O que é Cromatografia ?
Definição:
A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária.
A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenômeno de migração diferencial .
O que é Cromatografia a Líquido HPLC?
Definição:
Na técnica de cromatografia a líquido a fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido .
O processo cromatográfico acontece na fase líquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.
CLAE -HPLC
Fase móvel
(amostra)
Fase estacionária
(Componentes retidos)
Migrações diferenciais
Analitomov ⇋ Analitoest
K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partição
INSTRUMENTAÇÃO
pumpinjector
column
oven
detector
One pump used to control 4 reservoirs; mixing is donebefore pump.
MIXER
data processor
Fase móvel
Componentes de um Cromatógrafo a Líquido HPLC
Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes principais :
Injetor : É o dispositivo que tem a função de introduzir a
amostra na fase móvel ;
Coluna cromatografia : É o dispositivo que tem a função de separar os
componentes da amostra ;
Detector :É o dispositivo que tem a função de detectar os
componentes eluídos da coluna cromatográficas
Componentes auxiliares de um HPLC
Bomba :
É o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );
É composta de um ou mais pistão acoplados a um sistema de válvulas.
Fornece uma alta pressão.
BOMBABOMBA
- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário
- Mede a pressão sobre o sistema
- Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)
Componentes auxiliares de um HPLC
Válvula de purga:
É o dispositivo que permite a troca rápida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno.
Misturador:
É o dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluição .
Colunas Cromatográficas
Fases estacionárias :
Sílica- C8
Sílica- C18
Sílica- C18 ( ODS)
Sílica- NH2
Sílica- Diol
Sílica
Troca Iônica
Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca
Resinas DVB-ST porosas
Pré-Coluna:
É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica .
Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.
SÍLICA (suporte + usado):
- Resistência mecânica- Variedade de forma, tamanho de partículas e poros
- Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas - Superfície não homogênea
COLUNAS CROMATOGRÁFICASCOLUNAS CROMATOGRÁFICAS
Si
OH
SiHO OH
Si
OH
Si
OH
SÍLICA – GRUPOS SILANÓISSÍLICA – GRUPOS SILANÓIS
LIVRES GEMINAL VICINAIS
influenciam no grau de acidez da sílica
Fase Estacionária
A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica.
São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas.
Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.
RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS
-RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA
- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS
- Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte)
• Poli(etileno)• Poli(butadieno)• Poli(estireno)• Poli(dimetilsiloxano)• Poli(metiloctilsiloxano)• Poli(metiloctadecilsiloxano)• Poliéteres• Polissacarídeos• Poliaminas• Polinucleotídeos• Poliamidas• Proteínas
SílicaZircôniaTitâniaAlumina
PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)
INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO
INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fases estacionárias Interações
CN
NH2
2OH
Dipolo/Dipolo
OH
Si NH
H
OSi
OH
OOH
H
SiN
OH
C
Ligação de hidrogênio
Ligação de hidrogênio
Fase Estacionária
PRS
CBA
SAX
Eletrostática
Eletrostática
Eletrostática
H3+N
SO3-Si
Si
H3+N
O-
O
N+(CH3)3Si
-O3S
Fases estacionárias
Interações
Fase Estacionária
Processo de Eluição
Definição:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária.
Série eluotrópica
Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
Força eluente:
É uma medida da energia de adsorção do solvente
Cromatografia com fase normal:
Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar.
Cromatografia com fase reversa:
Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar.
DETECTORES - Classificação
UNIVERSAIS:Geram sinal para qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:Detectam apenas substânciascom determinada propriedade
físico-química.
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito
É mais comum, usado na CLAE.
Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta.
São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes.
Detectores Detectores Ultra violeta:Ultra violeta:
Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
- Seletivo (moléculas com cromóforos)
- Comprimento de onda (λ) fixo
- λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)
- Varredura (DAD)
- Solventes também absorvem
Ultra violeta (UV-visível):Ultra violeta (UV-visível):
ÁguaMeOHACNAcetonaHexanoClorofórmioTHF
190 210 200 330 200 245 215
λ nmSolvente
Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV
- Seletivo (moléculas que fluorescem)
- Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas
- Mais sensível que UV por ser emissão
- Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente.
- Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila
Fluorescência:Fluorescência:
Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna
- Não- seletivo
- Sensível a variações de:- Temperatura- Pressão- Fluxo- Composição fase móvel
- Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar
- Muito usado em cromatografia preparativa
Indice de refração:Indice de refração:
Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)
- Destrutivo
- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)
- Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI
- Análise de micro e macromoléculas.
- Alta sensibilidade
Espectrometria de massas:Espectrometria de massas:
MODO NORMALMODO NORMAL
MECANISMO DE INTERAÇÃO:
ADSORÇÃO
Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel
Fase móvel: mistura de solventes orgânicos
Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
MODO REVERSOMODO REVERSO
INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DOSOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
HIDROFOBICIDADE
Fase estacionária: APOLARFase móvel: H2O, MeOH, CH3CN
ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
HidrofobicidadeHidrofobicidade
Se a amostra possui CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica : grupo aromático
Se a amostra possui -COOH : grupo
carboxílico -NH2 : grupo amino -OH : grupo hidróxi
A hidrofobicidade
será forte
A hidrofobicidade
será fraca
TROCA IÔNICATROCA IÔNICA
MECANISMO DE INTERAÇÃO :
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)
Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)
Aniônicas: amônio quaternário, aminasCatiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Obs: Seringa de HPLC
Seqüência
Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos
Condicionamento da coluna com fase móvel
Monitoramento da linha de base
Injeção das amostras
Cromatograma
tR
tM
TEMPO
SIN
AL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um
composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fasesNão leva em conta o tempo morto da coluna
FATOR DE RETENÇÃO (k)FATOR DE RETENÇÃO (k)
tr – tok =to
tr = tempo retenção analito
to = tempo morto da coluna
NÚMERO DE PRATOS (N)NÚMERO DE PRATOS (N)
Mede a eficiência do sistemaDepende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel
trN = 5,54
w0,5
2
FASE MÓVELFASE MÓVEL
- Solvente grau HPLC (alta pureza)
- Filtração (membrana 0.45 μm)
- Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automático)
- Purgar os solventes
MODOS DE ELUIÇÃOMODOS DE ELUIÇÃO
ISOCRÁTICO:
Uma única composição de fase móvel ao longo da corrida; a composição ds FM é CONSTANTE.
GRADIENTE:
- Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo da corrida.
- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)
3) EXTRAÇÃO:
- LÍQUIDO-LÍQUIDO - LÍQUIDO-SÓLIDO - SOXHLET - FLUÍDO SUPER CRÍTICO - EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)
PREPARAÇÃO DA AMOSTRAPREPARAÇÃO DA AMOSTRA
FiltraçãoFiltração
É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas de 0.45 m mesh para a remoção do material insolúvel.
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do
analito suspeito
ANÁLISE QUANTITATIVA
Se ambos os compostos
respondessem igualmente ao
detector poderíamos usar a relação:
Massa A Área A
Massa B Área B
No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector.
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
Este método baseia-se na comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão.
Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão:
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração dessa substância na amostra.
É importante salientar que o gráfico deve ser construído com concentrações próximas da concentração esperada na amostra. Outro fator muito importante é que o volume injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razão este tipo de padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado.
Neste método não são usados fatores de correção para corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
PADRONIZAÇÃO INTERNA
Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração.
Mx = massa do componente x
Ma = massa da amostra
Mp = massa do padrão
Ap = área do padrão
Ax = área corrigida do componente x
PADRONIZAÇÃO INTERNA
A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. Deve ser também uma substância pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado à massa pesada
Este método possibilita a determinação de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.
Referências
TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel; VILEGAS, Wagner and ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinação de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.
AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins Ribeiro6