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ELMER ALEXANDER GENOY-PUERTO

Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops

geoffroanus (Schweigger, 1812) provenientes de ambientes poluídos: metodologia de isolamento e estimulação

São Paulo

2008

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ELMER ALEXANDER GENOY-PUERTO

Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops

geoffroanus (Schweigger, 1812) provenientes de ambientes poluídos: metodologia de isolamento e estimulação

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento: Patologia

Área de concentração:

Patologia Experimental e Comparada

Orientadora:

Profa. Dra. Eliana Reiko Matushima

São Paulo

2008

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Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.1997 Genoy-Puerto, Elmer Alexander FMVZ Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phynops geoffroanus

(Schweigger, 1812) provenientes de ambientes poluídos: metodologia de isolamento e estimulação / Elmer Alexander Genoy-Puerto. – São Paulo: E. A. Genoy-Puerto, 2008. 103 f. : il.

Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Patologia, 2008.

Programa de Pós-Graduação: Patologia Experimental e Comparada. Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada.

Orientador: Profa. Dra. Eliana Reiko Matushima.

1. Citometria de fluxo. 2. Função celular. 3. Phrynops geoffroanus. 4. Poluição. 5. Leucócitos sangüíneos. I. Título.

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FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: GENOY-PUERTO, Elmer Alexander

Título: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops geoffroanus

(Schweigger, 1812) provenientes de ambientes poluídos: metodologia de

isolamento e estimulação

 

 

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências

Data:____/____/____

Banca Examinadora

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: ____________________

Assinatura: _________________________ Julgamento: ___________________

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: ____________________

Assinatura: _________________________ Julgamento: ___________________

Prof. Dr. ___________________________ Instituição: ____________________

Assinatura: _________________________ Julgamento: ___________________

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, por apoiar meus sonhos e esperanças.

A Cata, por sua compreensão.

A Deus.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a minha orientadora, Profa Dra Eliana Reiko Matushima, Matu, pelo apoio nesses anos de estudo no Brasil. Por sua orientação, paciência e por ter me aceito na Pós-Graduação. Agradeço ainda por suas palavras, que se converteram no ponto de partida da minha vida como pesquisador.

Agradeço ao Prof. Dr. Luiz Carlos Sá-Rocha por ter me ensinado o

maravilhoso mundo da citometria de fluxo no Laboratório de Neuroimunologia da FMVZ-USP e por toda sua ajuda na metodologia proposta nesse trabalho.

Agradeço também ao professor Luciano M. Verdade, por ter me permitido

participar do projeto Phrynops geoffroanus e ter me dado o apoio técnico e logístico do Laboratório de Ecologia Animal em Piracicaba.

Agradeço à Vanessa de Moura Sá-Rocha, por seus ensinamentos sobre a

citometria de fluxo e sobre a metodologia desenvolvida. Ao grande Bruno, por sua ajuda durante todo o trabalho de coleta, captura e

transporte dos animais. Agradeço suas orientações para com o projeto, foram valiosas.

À Silmara, obrigado por toda sua paciência e apoio nas tardes e noites de

trabalho no laboratório e à Thaís, por sua ajuda e ensino na hematologia. Ao Cristian, pela amizade e ajuda no modelo e desenvolvimento estadístico do projeto. À Cybele, da FPZSP por sua colaboração.

A meus amigos do Laboratório de Patologia Comparada de Animais Silvestres

que acompanharam de perto o projeto: Igor, Juliana, Luiz Fernando, Alice, Bruna, Marina, Raoni e Ticiana.

A meus amigos colombianos e estrangeiros (Brasil, Peru, Argentina, Chile e

Peru). Lenin, Magda, Alejo, Marta, Fernando, Luciana, Daniel, Kátia, Caio, Bruno, Hugo, Arthur, Maria, Paul, Mauro e ao grande Álvaro, por acompanhar minhas alegrias em São Paulo.

A meus pais, Rodrigo e Elizabeth, por seu amor e educação. A minha esposa, uma grande mulher que entendeu meus momentos difíceis e

por seu amor. Ao Parque Zoológico de São Paulo, por ceder suas instalações e animais

para a realização do estudo. A CNPq pela bolsa de estudos concedida durante o mestrado, a FAPESP

pelo auxílio-pesquisa para a realização do projeto e ao IBAMA, pela concessão da licença de captura e coleta dos cágados.

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RESUMO

GENOY-PUERTO, E. A. Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops geoffroanus (Schweigger, 1812) provenientes de ambientes poluídos: metodologia de isolamento e estimulação. [Flow cytometry of blood leucocytes of Phrynops geoffroanus (Schweigger, 1812) from polluted environments: isolation and stimulation methodology]. 2008. 103 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

O quelônio Phrynops geoffroanus aparece freqüentemente associado a cursos

d'água poluídos, sem que, no entanto, sejam conhecidos aspectos que descrevam

sua atividade imune celular frente situações adversas (efeitos antrópicos). A

citometria de fluxo permite mensurar características estruturais e imunológicas de

células em suspensão submetidas a um fluxo contínuo, sendo capaz de analisar

inúmeros tipos celulares. Neste trabalho foi desenvolvida metodologia para estudar e

avaliar a função celular de leucócitos sangüíneos do Phrynops geoffroanus através

da fagocitose e burst oxidativo espontâneo e induzido utilizando a citometria de

fluxo. Para definir a metodologia foram utilizadas 86 amostras sangüíneas de

Phrynops geoffroanus encontrados em ambientes antrópicos do rio Piracicaba,

ribeirão Piracicamirim e Fundação Parque Zoológico de São Paulo como grupo de

comparação. Estes resultados foram complementados pelo perfil hematológico. O

processamento incluiu transporte e conservação das amostras em RPMI 1640

Gibco® para posterior utilização de Ficoll-PaqueTM PLUS como agente separador

entre leucócitos e hemácias, utilizando-se centrifugações refrigeradas (18°C) com

acelerações e desacelerações graduais. Amostras com porcentagens de viabilidade

inferiores a 90 % não foram utilizadas na realização dos estímulos: Zymosan A

(Saccharomyces cerevisiae) Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate para induzir

fagocitose e miristato acetato de phorbol (PMA) e Saccharomyces cerevisiae

(Zymosan) na indução do burst oxidativo. Condições ambientais, espécie específica

e da metodologia da citometria de fluxo determinaram uma melhor resposta para

realização da fagocitose em comparação com o burst oxidativo dos leucócitos aqui

avaliados.

Palavras-chave: Citometria de fluxo. Função celular. Phrynops geoffroanus. Poluição. Leucócitos sangüíneos.

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ABSTRACT

GENOY-PUERTO, E. A. Flow cytometry of blood leucocytes of Phrynops geoffroanus (Schweigger, 1812) from polluted environments: isolation and stimulation methodology. [Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops geoffroanus (Schweigger, 1812) provenientes de ambientes poluídos: metodologia de isolamento e estimulação]. 2008. 103 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.

The freshwater turtle Phrynops geoffroanus is frequently associated with polluted

waters; however, the aspects that describe the cellular immune activity against

adverse situations (anthropogenic effects) are still unknown. Flow cytometry allows

us to measure and analyze the characteristics of the suspended cells when

submitted to a continuous flow; it is capable of analyzing a number of different types

of cells. In this study, it designed a methodology in order to study and evaluate the

cellular function of blood leucocytes, through phagocytosis and spontaneous or

induced oxidative bursts, using flow cytometry. This methodology, was designed with

86 blood samples, collected from Phrynops geoffroanus in anthropogenic

environments of the river Piracicaba and its tributary Piracicamirim and the Sao

Paulo Zoological Park Foundation, as a comparison group, all in Sao Paulo State,

Brazil. These results were complemented with the blood profile. The samples were

stored in RPMI 1640 Gibco®, medium for transportation. Initially, it was used Ficoll-

PaqueTM PLUS, as a separator of leucocytes and red blood cells. Later the samples

were centrifuged at 18°C, with gradual break and speed. Samples with viability

percentage under 90% were not used. The agents used for stimulation were

Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate

to induce phagocytosis and phorbol miristate-acetate (PMA) and Saccharomyces

cerevisiae (Zymosan) to induce oxidative burst. Environmental, species-specific and

cytometric methodology conditions determined a better response for the occurrence

of phagocytosis in comparison with oxidative burst of the leucocytes analyzed.

Key words: Flow cytometry. Cellular function. Phrynops geoffroanus. Pollution. Blood leucocytes.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Média aritmética e desvio padrão por técnica utilizada e por local de captura das células viáveis e inviáveis – São Paulo – maio 2006-ago. 2007..................................................................... 43

Tabela 2 – Resultados do Teste de T-Student das comparações entre células sem estímulo e quando estimuladas por gates, G1 e G2 – São Paulo – 2007............................................................... 55

Tabela 3 – Teste de Kruskal-Wallis da intensidade fluorescência dos três locais de captura para fagocitose e burst oxidativo dos gates G1 e G2 – São Paulo – 2007....................................................... 55

Tabela 4 – Perfil hematológico de Phrynops geoffroanus dos três locais amostrais que foram processados com Ficoll – Desaceleração zero. Média, desvio padrão, amplitude de variação (entre parênteses) – São Paulo – 2007............................................. 56-57

Tabela 5 – Análise de variância com os respectivos p valores, dos parâmetros hematológicos de Phrynops geoffroanus que foram processados com metodologia Ficoll – Desaceleração zero – São Paulo – 2007.................................................................. 58

Tabela 6 – Razão heterófilo/linfócito em Phrynops geoffroanus em função do local. Média, desvio padrão, amplitude de variação (entre parênteses) – São Paulo – 2007............................................. 59

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Número de amostras sangüíneas de Phrynops geoffroanus que formaram ou não o anel leucocitário. As amostras que formaram o anel, foram dividas em amostras inviáveis e viáveis após utilização do Ficoll PaqueMT PLUS e centrífuga refrigerada – São Paulo – maio 2006-ago. 2007.................. 42

Gráfico 2 – Médias aritméticas por técnica utilizada e por local de captura das porcentagens de viabilidade celular – São Paulo – maio 2006-ago. 2007................................................................. 44

Gráfico 3 – Dispersão dos resultados da intensidade de fluorescência das células sem serem estimuladas (CÉLULA) e quando foi induzida à fagocitose por Saccharomyces cerevisiae Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate, Zymosan A, (CÉLULA + Zym A) dos três lugares amostrais em G1 e G2– São Paulo –2007................................................................................. 52

Gráfico 4 – Dispersão dos resultados da intensidade de fluorescência quando foi mensurado o metabolismo basal (DCFH) e quando foi induzido o burst oxidativo por PMA e Zym dos três locais amostrais em G1 e G2– São Paulo – 2007................................................................................. 53

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Phrynops geoffroanus. A. Detalhe cabeça e barbilhões. B. Plastrão com padrão marcação preto e vermelho. B. Carapaça – São Paulo – 2008.............................................................. 19

Figura 2 – Passagem da amostra pelo fluxo do citômetro – São Paulo – 2008............................................................................................. 22

Figura 3 – Configuração interna de um citômetro de fluxo– São Paulo – 2008............................................................................................. 22

Figura 4 – Localização da Bacia do rio Piracicaba e microbacia do ribeirão Piracicamirim. As setas destacam os pontos de captura – São Paulo – 2008........................................................................ 26

Figura 5 – Toma de amostra sangüínea de Phrynops geoffroanus do seio venoso supra vertebral-cervical – São Paulo – 2007..................................................................................... 29

Figura 6 – Formação final dos tubos para serem centrifugados. Dois tubos formaram uma amostra de um só animal. A. 3 mL de sangue. B. Camada de 3 mL de Ficoll-PaqueTM PLUS (densidade 1.055 g/mL). C. Camada de 3 mL de Ficoll-PaqueTM PLUS (densidade 1.070 g/mL) – São Paulo – 2007............................................ 33

Figura 7 – Tubos com amostras após centrifugação refrigerada: A) D quatro: O anel leucocitário não está bem definido. B) D zero: *) Camada de FPP (densidade 1.055 g/mL) junto com plasma sangüíneo. **) Anel leucocitário. ***) Camada de FPP (densidade 1.070 g/mL). Na porção sedimentada observam-se as hemácias (camada vermelha)– São Paulo – 2007..................................................................................... 42

Figura 8 – Exemplos de citogramas e histogramas da fagocitose de três animais, dos três lugares de captura, Piracicamirim 288, Piracicaba 299 e Zoológico de São Paulo 3 – São Paulo – 2007.................................................................................... .46

Figura 9 – Exemplos de citogramas e histogramas da burst oxidativo induzido por PMA e Zymosan de três animais, dos três lugares de captura, Piracicamirim 288, Piracicaba 296 e Zoológico de São Paulo 6. – São Paulo – 2007............................................ 47

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Figura 10 – Diferentes citogramas que evidenciam a pouca confiabilidade na leitura das amostras utilizando-se a metodologia Ficoll e centrifugação com desaceleração 4– São Paulo – maio 2006-ago. 2007............................................................................ 48

Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP e centrifugação com desaceleração zero evidencia-se duas diferentes populações G1 e G2 de células sem serem estimuladas (célula) e sendo estimuladas (Zym fago ou Zymosan A Saccharomyces cerevisiae Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate) de amostras – São Paulo – maio 2006-ago. 2007................................................................................... 49

Figura 12 – Citogramas do burst oxidativo de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP e centrifugação com desaceleração zero evidenciam-se duas diferentes populações de células G1 e G2 quando marcado o metabolismo basal ou burst espontâneo (DFCH) e sendo induzido (DCFH+PMA, DCFH+Zym). A) Ribeirão Piracicamirim e Rio Piracicaba. B) Zoológico de São Paulo – São Paulo – maio 2006-ago. 2007............................................................ 50-51

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LISTA DE APÊNDICES

APÊNDICE A – Amostras viáveis e inviáveis classificadas em função das porcentagens de viabilidade obtidas através da correlação entre o número de células viáveis e inviáveis, das amostras processadas com metodologia Ficoll – Desaceleração quatro – São Paulo – jun.-out. 2006..... 97-98

APÊNDICE B – Amostras viáveis e inviáveis classificadas em função

das porcentagens de viabilidade obtidas da correlação entre o número de células viáveis e inviáveis, das amostras processadas com metodologia Ficoll – Desaceleração zero – São Paulo – nov.-ago. 2007...... 99

APÊNDICE C – Resultados da aquisição dos eventos, sem estímulo (célula) e quando foi induzida a fagocitose com Saccharomyces cerevisiae Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate (Zymosan A), no G1 e G2, dos Phrynops geoffroanus capturados no ribeirão Piracicamirim, rio Piracicaba e Fundação Parque Zoológico de São Paulo, que foram avaliados pela metodologia Desaceleração zero – São Paulo – 2007............................................ 100

APÊNDICE D – Resultados da aquisição dos eventos no burst oxidativo espontâneo (DCFH), induzido por PMA (DCFH+PMA) e induzido por Saccharomyces cerevisiae, Zymosan (DCFH+ZYM) no G1 e G2, dos Phrynops geoffroanus capturados no ribeirão Piracicamirim, rio Piracicaba e Fundação Parque Zoológico de São Paulo, que foram avaliados pela metodologia Desaceleração zero – São Paulo – 2007............................................................. 101

APÊNDICE E – Perfil hematológico, identificação, sexo e data de processamento de das amostras de Phrynops geoffroanus processadas com Ficoll – Desaceleração zero – São Paulo – abr.-ago. 2007............................. 102

APÊNDICE F – Valores relativos de leucócitos sangüíneos de Phrynops geoffroanus dos três locais amostrais, que foram processados com a metodologia de Ficoll – Desaceleração zero, Média, desvio padrão, amplitude de variação (entre parênteses) – São Paulo – 20.......... 103

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................. 17

2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................. 19

2.1 Phrynops geoffroanus........................................................................ 19

2.2 CITOMETRIA DE FLUXO.................................................................. 20

2.3 FUNDAMENTOS DA CITOMETRIA DE FLUXO............................... 21

2.4 FUNÇÕES DO SISTEMA IMUNE DE RÉPTEIS............................... 23

3 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................ 25

3.1 ÁREA DE ESTUDO........................................................................... 25

3.1.1 Rio Piracicaba.................................................................................. 25

3.1.2 Ribeirão Piracicamirim.................................................................... 26

3.1.3 Fundação Parque Zoológico De São Paulo (FPZSP)................... 27

3.2 ANIMAIS............................................................................................ 27

3.3 CAPTURA DOS ANIMAIS................................................................. 27

3.4 COLETA SANGÜÍNEA...................................................................... 28

3.5 CITOMETRIA DE FLUXO................................................................. 30

3.5.1 Metodologia para Isolamento dos Leucócitos.............................. 30

3.5.1.1 Hemólise.................................................................................. .......... 31

3.5.1.2 Porcentagem de Viabilidade.................................................... .......... 31

3.5.1.3 Desaceleração......................................................................... .......... 32

3.5.2 Leitura no Citômetro de Fluxo........................................................ 36

3.6 HEMATOLOGIA................................................................................ 36

3.6.1 Volume Globular ou Hematócrito (Ht)........................................... 36

3.6.2 Proteína Plasmática Total............................................................... 37

3.6.3 Hemoglobina.................................................................................... 37

3.6.4 Contagem Total de Eritrócitos e Leucócitos................................ 38

3.6.5 Contagem Diferencial de Leucócitos............................................ 38

3.6.6 Contagem de Trombócitos............................................................. 39

3.6.7 Índices Hematimétricos.................................................................. 40

3.6.8 Índice de Estresse........................................................................... 40

4 RESULTADOS.................................................................................. 41

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4.1 CITOMETRIA DE FLUXO.................................................................. 41

4.1.1 Isolamento e Estímulo de Leucócitos........................................... 41

4.1.1.1 Células Viáveis.................................................................................. 43

4.1.1.2 Porcentagem de Viabilidade............................................................. 44

4.1.2 Leitura no Citômetro de Fluxo........................................................ 45

4.1.2.1 Tamanho Celular e Granulosidade/Complexidade Relativas............ 45

4.1.2.2 Intensidade de Fluorescência obtida dos Estímulos......................... 51

4.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS ESTÍMULOS..................................... 54

4.2.1 Funcionalidade dos Estímulos....................................................... 54

4.2.2 Comparação por Locais de Captura............................................... 55

4.3 HEMATOLOGIA................................................................................ 56

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA DO PERFIL HEMATOLÓGICO................. 57

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA DO ÍNDICE DE ESTRESSE..................... 58

5 DISCUSSÃO...................................................................................... 60

5.1 CITOMETRIA DE FLUXO................................................................. 61

5.1.1 Isolamento Leucócitico e Viabilidade Celular.............................. 61

5.1.2 Leitura no Citômetro de Fluxo........................................................ 61

5.1.3 Funcionalidade dos Estímulos....................................................... 63

5.2 HEMATOLOGIA................................................................................ 67

5.2.1 Hematócrito..................................................................................... 68

5.2.2 Proteína Plasmática Total............................................................... 68

5.2.3 Hemoglobina.................................................................................... 69

5.2.4 Contagem Total de Eritrócitos........................................................ 69

5.2.5 Contagem Total de Leucócitos....................................................... 70

5.2.6 Eosinófilos........................................................................................ 70

5.2.7 Heterófilos......................................................................................... 71

5.2.8 Basófilos........................................................................................... 72

5.2.9 Monócitos......................................................................................... 73

5.2.10 Linfócitos.......................................................................................... 73

5.2.11 Trombócitos...................................................................................... 74

5.2.12 Índices Hematimétricos................................................................... 75

5.2.13 Índice de Estresse............................................................................ 75

6 CONCLUSÃO................................................................................... 77

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................. 78

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REFERÊNCIAS................................................................................. 79

ANEXOS........................................................................................... 97

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1 INTRODUÇÃO

O cágado Phrynops geoffroanus é uma tartaruga de água doce que pertence

à subordem Pleurodira, família Chelidae (MCARTHUR; WILKINSON; MEYER,

2006), e segundo Ernst e Barbour (1989) e Pritchard e Trebbau (1984) com ampla

distribuição na América do Sul, incluindo Colômbia, Venezuela, Guiana, Brasil,

Bolívia, Equador, Peru, e Paraguai.

São poucos os estudos que oferecem informações sobre os aspectos

biológicos, ecológicos e evolutivos de Phrynops geoffroanus. (FERRONATO, 2008).

Durante dois anos foi desenvolvido um estudo na bacia do rio Piracicaba 1, visando

descrever o uso de habitat, estrutura populacional, dieta, biologia reprodutiva,

amplificação de marcadores moleculares, perfil hematológico, microbiota oral.

Espécies de répteis apresentam um declínio populacional numa escala global.

Existem seis ameaças para populações de répteis, degradação e perda do habitat,

introdução de espécies invasoras, doenças, uso insustentável, mudanças climáticas

globais e poluição ambiental (GIBBONS et al., 2000). Muitos destes répteis ocupam

áreas alteradas pela ação antrópica, como rios poluídos e fragmentos de rios

modificados pela construção de usinas hidrelétricas (RIBAS; MONTEIRO FILHO,

2002), fato este que ocorre com esta espécie de cágado (SOUZA, 1999). Para a

adaptação a ambientes antropizados, faz-se necessário conhecer os mecanismos

imunes defensivos pelos quais estes animais sobrevivem a estas condições

ambientais. Uma ferramenta que permite avaliar os mecanismos como o

funcionamento celular de leucócitos sangüíneos em Veterinária é a citometria de

fluxo, embora a metodologia em diferentes espécies esteja estabelecida, pouca tem

sido desenvolvida em répteis.

O objetivo deste estudo foi desenvolver uma metodologia que permitisse

descrever a função celular de leucócitos sangüíneos pela citometria de fluxo,

mensurando indicadores de atividade imunológica leucocitária, a fagocitose e o burst

oxidativo espontâneo e induzido, a partir de amostras de sangue de Phrynops

geoffroanus, réptil que se encontra em ambientes antrópicos do rio Piracicaba e o

ribeirão Piracicamirim do Estado de São Paulo, Brasil. Este trabalho vincula

                                                            1 Auxílio à Pesquisa FAPESP- Proc. No. 2005/00210-9

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aspectos fisiológicos e ambientais, confrontando as informações hematológicas com

as citométricas do tipo imune.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Phrynops geoffroanus

Phrynops geoffroanus é uma tartaruga pleurodira, caracterizada por conseguir

dobrar seu pescoço para ocultar a cabeça na carapaça. É facilmente reconhecido

quando jovem pelo padrão de marcação preto e vermelho brilhante no plastrão.

Embora essas marcas sejam perdidas quando adultos, os mais velhos podem ser

reconhecidos pelos longos barbilhões na região mandibular (PRITCHARD;

TREBBAU, 1984). Seu nome popular é cágado-de-barbicha. Na figura1, observam-

se características morfológicas de um exemplar adulto.

Fonte 1 A-B: GENOY-PUERTO, E. A., 2007 1 C: DAWKINS, R., 2008 Figura 1 – Phrynops geoffroanus. A. Detalhe cabeça e barbilhões. B. Plastrão com padrão marcação

preto e vermelho. B. Carapaça – São Paulo – 2008

A

B C

Page 21: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

20  

São onívoros, alimentando-se de sementes, frutos, peixes e insetos (MEDEM,

1960; ERNST; BARBOUR, 1989; FACHIN-TERAN et al., 1995), porém em cativeiro

têm hábitos preferencialmente carnívoros (MOLINA, 1989). O comprimento médio da

carapaça varia de 200 a 385 mm e a massa corpórea de animais adultos, em

cativeiro, varia de 850 a 5.900 g (MOLINA, 1989). No córrego Ribeirão Preto,

considerado poluído, Souza e Abe (2000) observaram que adultos se alimentam

principalmente de larvas e pupas de Chironomidae e resíduos domésticos. O

acasalamento ocorre de dezembro a abril e a nidificação entre março e novembro

(MOLINA, 1989). Os ovos são quase esféricos (34 x 32 mm) e a ninhada varia de 10

a 20 ovos (ERNST; BARBOUR, 1989). A quantidade de desovas varia de 2 a 3

vezes por ano e a temperatura não parece afetar o sexo em Phrynops geoffroanus

em incubação com temperaturas entre 26 e 32 ○C (VOGT, 1992).

Phrynops geoffroanus pertence às 35 espécies de tartarugas que fazem parte

da fauna conhecida de répteis no Brasil. Junto com as tartarugas marinhas, os

cágados no território brasileiro, estão ameaçados por sua alta exploração e

destruição de seu hábitat (RODRIGUES, 2005). Baseados na Partners in Amphibian

and Reptile Conservation (PARC) Gibbons et al. (2000) descrevem fatores

conhecidos ou suspeitos de estar associado com o declínio populacional nos répteis,

sendo eles: degradação e perda do habitat, introdução de espécies invasoras,

doenças, uso insustentável, mudanças climáticas globais e poluição ambiental. O

Phrynops geoffroanus encontra-se em córregos de água poluídos segundo os

estudos de Souza e Abe (2000); Souza e Abe (2001) e Brites e Rantin (2004),

contudo informações sobre características imunológicas que possam determinar os

efeitos diretos dos agentes estressores ambientais, como a polução, sobre as

populações de cágados que habitam esses habitats são nulas.

2.2 CITOMETRIA DE FLUXO

A citometria de fluxo (CF) permite mensurar características químicas ou

físicas de células que se encontram suspensas num fluxo contínuo. Parâmetros

estruturais intrínsecos, como o tamanho celular e granulosidade citoplasmática, e

parâmetros funcionais extrínsecos, como o metabolismo oxidativo, são algumas das

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21  

mensurações obtidas por essa tecnologia, que tem sido usada amplamente em

Medicina, Biologia e Imunologia desde os anos 30. (SHAPIRO, 2003). O citômetro

realiza uma análise multiparamétrica (SILVA et al., 2004), isto é, analisa múltiplas

características e estruturas celulares de um número elevado de células em forma

individual. A CF converte-se numa poderosa ferramenta para caracterizar complexas

populações celulares por ser precisa na descrição e contagem dos eventos (células)

quando comparada com metodologias anteriores, tendo grande importância na

pesquisa médica em especial em áreas como a Imunologia e Hematologia

(TARRANT, 2005).

2.3 FUNDAMENTOS DA CITOMETRIA DE FLUXO

O citômetro de fluxo foi desenvolvido para identificar e avaliar a emissão de

fluorescência das células, FACS – Fluorescence Activated Cell Sorter (NAKAGE et

al., 2005). O aparelho é conformado por cinco componentes: uma fonte de radiação,

uma câmera de fluxo, uma unidade de filtros ópticos, fotodiodos ou

fotomultiplicadores e uma unidade processadora dos dados obtidos (BD

BIOSCIENCES, 2002; SILVA, 2004).

As células suspensas numa solução tampão são adequadas numa única

coluna na câmara de fluxo, através de um fluxo laminar e um foco hidrodinâmico A

célula passa pelo feixe de radiação do laser de argônio que está perpendicular ao

fluxo (Figura 2).

O feixe intercepta a célula originando uma dispersão frontal, Forward

Scattering (FSC) e uma lateral, Side Scattering, (SSC). A radiação assim dispersa é

detectada diretamente por fotodiodos, dispersão frontal, ou desviada a 90° por

lentes, espelhos dicróicos e filtros ópticos para ser focada nos multiplicadores,

dispersão lateral (SILVA, 2004). Ver figura 3.

Page 23: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

22  

Fonte: BD Biosciences, 2002. Figura 2 – Passagem da amostra pelo fluxo do citômetro – São Paulo – 2008

Fonte: BD Biosciences, 2002. Figura 3 – Configuração interna de um citômetro de fluxo– São Paulo – 2008

Page 24: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

23  

A informação gerada pela combinação das diferentes dispersões de radiação

revela a dimensão ou tamanho celular, a granulosidade/complexidade e a

intensidade de fluorescência das células avaliadas.

Existem outros tipos de aplicações da CF. As populações podem ser isoladas

através da identificação de diferentes antígenos de superfície marcados com

anticorpos fluorescentes específicos, imunofenotipagem ou subteste linfocítico

(ROITT; BROSTOFF; MALE, 2003). Podem ser quantificadas duas importantes

funções dos neutrófilos, a capacidade fagocitária e de burst oxidativo pela

mensuração da fluorescência resultante da interação entre os leucócitos e diferentes

estímulos, como bactérias e reagentes fluorescentes.

A CF é útil também como analisador hematológico automático e contador de

plaquetas reticuladas e reticulócitos. Participa no diagnóstico de leucemia, linfoma,

anemia imune-mediada, trombocitopenia, granulocitopatias e trombocitopatias.

Avalia medula óssea, ciclo celular e ploidia, células-tronco hematopoiéticas,

eritrócitos, leucócitos, plaquetas e funções leucocíticas (NAKAGE et al., 2005;

TARRANT, 2005).

2.4 FUNÇÕES DO SISTEMA IMUNE DE RÉPTEIS

Diferentes estudos têm sido desenvolvidos visando a descrever o

comportamento imunológico de répteis. Desse modo, já foi avaliado os efeitos de

estressores como subnutrição (BORYSENKO; LEWIS, 1979), foram estudados a

morfologia e a função de órgãos linfóides (SOLAS; LECETA; ZAPATA, 1981;

ZAPATA; LECETA; SOLAS, 1981; LECETA; ZAPATA, 1985; SAAD et al., 1991;

VARAS; TORROBA; ZAPATA, 1992), foi avaliada a resposta imune celular mediada

(MCKINNEY; BENTLEY, 1985), foram estudados antígenos de superfície e

imunoglobulinas linfocíticas (MEAD; BORYSENKO, 1984a,b) e fez-se descobertas,

como a presença de células de Langerhans (PEREZ-TORRES; MILLAN-ALDACO;

RONDAN-ZARATE, 1995).

Os leucócitos são responsáveis pela resposta imune, sendo que sua ação

determina a imunidade inata e adaptativa, conferindo ao corpo um sistema de

defesa integral que lhe permite uma interação com seu entorno, garantindo-lhe que

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24  

não seja afetado por microorganismos ou ambientes desfavoráveis (JANEWAY et

al., 2007). Segundo Almosny e Monteiro (2006), os répteis apresentam diferentes

tipos de leucócitos: basófilos, eosinófilos, heterófilos, azurófilos, monócitos e

linfócitos. Tem se visto que informações que possam revelar os mecanismos imunes

são tão valiosas quanto aquelas que elucidam os mecanismos de evolução deste

sistema (COE, 1972).

Montali (1988) e Thrall et al. (2004) descrevem o heterófilo de répteis como

um equivalente do neutrófilo dos mamíferos. Seu comportamento, possivelmente,

tem semelhança com o heterófilo aviário, no qual mecanismos de oxigênio

independentes são mais utilizados para destruir o microorganismo fagocitado. Nos

neutrófilos, duas ações importantes garantem essa proteção: na primeira, duas

séries de eventos bioquímicos que destrói o agente invasor, processos oxidativos e

não oxidativos, que são ativados simultaneamente. Na segunda, a fagocitose, onde

o material externo é ingerido (SMITH, 1994; TIZARD, 2004).

O sangue periférico tem sido utilizado para estudar estas características

através de CF em bovinos (SMITS; BURVENICH; HEYNEMAN, 1997), eqüinos

(MASSOCO; CARMONA; BACCARIN, 2006) e baleias (GUISE et al.,1995).

Em quelônios de água doce a CF vem sendo usada na avaliação de danos

nucleares por contaminação ambiental (BICKHAM et al., 1988; LAMB et al., 1991;

MATSON et al., 2005; HAYS; MCBEE, 2007;). As células utilizadas na avaliação

citométrica provêm de diversos tecidos, como rim, baço, coração e sangue (LAMB et

al., 1995), sendo que no sangue a célula alvo é a hemácia, contudo poucos

trabalhos têm desenvolvido uma metodologia que permita estudar os leucócitos

sanguíneos destes répteis in vitro para avaliar suas funções.

Informações quanto o perfil hematológico da espécie Phrynops geoffroanus

são escassas, poucos trabalhos são encontrados na literatura (BRITES, 2002;

ZAGO et al., 2006), ainda mais os relacionados à hematologia de animais brasileiros

e seu vínculo com os aspectos fisiológicos e ambientais.

Os estudos em hematologia de répteis têm tentado estabelecer a

nomenclatura para os diferentes tipos sangüíneos, a qual tem sofrido modificações

sustentadas pela Imunologia, que elucida com maior profundeza a natureza dos

elementos celulares sangüíneos (SYPEK; BORYSENKO, 1988).

Page 26: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

25  

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ÁREA DE ESTUDO

Foi constituída por dois corpos d’água pertencentes à bacia hidrográfica do

Rio Piracicaba e do ribeirão Piracicamirim.

3.1.1 Rio Piracicaba

A bacia hidrográfica do rio Piracicaba localiza-se na porção sudeste do

Estado de São Paulo, Brasil, entre os paralelos 22°00’ e 23°30’ de latitude sul e os

meridianos 45°45’ e 48°30’ de longitude oeste (FERRAZ; MARTINELLI; VICTÓRIA,

2001). Em seus 12400 km2, engloba áreas urbanas densamente povoadas de 61

municípios e abriga quase quatro milhões de pessoas (MARTINELLI et al., 1999;

FERRAZ; MARTINELLI; VICTÓRIA, 2001; TOMAZELLI et al., 2003). As fontes

poluidoras estão associadas ao tipo de uso da ocupação do solo (CETESB, 2001),

na bacia, existe um forte uso de agroquímicos associado ao cultivo de cítricos e

cana de açúcar (MARTINELLI et al., 1999). Atualmente, a maior fonte poluidora na

bacia provém de efluentes domésticos, ou seja, descarga direta de esgotos

domésticos na rede de drenagem o que representa um grande estressor ambiental,

degradando a qualidade da água e, conseqüentemente, alterando as comunidades

biológicas. (MARTINELLI et al., 2002; CETESB, 2007).

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26  

3.1.2 Ribeirão Piracicamirim

A microbacia do ribeirão Piracicamirim, que é tributário do rio Piracicaba,

localiza-se entre os paralelos 22°41’e 22°52’ de latitude sul e entre os meridianos

47°35’ e 47°43’ de longitude oeste, compreende uma área de 133 km2 e abriga uma

população aproximada de 70 mil habitantes (TOLEDO; BALLESTER, 2001). Devido

à falta no controle de emissão de poluentes, como tratamento de esgotos urbanos,

as principais fontes de poluição são lançamentos de esgotos clandestinos e insumos

químicos das plantações de cana-de-açúcar. (OMETO et al., 2000). A figura 4

apresenta os locais amostrais e bacia do Rio Piracicaba e microbacia do ribeirão.

Fonte: Toledo e Ballester, 2001; Fostier, et al., 2005. www.cena.usp.br/piracena Figura 4 – Localização da Bacia do rio Piracicaba e microbacia do ribeirão Piracicamirim. As setas

destacam os pontos de captura – São Paulo – 2008

Bacia do Rio Piracicaba

Ponto de coleta no

Rio Piracicaba

Ponto de coleta no

Ribeirão

Piracicamirim

Microbacia do

Ribeirão

Piracicamirim

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27  

3.1.3 Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP)

O Zoológico possui na sua coleção nove exemplares de Phrynops

geoffroanus em cativeiro, os quais são mantidos em um único recinto exposto para

visitação. O recinto possui uma área aproximada de 400 m2 com um tanque central

de 1 m de profundidade. Apresentam duas áreas, uma sombreada e uma exposta ao

sol. O tanque lavado cada semana e sua água trocada. Segundo Lisboa 2 (2007)

existem outras espécies de répteis que convivem junto com os cágados de barbicha,

39 Trachemys dorbigny, 20 Geochelone carbonaria, um casal de Caiman yacare, um

casal Caiman crocodilus [...] (informação verbal).

3.2 ANIMAIS

Foram utilizados Phrynops geoffroanus capturados no rio Piracicaba (19), no

ribeirão Piracicamirim (41) e na Fundação Parque Zoológico de São Paulo (9). O

número de animais capturados é diferente do número utilizado na avaliação da

citometria de fluxo. Ver itens 3.4 e 3.5.1.

3.3 CAPTURA DOS ANIMAIS

Os sítios de captura do rio Piracicaba localizaram-se nas proximidades do

bairro Monte Alegre, a pouca distância da ponte Copersucar (22º41’75”S

47º33’58”W) na cidade de Piracicaba, São Paulo. Os exemplares foram capturados

foram capturados mediante busca ativa (LAGUEUX et al., 1995) com puçás, durante

a noite, com a utilização de barco motorizado. Foi necessária a utilização de

lanternas para localizar o animal nos próximos 2 Km do rio utilizados para captura.

Na mesma cidade, no ribeirão Piracicamirim, o local de captura (22º42’51”S

                                                            2 Informação fornecida por LISBOA, C.S. Bióloga responsável pelo Setor de Répteis da Fundação Parque Zoológico de São Paulo em São Paulo, 2007.

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28  

47º37’36”W) estava localizado próximo ao Departamento de Entomologia no

Campus da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Universidade de São

Paulo (ESALQ/USP), Piracicaba, São Paulo. Nesse ponto, utilizaram-se quatro

redes de pesca de espera de nylon, que foram estendidas entre as margens do

ribeirão. Puçás também foram empregados, quando necessário. A captura foi

durante o dia.

As capturas aconteceram entre o período de abril de 2006 a agosto de 2007.

Os indivíduos capturados foram acondicionados em caixas de transporte para serem

transportados ao Laboratório de Ecologia Animal (LEA) da ESALQ/USP.

No LEA os animais foram identificados, examinados, mensurados, sexados, e

pesados. A identificação foi por meio de ranhuras realizadas nos escudos marginais

(CAGLE, 1939) e implante de microchip no tecido subcutâneo do membro posterior

esquerdo (DIXON; YANOSKY, 1999). Exame clínico foi realizado em cada um dos

animais capturados. Paquímetro foi utilizado para medir comprimento e largura de

carapaça e plastrão e comprimento desde a base da cauda até a cloaca e da cloaca

até a ponta da cauda. Segundo Molina (1989) as fêmeas possuem maior massa

corpórea, e os machos apresentam uma leve concavidade no plastrão e uma cauda

maior, características estas utilizadas para sexar os animas. Uma balança foi

necessária para a pesagem.

Só foram utilizadas tartarugas adultas; Souza (1999), em seu trabalho sobre

ecologia de Phrynops geoffroanus, agrupou jovens com comprimento das carapaças

≤ 210 mm.

Os cágados da coleção da Fundação Parque Zoológico de São Paulo foram

utilizados como grupo comparativo. Sua captura foi manual; identificação e sexagem

já tinham sido realizadas pelos responsáveis técnicos do Zoológico.

3.4 COLETA SANGÜÍNEA

Para avaliar a metodologia de isolamento dos leucócitos sangüíneos, alguns

animais foram amostrados duas vezes. Já na análise da citometria e avaliação

hematológica, uma única amostra obtida por animal foi analisada.

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29  

Com relação à quantidade da amostra de sangue obtida, até 10% do volume

sangüíneo pode ser retirado com relativa segurança, sendo que a quantidade

máxima é de aproximadamente 3 mL/Kg na maioria dos quelônios (WILKINSON,

2006). Alíquotas sangüíneas de 2,5 mL foram coletadas por venipunção do seio

venoso supra vertebral-cervical (ALMOSNY; MONTEIRO, 2006) com seringa de 3

mL descartável e agulha 30x7, 22G1¼. Ver figura 5.

Fonte: GENOY-PUERTO, E. A.

Figura 5 – Toma de amostra sangüínea de Phrynops geoffroanus do seio venoso supra vertebral-cervical – São Paulo – 2007

As amostras foram acondicionadas em tubos (BD Vacutainer®) contendo

heparina lítica como anticoagulante, sendo que 2 mL foram utilizados para a

citometria e 0,5 mL para hematologia. Em seguida, o sangue para citometria foi

transferido para tubos contendo meio de cultura RPMI 1640 Gibco® e o sangue para

análise hematológica continuou no tubo com heparina.

No ano de 2006, as amostras eram obtidas em Piracicaba e encaminhadas ao

Laboratório de Patologia Comparada de Animais Selvagens (LAPCOM) do

Departamento de Patologia (VPT) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

da Universidade de São Paulo (FMVZ/USP). Em 2007, os indivíduos foram

capturados e transferidos ao LAPCOM, onde foram obtidas as amostras sangüíneas,

no seguinte dia a amostra foi coletada. Alguns animais tiveram o sangue coletado

por duas vezes, mas uma única amostra foi considerada para o estabelecimento da

metodologia.

Page 31: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

30  

Os animais foram mantidos com condições adequadas de água, luz,

temperatura e alimentação antes de ser novamente liberados no mesmo local de

origem.

Os processamentos laboratoriais foram realizados no mesmo dia em que as

amostras sangüíneas foram colhidas. Tais processamentos foram realizados no

LAPCOM e no laboratório de Neuroimunologia (LNI) do VPT-FMVZ/USP. Durante

toda a análise laboratorial, as amostras foram mantidas sob refrigeração.

Não foi superado o tempo de uma hora entre a colheita e o processamento do

sangue dos animais de Piracicaba, e de três horas no caso dos animais do

Zoológico (tempo médio entre colheita e transporte até o LAPCOM).

3.5 CITOMETRIA DE FLUXO

Levando em conta que as respostas imunes dependem da atividade dos

leucócitos (JANEWAY et al., 2007) e que as hemácias de répteis são células

nucleadas podendo ser interpretadas como evento celular pelo citômetro de fluxo,

foram testadas três metodologias para separar as camadas celulares branca e

vermelha destes animais.

3.5.1 Metodologia para Isolamento dos Leucócitos

Foram utilizadas amostras de 86 animais. Dezesseis amostras foram

submetidas à hemólise e setenta por diferença de gradientes de densidade.

A avaliação de cada método foi feita através do percentual de viabilidade

entre o número de células vivas e mortas de cada amostra testada.

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31  

3.5.1.1 Hemólise

Em um tubo de ensaio 100 µL de sangue foram ressuspendidos em 900 µL

de solução salina tamponada com fosfato, PBS, logo após foram adicionados 2 mL

de cloreto de sódio (NaCl) a 0,2%. A amostra ficou em repouso por 20 segundos, em

seguida foram adicionados novamente 2 mL de NaCl a 1,6%. Finalmente, a amostra

passou por uma centrifugação simples (Fanem® Excelsa baby II, modelo 206-R) por

10 minutos a 10000 rpm a temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado e

o sedimento ressuspendido em 500 µL de PBS. Imediatamente após, foi feito uma

contagem de viabilidade celular.

3.5.1.2 Porcentagem de Viabilidade

Para a realização da contagem das células viáveis, utilizou-se como marcador

o Azul de Tripan. Em tubos Eppendorf® 3810X standard devidamente identificados

foram conjugados 90 µL do marcador com 10 µL da amostra. Dos 100 µL totais 10µL

foram retirados para a contagem na câmara de Neubauer. Somente o quadrado

central da câmara foi lido. Avaliou-se a morte celular pela presença de Azul de

Tripan intracitoplasmático, identificada com uma coloração azul. O número total de

células e a porcentagem de células não viáveis foram determinados por microscopia

óptica. O resultado (Fórmula 1) foi dado em x105 leucócitos viáveis por 1000 µL,

sendo que 10 foi o valor da diluição e 104 correspondeu ao volume da câmara.

Partindo do número de células viáveis e inviáveis, foi calculada a porcentagem de

viabilidade (Fórmula 2).

Fórmula 1

Page 33: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

32  

Uma amostra era considerada viável, quando se obtinha valores ≥ 90%.

A metodologia por diferenças de gradientes de densidade tinha como objetivo

a separação de duas camadas celulares, uma de hemácias e outra de leucócitos

através da utilização do Ficoll-PaqueTM PLUS (FPP) e centrifugações refrigeradas

com diferentes desacelerações.

3.5.1.3 Desaceleração

Outras 70 amostras foram processadas através de duas diferentes

velocidades de desaceleração da centrifuga refrigerada: quatro e zero. Assim, as

duas metodologias foram nomeadas desaceleração quatro (D quatro) e

desaceleração zero (D zero).

As velocidades de desaceleração foram diferentes prevendo possíveis danos

estruturais que a célula poderia sofrer comprometendo, assim, sua viabilidade.

Centrifugações com velocidades de desacelerações no nível 9 (máximo) não são

aconselhadas. A desaceleração zero corresponde a uma travagem zero, onde

ocorre uma liberação da velocidade (EPPENDORF, [200-?]), isto é, a não utilização

da travagem para diminuir a velocidade do rotor, assim o rotor levará um tempo

aproximado de 740 segundos até que pare (EPPENDORF, [200-?]). Com a

desaceleração quatro o rotor pode parar em quase um minuto.

A procedência e número de amostras foram os seguintes: D quatro (n=42), 22

do ribeirão Piracicamirim, 12 do rio Piracicaba, e 8 da Fundação Parque Zoológico

de São Paulo. D zero (n=28), 5 de ribeirão Piracicamirim, 10 do rio Piracicaba e 13

da FPZSP.

Fórmula 2

Page 34: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

33  

As duas velocidades de desaceleração da centrífuga refrigerada resultaram

na formação de um anel branco leucocitário entre as camadas de FPP. Foi realizado

o percentual de células viáveis (item 3.5.1.2) antes da leitura pelo citômetro de fluxo.

Desaceleração Quatro: Em tubos BD FalconTM Conical Tubes de 15 mL, foram

misturados 4 mL de meio RPMI 1640 Gibco® com 2 mL do sangue coletado,

obtendo-se um total de 6 mL do sangue com RPMI 1640 (6 mL sangue-RPMI, S-

RPMI) por cada animal, que foram divididos em duas partes iguais (3 mL).

As densidades previamente elaboradas foram 1,055 e 1,070 g/mL. Em outro

tubo, colocou-se 3 mL de FPP de densidade 1,070 g/mL e adicionou-se 3 mL de

FPP de densidade 1,055 g/mL e finalmente, 3 mL S-RPMI (Figura 6). Os 3 mL S-

RPMI restantes foram processados igualmente.

Cada tubo foi disposto em ângulo de 45°, para permitir que a mistura (FPP e

sangue) descesse lentamente pelas paredes do tubo, diminuindo possibilidades de

mistura das densidades e morte celular. Imediatamente os tubos foram levados à

centrífuga para gerar a formação do anel leucocítico.

Fonte: GENOY-PUERTO, E. A.

Figura 6 – Formação final dos tubos para serem centrifugados. Dois tubos formaram uma amostra de um só animal. A. 3 mL de sangue. B. Camada de 3 mL de Ficoll-PaqueTM PLUS (densidade 1.055 g/mL). C. Camada de 3 mL de Ficoll-PaqueTM PLUS (densidade 1.070 g/mL) – São Paulo – 2007

Os tubos foram centrifugados (em centrífuga Harrier® 18/80 Sanyo) a 18 °C,

com aceleração 9 e desaceleração 4. A centrifugação inicial foi realizada durante 30

A

B

C

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34  

minutos e a uma velocidade 450 x g, para a obtenção do anel leucocitário e a

separação de leucócitos e hemácias. Após a centrifugação, verificou-se a formação

de anéis.

Os anéis leucocitários formados foram coletados com auxílio de pipeta

Pasteur e ressuspendidos em 10 mL de PBS (phosphate-buffered saline), para

lavagem e retirada do excesso de FPP, que poderiam comprometer a viabilidade das

células sangüíneas. Este procedimento fez-se necessário, uma vez que seriam

realizadas mais duas centrifugações consecutivas (duração 10 minutos e velocidade

300 x g). Ao término da primeira centrifugação, os sobrenadantes foram

desprezados e os respectivos sedimentos de cada amostra foram adicionados em

um único tubo e ressuspendidos em 10 mL de PBS para a segunda centrifugação.

Após a segunda centrifugação, repetiu-se o mesmo procedimento anterior e, agora,

a amostra foi ressuspendida em 500 µL de PBS. A partir desta amostra, foi realizada

a avaliação da viabilidade celular para obter a quantidade de amostra a ser utilizada

para cada tubo de cada estímulo.

Os estímulos utilizados foram: Zymosan A Saccharomyces cerevisiae Bio

Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate para induzir fagocitose. Miristato acetato de

phorbol (PMA) e Zymosan Saccharomyces cerevisiae na indução do burst oxidativo.

Foram avaliados também o burst oxidativo basal e a atividade das células sem

estímulo.

Em tubos para citometria foram elaborados os estímulos. Em cada tubo, foi

realizado um estímulo, sendo que o volume total da amostra foi de 1100 µL. Partindo

dessa quantidade, foi descontado, o volume celular e o volume de cada estímulo

para finalmente completar com PBS. O volume celular (Fórmula 3) foi ajustado para

ter uma concentração de 4 X105 de leucócitos em 1000 µL, tendo como base o

resultado de células viáveis em 1000 µL (Fórmula 1). O volume para DCFH foi 200

µL, para PMA 10 µL, para Zymosan e Zymosan A 1 µL.

Fórmula 3

Page 36: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

35  

Desta forma, o experimento apresentou a seguinte bateria de tubos por

animal amostrado:

Tubo A (Controle): leucócitos + PBS;

Tubo B (Avaliou metabolismo basal): leucócitos + 200 µL DCFH + PBS;

Tubo C (Avaliou burst oxidativo por estímulo químico): leucócitos + 200 µL

DCFH + 10 µL PMA + PBS;

Tubo D (Avaliou burst oxidativo por estímulo biológico): leucócitos + 200 µL

DCFH + 1 µL Zymosan + PBS;

Tubo E (Avaliou fagocitose): leucócitos + 1 µL Zymosan A + PBS.

As amostras foram incubadas em temperatura ambiente por 50 minutos, no

escuro e sob agitação a cada 10 minutos. A preparação das densidades de FPP e a

conjugação dessas densidades com sangue foram feitas na câmara de fluxo laminar

sem luz.

Interrompeu-se o estímulo vertendo 2 mL de EDTA 3mM em cada tubo. O

EDTA é um quelante de cálcio e impossibilitando a emissão de pseudópodes,

inibindo assim a fagocitose. Para obter uma melhor concentração de células no tubo

foi feita uma última centrifugação refrigerada com tempo de 8 minutos, velocidade

300 x g. Finalmente desprezou-se o sobrenadante e foi feita uma ressuspensão com

500 µL de PBS para passar a amostra no citômetro.

Desaceleração Zero: Esta técnica seguiu o protocolo descrito no item

anterior, porém utilizou-se uma centrífuga refrigerada Eppendorf Centrífuge 5810®

(18 °C, aceleração 9 e desaceleração zero). Para as lavagens após a primeira

centrifugação, optou-se por substituir o PBS por RPMI 1640, numa tentativa de

melhorar a viabilidade celular.

Page 37: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

36  

3.5.2 Leitura no Citômetro de Fluxo

O citômetro utilizado foi o FACs Calibur Becton Dickinson Immunocytometry

Systems®, San José, CA, USA, acoplado a um computador Macintosh (G4) da

Apple®. As amostras passaram pelo aparelho uma única vez, sendo adquiridos

10.000 eventos dentro de um gate previamente determinado. Os parâmetros

registrados foram as médias de fluorescência do canal verde para burst oxidativo e

vermelho para fagocitose. Os dados coletados foram analisados pelo software Cell

Quest Pró® (Becton Dickinson Immunocytometry Systems®) versão para Macintosh.

3.6 HEMATOLOGIA

Logo após a obtenção e distribuição das amostras para citometria (2.0 mL) e

hematologia (0.5 mL), já descritas, uma pequena quantidade de sangue de cada

animal foi utilizada para a realização de uma extensão sangüínea (DICKINSON;

JARCHOW; TRUEBLOOD, 2002). Os 0.5 mL foram empregados na metodologia do

perfil hematológico.

A avaliação hematológica de répteis envolve o exame de eritrócitos,

leucócitos e trombócitos do sangue periférico (CAMPBELL; ELLIS, 2007). Esse

exame está constituído pela obtenção de uma série de mensurações, contagens e

porcentagens, sendo eles: hematócrito, proteína plasmática total, hemoglobina,

contagens totais de hemácias e leucócitos, contagem diferencial de leucócitos e os

índices hematimétricos. Estes foram os protocolos utilizados para sua realização.

3.6.1 Volume Globular ou Hematócrito (Ht)

Este volume indica o volume ocupado pelos eritrócitos em determinada

quantidade de sangue. A determinação é pela técnica de micro-hematócrito

(COLES, 1986). Aproximadamente dois terços de um tubo capilar para determinação

Page 38: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

37  

de micro-hematócrito (Perfecta®) foram preenchidos com a amostra, vedando-o com

uma massa própria para colocá-lo em uma centrífuga de micro-hematocrito

(Centrimicro®, Fanem®). Logo após a centrifugação, 10000 rpm durante 5 minutos,

um cartão de hematócrito foi utilizado para a obtenção do resultado em

porcentagem.

3.6.2 Proteína Plasmática Total

O plasma contido no tubo capilar empregado no hematócrito serviu para esta

mensuração dada em g/dL. Quebrou-se cuidadosamente o capilar com a finalidade

de separar o volume de eritrócitos e o de leucócitos do plasma. Mediante leitura

desse plasma no refratômetro, foi obtida a dosagem de proteína plasmática total.

3.6.3 Hemoglobina

A concentração hemoglobina constitui-se num indicativo de avaliação do

carreamento do oxigênio pelo organismo e de seu aproveitamento pelos vários

tecidos. Para sua determinação, foi utilizado o método da cianometahemoglobina

(DEIN, 1984; CAMPBELL, 1996) através de um kit comercial da Labtest®

Reagentes. Em tubos de ensaio devidamente identificados e com ajuda de uma

pipeta automática, foram adicionados 5 mL do reagente de cor de hemoglobina

preparado anteriormente e 20 µL da amostra. Logo após, objetivando a lise dos

eritrócitos e retirada de seus núcleos da mistura de sangue-reagente de

cianometahemoglobina a solução foi homogeneizada e centrifugada. O

sobrenadante resultante foi utilizado para a análise. Um analisador LABQUEST®, da

empresa LABSTEST® Diagnóstica Ltda foi utilizado para realizar as leituras com

100% de transmissão, em 540 nm. A máquina forneceu os resultados de

absorbância e da concentração de hemoglobina em g/dL.

Page 39: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

38  

3.6.4 Contagem Total de Eritrócitos e Leucócitos

Utilizou-se o diluente isotônico de Natt e Herrick (NATT; HERRICK, 1952).

Num tubo de ensaio, utilizando pipeta automática, 20 µL da amostra foram

conjugados com 4 mL do diluente. Assim que a solução foi homogeneizada, a

câmera de Neubauer foi preenchida para realizar uma contagem dos dois grupos

celulares (hemácias e leucócitos). A contagem foi dada em milímetros cúbicos,

sendo baseada nas técnicas de Almosny e Santos (2001) e Rameh-de-Albuquerque

(2007).

Em cinco dos pequenos quadrantes do quadrante central da câmara, foram

contados os eritrócitos. Levando-se em conta que a diluição utilizada foi 1:200, 10 à

altura da câmara e 5 à área contada o fator de diluição foi 10000 assim, o cálculo do

número de eritrócitos foi feito com seguinte fórmula:

Já os leucócitos foram contados nos 4 quadrantes maiores dos cantos

externos da câmara. O fator de diluição para leucócitos foi 500, levando em conta

que a diluição foi 1:200, 10 à altura da câmara e ¼ à divisão das 4 áreas contadas.

A fórmula para o cálculo do número de leucócitos por milímetro cúbico seguiu a

seguinte fórmula:

3.6.5 Contagem Diferencial de Leucócitos

Os répteis apresentam diferentes tipos de leucócitos: basófilos, eosinófilos,

heterófilos, azurófilos, monócitos e linfócitos (ALMOSNY; MONTEIRO, 2006). Os

azurófilos são células sangüíneas ocasionalmente encontradas na ordem Chelonia:

jabutis, tartarugas e cágados (RAMEH-DE-ALBUQUERQUE, 2007), assim o

azurófilo foi desconsiderado deste estudo. Por meio dessa contagem, foram

Page 40: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

39  

avaliadas as seguintes células: heterófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e

monócitos.

Para identificação dos tipos celulares, foram utilizadas as extensões

sangüíneas realizadas no dia da coleta, secas em temperatura ambiente e coradas

com May-Grunwald-Giemsa modificado (ROSENFELD, 1947). A técnica utilizada

para coloração consistiu em cobrir a lâmina com 1 ml do corante e deixar por 3

minutos e meio. Decorrido este tempo, foram adicionados 2 ml de água MilliQ sobre

a extensão com o corante. Após 13 minutos e meio, a lâmina foi lavada com água

deionizada e colocada para secar, estando pronta para visualização em microscópio

ótico em objetiva de imersão. Utilizando deste tipo de contagem, foram avaliadas as

seguintes células: heterófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e monócitos

(BRENNER et al., 2002; DEEM et al., 2006).

Foram contados 100 leucócitos. O valor obtido da leitura foi o número relativo

(%) de cada tipo celular. O valor absoluto desses tipos celulares é obtido

multiplicando-se o valor obtido na Contagem Total de Leucócitos e o número relativo

de cada uma delas, dividindo esse resultado por 100. Os resultados foram dados em

milímetros cúbicos. Foi utilizada a seguinte fórmula:

3.6.6 Contagem de Trombócitos

Partindo das extensões sangüíneas, foram realizadas as contagens de

trombócitos em cada 1000 hemácias contadas. O cálculo em milímetros cúbicos foi

obtido com a seguinte fórmula:

Page 41: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

40  

3.6.7 Índices Hematimétricos

Estes índices são: volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina

corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média

(CHCM) (CAMPBELL, 1996). Seu cálculo foi feito com as equações apresentadas

abaixo:

3.6.8 Índice de Estresse

Alterações nos leucócitos podem representar supressão do sistema imune

(LANCE; ELSEY, 1999). Sendo assim, além das informações fornecidas pelo quadro

hemático, existe a correlação heterófilo/linfócito, que é utilizada para mensurar o

estresse no animal. Estudos com galinhas (GROSS; SIEGAL, 1983), tartarugas

marinhas (AGUIRRE et al., 1995), jacarés (LANCE; ELSEY, 1999) e Phrynops

geoffroanus (FERRONATO, 2008).

Page 42: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

41  

4 RESULTADOS

4.1 CITOMETRIA DE FLUXO

A metodologia apresentou duas classes de resultados: inicialmente aqueles

que têm relação com a metodologia usada para separar leucócitos e obtenção de

células para serem estimuladas, denominados “Isolamento e estímulo de leucócitos”;

e posteriormente aqueles obtidos da leitura do aparelho, nomeados “Leitura no

citômetro”.

4.1.1 Isolamento e Estímulo de Leucócitos

A formação de um pellet branco no fundo dos tubos de ensaio, quando

utilizada a hemólise, e a formação do anel leucocitário nas metodologias com

desaceleração quatro e zero foram consideradas uma demonstração da separação

das duas populações celulares.

Como já foi descrito na metodologia, quando utilizada a hemólise nenhuma

amostra formou o pellet. Quando empregada a metodologia D quatro, apenas 5

amostras não apresentaram o anel leucocitário; mas se formou em 37. Destas foram

viáveis 24 amostras, e 13 foram inviáveis (Gráfico 1). Algumas vezes, o anel

formado não era claramente definido (Figura 7A). Com a D zero, vinte e oito

amostras formaram o anel leucocitário, sendo que 25 apresentaram células viáveis e

apenas 3 amostras foram inviáveis. O anel leucocitário formado apresentou-se mais

espesso e melhor definido (Figura 7B).

Page 43: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

42  

Gráfico 1 – Número de amostras sangüíneas de Phrynops geoffroanus que formaram ou não o anel leucocitário. As amostras que formaram o anel, foram dividas em amostras inviáveis e viáveis após utilização do Ficoll PaqueMT PLUS e centrífuga refrigerada – São Paulo – maio 2006-ago. 2007

Fonte: GENOY-PUERTO, E. A., 2007

Figura 7 – Tubos com amostras após centrifugação refrigerada: A) D quatro: O anel leucocitário não está bem definido. B) D zero: *) Camada de FPP (densidade 1.055 g/mL) junto com plasma sangüíneo. **) Anel leucocitário. ***) Camada de FPP (densidade 1.070 g/mL). Na porção sedimentada observam-se as hemácias (camada vermelha)– São Paulo – 2007

No total, das 70 avaliadas, 49 amostras sangüíneas formaram o anel e, além

disso, foram viáveis, sendo 24 da metodologia D quatro e 25 da D zero. Apesar do

número de amostras serem distintas entre os dois grupos experimentais, foi notável

A B

*

**

***

Page 44: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

43  

a diferença de amostras inviáveis obtidas como resultado, ou seja, treze no primeiro

grupo (D quatro) e 3 no segundo (D zero).

Para se determinar se a amostra obtida do anel deve ou não para ser

estimulada, é preciso avaliar o estado funcional e estrutural daquelas células que o

compõe, comprovando sua viabilidade. A porcentagem de viabilidade é obtida

partindo do número de células viáveis.

4.1.1.1 Células Viáveis

Quando utilizada a metodologia Desaceleração quatro, a média aritmética e

desvio padrão das células viáveis foram de 143,33 ± 174,99 nos três locais

amostrais, sendo que a maior média foi registrada nas amostras procedentes do rio

Piracicaba, 168,22 ± 249,27.

A média nos três lugares não diminuiu de forma significativa, sendo 141,77 ±

137,97, para a metodologia com desaceleração zero. De acordo com o local, o

número de células aptas para o estímulo aumentou, exceto para o ribeirão

Piracicamirim, 93,20 ± 63,38, ver tabela 1. Nas duas metodologias o número de

células inviáveis foi sempre baixo, sendo um pouco mais notável na D quatro.

Tabela 1 – Média aritmética e desvio padrão por técnica utilizada e por local de captura das células

viáveis e inviáveis – São Paulo – maio 2006-ago. 2007

DESACELERAÇÃO QUATRO DESACELERAÇÃO ZERO LOCAL

Viáveis Inviáveis Viáveis Inviáveis

Ribeirão Piracicamirim 149,44 ± 142,16 3,22 ± 3,83 93,20 ± 63,38 7,60 ± 4,93

Rio Piracicaba 168,22 ± 249,27 2,67 ± 4,77 206,38 ± 196,13 6,00 ± 12,20

Zoológico de São Paulo 96,83 ± 72,96 1,33 ± 1,75 126,00 ± 92,05 3,55 ± 4,25

Média e Desvio Padrão 143,33 ± 174,99 2,54 ± 3,78 147, 77 ± 137,97 5,36 ± 7,99

Partindo-se dos valores observados foram calculadas as porcentagens de

viabilidade, que determinaram quais amostras iriam ser estimuladas.

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44  

4.1.1.2 Porcentagem de Viabilidade

Como já foi descrito no item 3.5.1.2, as amostras foram consideradas viáveis

quando suas células tiveram porcentagens de viabilidade maior aos 90 %. No gráfico

2, que apresenta as porcentagens com desvios padrões, observa-se que a

viabilidade foi melhor na técnica com desaceleração quatro, atingindo uma média de

98,34 ± 1,91% contra os 96,54 ± 5,19% da outra. Estes percentuais foram superiores

aos 90% que foi estabelecido como ideal de viabilidade. Estudos similares com

tartarugas marinhas utilizaram leucócitos sangüíneos para serem estimulados e

avaliados através da leitura pela citometria de fluxo quando sua porcentagem de

viabilidade foi ≥ aos 95% (ROSSI, 2007).

Os resultados das porcentagens de viabilidade celular do estudo estão

apresentados nos apêndices A e B.

Gráfico 2 – Médias aritméticas por técnica utilizada e por local de captura das porcentagens de

viabilidade celular – São Paulo – maio 2006-ago. 2007

Utilizando o número de células viáveis das amostras com porcentagens ≥

90%, foram calculadas as suspensões dos estímulos a serem conjugadas com as

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45  

células leucocitárias do Phrynops geoffroanus para, finalmente, realizar a leitura no

citômetro de fluxo.

4.1.2 Leitura no Citômetro de Fluxo

Partindo das leituras feitas pelo citômetro de fluxo, os dados para serem

interpretados foram: as características de tamanho celular e

granulosidade/complexidade relativas e as intensidades de fluorescência, que

provêm dos estímulos para fagocitose e burst oxidativo.

Os resultados foram agrupados em gráficos de dispersão dos diferentes

estímulos dos três locais de captura e analisados por duas diferentes análises

estatísticas.

4.1.2.1 Tamanho Celular e Granulosidade/Complexidade Relativas

Os eventos celulares registrados pelo aparelho são apresentados como

citogramas e histogramas.

O citograma representa características de tamanho celular relativo (FSC:

Foward Scatter Chanel) no eixo “X” e de granulosidade/complexidade relativas

(SSC: Side Scatter Chanel) no eixo “Y” das células avaliadas. Partindo da avaliação

do citograma, foram identificadas duas diferentes populações, nomeadas como

Gates1 e 2 (G1 e G2). G1 com tamanho e granulosidade/complexidade menor que

as células encontradas no G2.

O histograma registra as emissões ou intensidade de fluorescência do evento

ou estímulo avaliado na população celular selecionada nos gates. O programa Cell

Quest Pro® inserido no Computador Macintosh do Citômetro resumiu, por estatística

descritiva, a intensidade de fluorescência originada por cada população quando foi

ou não estimulada. As figuras 8 e 9 apresentam exemplos de alguns citogramas e

histogramas obtidos quando os leucócitos de Phrynops geoffroanus foram

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46  

estimulados para fagocitar e produzir espécies reativas de oxigênio no burst

oxidativo.

Figura 8 – Exemplos de citogramas e histogramas da fagocitose de três animais, dos três lugares de

captura, Piracicamirim 288, Piracicaba 299 e da Fundação Parque Zoológico de São Paulo 3 – São Paulo – 2007

G1 

G1 

G1  G1 

G1 

G2 

G1 

G2 G2 

G2  G2  G2 

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47  

Figura 9 – Exemplos de citogramas e histogramas da burst oxidativo induzido por PMA e Zymosan de

três animais, dos três lugares de captura, Piracicamirim 288, Piracicaba 296 e Fundação Parque Zoológico de São Paulo 6. – São Paulo – 2007

As 24 amostras da primeira metodologia (Ficoll – Desaceleração quatro)

apresentaram vários problemas de leitura no citômetro. O equipamento teve

G2 G2 G2 

G2  G2  G2 

G1  G1  G1 

G1 G1  G1 

G1  G1 G1 G2 

G2 

G2 

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48  

problemas para ler os 10000 eventos que foram solicitados, sendo que algumas

vezes uma só amostra demorou de 5 a 8 minutos para registrar 5000 eventos. Os

histogramas apresentaram eventos de morte celular, isto é, uma formação parecida

com um cometa, devido à passagem rápida de inúmeras células mortas. Também

apresentaram conformações confusas dos eventos, que não permitiram identificar

populações celulares para serem analisadas, assim muitos dos estímulos não

tiveram nenhum resultado registrado. Estes problemas originaram uma base de

dados pouco confiável, o que impediu realizar uma análise estatística dos mesmos

nesta metodologia, por isso foram descartados da análise de resultados. Ver figura

10.

\

Figura 10 – Diferentes citogramas que evidenciam a pouca confiabilidade na leitura das amostras

utilizando-se a metodologia Ficoll e centrifugação com desaceleração 4– São Paulo – maio 2006-ago. 2007

Das 25 amostras com a metodologia do Ficoll e desaceleração zero, foram

desconsideradas as três amostras com três densidades de Ficoll, outras sete por

serem utilizadas em experimento piloto e uma por ser de um mesmo animal, assim

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49  

14 amostras foram analisadas tendo as mesmas condições de processamento para

CF e hematologia. Três amostras foram do ribeirão Piracicamirim, cinco do rio

Piracicaba e seis da Fundação Parque Zoológico de São Paulo como grupo de

comparação. As figuras 11 e 12 apresentam algumas leituras de fagocitose e burst

oxidativo espontâneo e induzido destas amostras.

Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia

que utilizou FPP e centrifugação com desaceleração 0, evidencia-se duas diferentes populações G1 e G2 de células sem serem estimuladas (célula) e sendo estimuladas (Zym fago ou Zymosan A Saccharomyces cerevisiae Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate) de amostras– São Paulo – maio 2006-ago. 2007

G 1  G 1

G 1  G 1G 2 G 2 

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50  

G 1

G 1  G 1

G 1

G 1 G 1

G 2

G 2

G 2

G 2 G 2

G 2

A

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51  

Figura 12 – Citogramas do burst oxidativo de amostras dos diferentes locais amostrais com

metodologia que utilizou FPP e centrifugação com desaceleração zero evidenciam-se duas diferentes populações de células G1 e G2 quando marcado o metabolismo basal ou burst espontâneo (DFCH) e sendo induzido (DCFH+PMA, DCFH+Zym). A) Ribeirão Piracicamirim e Rio Piracicaba. B) Fundação Parque Zoológico de São Paulo – São Paulo – maio 2006-ago. 2007

4.1.2.2 Intensidade de Fluorescência obtida dos Estímulos

Os gráficos de dispersão permitem comparar os resultados da emissão ou

intensidade de fluorescência emitida pelas células sangüíneas de Phrynops

geoffroanus dos diferentes locais de captura por cada gate sem serem estimuladas e

quando estimuladas para fagocitose ou burst oxidativo.

Na fagocitose dos dois gates dos três locais de captura, é evidente que os

valores de intensidade de fluorescência para a célula já estimulada superaram os

valores da célula sem estímulo e que o gate 2 (G2) apresentou valores maiores

quanto os do gate 1 (G1). Esta condição não foi evidente quando observados os

gates do burst, muitos dos resultados da célula estimulada com PMA ou Zymosan

G 1 G 2

G 1  G 1G 2 G 2

B

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52  

apresentaram um incremento mínimo dessa intensidade se comparados com os da

célula quando foi mensurado seu metabolismo basal (DCFH). Ver os seguintes

gráficos 3 e 4 de dispersão.

Gráfico 3 – Dispersão dos resultados da intensidade de fluorescência das células sem serem

estimuladas (CÉLULA) e quando foi induzida à fagocitose por Saccharomyces cerevisiae Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate, Zymosan A, (CÉLULA + Zym A) dos três lugares amostrais em G1 e G2 – São Paulo – 2007

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53  

Gráfico 4 – Dispersão dos resultados da intensidade de fluorescência quando foi mensurado o

metabolismo basal (DCFH) e quando foi induzido o burst oxidativo por PMA e Zym dos três locais amostrais em G1 e G2– São Paulo – 2007

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54  

Os resultados da intensidade de fluorescência obtidos na fagocitose e burst

oxidativo espontâneo e induzido, com os quais foram elaborados estes gráficos de

dispersão, podem ser conferidos nos apêndices C e D.

4.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS ESTÍMULOS

Foram analisados estatisticamente os estímulos, por sua funcionalidade

individual e por sua funcionalidade segundo local amostral.

4.2.1 Funcionalidade dos Estímulos

Numa primeira análise, foi avaliada a funcionalidade do estímulo através da

comparação das médias da intensidade de fluorescência dos grupos celulares, G1 e

G2, com e sem estímulo, sem levar em consideração os locais de captura.

As hipóteses de interesse são formuladas para testar se “as médias da

intensidade de fluorescência das células sem estímulo e com estímulo são iguais”

contra “as médias da intensidade de fluorescência das células sem estímulo são

menores que as médias das células estimuladas” no G1 e no G2. O teste T-Student

mostrou (Tabela 2) que as células não estimuladas, em média, apresentaram uma

menor fluorescência que as médias das células estimuladas na fagocitose, tanto

para o G1 quanto para o G2 (p valor= 0).

Similarmente, formularam-se hipóteses para o burst oxidativo, onde o burst

basal poderia se incrementar através de um estímulo químico, PMA e um biológico,

Zymosan e os resultados são apresentados na Tabela 2. Estes resultados foram

submetidos à análise estatística (teste T-Student), e verificou-se que não existem

diferenças significativas quando se estimula a célula, tanto no G1 quanto no G2 (p

valor > 0,05).

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55  

Tabela 2 – Resultados do Teste de T-Student das comparações entre células sem estímulo e quando estimuladas por gates, G1 e G2 – São Paulo – 2007

COMPARAÇÕES T-STUDENT DF p VALOR

G1 Célula x Célula+Zymosan A -6,2454 28 0

G2 Célula x Célula+Zymosan A -7,4362 28 0

G1 Célula com DCFH x Célula DCFH + PMA -0,2723 28 0,3937

G2 Célula com DCFH x Célula DCFH + PMA 0,2437 28 0,5954

G1 Célula com DCFH x Célula DCFH + Zymosan -0,5799 28 0,2833

G2 Célula com DCFH x Célula DCFH + Zymosan -0,4453 28 0,3298

4.2.2 Comparação por Locais de Captura

A segunda análise estatística foi realizada para determinar se houve diferença

entre os locais de captura quando seus grupos celulares (gates um e dois) foram

estimulados e, assim, inferir se a resposta imune celular pode estar sendo afetada

segundo o ambiente no qual se encontra o animal. Para testar a hipótese anterior,

utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis, que compara, em geral, as hipóteses: “não

existem diferenças entre as médias dos grupos” com “há pelo menos uma diferença

entre as médias dos grupos”. A tabela 3 mostra que não existem diferenças

estatísticas significativas entre os estímulos e os grupos celulares, nos três locais (p

valor > 0,05).

Tabela 3 – Teste de Kruskal-Wallis da intensidade fluorescência dos três locais de captura para

fagocitose e burst oxidativo dos gates G1 e G2 – São Paulo – 2007 LOCAL DE CAPTURA ESTÍMULO GRUPO

CELULAR KRUSKAL-

WALLIS DF p -VALOR

G1 0,9624 2 0,6180 Fagocitose

G2 3,7996 2 0,1496

G1 1,0794 2 0,5829 Burst oxidativo induzido por PMA G2 1,5713 2 0,4558

G1 0,9530 2 0,6210

Ribeirão Piracicamirim, Rio

Piracicaba, Zoológico de São Paulo

Burst oxidativo induzido por Zymosan G2 0,9901 2 0,6095

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56  

4.3 HEMATOLOGIA

Como explicado anteriormente, 14 amostras apresentaram iguais condições

de processamento com a metodologia de melhor desempenho para isolar leucócitos

e estimulá-los, Desaceleração zero. Os resultados podem ser conferidos no

apêndice E. A seguir, na tabela 4, apresenta-se uma análise descritiva das 14

amostras para cada local.

Tabela 4 – Perfil hematológico de Phrynops geoffroanus dos três locais amostrais que foram

processados com Ficoll – Desaceleração zero. Média, desvio padrão, amplitude de variação (entre parênteses) – São Paulo – 2007

RIBEIRÃO

PIRACICAMIRIM RIO

PIRACICABA ZOOLÓGICO DE

SÃO PAULO PARÂMETRO (n=3) (n=5) (n=6)

18,33 ± 3,79 23,80 ± 4,27 23,00 ± 4,90 Hematócrito %

(14-21) (19-28) (18-29)

5,60 ± 1,04 6,52 ± 0,52 7,63 ± 2,12 Proteína Plasmática Total g dL-1

(4,4-6,2) (6,0-7,0) (5,4-11,0)

4,60 ± 0,66 6,48 ± 1,68 5,77 ± 1,30 Hemoglobina g dL-1

(3,9-5,2) (4,6-8,8) (3,8-7,3)

396,67 ± 156,95 438,00 ± 202,53 313,33 ± 238,47 Eritrócitos 103 mm-3

(220,00-520,00) (340,00-800,00) (80,00-740,00)

23,17 ± 27,15 21,90 ± 19,69 4,92 ± 1,50 Leucócitos 103 mm-3

(6,50-54,50) (8,00-55,00) (3,00-7,00)

1,77 ± 2,26 4,36 ± 6,67 0,64 ± 0,67 Eosinófilos absolutos 103 mm-3

(0,26-4,36) (0,08-15,75) (0,12-1,87)

15,17 ± 19,90 7,34 ± 8,23 1,49 ± 0,59 Heterófilos absolutos 103 mm-3

(3,45-38,15) (0,00-21,45) (0,72-2,34)

0,83 ± 0,23 1,66 ± 1,12 0,69 ± 0,29 Basófilos absolutos 103 mm-3

(0,68-1,09) (0,72-3,00) (0,36-1,04)

0,84 ± 0,69 0,53 ± 0,94 0,17 ± 0,19 Monócitos absolutos 103 mm-3

(0,43-1,64) (0,01-2,20) (0,00-0,48)

 

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Tabela 4 – Perfil hematológico de Phrynops geoffroanus dos três locais amostrais que foram processados com Ficoll – Desaceleração zero. Média, desvio padrão, amplitude de variação (entre parênteses) – São Paulo – 2007 (continuação)

RIBEIRÃO

PIRACICAMIRIM RIO

PIRACICABA ZOOLÓGICO DE

SÃO PAULO PARÂMETRO (n=3) (n=5) (n=6)

4,57 ± 4,11 7,85 ± 8,95 1,93 ± 1,05 Linfócitos absolutos 103 mm-3

(1,63-9,27) (2,48-23,65) (0,87-3,57)

12,48 ± 4,34 12,62 ± 9,22 7,99 ± 6,06 Trombócitos 103 mm-3

(8,58-17,16) (4,32-25,60) (2,56-18,45)

495,88 ± 128,39 594,72 ± 175,60 1276,14 ± 1144,23 VCM fL

(384,62-636,36) (350,00-823,53) (270,27-3375,00)

25,37 ± 2,24 26,88 ± 2,71 25,12 ± 2,96 CHCM g dL-1

(23,50-27,86) (24,21-31,43) (21,11-29,50)

127,74 ± 44,71 162,53 ± 62,92 316,08 ± 293,99 HCM pg

(90,38-177,27) (91,25-258,82) (79,73-862,50)

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA DO PERFIL HEMATOLÓGICO

O objetivo deste item é avaliar se existem diferenças estatísticas entre os três

locais, segundo cada variável de interesse. As variáveis estudadas anteriormente

(tabela 5) podem ser classificadas como contagens ou mensurações.

A técnica estatística utilizada é a análise de variância (ANOVA). As variáveis

que representam contagem vão ser estudadas pela distribuição Poisson, e as

variáveis que representam mensurações vão ser estudadas pela distribuição normal.

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58  

Tabela 5 – Análise de variância com os respectivos p valores, dos parâmetros hematológicos de Phrynops geoffroanus que foram processados com metodologia Ficoll – Desaceleração zero – São Paulo – 2007

PARÂMETRO p VALOR

Eritrócitos 103 mm-3 0,646

Leucócitos 103 mm-3 0,141

Eosinófilos absolutos 103 mm-3 0,265

Heterófilos absolutos 103 mm-3 0,116

Basófilos absolutos 103 mm-3 0,064

Monócitos absolutos 103 mm-3 0,347

Linfócitos absolutos 103 mm-3 0,187

Trombócitos 103 mm-3 0,521

Hematócrito % 0,260

Proteína Plasmática Total g dL-1 0,342

Hemoglobina g dL-1 0,221

VCM fL 0,272

CHCM g dL-1 0,563

HCM pg 0,342

Baseado na tabela 5 pode-se observar que não existem diferenças

estatísticas significativas (p valor > 0,05) para as variáveis estudadas, tanto para as

contagens quanto para as mensurações.

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA DO ÍNDICE DE ESTRESSE

Foi avaliada a relação heterófilo: linfócito dos 14 animais que tiveram seu

sangue processado pela metodologia D zero, sendo que essa relação apresentou

um valor mais elevado em animais que provieram dos locais com rios antropizados,

ou seja, Rio Piracicaba e ribeirão Piracicamirim, como é observado na tabela 6.

Page 60: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

59  

Tabela 6 - Razão heterófilo/linfócito em Phrynops geoffroanus em função do local. Média, desvio padrão, amplitude de variação (entre parênteses) – São Paulo – 2007

LOCAL n RAZÃO HETERÓFILO : LINFÓCITO

Ribeirão Piracicamirim 3 2,54 ± 1,41 (1,39-4,12)

Rio Piracicaba 5 1,17 ± 0,76 (0,00-1,96)

Zoológico de São Paulo 6 0,85 ± 0,28 (0,49-1,15)

Page 61: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

60  

5 DISCUSSÃO

5.1 CITOMETRIA DE FLUXO

A discussão dos resultados da citometria de fluxo foi dividida em isolamento

leucócitico e viabilidade celular, leitura no citômetro e funcionalidade dos estímulos.

5.1.1 Isolamento Leucócitico e Viabilidade Celular

O Ficoll-PaqueTM PLUS apresentou-se como a opção ideal para isolar os

leucócitos sangüíneos sem importar a utilização ou não de uma centrífuga com

desaceleração gradativa (D zero), sendo que, nas duas metodologias que o

utilizaram, a formação de anéis foi alta, só 5 amostras não formaram esse anel.

Noble, Cutis e Carrol (1968) entenderam que é possível aproveitar a diferença

de gravidade entre os diferentes tipos celulares, neste processo a centrifugação do

sangue total em fluidos de alta densidade tem sido bem sucedida na separação de

leucócitos do sangue periférico. Diferentes regentes, como Ficoll-Hypaque,

Sepracell-MN, Percoll, têm sido utilizados para isolar leucócitos, obter algum dos

tipos celulares (monócitos, neutrófilos, eosinófilos) ou analisar as funções

imunológicas das células. Estudos em humanos (FLUKS, 1981; HARDIN; DOWS,

1981; KALMAR et al., 1988; MADYASTHA et al., 1982; VISSERS; JESTER;

FANTONE, 1988) e animais (KURAMOCHI, 1974; CHI; HARRIS, 1978; ROTH;

KAEBERLE, 1981) já foram elaborados aplicando esse princípio de diferença de

densidades. O fluido de alta densidade testado foi o Ficoll-PaqueTM PLUS (FPP)

Amersham Biosciences®.

A técnica consistiu na elaboração de camadas de FPP, com diferentes

densidades que permitissem a deposição dessas hemácias após centrifugação e a

formação de um anel branco leucocitário no meio das camadas de FPP.

Substâncias com alta densidade, como FPP ou similares, já têm sido

utilizadas em quelônios. Rossi (2007), isolou leucócitos sangüíneos de Chelonia

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mydas com Ficoll PaqueTM PLUS e Cray et al. (2001) isolaram linfócitos de sangue

total de tartaruga marinha (Chelonia mydas) com Ficoll Hypaque (Sigma, St. Louis,

Missouri 63160, USA).

Em humanos, o FPP serve como meio para isolar linfócitos em alta produção

e pureza a partir de sangue periférico usando a centrifugação rápida, pode ser

utilizado para isolar linfócitos de outras fontes diferentes da humana; e as células

resgatadas após processamento apresentam viabilidades maiores aos 90%

(AMERSHAM BIOSCIENCES, 2001).

Quando foram observados os resultados do número de células que foram

viáveis, percebe-se que os valores são muito próximos, mas quando é considerado o

número das amostras que foram viáveis, há um aumento deste número quando se

utiliza a centrífuga com desaceleração 0. As condições controladas de

desaceleração influenciam no aumento ou na diminuição de células e amostras

viáveis que são resgatadas dos anéis leucocitários.

Embora em média as porcentagens de viabilidade da metodologia D quatro

(98,34 ± 1,91%) foram melhores do que a outra (96,54 ± 5,19%), esta viabilidade

parece não se manter por muito tempo, sendo que muitas das amostras, na hora da

aquisição dos eventos, apresentaram leituras irregulares ou simplesmente não foi

lido nenhum evento. Possivelmente, a utilização do RPMI como meio para manter a

células durante as lavagens para retirar o FFP melhorou a viabilidade das amostras

da metodologia com desaceleração zero. Em amostras que possuam células

relativamente pouco freqüentes, faz-se necessário enriquecê-las antes da análise,

como acontece com leucócitos, além disso, também é preciso separar as hemácias

por lise ou por centrifugação com gradiente de densidade (CARTER; MEYER, 1994).

Ficou comprovado o desempenho do FPP e o RPMI como reagentes

indispensáveis no isolamento e manutenção de leucócitos sangüíneos de Phrynops

geoffroanus durante o processamento para estimulá-los e mensurar sua

funcionalidade.

Page 63: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

62  

5.1.2 Leitura no Citômetro de Fluxo

A CF não é uma metodologia simples, sendo um dispositivo de mensuração

complexo, é importante possuir um conhecimento básico da teoria operacional para

que os resultados estejam acompanhados de precisão e significância, mas

marcações e qualidade no preparo das amostras são tão importantes quanto o

desenho dos componentes eletrônicos, ótico e de fluido do aparelho (CARTER;

MEYER, 1994). Existem diferentes aspectos da metodologia e preparo das amostras

que poderiam ter influenciado os resultados.

É factível que a irregularidade na leitura das amostras da metodologia com

desaceleração quatro provenha de células que morreram rapidamente, gerando

detritos que dificultaram a passagem pela câmera de fluxo ou porque, durante as

lavagens consecutivas, foram perdendo-se muitas células, fatos estes que

demonstrariam que, a utilização de centrifugação sem desaceleração gradual (D

quatro) permite a formação do anel leucocítico, mas não garante uma viabilidade

celular no tempo. Segundo Carter e Meyer (1994), as amostras devem permitir a

passagem de uma única célula sem perturbar o fluxo ou bloquear os tubos dos

componentes do citômetro. Em humanos, a hemólise é amplamente utilizada frente

à separação por Ficoll e controles de qualidade reportam um número significante de

perda celular (CD8) com esta metodologia, além de requerer maior volume

sangüíneo por amostra (PAXTON et al., 1989).

Os resultados aqui obtidos pela metodologia com desaceleração quatro são

reportados como “amostragem não confiável” por apresentarem um cluster ou gate

celular de má qualidade e que não está claramente definido (PAXTON et al., 1989).

As amostras que foram pré-separadas com FPP e D zero tiveram melhor

passagem pelo citômetro, por apresentarem citogramas que permitiram identificar

duas populações ou gates celulares leucocitários, segundo determinações visuais

dos parâmetros FSC e SSC. Embora a condição dessa determinação fosse

subjetiva, pode-se constatar que as duas populações reagiram de formas diferentes

quando avaliadas as dispersões dos resultados de intensidade de fluorescência das

células estimuladas.

A diferença entre grupos celulares é possível pela análise das dispersões

lateral (SSC) e frontal (FSC) que a CF gera. Trabalhos em peixes, como o

Page 64: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

63  

desenvolvido por Scharsack et al., 2001, caracterizam dois tipos celulares diferentes

por dispersão lateral e dispersão frontal, confirmando-os por microscopia, sendo que

os linfócitos tiveram valores baixos de FSC/SSC, e os leucócitos não linfóides

tiveram aumento destes. Para confrontar os gates com a microscopia, foi realizado

em duas oportunidades o sorting celular, baseado na metodologia de Rossi (No

prelo)3, no entanto, sem obter resultados que permitissem observar os dois possíveis

tipos celulares que se encontravam nos gates.

A CF pode determinar rapidamente as porcentagens relativas de grupos

celulares, mas a determinação fenotípica leucocitária depende de uma padronização

das técnicas em espécies silvestres. Byrne et al. (2000) argumentam que um dos

primeiros passos desta uniformização na área da Veterinária é a obtenção dos gates

no citômetro, fato este que está ocorrendo neste trabalho.

Os valores da intensidade de fluorescência para fagocitose apresentaram

uma diferença de resposta ao mesmo estímulo. Valores superiores aos 450 do

segundo gate superaram ao primeiro, demonstrando que essa segunda população

apresentou uma maior capacidade para realizar fagocitose quando estimulada.

Parece que essas mesmas tendências de resposta da segunda população

continuaram se apresentando no burst oxidativo, mas a presença de outlayers

nesses resultados incrementou as médias aritméticas dos dois gates, o que não

reflete de maneira correta o que aconteceu com esses grupos celulares que, de

forma geral, apresentaram incrementos pouco significativos quando estimulados

para burst oxidativo basal e induzido.

5.1.3 Funcionalidade dos Estímulos

Os resultados do T-Student demonstraram, estatisticamente, que o

Saccharomyces cerevisiae Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate permitiu

estimular leucócitos sangüíneos de Phrynops geoffroanus. Esta mesma prova

demonstrou que não foi representativo qualquer um dos estímulos, seja químico ou                                                             3 ROSSI, S.; SÁ-ROCHA, V. M.; KINOSHITA, D.; GENOY-PUERTO, A.; ZWARG, T.; WERNECK, M. R.; SÁ-ROCHA, L. C.; MATUSHIMA, E. R. Flow cytometry as a tool in the evaluation of blood leukocyte function in Chelonia mydas (LINNAEUS,1758) (Testudines, Cheloniidae). Brazilian Journal of Biology, v. 69, n. 3, 2009. No prelo.

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64  

biológico, utilizado para fomentar a formação de substâncias reativas de oxigênio no

burst oxidativo.

A prova de Kruskal-Wallis confirmou os resultados do T-Student. Quando

observados os resultados, aprecia-se que, indistintamente do local de captura, as

três populações amostrais reagem da mesma forma quando estimuladas para testar

sua função celular, realizam fagocitose, mas têm baixa capacidade de resposta

durante o burst oxidativo.

Segundo Mateo, Roberts e Enright (1984) os heterófilos dos répteis

apresentam habilidade para fagocitar e matar estafilococos. Os resultados

demonstraram que esta função nos leucócitos do cágado aqui estudado foi possível

de mensurar, mas cabem as perguntas: Será que o estímulo foi adequado? A

capacidade de resposta por parte das células aqui mensurada pelo citômetro foi alta

ou baixa? E se fosse normal, o que é normal?

A toxicologia genética estuda a indução de danos genéticos por

contaminação, por exemplo, mutações (CRONIN; BICKHAM, 1998), nela tem se

utilizado a CF como ajuda diagnóstica na avaliação do impacto ambiental em

populações que habitam locais contaminados. São exemplos os trabalhos feitos por

Bickham et al. (1998); Dahl et al. (2001); Dallas et al. (1998); Hays e McBee (2007) e

Matson et al. (2005), pesquisas que tiveram também populações de referência em

lugares não contaminados. A avaliação do estado imune de animais silvestres em

ambientes não contaminados é importante por permitir o estabelecimento de

parâmetros a serem comparados.

A metodologia utilizada em mamíferos, como nos eqüinos, elimina a

necessidade de separação prévia de leucócitos, diminuindo o tempo de

processamento e assim, a produção de espécies reativas de oxigênio do burst

oxidativo (MASSOCO; CARMONA; BACCARIN, 2006). É possível que a etapa de

separação das hemácias nos répteis da metodologia aqui testada desencadeou a

explosão oxidativa celular, assim, quando mensurada essa função, os incrementos

das espécies reativas de oxigênio foram mínimos.

Segundo Cai (1994) a redução desta atividade oxidativa celular tem sido

associada à inapropriada habilidade para matar bactéria, o que incrementa a

susceptibilidade à doenças respiratórias. Outros estudos sugerem que a função

imune alterada está relacionada ao surgimento de manifestações de doenças, como

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65  

os papilomas, isto por um declínio na resposta imune, devido à poluição, infecção

viral etc. (CRAY et al., 2001).

Segundo Cuchens e Clem (1979), estudos in vitro descrevem as propriedades

de estimulação dos leucócitos como similares entre peixes teleósteos, jacarés,

tartarugas marinhas e outros répteis. Estudos deste tipo auxiliam na interpretação

dos estudos imunológicos em cágados como o Phrynops geoffroanus.

Tartarugas marinhas sadias respondem vigorosamente a variados estímulos

linfocíticos in vitro quando comparadas com as respostas típicas dos mamíferos

(JURD, 1994; WORK et al., 2000), mas, em tartarugas doentes, essas células não

funcionam desse jeito quando comparadas com tartarugas mantidas em cativeiro.

Uma resposta imune alterada in vitro supõe uma disfunção imunológica in vivo

(CRAY et al., 2001). Segundo os resultados de burst oxidativo, poderia se pensar

que as condições de estresse crônico, como permanência em locais antropizados

(ribeirão Piracicamirim e rio Piracicaba) e confinamento prolongado (Fundação

Parque Zoológico de São Paulo), diminuem a capacidade dos animais, como o

Phrynops geoffroanus, de realizar funções celulares, como a explosão oxidativa de

espécies reativas de oxigênio, embora estudos como o realizado por Mateo, Roberts

e Enright (1984) demonstrem que heterófilos de répteis apresentam peroxidase e

fosfatase alcalina capacitando-os para realizar burst oxidativo.

Também é possível pensar que os estímulos aqui avaliados não foram os

indicados para esta espécie de réptil. Cray et al. (2001) e Rossi et al. (2007)

encontraram que o PMA foi um dos melhores para analisar função celular de

Chelonia mydas com fibropapiloma, porém nesse estudo isso não foi observado. O

fato dos leucócitos de Phrynops geoffroanus não reagirem a estímulos de burst

oxidativo pode ter ocorrido, especificamente, por não reconhecerem estes.

Rossi (2007), para estimular fagocitose, utilizou SAPI (Staphylococcus aureus

marcado com iodeto de propídeo), tendo resultado negativo. No início desse estudo,

2006, esse mesmo estímulo foi testado, obtendo os mesmos resultados. Segundo o

autor citado, este fato foi atribuído à falta de reconhecimento da bactéria por parte

do monócito de Chelonia mydas.

Pesquisas demonstram que existem espécies de um mesmo gênero que

podem apresentar diferentes estados imunológicos. Por exemplo, tem se visto que a

imunidade inata de anfíbios através da pele apresenta a capacidade para resistir ao

Batrachochytrium dendrobatidis pela produção de vários peptídeos antimicrobianos

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66  

e granulócitos circulantes, mas que essa capacidade é espécie dependente

(WOODHAMS et al., 2007a,b).

A interferência que o ambiente pode estar ocasionando no estado imune de

animais selvagens é um fato de preocupação para imunologistas e ecólogos, que

encontram no estudo das características fundamentais do sistema inato dos animais

uma resposta inicial e que entendem que o conhecimento dos fatores abióticos

sobre a biologia poderia estar influenciando a dinâmica parasita - hospedeiro na

ocorrência de doenças em populações de vida livre (FISHER, 2007; KURTZ;

SCHARSACK, 2007). Inclusive, a possibilidade de encontrar variação funcional nas

respostas imunes inatas abre a possibilidade de realizar futuras pesquisas que

reportem essas variações por linhagem, idade e ambiente (GARNER, 2007). Dessa

maneira é importante a realização de pesquisas que permitam melhor entendimento

da imunologia inata e adquirida deste grupo de répteis, como por exemplo, a

identificação das diversas populações de leucócitos e suas funções no sistema

imune através da criação de anticorpos monoclonais (SHARMA, 1998) que poderiam

ser avaliados através da CF numa fase posterior do trabalho.

Em pesquisas anteriores, a resposta imune foi estudada experimentalmente

em várias espécies de répteis. Evans et al.4 (1965 apud CRAY et al., 2001, p. 436)

estudaram a resposta de anticorpos induzida na presença de proteínas, antígenos

bacterianos, e vírus em Diposauras spp, Saurumalus obesus e Bufo marinus.

Segundo Coe (1972), tartarugas de água doce, como a Chryemys picta, têm dois

tipos de imunoglobulinas com uma série complexa de interações relacionadas à

duração de imunização, como com antígeno protéico. Wetherall e Turner 5 (1972

apud CRAY et al., 2001, p. 436) avaliaram a resposta imune secundária por estímulo

com Salmonella typhimurium e eritrócitos de roedores em Tiliqua rugosa. Styrt

(1989) encontrou diferenças entre o sistema imune de mamíferos à resposta da

vulnerabilidade de algumas espécies para enfrentar infecções ou para responder a

antibióticos. Estudos deste tipo, que caracterizam o sistema imunológico de

quelônios, como o Phrynops geoffroanus, são importantes para a conservação

                                                            4 EVANS, E. S. S.; KENT, M.; ATTLEBERGER, C.; SEIBERT, R.; BRYANT; B. BOOTH. Antibody synthesis in poikilothermic vertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. v. 126, p. 629– 646, 1965. 5 WETHERALL, J.; TURNER; K. Immune response of the lizard, Tiliqua rugosa. Australian Journal of Experimental Biology and Medicine Sciences, v. 50, p. 79–95, 1972.

Page 68: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

67  

destes répteis e para determinar o impacto de sistemas poluídos sobre populações

de vida livre.

5.2 HEMATOLOGIA

Por suas múltiplas características, o sangue constitui-se importante

ferramenta de avaliação do estado funcional do organismo animal. (RAMEH-DE-

ALBUQUERQUE, 2007), sendo que as informações hematológicas são utilizadas

para caracterizar condições que afetam o organismo, levando a mudanças

quantitativas ou qualitativas das células sangüíneas, como anemias, doenças

inflamatórias, parasitemias, desordens hematopoiéticas e alterações hemostáticas

(CAMPBELL; ELLIS, 2007). Os resultados dos testes estatísticos não encontraram

diferenças entre os três locais amostrais nos parâmetros hematológicos. Embora a

tabela 4 com a média, desvio padrão e amplitude de variação desses parâmetros

permitiram discutir o estado sanitário dos animais que tiveram seus leucócitos

sangüíneos avaliados pela citometria de fluxo.

É importante entender que existem outros fatores que podem estar alterando

de maneira direta ou indireta os resultados hematológicos e que puderam influenciar

os resultados neste estudo.

Os valores hematológicos variam dependendo da amostragem sangüínea,

manejo e técnicas de análise, condições sazonais do habitat, idade, gênero, estado

nutricional, uso de anestésicos, sitio da coleta, mudanças ambientais, incluindo a

temperatura e modificações segundo o gênero do animal (DUGUY, 1970;

ANDERSON; WACK, HATCHER, 1997; CAMPBELL; ELLIS 2007; WILKINSON,

2006; RAMEH-DE-ALBUQUERQUE, 2007). Além desses fatores Wilkinson (2006),

discute a possibilidade de se apresentar dificuldades para distinguir os diferentes

tipos celulares presentes em répteis, porém podem existir variações de

interpretação, dificultando a interpretação dos dados, sendo difícil distinguir se a

diferença foi por mudanças fisiológicas no paciente ou por critérios de identificação

celular.

As amostras sangüíneas aqui analisadas são dos animais avaliados pela

metodologia D zero (n=14) e como dito na coleta de sangue, as amostras foram

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coletadas uma única vez em cada animal. Os animais capturados de vida livre nos

dois cursos de água poluída em Piracicaba foram mantidos em cativeiro durante o

experimento, igual situação aconteceu na Fundação Parque Zoológico de São Paulo

o que poderia influenciar os resultados hematológicos. As alterações hematológicas

em répteis mantidos em cativeiro podem ser diminuição na contagem total de

leucócitos (AGUIRRE et al., 1995) ou aumento no número de heterófilos

(ALMOSNY; MONTEIRO, 2006).

5.2.1 Hematócrito

Os valores de hematócrito obtidos nos três sítios são muito semelhantes

(Tabela 4). Estes valores podem representar anemia quando inferiores a 20% e,

quando maior a 40%, hemoconcentração ou eritrocitose (policitemia) (THRALL et al.,

2004), sendo que nenhuma das duas condições foi apresentada nos animais desse

estudo.

Os resultados observados podem ser considerados normais para animais

sadios; segundo Frye (1991); Marks e Citino (1990) e Wallach e Boever (1983), o

hematócrito em répteis tem uma faixa entre 20 a 40%.

5.2.2 Proteína Plasmática Total

Os valores de proteína plasmática nos três locais amostrais (Tabela 4)

encontram-se dentro da faixa esperada, 3 a 8 g/dL para répteis (FRYE, 1991).

A diferença de valores entre os animais do Zoológico e os de Piracicaba

poderia ser explicado por sua dieta. Souza e Abe (2000) descrevem a dieta de

Phrynops geoffroanus que habitam o Ribeirão Preto com predomínio de larvas de

Chironomidae, que é pouco significativa em proteínas quando comparada à dieta

Page 70: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

69  

dos cágados da Fundação Parque Zoológico de São Paulo que segundo Lisboa 6(2007) é baseada em peixe e carne moída [...] (informação verbal).

5.2.3 Hemoglobina

Segundo Sypek e Borysenko (1988), a concentração de hemoglobina na

maioria das espécies dos répteis está entre 6 e 12 g/dL. Os cágados dos três locais

apresentaram valores inferiores aos reportados na literatura (Tabela 4). Brites

(2002), no seu trabalho de Phrynops geoffroanus, obteve a amplitude de variação

mais baixa de hemoglobina (4,50 a 10,00 g/dL) para machos expostos à influência

urbana no rio Uberabinha. Troiano e Silva (1998), trabalhando com Chelonoidis

chilensis chilensis, encontraram que a hemoglobina podia ser 10±1,54 g/dL para

machos e 10,4±1,49 g/dL para fêmeas. Anderson, Wack e Hatcher (1997), com

indivíduos de Elseya novaeguineae em cativeiro, encontraram médias de 8,2 e 10,0

g/dL para fêmeas e machos, respectivamente. Marks e Citino (1990) pesquisaram

esse parâmetro em Testudo radiata que estiveram por um período prolongado em

cativeiro, obtendo um valor de 6,7 ± 1.5 g/L.

5.2.4 Contagem Total de Eritrócitos

Como já observado na tabela 4, a contagem de eritrócitos foi maior em

animais do rio Piracicaba em relação ao ribeirão Piracicamirim e Zoológico de São

Paulo.

Segundo Sypek e Borysenko (1988), a concentração de hemoglobina no

sangue dos répteis corresponde a 25-32% do peso total do conteúdo sólido dos

eritrócitos, e esta concentração tem uma correlação direta com o volume globular ou

hematócrito. Um aumento no hematócrito corresponderia a um incremento na

concentração de hemoglobina; essa correlação foi confirmada neste trabalho, em

                                                            6 Informação fornecida por LISBOA, C. S. Bióloga responsável pelo Setor de Répteis da Fundação Parque Zoológico de São Paulo em São Paulo, em 2007.

Page 71: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

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que a concentração de hemoglobina mais alta (6,48 ± 1,68 g dL-1) correspondeu aos

animais do rio Piracicaba, que tiveram a maior porcentagem de hematócrito (23,80 ±

4,27 %); e a menor concentração de hemoglobina (4,60 ± 0,66 g dL-1) foi registrada

pelos animais do ribeirão Piracicamirim, com média de hematócrito mais baixa

(18,33 ± 3,79 %) dos três locais amostrais.

5.2.5 Contagem Total de Leucócitos

A contagem total de leucócitos sangüíneos dos cágados do Zoológico de São

Paulo (4,92 ± 1,50 x103 mm-3) foi muito baixa em relação às contagens dos rios de

Piracicaba (23,17 ± 27,15 x103 mm-3 no ribeirão Piracicamirim e 21,90 ± 19,69 x103

mm-3 no rio Piracicaba). Embora existam pesquisas com tartarugas de água doce,

Clemmys muhlenbergii, mantidas em cativeiro que reportam uma maior quantidade

de leucócitos quando comparada a animais de vida livre, machos de cativeiro: 12,5

x103mm-3 contra 7 x103mm-3 de machos de vida livre (BRENNER et al., 2002). Na

Elseya novaeguinae, Anderson; Wack e Hatcher (1997) também encontraram

valores maiores na contagem leucocitária, 11,3 x103mm-3. Porém, em tartarugas

marinhas de vida livre, Deem et al. (2006) encontraram que Dermochelys coriacea

tem em média 5,9 x103 mm-3 e para Chelonia mydas, Work e Balazs (1999) com

fibropapilomatose os valores se incrementam para 11,89 ± 0,80 x103mm-3`. Em

geral; os estudos relatam uma grande variabilidade deste parâmetro hematológico,

que permite inserir dentro da normalidade os resultados encontrados nesta

pesquisa.

5.2.6 Eosinófilos

A contagem de eosinófilos de Phrynops geoffroanus do Zoológico de São

Paulo (0,64 ± 0,67 x103 mm-3) foi menor em relação à contagem dos animais de vida

livre em Piracicaba (1,77 ± 2,26 x103 mm-3, ribeirão Piracicamirim e 4,36 ± 6,67 x103

mm-3, rio Piracicaba).

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O número de eosinófilos nos répteis pode variar como decorrência da reposta

a uma variedade de parasitas, ao ambiente (sazonalidade) e a estímulos não

específicos (DUGUY, 1970; WOLKE; BROOKS; GEORGE, 1982; BURKE;

RODGERS, 1982; MONTALI, 1988;). A eosinofilia pode ser associada às infecções

parasitárias ou estimulação do sistema imune (MEAD; BORYSENKO, 1984a).

Embora o estado clínico dos animais não pareça estar associado a nenhuma

infecção do tipo parasitária, nessa pesquisa, o aumento no número de eosinófilos

poderia estar associado à presença de parasitas nos animais do ribeirão e rio em

Piracicaba. Brites (2002) reportou a ocorrência de larvas de helmintos e ovos de

trematóides em necropsias de Phrynops geoffroanus que habitam córregos de rios

sob influência urbana. No zoológico, tratamento com antiparasitários poderia estar

diminuindo a carga parasitária e, assim, o valor quantitativo dos eosinófilos. Nesse

estudo, não foi realizada necropsias ou exames coproparasitológicos que pudessem

confirmar a ocorrência de endoparasitos.

5.2.7 Heterófilos

Os heterófilos presentes nos cágados do ribeirão Piracicamirim e do rio

Piracicaba, em geral, apresentaram valores mais altos, 15,17 ± 19,90 e 7,34 ± 8,23

x103 mm-3 respectivamente quando comparados com a Fundação Parque Zoológico

de São Paulo, 1,49 ± 0,59 x103 mm-3.

Embora apresentem diferenças no nível bioquímico, os heterófilos de répteis

aparentemente funcionam como os neutrófilos de mamíferos. Segundo Mateo,

Roberts e Enright (1984) o heterófilo de répteis está preparado para realizar a

fagocitose. Os heterófilos são o tipo celular predominante que reage em

experimentos que induzem inflamação e parecem ter um papel importante na

supressão microbiana (MONTALI, 1988). Participam nas respostas inflamatórias

associadas às infecções microbiais, doenças parasitárias e inflamação não

específica (JACOBSON; CLUBB; GREINER, 1983; SYPEK; BORYSENKO, 1988).

Nenhum dos 14 Phrynops geoffroanus utilizados para avaliação através da

citometria de fluxo junto com sua hematologia apresentou sintomatologia compatível

com doença infecciosa, assim os resultados dos três locais amostrais parecem estar

Page 73: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

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dentro dos níveis esperados. Segundo Campbell (1996), os heterófilos de répteis

sadios podem representar mais de 40% da contagem diferencial dos leucócitos.

Essa porcentagem relativa correspondeu a 56,33 ± 12,34% no ribeirão

Piracicamirim, 38,80 ± 22,48% no rio Piracicaba e 30,17 ± 7,49% para o Zoológico

de São Paulo (essas porcentagens podem ser conferidas no apêndice F).

Assim, este grupo celular foi o mais representativo da contagem diferencial de

leucócitos sangüíneos de Phrynops geoffroanus. Conforme os resultados obtidos

quanto ao tamanho celular e granulosidade/complexidade relativas (item 4.1.2.1) e

funcionalidade dos estímulos (item 4.2.1), existe a possibilidade de que os

heterófilos corresponderiam às células do G2 dos citogramas e que a intensidade de

fluorescência registrada pelo citômetro seria Saccharomyces cerevisiae Bio

Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate fagocitado por essas células.

5.2.8 Basófilos

Os resultados em média dos três locais amostrais não superaram 1,66 x103

mm-3 de basófilos do rio Piracicaba e são muito próximos. Em algumas espécies de

tartarugas, os basófilos compreendem entre 0 e 50% da contagem total de

leucócitos (MEAD et al., 1983; MARKS; CITINO, 1990; WRIGHT; SKEBA,1992). Os

resultados encontrados por Brites (2002) em Phrynops geoffroanus reportam uma

porcentagem média que não superou a 1,17 ± 0,72 % e Troiano e Silva (1998)

encontraram uma porcentagem de 1 ± 0,8% para os machos e 2 ± 0,2% as fêmeas

de Chelonoidis chilensis chilensis, resultados muito baixos quando comparados às

porcentagens dos três locais amostrais aqui estudados, 7,00 ± 4,58% no ribeirão

Piracicamirim, 8,60 ± 2,51% para o rio Piracicaba e 15,83 ± 9,77% na Fundação

Parque Zoológico de São Paulo (apêndice F). Segundo Sypik e Borysenko (1988),

um aumento no número de basófilos, basofilia, está relacionado com infecção

parasitária ou viral, fato que não aconteceu com este tipo celular nesta pesquisa.

Page 74: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

73  

5.2.9 Monócitos

Nos três locais amostrais o número de monócitos absoluto em média não

superaram 1,00 x103 mm-3 (Tabela 4), e suas porcentagens relativas em média não

foram acima de 5,00 ± 2,00% (apêndice F). Na contagem diferencial de leucócitos,

resultados baixos entre 0 e 10% de monócitos são normais (DUGUY, 1970; SYPEK;

BORYSENKO, 1988; MARKS; CITINO, 1990). Brites (2002) reportou para Phrynops

geoffroanus do rio Uberlândia uma porcentagem de 1,5%. Outros estudos

apresentam valores médios de 0,51 x103 mm-3 em Terrapene carolina carolina com

Phaeohyphomycose (JOYNER et al., 2006) de 0,3 x103 mm-3 em Clemmys

muhlenbergii (BRENNER et al., 2002). Os monócitos apresentam-se numericamente

aumentados em respostas granulomatosas por infecções bacterianas e por

trematódeos (BURKE; RODGERS, 1982; WOLKE; BROOKS; GEORGE, 1982;

JACOBSON; CLUBB; GREINER, 1983).

5.2.10 Linfócitos

Os resultados em média do Zoológico de São Paulo (1,93 ± 1,05 x103 mm-3)

apresentaram inferiores aos animais de vida livre. Em tartarugas de água doce,

como a espécie Clemmys muhlenbergii (BRENNER et al., 2002), os valores nos

machos, 8,2 x103mm-3, foi similar ao obtido pelos cágados do rio Piracicaba (7,85 ±

8,95 x103mm-3); e o valor médio nas fêmeas 3,5 x103mm-3 similar ao valor dos

animais do ribeirão Piracicamirim (4,57 ± 4,11 x103mm-3). Em algumas espécies de

répteis, os linfócitos representam cerca de 80% dos leucócitos (SYPEK;

BORYSENKO, 1988). Esta porcentagem relativa foi, em geral, a mais alta quando

comparada com os demais grupos celulares, como pode ser visto no apêndice F as

porcentagens foram, 25,00 ± 8,00% no ribeirão Piracicamirim, 32,60 ± 7,50% para o

rio Piracicaba e 37,33 ± 10,17% para os animais do Zoológico de São Paulo. Seu

aumento, linfocitose, decorre de processos inflamatórios, reparo de feridas, infecção

parasitária (espironchidiase, anasakiase e hematozoa) e doença viral (CAMPBELL,

1996). Em estudos similares, como o realizado por Brites (2002), os animais

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apresentam resultados porcentuais entre 38,50 ± 4,40 e 41,25 ± 5.18, próximos aos

aqui descritos.

É possível que, os achados imunológicos de leucócitos obtidos através da CF

possam complementar a informação hematológica das populações encontradas nos

gates.

Em pesquisas anteriores de Cuchens e Clem (1979); El Deeb e Saad (1987);

Manickasundari e Negm e Mansour (1983) é demonstrado a tendência geral à

aceitação de que entre os répteis e anfíbios existam pelo menos duas

subpopulações de linfócitos, células tipo T e B. Work et al. (2000) em seu trabalho

com Chelonia mydas sugere que o estado funcional destas populações linfocíticas

poderia ser estabelecido através de estudos imunológicos.

Segundo os resultados nos citogramas da CF aqui testada, um dos grupos

celulares encontrados apresentou tamanho celular relativo e

granulosidade/complexidade relativas pequenas (G1) que poderiam ser comparadas

com as de um linfócito. As células B e T são reconhecedoras de antígenos que

utilizam moléculas de identificação (JANEWAY, 2007). Poderia se pensar, conforme

os resultados de intensidade de fluorescência que, o material fluorescente nessas

células não foi fagocitado porém identificado pelas moléculas de superfície

leucocitária; isto poderia explicar também, as intensidades de fluorescência baixa de

G1 quando comparado com G2 (gráfico 3). Tais afirmações poderão ser confirmadas

quando da realização do sorting celular com CF.

5.2.11 Trombócitos

Os trombócitos dos animais oriundos de Piracicaba (ribeirão Piracicamirim

12,48 ± 4,34 x103 mm-3 e 12,62 ± 9,22 x103 mm-3 do rio Piracicaba) tiveram média

de valores absolutos muitos próximos, superando os valores do Zoológico (7,99 ±

6,06 x103 mm-3). Os trombócitos participam significativamente na formação de

trombos (CAMPBELL, 1996; THRALL et al., 2004), quando do aumento de seu

número, trombocitopenia, existe uma excessiva utilização periférica e há um declínio

na produção. Nos casos de doenças inflamatórias severa, ocorre a trombocitose

(THRALL et al., 2004). O valor normal de trombócitos em répteis ainda apresenta

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divergência na sua metodologia de contagem, o que torna difícil sua comparação. O

estado de saúde dos animais aqui avaliados (clinicamente sadios) corresponderia a

ter valores normais quanto ao número de trombócitos.

5.2.12 Índices Hematimétricos

Como já apresentado na tabela 4, o VCM foi maior nos animais oriundos d a

Fundação Parque Zoológico de São Paulo do que nos locais amostrais em

Piracicaba. O CHCM foi praticamente similar para os três grupos amostrais. Os

animais do Zoológico apresentaram valores maiores do que os oriundos de

Piracicaba para o HCM. Esses índices têm como foco a classificação morfológica de

anemias ao relacionar volume eritrocitário e sua concentração de hemoglobina

(THRALL et al., 2004).

As anemias oriundas de hemorragias podem resultar de injúrias,

hemoparasitoses, coagulopatias ou lesões ulcerativas. Anemia hemolítica pode ser

originada por septicemia, parasitemias ou toxemia. A depleção anêmica tem suas

causas em doenças inflamatórias crônicas associadas a agentes infecciosos

(THRALL et al., 2004). Os índices eritrocitários aqui avaliados não sugerem anemia

e nem os animais apresentaram sintomatologia compatível à acima descrita.

5.2.13 Índice de Estresse

O índice mais alto da relação heterófilo:linfócito foi para o ribeirão

Piracicamirim com 2,54 ± 1,41 (1,39-4,12) ,seguido pelo rio Piracicaba 1,17 ± 0,76

(0,00-1,96) e por último o Zoológico de São Paulo com 0,85 ± 0,28 (0.49-1,15).

Na pesquisa de Ferronato (2008) com esta mesma espécie os índices de

estresse apresentaram um comportamento diferente, tendo resultados menores no

rio Piracicaba, fêmeas: 0,85± 0,66 (0,14-2,5) e machos: 0,91± 0,54 (0,10-2,6) e

ribeirão Piracicamirim, fêmeas: 1,52± 1,41 (0,18-5,3) e machos 0,94± 1,01 (0,09-4,6)

e maiores para a Fundação Parque Zoológico de São Paulo, 1,97± 1,30 (0,32-4,4).

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76  

Segundo o autor citado a razão H:L dos animais da Fundação Parque Zoológico de

poderia ser um indicativo de que o cativeiro estaria agindo como um fator de

estresse.

Diferenças quanto ao número de indivíduos amostrados (maior na pesquisa

de Ferronato) e as condições distintas de processamento das amostras analisadas

neste trabalho poderiam explicar a diferença no resultado da razão H:L.

Agentes estressores agudos, como a captura, manipulação e venipunctura,

podem não ter ações equivalentes aos estressores crônicos, como ambiente e

nutrição inadequados (WILKINSON, 2006). Segundo Lutzv e Dunbar-Cooper (1987

apud WILKINSON, 2006), em tartarugas marinhas estressadas por captura, os

valores do hematócrito aumentam pós-captura, mas retornam ao normal após

algumas horas, isto é possível porque esses animais apresentam habilidade para

liberar ou seqüestrar hemácias em resposta ao estímulo. Carey (1993) considera

que estressores ambientais primários, como a poluição, podem suprimir o sistema

imune.

Poderia se supor que em nossos animais existiu um breve incremento da

relação H:L após captura, manipulação e coleta de amostras e que posteriormente

haveria a estabilização dessa relação com o decorrer do tempo. Embora os

resultados em nosso trabalho demonstrem que cursos d’água poluídos, como o

ribeirão Piracicamirim, nos quais habitam Phrynops geoffroanus, possa agir como

um agente estressor crônico levando a uma baixa na imunidade do animal refletida

no aumento da relação heterófilo : linfócito. Esse aumento observado nos animais do

ribeirão Piracicamirim poderia ser explicado pelo fato de habitarem em um local com

condições hidrodinâmicas e ambientais que aumentariam o tempo de contato com

possíveis substâncias poluidoras. O ribeirão Piracicamirim é um efluente do rio

Piracicaba com menor volume de água (OMETO et al. 2000), além disso, desde

1985 é considerado o mais poluído afluente do Rio Piracicaba (FERRONATO, 2008).

Em 1997 a construção da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) Piracicamirim,

permitiria a diminuição da poluição do córrego, mas autores como Ballester et al.

(1999) e ECOAR (2007) consideram o corpo d’água ainda poluído.

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77  

6 CONCLUSÃO

A metodologia para avaliar a função celular de leucócitos sangüíneos de

Phrynops geoffroanus foi definida estabelecendo-se técnica de isolamento que

requer a utilização de RPMI Gibco® como meio de transporte, de centrifugação com

condições controladas de temperatura, tempo, aceleração e desaceleração e Ficoll

PaqueMT PLUS como agente separador de leucócitos e eritrócitos. Além disso,

observou-se que o Saccharomyces cerevisiae é um estímulo adequado para

mensurar fagocitose.

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78  

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Populações de quelônios de vida livre, submetidos a ações antrópicas –

degradação de habitats, poluição ambiental podem estar apresentado alterações

metabólicas ou sub-clínicas que seriam difíceis de serem detectadas por uma

simples avaliação clínica ou através da análise hematológica; em função disso a

utilização da Citometria de Fluxo abre uma possibilidade da realização de um

diagnóstico mais específico e sensível, e pouco utilizado para animais silvestres.

A determinação de uma metodologia que permita a avaliação da função

celular poderá servir como instrumento de monitoramento ambiental que auxiliará no

delineamento de estratégias visando a Conservação de quelônios de vida livre;

permitindo uma melhor compreensão dos efeitos estressores ambientais sobre essa

população animal.

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79  

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97  

APÊNDICES

APÊNDICE A – Amostras viáveis e inviáveis classificadas em função das porcentagens de viabilidade

obtidas através da correlação entre o número de células viáveis e inviáveis, das amostras processadas com metodologia Ficoll – Desaceleração quatro – São Paulo – jun.-out. 2006

Tipo

Viabilidade N Data Local Amostra Células Viáveis

Células Inviáveis

Porcentagem Viabilidade

1 14/06/06 Piracicamirim Pisca 71 73 5 93,59 2 04/07/06 Piracicamirim Pisca 75 140 2 98,59 3 Piracicamirim Pisca 76 108 5 95,58 4 Piracicamirim Pisca 78 520 12 97,74 5 Piracicamirim Pisca 81 92 2 97,87 6 12/07/06 FPZSP FPZSP1 76 3 96,20 7 FPZSP FPZSP3 35 1 97,22 8 Piracicamirim Pisca 268 59 3 95,16 9 23/08/06 Piracicaba 116 86 - 100,00

10 Piracicaba 117 658 10 98,50 11 Piracicaba 118 547 12 97,85 12 13/09/06 Piracicaba 131 31 - 100,00 13 Piracicaba 132 84 - 100,00 14 Piracicaba 145 57 1 98,28 15 27/09/06 Piracicaba 153 24 1 96,00 16 Piracicaba 157 15 - 100,00 17 Piracicaba 158 12 - 100,00 18 FPZSP FPZSP5 45 - 100,00 19 FPZSP FPZSP6 153 4 97,45 20 FPZSP FPZSP7 54 - 100,00 21 18/10/06 Piracicamirim Pisca 179 98 - 100,00 22 Piracicamirim Pisca 181 99 - 100,00 23 Piracicamirim Pisca 182 156 - 100,00

Viáveis

24 FPZSP FPZSP10 218 - 100,00 1 17/05/06 Piracicamirim Pisca 50 14 2 87,50 2 Piracicamirim Pisca 51* - - - 3 Piracicamirim Pisca 52* - - - 4 14/06/06 Piracicamirim Pisca 72 9 2 81,82 5 27/06/06 Piracicamirim Pisca 73 8 2 80,00 6 Piracicamirim Pisca 9 43 14 75,44 7 04/07/06 Piracicamirim Pisca 78 0 0 0,00 8 12/07/06 FPZSP FPZSP2 10 5 66,67 9 Piracicamirim Pisca 83 5 1 83,33

10 16/08/06 Piracicamirim Pisca 96 0 7 0,00 11 Piracicamirim Pisca 98 0 5 0,00

Inviáveis

12 Piracicamirim Pisca 99 - - -  

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98  

APÊNDICE A – Amostras viáveis e inviáveis classificadas em função das porcentagens de viabilidade obtidas através da correlação entre o número de células viáveis e inviáveis, das amostras processadas com metodologia Ficoll – Desaceleração quatro – São Paulo – jun.-out. 2006

 

 

Tipo Viabilidade N Data Local Amostra Células

Viáveis Células Inviáveis

Porcentagem Viabilidade

13 Piracicamirim Pisca 100 - - - 14 Piracicamirim Pisca 105 - - - 15 Piracicaba 129* - - - 16 Piracicaba 131* - - - 17 Piracicaba 143* - - -

18 18/10/06 FPZSP FPZSP9 4 1 80,00 Nota: * Amostras que não formaram anel Nota: Piracicamirim: ribeirão Piracicamirim; Piracicaba: rio Piracicaba; FPZSP: Fundação Parque

Zoológico de São Paulo

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APÊNDICE B – Amostras viáveis e inviáveis classificadas em função das porcentagens de viabilidade

obtidas da correlação entre o número de células viáveis e inviáveis, das amostras processadas com metodologia Ficoll – Desaceleração zero – São Paulo – nov.-ago. 2007

n Data Local Amostra Células Viáveis

Células Inviáveis

Porcentagem Viabilidade

1 15/11/06 FPZSP FPZSP6 132 1 99,25 2 29/11/06 FPZSP FPZSP5 138 3 97,87 3 FPZSP FPZSP10 81 1 98,78 4 11/04/07 Piracicamirim Pisca 279 110 10 91,67 5 FPZSP FPZSP6 247 5 98,02 6 18/04/07 Piracicaba 280 15 1 93,75 7 FPZSP FPZSP3 298 13 95,82 8 FPZSP FPZSP11 69 7 90,79 9 26/04/07 Piracicaba 282 360 36 90,91 10 Piracicaba 283 114 4 96,61 11 09/05/07 Piracicamirim Pisca 288 75 6 92,59 12 17/05/07 Piracicaba 296 94 0 100,00 13 Piracicaba 299 584 2 99,66 14 14/07/07 Piracicamirim Pisca 127 195 15 92,86 15 Piracicaba 304 22 2 91,67 16 22/08/07 Piracicamirim Pisca 127 38 4 90,48 17 Piracicamirim Pisca 308 48 3 94,12 18 Piracicaba 304 160 0 100,00 19 Piracicaba 315 302 3 99,02 20 29/08/07 FPZSP FPZSP4 48 2 96,00 21 FPZSP FPZSP6 102 0 100,00 22 FPZSP FPZSP9 19 0 114,00 23 08/11/06 FPZSP FPZSP9 196 1 99,49 24 FPZSP FPZSP11 95 0 100,00

Viáveis

25 15/11/06 FPZSP FPZSP10 113 1 99,12 1 18/04/07 Piracicaba 281 26 6 81,25 2 22/08/07 Piracicaba 316 29 4 87,88 Inviáveis 3 29/08/07 FPZSP FPZSP10 64 9 87,67

Nota: * Amostras que não foram processadas com três densidades de FPP (1,085; 1,070 e 1,055

g/mL) Nota: FPZSP: Fundação Parque Zoológico de São Paulo, Piracicamirim: Ribeirão Piracicamirim,

Piracicaba: Rio Piracicaba

Page 101: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

100  

APÊNDICE C – Resultados da aquisição dos eventos, sem estímulo (célula) e quando foi induzida a

fagocitose com Saccharomyces cerevisiae Bio Particles®, Alexa Fluor® 594 conjugate (Zymosan A), no G1 e G2, dos Phrynops geoffroanus capturados no ribeirão Piracicamirim, rio Piracicaba e Fundação Parque Zoológico de São Paulo, que foram avaliados pela metodologia Desaceleração zero – São Paulo – 2007

CÉLULA  Zymosan A LOCAL  IDENTIFICAÇÃO

G1  G2  G1  G2 

Pisca 279 18,02 18,17 386,66 720,48

Pisca 288 16,44 17,18 321,80 643,68 Ribeirão Piracicamirim

Pisca 308 18,27 0,00 21,63 66,33

280 12,68 11,86 12,61 13,72

282 16,09 17,54 190,99 349,74

283 23,17 0,00 176,30 436,02

296 22,98 0,00 53,81 634,94

Rio Piracicaba

299 18,28 12,24 297,28 694,65

ZSP5 17,94 18,03 332,86 492,08

ZSP10 90,04 18,88 365,32 123,71

ZSP 3 20,26 15,61 184,35 459,86

ZSP4 12,43 13,06 289,76 536,40

ZSP6 14,14 31,51 290,93 508,15

Fundação

Parque

Zoológico de

São Paulo

ZSP9 58,29 58,29 416,97 743,32

Nota: O valor apresentado corresponde à média geométrica da intensidade de fluorescência de cada

gate

Page 102: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

101  

APÊNDICE D – Resultados da aquisição dos eventos no burst oxidativo espontâneo (DCFH),

induzido por PMA (DCFH+PMA) e induzido por Saccharomyces cerevisiae, Zymosan (DCFH+ZYM) no G1 e G2, dos Phrynops geoffroanus capturados no ribeirão Piracicamirim, rio Piracicaba e Fundação Parque Zoológico de São Paulo, que foram avaliados pela metodologia Desaceleração zero – São Paulo – 2007

DCFH DCFH + PMA DCFH + Zym LOCAL IDENTIFICAÇÃO

G1 G2 G1 G2 G1 G2

Pisca 279 84,52 1465,92 96,32 1525,84 104,76 1506,63

Pisca 288 1,11 7,10 1,43 4,85 1,21 5,21 Ribeirão Piracicamirim

Pisca 308 1,79 127,28 3,19 90,87 2,12 117,70

280 13,13 51,72 30,73 291,39 12,47 60,31

282 1,44 39,24 2,04 44,74 1,94 48,38

283 1,52 71,23 3,30 111,02 1,52 56,68

296 4,35 129,54 4,37 136,48 5,31 136,14

Rio Piracicaba

299 3,21 58,09 4,15 71,04 4,15 42,84

FPZSP5 1,71 30,86 2,66 32,35 1,63 30,29

FPZSP10 4,53 38,07 4,03 35,30 4,48 33,04

FPZSP 3 1,80 30,31 2,25 28,43 1,78 18,03

FPZSP4 3,55 59,39 2,88 38,11 7,11 68,81

FPZSP6 3,94 50,04 4,49 21,79 3,80 8,03

Fundação

Parque

Zoológico de

São Paulo

FPZSP9 3,88 42,65 7,00 31,34 3,80 58,74

Nota: O valor apresentado corresponde à média geométrica da intensidade de fluorescência de cada

gate

Page 103: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

102  

APÊNDICE E – Perfil hematológico, identificação, sexo e data de processamento de das amostras de Phrynops geoffroanus processadas com Ficoll –

Desaceleração zero – São Paulo – abr,-ago, 2007

Hematócrito Proteína Plasmática Hemoglobina Eritrócitos Leucócitos Eosinófilos

Absolutos Heterófilos Absolutos

Basófilos Absolutos

Monócitos Absolutos

Linfócitos Absolutos Trombócitos VCM CHCM HCM

Identificação Sexo Data Processamento

% g/dL g/dL 103 mm -3 103 mm -3 103 mm -3 103 mm -3 103 mm -3 103 mm -3 103 mm -3 103 mm -3 fL g/dL pg

Pisca 279 F 11/04/07 14 4,4 3,9 220 6,50 0,26 3,45 0,72 0,46 1,63 8,58 636,36 27,86 177,27

Pisca 288 M 09/05/07 21 6,2 5,2 450 54,50 4,36 38,15 1,09 1,64 9,27 11,70 466,67 24,76 115,56

Pisca 308 M 22/08/07 20 6,2 4,7 520 8,50 0,68 3,91 0,68 0,43 2,81 17,16 384,62 23,50 90,38

280 F 18/04/07 20 6,0 5,2 360 9,50 0,67 5,23 0,86 0,10 2,66 4,32 555,56 26,00 144,44

282 M 26/04/07 28 7,2 8,8 340 8,00 0,08 3,92 0,72 0,01 2,48 10,54 823,53 31,43 258,82

283 M 26/04/07 19 6,0 4,6 340 25,00 15,75 0,00 3,00 0,25 6,00 4,42 558,82 24,21 135,29

296 F 17/05/07 24 6,6 6,4 350 12,00 0,36 6,12 0,96 0,12 4,44 18,20 685,71 26,67 182,86

299 M 17/05/07 28 6,8 7,3 800 55,00 4,95 21,45 2,75 2,20 23,65 25,60 350,00 26,07 91,25

FPZSP5 M 29/11/06 18 5,4 3,8 180 7,00 0,49 1,75 0,91 0,28 3,57 5,22 1000,00 21,11 211,11

FPZSP10 M 29/11/06 26 9,0 5,9 300 4,00 0,12 1,52 0,40 0,48 1,48 6,30 866,67 22,69 196,67

FPZSP 3 M 18/04/07 20 7,4 5,9 740 4,00 0,92 0,72 1,04 0 1,32 11,84 270,27 29,50 79,73

FPZSP4 M 29/08/07 27 11,0 6,9 80 5,50 1,87 1,65 0,55 0 1,43 2,56 3375,00 25,56 862,50

FPZSP6 M 29/08/07 18 7,4 4,8 410 6,00 0,24 2,34 0,36 0,18 2,88 18,45 439,02 26,67 117,07

FPZSP9 M 29/08/07 29 5,6 7,3 170 3,00 0,21 0,93 0,90 0,09 0,87 3,57 1705,88 25,17 429,41

Nota: Pisca: ribeirão Piracicamirim; Só número: rio Piracicaba; FPZSP: Fundação Parque Zoológico de São Paulo

Page 104: Citometria de fluxo de leucócitos sangüíneos de Phrynops ......Figura 11 – Citogramas da fagocitose de amostras dos diferentes locais amostrais com metodologia que utilizou FPP

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APÊNDICE F – Valores relativos de leucócitos sangüíneos de Phrynops geoffroanus dos três locais

amostrais, que foram processados com a metodologia de Ficoll – Desaceleração zero, Média, desvio padrão, amplitude de variação (entre parênteses) – São Paulo – 2007

Parâmetro Ribeirão Piracicamirim Rio Piracicaba Zoológico de São Paulo

(n=3) (n=5) (n=6)

6,67 ± 2,31 16,60 ± 26,13 13,00 ± 12,60 Eosinófilos %

(4,00 - 8,00) (1,00 - 63,00) (3,00 - 34,00)

56,33 ± 12,34 38,80 ± 22,48 30,17 ± 7,49 Heterófilos %

(46,00 - 70,00) (0,00 - 55,00) (18,00 - 39,00)

7,00 ± 4,58 8,60 ± 2,51 15,83 ± 9,77 Basófilos %

(2,00 - 11,00) (5,00 -12,00) (6,00 - 30,00)

5,00 ± 2,00 3,40 ± 3,91 3,67 ± 4,41 Monócitos %

(3,00 - 7,00) (1,00 - 10,00) (0,00 - 12,00)

25,00 ± 8,00 32,60 ± 7,50 37,33 ± 10,17 Linfócitos %

(17,00 - 33,00) (24,00 - 43,00) (26,00 - 52,00)


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