmax não necessariamente será igual a 2.

Conhecer as concentrações de KM e Vmax são importantes pois

garantem o uso racional das enzimas. Muitos catalisadores enzimáticos são

sintetizados em pouca quantidade ou são comercialmente caros e, portanto,

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devem ser usados com sapiência. Para calcular esses valores há diferentes

metodologias. Existem disponíveis no mercado programas baseados em

regressão não linear, capazes de fornecer respostas precisas a partir do gráfico da

curva da cinética enzimática. No entanto, nem sempre temos acesso fácil a tais

programas sofisticados.

Outra forma de calcular KM e Vmax é utilizando a plotagem dos

dados em papel milimetrado, onde a curva é linearizada e as informações são

obtidas através da regressão linear dos coeficientes da equação. Esse método

pode ainda ser utilizado no programa MS Excel, mais simples e fácil de ser

encontrado em computadores domésticos, e que fornece dados bastaste precisos

e confiáveis.

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3. FUNÇÕES LINEARES

3.1 Termos de uma função linear

Uma função é uma equação matemática com pelo menos uma

incógnita, onde para cada valor atribuído haverá valores referentes, ou em função

deste. Trata-se de relações matemáticas especiais entre dois objetos.

No caso das equações lineares (de primeiro grau) as funções

apresentam a seguinte formulação básica:

abxxf

Onde X são os valores conhecidos (atribuídos) e Y são os valores

determinados em função da X segundo a equação. Matematicamente falando, X

corresponde ao conjunto domínio e Y, ao conjunto imagem da equação. Os

termos “b” e “a” são coeficientes da equação, onde “b” é chamado de inclinação

da reta e “a” é o termo independente.

Em uma função linear, para cada valor X atribuído, é possível

calcular o valor de um – e apenas um – Y correspondente. Os valores atribuídos

para X podem ser feitos de maneira aleatória. Observe a função abaixo:

42 xxf

Para calcular esses valores correspondentes de Y, basta substituir os

valores atribuídos para X na equação.

X Y f(x) = 2x + 4 y = 2x + 4 -3 -2 y = 2 * (-3) + 4 = -2 -2 0 y = 2 * (-2) + 4 = 0 -1 2 y = 2 * (-1) + 4 = 2 0 4 y = 2 * 0 + 4 = 4 1 6 y = 2 * 1 + 4 = 6 2 8 y = 2 * 2 + 4 = 8 3 10 y = 2 * 3 + 4 = 10

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3.2 Representação gráfica de uma função

As funções possuem uma representação gráfica baseada em

coordenadas (X,Y) em um plano cartesiano. A coordenada abcissa (horizontal)

corresponde aos valores definidos para X, e a coordenada ordenada (vertical)

corresponde aos valores encontrados para Y.

No caso do exemplo anterior, quando colocados no plano cartesiano,

os valores descreverão o seguinte gráfico:

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

Podemos observar que as funções do primeiro grau são ditas

lineares, pois sua representação gráfica sempre tende à linearização. Um gráfico é

a representação visual de uma função, e a partir dele podemos tirar importantes

conclusões:

O ponto em que o gráfico toca o eixo X (ou seja, onde Y = 0) corresponde à

raiz da equação. A raiz de uma equação é fornecida quando igualamos a

função à zero. Nas funções lineares, há apenas uma raiz, e ela sempre está

presente.

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O termo independente “A” é a coordenada onde o gráfico toca o eixo Y (pois

então X = 0) quando ambos os eixos possuem a mesma origem.

A inclinação da reta “B” define o ângulo de inclinação do gráfico. Se o valor de

“B” é positivo, diz-se ter um gráfico crescente. Quando o valor de “B” é

negativo, um gráfico decrescente.

No caso de uma equação quadrática (de segundo grau, onde há uma

incógnita X elevada ao quadrado). O gráfico é definido como uma parábola que

corta o eixo X em dois pontos, evidenciando duas raízes distintas (o X’ e X’’ da

fórmula de Bháskara), apenas em um ponto, no caso de raízes coincidentes

(quando = 0) ou não tocar em ponto algum, no caso de não houver raízes

(quando < 0). No caso de uma equação do primeiro grau, todas as funções

possuem raízes, mesmo que não estejam demonstradas no gráfico.

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3.3 Regressão linear

Nos modelos clássicos estudados temos a equação (função) linear e

utilizamos valores de X para determinar Y, seguido da representação gráfica. Mas

no caso de termos o gráfico, ou os valores de X e Y, precisamos determinar a

equação que originou esses valores. Para isso utilizamos a regressão linear,

também chamada técnica dos quadrados múltiplos.

Deve-se observar que a regressão é característica da função

utilizada, sendo assim temos regressões logarítmicas, potenciais, de média móvel

e polinomiais, onde a ordem define o expoente maior (quadráticas, de terceiro

grau, etc). Quando nos referimos a uma regressão de ordem um, ou seja, uma

função de primeiro grau, estamos tratando de uma regressão linear.

Os termos de uma função linear podem ser calculados através das

seguintes fórmulas:

Nxx

Nyxxy

B 22 )(

xdemédiaBydemédiaA

Note a necessidade de primeiro se determinar o valor de “B” para

depois determinar o termo independente “A”.

N Número de termos da determinação, ou de pontos na reta. x Somatória dos valores de X. y Somatória dos valores de Y. xy Somatória dos produtos entre X e Y. x² Somatória dos valores dos quadrados de X.

(x)² Somatória de X elevada ao quadrado.

As médias de X e Y (Mx e My) são obtidas pela soma de X dividido

pelo número de termos (N), ou seja, a média aritmética simples dos valores.

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UM EXEMPLO...

O quadro abaixo demonstra os valores sugeridos para X e Y:

X Y -3 -8 -2 -5 -1 -2 0 1

Pede-se a função geratriz desses valores.

Para facilitar os cálculos e evitar erros, sugerimos a utilização de

uma tabela de resoluções como a que exibimos a seguir. É fortemente sugerido

sempre realizar todos os cálculos antes de inseri-los na fórmula.

x y xy x² -3 -8 24 9 -2 -5 10 4 -1 -2 2 1 0 1 0 0

x -6 y -14 xy 36 x² 14 (x)² 36 My -3,5

Mx -1,5

Substituindo na fórmula da regressão linear, obtemos:

3

436144

14636

B

1)5,13()5,3( A

Assim podemos concluir que a equação linear de onde derivam os

resultados apresentados no início do exemplo é 3x+1, o que demonstra ser

verdadeiro, pois quando substituímos na expressão obtida os valores de X

sugeridos obtemos exatamente os resultados de Y sugeridos (a “prova real”).

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Em alguns casos, quando realizamos a “prova real”, observamos que

mesmo colocando os resultados para X sugeridos no início do exercício os

resultados de Y são levemente diferentes daqueles sugeridos. Esse fenômeno

acontece principalmente quando os valores para A e B obtidos não são valores

inteiros. Isso se deve porque nem sempre os valores de X para a variável Y

respondem perfeitamente a uma função, como demonstrado no exemplo anterior.

Muitas experiências práticas que utilizam valores conhecidos para se

determinar outros (X determinando Y) são influenciados por diferentes variáveis e

limitações do próprio experimento. A regressão linear fornece os resultados mais

prováveis dentro de um horizonte de eventos. É possível, no entanto, mensurar

essa confiabilidade através do cálculo do coeficiente R², também chamado

coeficiente de Pearson ou coeficiente de correlação. R² está compreendido entre 0

e 1, que respectivamente representam totalmente incorreto e totalmente confiável

(0% de acerto e 100% de acerto, ou accuracy). Dessa forma podemos condicionar

os resultados a níveis confiáveis e, se necessário, excluir os resultados que

sofreram muita variação por fatores alheios ao experimento, como problemas com

diluição ou tempo de leitura incompatível com a técnica.

R pode ser calculado com base na seguinte expressão:

)²(²)²(²)(

yyNxxNyxxyNR

N Número de termos da determinação, ou de pontos na reta. x Somatória dos valores de X. y Somatória dos valores de Y. xy Somatória dos produtos entre X e Y. x² Somatória dos valores dos quadrados de X. y² Somatória dos valores dos quadrados de Y.

(x)² Somatória de X elevado ao quadrado. (y)² Somatória de Y elevado ao quadrado.

Observe a necessidade de se elevar ao quadrado o resultado obtido

para R (apenas R² corresponde ao coeficiente de correlação).

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No exemplo anterior, obteremos para R² o seguinte cálculo:

x y xy x² Y² -3 -8 24 9 64 -2 -5 10 4 25 -1 -2 2 1 4 0 1 0 0 1

x -6 y -14 xy 36 x² 14 y² 94 (x)² 36 (y)² 196

1

19694436144)146(364

R

O quadrado de 1 é 1, e portanto a confiabilidade na regressão obtida

é de 100%. Prova disso é que os valores sugeridos para X geram por essa

expressão, os valores sugeridos para Y sem a menor diferença.

Agora, observe os seguintes valores:

X Y 15 31 30 61 45 92,6 60 122,9 75 151,5 90 180 105 210

A expressão obtida através de regressão linear é Y = 1,98X + 2,15.

Esses valores foram aproximados. R² obteve 0,9997, o que significa que os

valores de X, quando substituídos nessa expressão, vão gerar valores de Y

diferentes. Essa diferença é notoriamente pequena, mas mesmo pequenas

diferenças podem arruinar pesquisas ou denotar falhas nos procedimentos.

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4 USANDO O MS EXCEL

O MS Excel, programa distribuído pela Microsoft Corporation, é um

editor de planilhas matemáticas carregado com funções que permitem cálculos

simples e avançados. Baseado em suas funções, podemos calcular os valores de

Y em função de X, bem como os coeficientes de uma equação, ou seja, regredir à

função geratriz a partir dos resultados obtidos, por exemplo, numa curva de

calibração.

Esse capítulo tem por objetivo explicar os conceitos mais simples de

utilização de fórmulas e gráficos para que o leitor seja capaz de analisar um

gráfico de cinética enzimática e calcular os valores de KM e Vmax sem

complicações. Mais informações sobre as funções do MS Excel podem ser obtidas

gratuitamente em sites especializados (vide capítulo 6 deste trabalho).

Esse pequeno tutorial foi feito baseando-se na versão 2003 do MS

Excel, mas por se tratar da base de inserção de dados, como criação de tabelas e

digitação de fórmulas, é perfeitamente funcional em versões anteriores e

posteriores. A posição dos botões e cores exibidas pode variar conforme a versão,

mas não sua utilidade e funcionalidade.

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4.1 Fórmulas e cálculos

4.1.1 Digitando uma fórmula

O MS Excel baseia-se no uso de fórmulas matemáticas e na relação

entre as células que compõe a planilha. Sempre que um dado é digitado ele passa

a fazer parte de uma célula, e assim passa a ter uma coordenada de localização.

As funções mais complexas possuem um título, que deve ser

digitado entre o sinal de igual e antes dos parênteses. O sinal de igual (=) inicia

toda e qualquer fórmula, e entre os parênteses devem ser colocados os números

ou as coordenadas para que a fórmula tenha o que calcular.

Os dados a serem calculados podem estar na forma de números ou

na forma das coordenadas das células. Tecle “Enter” para exibir a resposta.

Observe abaixo:

=RAIZ(9) : calcula a raiz de 9.

=SOMA(C1;C3) : soma os valores contidos nas células C1 e C3.

=CONTAR.VAZIO(A1:A11) : conta o número de células vazias no intervalo.

Para mais informações sobre como usar as funções avançadas (que

possuem um nome), consulte o “assistente de fórmulas”. Uma breve descrição

desse assistente é dada no capítulo 4.3.1 desse trabalho.

As funções matemáticas básicas (adição, subtração, multiplicação e

divisão) podem ser feitas a partir de símbolos simples e diretos (+, -, *, /

respectivamente). Esse método poupa tempo, pois ao invés de digitarmos o nome

da função, podemos digitar os dados diretamente. Além disso, podemos mesclar

números digitados diretamente na fórmula e números digitados em outras células,

através de suas coordenadas (C1, D2, H13...). Dessa forma podemos escrever:

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=(2+2) : soma 2 com 2.

=(5*3+1) : multiplica 5 e 3 e soma 1.

=((2/5)*(7/8)) : divide 2 por 5 e multiplica pelo resultado de 7 dividido por 8.

=(C1+C5) : soma os valores contidos nas células C1 e C5.

=(D1*5-3) : Multiplica D1 por 5 e subtrai 3 do resultado.

Observe que os parênteses são utilizados para se organizar as

ações. Assim =(2+4/2) é igual a 4, enquanto =((2+4)/2) é igual a 3. Os parênteses

são resolvidos primeiro, mas na ausência deles é empregada a regra de primeiro

efetuar as operações de divisão e multiplicação e depois somar ou subtrair.

4.1.2 Utilizando o assistente de fórmulas

Certifique-se de que todos os dados necessários de X e Y já estão

digitados e que a célula onde o cursor se encontra é a célula onde você deseja

que a resposta seja inserida. Para abrir o assistente de fórmulas, clique sobre a

pequena seta à direita do botão de auto-soma, então clique em “Mais funções...”.

Você pode optar por selecionar os dados antes ou depois de iniciar o assistente.

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Na janela que abrir, digite um nome relativo à fórmula que deseja ser

efetuada, ou digite diretamente o nome dela, e tecle “enter” para procurar entre as

fórmulas listadas. Selecionada a fórmula requerida, tecle “OK” para selecionar os

argumentos da função (os dados necessários à sua execução):

Clique sobre o botão com uma seta vermelha localizado na extremidade

direita de cada caixa de texto para minimizar a janela.

Use o mouse para selecionar a célula ou o intervalo de dados com as

informações necessárias à execução da fórmula (uma pequena descrição do

tipo de informação necessária ao funcionamento correto da fórmula é

fornecida na parte de baixo da janela dos parâmetros).

Clique novamente no botão vermelho para retornar à janela dos argumentos.

Se houver outros argumentos, execute o item anterior até fornecer

informações suficientes para a conclusão da tarefa. Clique “OK” para finalizar.

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4.2 Calculando Y em função de X

Para calcular qualquer função no MS Excel podemos usar as

fórmulas descritas acima. Como as funções do primeiro grau são, na realidade,

multiplicações de coeficientes com incógnitas somados ou subtraídos por outro

coeficiente, podemos usar o método rápido de inserção de fórmulas: usando os

sinais algébricos /, *, -, e +.

A função a ser estudada é f(x)=2x+1.

Primeiro digitamos os valores de X, que são definidos por nós

mesmos. Usaremos nesse exemplo o seguinte conjunto: {-2, -1, 0, 1, 2}. Esses

valores deverão ser escritos na forma de coluna (fig.1).

Em seguida, selecione a célula imediatamente ao lado do primeiro

valor de X. Digite a fórmula para a expressão que queremos utilizar. Para a

expressão 2x+1 a função a ser digitada deverá ser =(2*célula+1). No lugar de

“célula” deve ser inserida a coordenada do primeiro valor de X. No exemplo

mostrado na figura 2, o primeiro valor de X encontra-se na coordenada A3, então

a fórmula é =(2*A3+1). (fig.2).

Posicione o cursor sobre a célula que contém o primeiro valor de Y.

Note que há um pequeno quadrado no canto inferior direito das células

selecionadas. Esse é o comando autopreenchimento. Posicione o mouse sobre

esse pequeno quadrado – ele tomará a forma de uma cruz –, clique e arraste

expandindo o conteúdo para baixo até atingir a última célula que seja adjacente a

um valor de X (fig.3). Solte o mouse. A fórmula =(2*célula+1) foi copiada e

aplicada às células abaixo automaticamente. Os valores de Y foram calculados.

FIG 1 FIG 2 FIG 3

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4.3 Calculando os coeficientes “A” e “B” de uma função linear

Para calcular os coeficientes da regressão linear, podemos digitar as

fórmulas diretamente na célula de resposta, ou usar o assistente de fórmulas para

obter os resultados, pesquisando pelos nomes das fórmulas.

Quando digitamos uma fórmula que trabalha com seqüência de

dados, temos que informar o intervalo de células. Esse intervalo é informado com

o uso de dois pontos (:). Assim, digitar B1:B4 significa o intervalo B1, B2, B3 e B4.

4.3.1 Calculando o coeficiente “A”

Para obter o termo independente de uma função linear, digite a

fórmula =INTERCEPÇÃO(valores_de_Y;valores_de_X) na célula de resposta. Nos

campos de “valores de Y e X” devem ser informados os intervalos de células que

contém os dados para Y e X, respectivamente. Observe atentamente que se deve

primeiro informar o intervalo Y e depois o intervalo X.

4.3.2 Calculando o coeficiente “B”

Digite a fórmula =INCLINAÇÃO(valores_de_y;valores_de_x) para

executar a fórmula do termo de inclinação da reta.

4.3.3 Calculando o coeficiente de correlação

Digite a fórmula =RQUAD(valores_de_y;valores_de_x) para obter o

resultado para o coeficiente de correlação R² direto. Existe uma alternativa a essa

fórmula: =PEARSON(matriz1;matriz2), que fornece como resultado apenas R,

sendo necessário eleva-lo ao quadrado em seguida.

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4.4 Criando gráficos de regressão linear com o MS EXCEL

Antes de criar seu gráfico, certifique-se de que os dados necessários

de X e Y estão digitados na planilha.

Selecione o intervalo de dados necessários à regressão linear (coluna com

os valores de X e coluna com os valores de Y).

Clique sobre o botão “assistente de gráfico”.

Na janela que abrir, como tipo do gráfico, selecione “dispersão(XY)”, e

como subtipo o modelo que apresenta pontos não conectados por linhas.

Clique em “avançar”.

Passe a etapa dois clicando em “avançar”.

Na etapa três, digite o nome do gráfico e dos eixos (opcional). Clique em

“avançar”.

Na etapa quatro, selecione o local do gráfico (se flutuando na planilha ou

como nova planilha). Clique em “concluir”.

O resultado obtido é semelhante ao mostrado abaixo:

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21

A regressão linear é representada graficamente como uma linha

(uma função do primeiro grau) que passa tocando ou mais proximamente à

maioria dos pontos descritos originalmente pelos dados. No MS Excel, essa linha

é denominada “linha de tendência”.

Clique sobre o gráfico.

Na barra de menus, clique em “gráfico” e depois em “adicionar linha de

tendência”.

Selecione a opção “linear”, e depois clique na aba “opções”.

Marque as caixas “exibir equação no gráfico” e “exibir valor de R-quadrado

no gráfico”.

Clique em OK.

O resultado obtido deverá ser similar a este mostrado abaixo:

Observe que através da opção gráfico é possível obter a equação da

regressão linear e o R² diretamente.

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5 ANALISANDO KM E VMAX

Nos estudos envolvendo enzimas, é de importante relevância as

informações conhecidas como Constante de Michaelis-Menten (KM) e Velocidade

Máxima (Vmax). A velocidade máxima é a concentração de substrato em que a

enzima apresenta sua velocidade máxima, e KM representa a concentração de

substrato em que a enzima apresenta metade da velocidade máxima.

Por exemplo, na reação envolvendo glioxalato obtiveram-se os

seguintes resultados:

Glioxalato

(mM) Velocidade de transformação

(M.min-1) 1,00 2,5 0,75 2,44 0,60 2,08 0,50 1,89 0,40 1,67 0,33 1,39 0,25 1,02

Nota-se pelo gráfico que há pouca variação da velocidade máxima

acima de certa concentração de substrato (a velocidade máxima):

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

SUBSTRATO

VELO

CID

AD

E

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A partir do gráfico mostrado anteriormente não é possível calcular

KM e Vmax sem o uso de programas baseados em regressão não-linear. No

entanto, linearizando a curva e obtendo os coeficientes da regressão, é possível

que analisemos essas constantes. O gráfico linearizado é conhecido como gráfi

ode Lineweaver-Burke, ou gráfico do duplo recíproco.

5.1 O gráfico de Lineweaver-Burke

Nesse modelo gráfico, o ponto em que a reta intercepta os eixos X e

Y correspondem respectivamente ao inverso de KM e inverso da velocidade

máxima, conforme o modelo abaixo:

Para se obter esse gráfico, primeiro, é necessário inverter todos os

valores da velocidade e da concentração do substrato. Isso é feito dividindo-se 1

pelo valor. No MS Excel efetue =(1/célula).

Glioxalato

(mM) Velocidade de transformação

(M.min-1) 1 0,4

1,333333 0,409836 1,666667 0,480769

2 0,529101 2,5 0,598802

3,030303 0,719424 4 0,980392

Page 24: Calculando KM

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O resultado disso é um gráfico que tende à linearização, como

exibido abaixo:

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

1/SUBSTRATO

1/VE

LOC

IDA

DE

O gráfico de Lineweaver-Burke deve passar mais proximamente aos

pontos e portanto equivalem à regressão linear, ou linha de tendência:

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

1/SUBSTRATO

1/VE

LOC

IDA

DE

Observe que a partir dos dados fornecidos o gráfico de Lineweaver-

Burke não toca os eixos. Isso porque na prática não existem concentrações

negativas para serem utilizadas. É necessário então projetar a linha do gráfico à

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sua esquerda, de forma a fazê-lo tocar os eixos X e Y. É importante manter o

ângulo de inclinação constante, não alterando assim os coeficientes da regressão.

Plotando os dados em papel milimetrado, os pontos serão contados

manualmente, e nesse caso uma diferença de frações de milímetros poderá

alterar substancialmente o cálculo final. O seguinte método de determinação dos

pontos é mais exato, e sendo efetuado pelo MS Excel, poderá ter dezenas de

casas decimais de precisão.

A partir dos dados fornecidos para a criação do gráfico de

Lineweaver-Burke (1/X e 1/Y), devem-se obter os coeficientes da regressão linear.

158,0194,0)( xxf 97,0² R

Com base nos dados obtidos da regressão, podemos considerar o

seguinte:

O coeficiente “A” é o ponto onde o gráfico toca o eixo Y (onde X = 0).

O ponto em que o gráfico toca o eixo X é a raiz da equação (onde a

equação está igualada a zero).

Sendo assim, podemos concluir que as coordenadas (X;0) e (0;Y)

serão (-0,814;0) e (0;0,158). Com esses dados podemos projetar o gráfico à sua

esquerda, fazendo com que toque os eixos nas coordenadas descritas:

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-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

-2 -1 0 1 2 3 4 5

1/SUBSTRATO

1/VE

LOC

IDA

DE

Agora podemos calcular a velocidade máxima e o KM usando as

coordenadas encontradas.

329,6158,011

Y

VMAX 228,1814,011

X

KM

O quociente entre KM e Vmax equivale ao termo “B” da regressão:

194,0329,6228,1

VMAX

KMB

Através da relação acima podemos definir o valor de KM sem a

necessidade de definir o ponto que intercepta o eixo X – apenas tendo calculado

os termos da regressão e Vmax:

228,1329,6194,0329,6

194,0 KMKM

Assim, podemos concluir que a velocidade máxima da reação é

6,329 M.min-1 e KM é igual a 1,228 mM.

Page 27: Calculando KM

27

6. MAIS INFORMAÇÕES

- Mais informações sobre a cinética enzimática e bioquímica podem ser acessadas

nos seguintes endereços: PT.WIKIPEDIA.ORG

EN.WIKIPEDIA.ORG

HTTP://XYZT.ATOMIC-HOSTING.COM/VI/ENZIMAS.HTM

HTTP://WWW.BIOQ.UNB.BR/INDEX_BR.PHP

- Mais informações sobre o MS Excel podem ser obtidas nos seguintes endereços: HTTP://WWW.USD.EDU/TRIO/TUT/EXCEL/

HTTP://WWW.BAYCONGROUP.COM/EL0.HTM

HTTP://WWW.APOSTILANDO.COM/DOWNLOAD.PHP?COD=165&CATEGORIA=OFFICE

- Departamento de Bioquímica da Universidade Estadual de Londrina (UEL) HTTP://WWW2.UEL.BR/CCE/BIOQUIMICA/

- Contato com o autor

[email protected]

Page 28: Calculando KM

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7. REFERÊNCIAS

MURRAY, R. K.; GRANNER, D. K. et al. Harper: bioquímica. 6ª. Edição. Atheneu

Editora São Paulo. São Paulo. 1990.

LOROWITZ, W. Using Microsoft Excel to Plot and Analyze Kinetic Data.

Weber State University. <faculty.weber.edu/wlorowitz/3053/kineticsexcel.pdf> em

09/03/2008.

- As imagens dos gráficos nas páginas 5 e 23 desse trabalho foram retiradas da

página de cinética enzimática da Wikipédia brasileira, disponível no endereço

http://pt.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica, em 21/10/2008.

- Excel, MS Excel e Microsoft Excel são marcas registradas de Microsoft

Corpotration. Todos os direitos reservados à Microsoft Corporation.