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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE QUÍMICA LABORATÓRIO DE QUÍMICA ORGÂNICA

EXPERIMENTO 5. INTRODUÇÃO A MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA E EM COLUNA

OBJETIVOS

Estudar o comportamento de substâncias orgânicas em termos da partição cromatográfica - estrutura química versus fenômeno adsorção cromatográfica.

Demonstrar experimentalmente princípios fundamentais da cromatografia. Empregar a técnica de cromatografia em camada delgada na análise uma amostra e

utilizar o Rf na identificação de compostos orgânicos usualmente presentes em diversas formulações farmacêuticas.

Empregar a técnica de cromatografia em coluna na purificação de compostos orgânicos. LEITURA RECOMENDADA

Métodos de separação, cromatografia, fator de retenção, em livros de Química Analítica ou Química Orgânica. INTRODUÇÃO

Os termos cromatografia, cromatograma e método cromatográfico são atribuídos ao

botânico russo Mikhael S. Tswett, que em 1906 utilizou estes termos em dois trabalhos descrevendo suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas e gema de ovo. Tswett usou colunas de vidro recheadas com vários sólidos finamente divididos e arrastou os componentes dos extratos com éter de petróleo. O nome deriva-se das palavras gregas chrom (cor) e graphe (escrever), embora o processo não dependa da cor, exceto para

facilitar a identificação dos componentes separados. Existem várias técnicas cromatográficas que vão das mais simples como cromatografia

de coluna e camada fina até as mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).1 De modo geral, entre os métodos modernos de análises, as técnicas cromatográficas, ocupam um lugar de destaque na química e bioquímica, na pesquisa e na indústria, devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas presentes em uma amostra, mesmo em misturas muito complexas. O ponto comum entre as várias técnicas cromatográficas existentes e que caracteriza o método é o fato de os componentes da mistura, ou amostra serem distribuídos entre duas fases. A cromatografia é, portanto, um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel pela fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é

1 Degani, A. L. G.; Cass, Q. B.; Vieira, P. C.; Cromatografia – um breve ensaio. Química Nova na Escola,

1998, No. 7.

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seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes.

Uma delas permanece fixa e por isso é chamada de fase estacionária enquanto outra percola através da fase estacionária sendo então chamada de fase móvel. Esta situação dinâmica resulta numa migração diferencial, ou seja, os componentes da amostra têm diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionária. A cromatografia de adsorção baseia-se no grau de partição relativa dos compostos, entre uma dada fase líquida móvel (eluente) e uma determinada fase sólida estacionária, geralmente sílicagel (SiO

2.xH

2O) ou alumina (Al

2O

3). Outros materiais que são usados incluem

Florisil (silicato de magnésio, carvão ativo, magnésia, carbonato de cálcio, amidas e açúcar). O grau de adsorção depende da quantidade de água presente na fase sólida (esta será mais reativa quanto menos água estiver presente), da estrutura do composto (presença de grupos funcionais polares, capacidade de formar ligações hidrogênio, etc.), da adsorção do solvente ao ocupar os sítios ativos da fase sólida e da força atrativa entre o soluto e o solvente (Figura 1). Os componentes da amostra são, posteriormente, detectados individualmente por meios químicos ou físicos.

N

Al2O3

HH

R

O Al

O

O H O

R

C

R

RO

O Al

C

O

ORHOAl

Figura 1. Algumas formas de visualizar as interações entre alumina e componentes orgânicos

de uma amostra. Estruturas similares poderiam ser escritas para a sílicagel.

Cromatografia em Camada Delgada A cromatografia em camada delgada (ccd), um caso particular da cromatografia de adsorção, tem várias aplicações importantes em química orgânica, tais como: estabelecer se dois compostos são idênticos, verificar a pureza de um composto (complexidade e muitas vezes a natureza), determinar o número de componentes em uma mistura, determinar o solvente apropriado para separação em uma coluna cromatográfica, monitorar a separação de uma mistura em uma coluna cromatográfica ou acompanhar o progresso de uma reação. É um método extremamente conveniente, pois é uma técnica rápida, reproduzível e necessita

apenas uma quantidade muito pequena de amostra (1-100g). Existem comercialmente folhas pré-recobertas por alumina ou sílicagel para

cromatografia em camada delgada, muitas incorporando material fluorescente. Quando não se tem folhas ou lâminas cromatográficas comerciais, pode-se preparar com facilidade as placas de vidro. A fase sólida é espalhada em camada fina sobre uma placa de vidro ou folha de alumínio. Para fixar o adsorvente à superfície da lâmina usa-se sulfato de cálcio (gesso) ou um polímero orgânico. Uma pequena quantidade de uma amostra orgânica é colocada em um ponto numa das extremidades da placa, sendo adsorvida pela fase sólida. A placa cromatográfica é colocada em uma câmara fechada contendo um eluente que percorre a fase fixa em movimento ascendente por ação capilar, carreando consigo a amostra orgânica. Diferentes compostos ascendem a diferentes alturas dependendo de suas estruturas moleculares. Este procedimento é especialmente útil no caso de compostos que são sensíveis ao calor ou não são voláteis, ou seja, no caso de compostos que não são apropriados à determinação de ponto de ebulição ou à cromatografia em fase gasosa. A distância percorrida por cada composto em uma amostra, dividida pela frente do solvente é conhecido como o Rf

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(fator de retenção). Comparações do valor de Rf da amostra com o de um padrão é um método

qualitativo usado na identificação de um composto.

Instruções Gerais para Execução da Técnica de Cromatografia em Camada Delgada

Para se fazer a escolha do solvente de desenvolvimento pode-se proceder da seguinte maneira: preparam-se vários tubos capilares e recolhe-se a amostra dissolvida nos vários solventes que se deseja testar, as amostras são recolhidas por ação capilar. Faz-se o toque da película cromatográfica pelo tubo (Figura 2). Quando o círculo do solvente tiver atingido a

posição final, o solvente apropriado é aquele que tiver arrastado a cerca de 0,3 a 0,5 do raio do círculo do solvente.

Figura 2. Escolha de solvente para a cromatografia em camada delgada

(a) Bom desenvolvimento. (b) Superdesenvolvimento. (c) Subdesenvolvimento.

Na Tabela 1 encontramos uma relação dos solvente mais usuais para a cromatografia em ordem crescente de polaridade. Podem ser usadas misturas de dois ou mais solvente como eluente em cromatografia. Talvez, a mistura mais usada seja acetato de etila em éter de petróleo ou hexano, por ser constituída de solventes razoavelmente baratos, voláteis e de regular ou baixa toxicidade. Tabela 1: Solventes cromatográficos em ordem crescente de polaridadea.

Éter de petróleo Ciclohexano Tetracloreto de carbono Benzeno Cloreto de metileno Clorofórmio Éter etílico Acetato de etila Piridina Acetona Álcool n-propílico Etanol Água Ácido acético

a A polaridade, neste contexto, só tem sentido para a cromatografia e não coincide, necessariamente, com a polaridade medida, por exemplo, pela constante dielétrica.

Uma vez escolhido o eluente adequado, as amostras são aplicadas nas cromatoplacas na forma de soluções (1-10%), em solventes bastante voláteis por meio de um tubo capilar. O tubo capilar é introduzido na solução da amostra e em seguida toca-se a ponta do capilar na cromatoplaca, cerca de 1cm da base inferior (Figura 3.1), permitindo que a amostra seja

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adsorvida pela fase estacionária. Alguns cuidados devem ser tomados para evitar que a camada de adsorvente seja alterada ou que o halo de difusão da amostra seja maior que 2 mm. Um mesmo ponto de aplicação poderá sofrer várias aplicações, se necessário uma maior concentração da amostra. Após cada aplicação deve-se esperar a evaporação do solvente. Mais de uma amostra pode ser aplicada em uma mesma placa mantendo-se uma distância de 1 cm para evitar contato entre os pontos de cada amostra. Em seguida, a placa é introduzida cuidadosamente em uma cuba fechada (câmara) contendo o solvendo indicado, com a extremidade semeada para baixo. O nível do solvente deverá ficar abaixo dos pontos de aplicação das amostras (Figura 3.2). Durante a corrida do solvente o sistema fica fechado para que a atmosfera esteja saturada pelo vapor do solvente. Facilita-se a saturação colocando-se um pedaço de papel de filtro na parede interna da câmara. A cromatoplaca deverá ser retirada da cuba somente quando a frente do solvente atingir um limite pré-determinado na parte superior da placa (cerca de 1 cm). Após o desenvolvimento as cromatoplacas são secadas e reveladas. Esta última etapa consiste em tornar visíveis as substâncias incolores presentes na amostra. A visualização pode ser feita através de métodos físicos ou químicos. Muitos compostos podem ser visualizados através de luz ultravioleta, por se tornarem fluorescentes quando excitados por essas radiações (cuidado!) vêem-se manchas negras nos pontos onde a

fluorescência é obstada. Estas manchas (e quaisquer outras detectadas pelos métodos alternativos mencionados abaixo) devem ser marcadas por um pequeno círculo. Para a maior parte dos compostos orgânicos é muito utilizado a exposição da cromatoplaca aos vapores de iodo, em recipiente fechado (Figura 3.3).

Figura 3. (1) Aplicação da amostra na cromatoplaca (2) Eluição de uma placa cromatográfica;

(3) Revelação de uma placa cromatográfica em cuba de iodo

Quase todas as classes de substâncias orgânicas (exceto alcanos e haletos alifáticos) formam complexos de transferência de carga com o iodo. Estes complexos revelam-se como manchas marrom, tanto mais escuras quanto maior o tempo de exposição e a concentração da amostra. A formação desses complexos é reversível (muitas vezes rapidamente), de modo que a posição das manchas escuras deve ser marcada prestemente. A grande vantagem desse método é que o iodo pode ser eliminado posteriormente, na maioria dos casos, através do aquecimento da placa, a qual pode, então, ser borrifada com outro revelador (ácido sulfúrico, vanilina sulfúrica , tricloreto de antimônio, permanganato de potássio/ácido sulfúrico). Isto é possível porque o iodo se une apenas fisicamente com as substâncias, exceto em compostos insaturados em que ele pode adicionar às insaturações. A literatura química traz uma série de referências a reveladores para cromatografia em camada delgada, variando desde os de aplicação muito específica até os mais gerais, como no

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caso dos vapores de iodo. Em geral os métodos químicos de revelação são destrutivos e aplicáveis a separações analíticas, mas não em separações preparativas. Quando as condições de medida são completamente especificadas, o valor do Rf é

constante para uma dada substância, e corresponde a uma propriedade física daquele composto. O valor de Rf pode, então, ser usado para identificar um composto desconhecido,

mas como muitas substâncias podem ter o mesmo valor de Rf, assim com podem ter o mesmo

ponto de fusão, métodos adicionais devem ser utilizados para identificação inequívoca do composto. Para cálculo do valor de Rf mede-se a distância que a substância deslocou a partir do

ponto de aplicação (x), considerando-se para efeito de medida o centro de gravidade da mancha, e divide-se pela distância percorrida pela frente do solvente a partir do ponto original

da amostra (y). A Figura 4 ilustra análise das frações recolhidas de uma coluna

cromatográfica (a) e o cálculo do Rf para um componente de uma amostra (b).

Distância percorrida pela mancha desde a origem (x) Rf = -----------------------------------------------------------------------------------

Distância percorrida pelo solvente desde a origem (y)

(b)(a)

Origem

Marca dafrente dosolvente

Componente 1

Componente 2

Manchacromatográfica

Origem

Marca dafrente dosolvente

x

y

Rf = x/y

Figura 4. (a) Cromatograma de uma separação em coluna; (b) Determinação de Rf no cromatograma em camada fina

EXPERIMENTAL DA PARTE A-I – PREPARAÇÃO DAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS

EXPERIMENTO DEMONSTRATIVO

Objetivo: Demonstrar experimentalmente a preparação artesanal de placas para uso na cromatografia em camada delgada. Procedimento: 1. Lava-se as placas cuidadosamente com detergente e água corrente. Após a lavagem, a

superfície das placas não deve ser mais tocada com os dedos. Em seguida, as placas são secas em uma estufa, apenas com papel toalha ou ao ar.

2. Mistura-se num béquer 30 g de sílica gel com 60 mL de água destilada até obter uma suspensão homogênea.

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3. Mantendo-se as placas em posição horizontal, transfere-se uma porção adequada da suspensão para a superfície das placas, espalhando-a uniformemente com o auxílio de um bastão de vidro.

4. Logo em seguida, para facilitar a distribuição homogênea da suspensão, mantém-se a placa apoiada sobre a bancada, suspende-se uma das extremidades a cerca de 3 cm de altura e se solta. Repete-se esta operação com a outra extremidade da placa até que visualmente toda a superfície esteja uniforme. A espessura do recobrimento deve ser aproximadamente 0,3 mm.

5. Repousa-se a placa em uma superfície plana horizontal e deixa-se secar ao ar durante 15 a 30 minutos, quando o adsorvente adquire uma aparência opaca.

6. Para serem utilizadas, as placas devem ser ativadas por aquecimento em uma estufa a 110 oC durante 30 minutos . Este processo visa eliminar a água adsorvida no suporte.

As placas assim preparadas estão prontas para uso e podem ser guardadas em lugar protegido, tomando-se cuidado para não tocar, contaminar ou ferir a camada de adsorvente

EXPERIMENTAL DA PARTE A.II – USO DA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PARA INVESTIGAÇÃO DE CAFEÍNA E N-ACETIL-p-AMINOFENOL EM ANALGÉSICOS

Objetivo: Investigar a presença de cafeína e N-acetil-p-aminofenol (paracetamol) em analgésicos [Tylenol, Saridon, Dorflex, Paracetamol (Genérico), etc.]. Procedimento:

1. Aplica-se em pontos separados, através de tubos capilares, uma gotinha das soluções de

cafeína P.A. (1), N-acetil-p-aminofenol (2) e das amostras de analgésicos (soluções 3 a 5)

em uma mesma placa de cromatografia, a 1 cm da borda inferior da placa e mantendo-se cerca de 1 cm de distância entre os pontos de aplicação.

2. Transfere-se uma certa quantidade de acetato de etila para a cuba de cromatografia de modo que o mesmo alcance uma altura de 5 mm.

3. Reveste-se a parede interna da cuba com um papel de filtro encostado no fundo. Cubra o recipiente com um vidro de relógio e espere alguns minutos para que a atmosfera da cuba fique saturada com os vapores do solvente de desenvolvimento. Eventualmente o nível do líquido deverá ser completado.

4. Estando os pontos de aplicação bem secos, introduz-se a placa na cuba de modo que o nível do líquido fique abaixo dos pontos de aplicação. Espera-se o desenvolvimento do cromatograma mantendo-se a cuba fechada.

5. Quando a frente do solvente ficar a 1 cm (registre essa distância) da borda superior da placa, retira-se e deixa-se secar totalmente ao ar (10 a 15 minutos).

6. Antes da revelação com iodo, verifica-se o cromatograma na lâmpada UV. Marca-se o contorno das manchas das substâncias UV ativas, cuidadosamente, com o auxílio de uma lapiseira.

7. Para revelação definitiva, insere-se a placa em um recipiente cilíndrico e seco de tamanho adequado contendo um pouco de iodo sólido e coberto com um vidro de relógio. Espera-se o surgimento de manchas na placa.

8. Registrar as distâncias percorridas pela frente do solvente e pelos componentes de cada amostra analisada (cafeína e N-acetil-p-aminofenol e soluções de analgésico analisadas -

soluções 3 a 5).

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Discussão:

1. Com base no experimento realizado responda as seguintes questões: (a) Apresente um desenho do cromatograma e diga quantos componentes foram

detectados em cada amostra aplicada? (b) Determinar os Rf das substâncias puras (cafeína e N-acetil-p-aminofenol) e de todos os

componentes das soluções de analgésico analisadas (soluções 3 a 5). (c) Você pode inferir inequivocamente que algumas amostras contêm paracetamol? Ou

cafeína? Ou nenhum dos dois? Ou outros constituintes? Explique. (d) Supondo que você precisa emitir parecer técnico em relação às amostras analisadas,

com base na técnica empregada e no formulário especificações do fabricante (EM ANEXO) o que você poderia inferir no seu parecer?

2. Sobre a técnica cromatografia em camada delgada, responda:

(a) Quais os fundamentos básicos? (b) Cite os usos mais consagrados da técnica (importância). (c) Enumere as vantagens e desvantagens da técnica. (d) Que características deve ter um solvente para ser considerado um bom eluente de

desenvolvimento? No caso em questão você considera o acetato de etila um bom solvente de eluição?

(e) Que artifícios podemos utilizar quando suspeitamos que o(s) componente(s) da amostra a ser analisada pode não ser visível a olho nu?

3. (Provão 2000) Uma mistura contendo os compostos I, II e III, representados abaixo, foi

analisada pela técnica de cromatografia em camada fina. A mistura foi aplicada em uma cromatoplaca de sílica sem indicador de fluorescência. Após eluição com hexano:éter etílico (4:1) e revelação sob luz ultravioleta (254nm), a cromatoplaca apresentou o seguinte aspecto:

O

(I) (II) (III)

Rf = 0,77 Rf = 0,34

Quando a cromatoplaca foi revelada com iodo, foram observadas três manchas. Pode-se afirmar que as manchas obtidas nos Rf 0,34 e 0,77 correspondem, respectivamente, às estruturas: (a) I e II. (b) I e III. (c) II e III. (d) III e I. (d) III e II.

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Cromatografia em Coluna A cromatografia em coluna é uma técnica usada para a separação de muitos compostos orgânicos. Essa técnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das moléculas envolvidas. O investigador deverá dispor de tubos de vidro compactado com um material polar finamente dividido (suporte sólido ou fase estacionária), em geral, alumina ou silicagel, empacotado com um solvente orgânico ou uma mistura de solventes. Uma solução contendo o composto que se deseja purificar é aplicada na superfície superior da fase estacionária, e após eluição coletar frações com volume predeterminados, as quais muito provavelmente conterão os componentes da mistura separados. A velocidade na qual um composto é eluído da coluna depende de sua polaridade, da polaridade da fase estacionária e da polaridade do solvente utilizado como eluente. Se o composto é mais atraído pela fase estacionária do que pelo solvente, ele migrará mais lentamente da coluna. Caso contrário, se o composto tiver maior afinidade pelo solvente ele migrará mais rapidamente da coluna, gastando menos tempo e solvente. O êxito de uma coluna dependerá então da escolha de um suporte e solvente adequados para a sua realização. Em alguns casos é possível visualizar a separação dos componentes de uma mistura observando o desenvolvimento de manchas diferentes na coluna ou acompanhando cm uma luz ultravioleta. Entretanto, na maioria das vezes, torna-se necessário o acompanhamento da separação dos componentes pela técnica de cromatografia em camada delgada (ccd).

Instruções Gerais para Execução da Técnica de Cromatografia em Coluna 1. Escolha da fase estacionária e do solvente para uma coluna cromatográfica

Os sólidos e solventes usados em uma coluna cromatográfica, são normalmente, os mesmos utilizados na cromatografia em camada delgada. Portanto o suporte e os solventes que deverão ser usados em uma coluna cromatográfica são escolhidos, previamente, através de uma análise por cromatografia em camada delgada. Após se obter uma boa separação dos componentes de uma mistura por cromatografia em camada delgada, deve-se usar o mesmo suporte e o mesmo solvente para a coluna cromatográfica. A quantidade de adsorvente utilizada depende da quantidade de amostra a ser separada. 2. Empacotamento da coluna

A coluna de vidro a ser utilizada para cromatografia deverá conter uma válvula para controle de fluxo de solvente. Em alguns casos pode-se utilizar uma bureta em substituição a uma coluna propriamente dita. Existem dois métodos para empacotar uma coluna. Um método no qual o suporte é introduzido na coluna a seco (Figura 5a), e um método no qual o suporte é introduzido na coluna junto com o solvente (Figura 5b). No primeiro caso, coloca-se uma pequena quantidade de algodão na base inferior da coluna para evitar a passagem do suporte sólido. A coluna é preenchida até cerca da metade com solvente, tendo cuidado de retirar as pequenas bolhas de ar surgidas da sua introdução. Com a ajuda de um funil adaptado na parte superior da coluna introduz-se lentamente, a fase estacionária que será empacotada com o solvente. O empacotamento poderá ser auxiliado com a introdução e escoamento de novas quantidades de solvente. Nunca deve deixar a superfície do suporte livre de solvente. O segundo método é idêntico ao primeiro, exceto que a introdução do suporte sólido é feita junto com o solvente,

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portanto, os mesmos cuidados devem ser observados durante a preparação e o empacotamento da coluna.

Figura 5. Colunas cromatográficas. (a) Solvente adicionado à coluna;

(b) suporte sólido sendo introduzido na coluna.

3. Introdução da mistura de compostos a ser separada; eluição dos compostos e monitoramento da coluna

Quando a coluna estiver totalmente empacotada e restando uma diminuta quantidade de solvente na base superior, o material que se deseja separar é introduzido na coluna. Para realizar essa transferência, a mistura é dissolvida em uma quantidade mínima de solvente, normalmente o eluente, e introduzida na superfície da coluna com a ajuda de uma pipeta de Pasteur. Se a mistura for líquida ela poderá ser introduzida diretamente na coluna. Uma metodologia alternativa envolve a impregnação da amostra em pequena quantidade de adsorvente com o auxílio de um solvente, em seguida evapora-se o solvente e introduz-se a amostra a seco (farofa). Esse procedimento é particularmente útil quando pelo menos um dos

constituintes da amostra se dissolve apenas em solventes muitos polares. Nesse procedimento, um funil de separação com o solvente de escolha deverá ser adaptado no topo da coluna. Inicialmente, deixa-se eluir uma fração pequena de solvente, introduz-se na coluna uma nova quantidade de solvente e repete-se a operação. A coluna é, então, preenchida com o solvente e começa-se a eluição propriamente dita. Durante o processo de eluição, mais solvente é adicionado no topo da coluna (Figura 6), procurando-se manter a mesma velocidade de adição e de escoamento, cerca de 1 a 5 gotas por segundo. Deverão ser coletadas pequenas frações de solvente em recipientes fechados. Depois de recolhidas algumas frações, normalmente, torna-se necessário uma mudança de solvente ou simplesmente da polaridade de uma mistura de solventes. Faça um monitoramento das frações recolhidas por cromatografia em camada delgada, para verificar se todos os compostos das misturas foram eluídos e para verificar quais as frações que podem ser combinadas, pois um composto individual raramente encontra-se em uma única fração. Algumas frações recolhidas contêm mais de um composto, essas frações não devem ser reunidas com frações que contém apenas um composto.

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Figura 6. Coluna cromatográfica acoplada a um funil de separação

para manter o nível do solvente na superfície superior.

Uma vez que as frações recolhidas encontram-se diluídas, torna-se necessário evaporar

o solvente para obter o composto puro. Em alguns casos, esse processo de evaporação do solvente é indispensável, mesmo antes da análise cromatográfica.

Coluna Cromatográfica Rápida (flash-column chromatography)2

A técnica cromatográfica mais utilizada pelos químicos orgânicos para a separação de uma mistura de compostos é a cromatografia rápida ou cromatografia sob pressão. Essa técnica utiliza colunas cromatográficas curtas e a eluição é realizada sob pressão, possibilitando que a separação dos componentes tendo ΔRf ≥ 0,05 em cromatografia de camada delgada (ccd) ocorram em um tempo relativamente reduzido (1-3h). Pelo uso de pressões mais elevadas a separação poderá ocorrer de maneira mais rápida (10-15min), entretanto a resolução é moderada (ΔRf ≥ 0,15). O aparato necessário para essa técnica consiste em uma coluna cromatográfica com diâmetro apropriado, equipada com reservatório de solventes e uma válvula de controle de pressão (Figura 7). A pressão fornecida é proveniente de um cilindro de gás inerte (nitrogênio, argônio, etc.). A quantidade de suporte a ser utilizada normalmente é calculada multiplicando-se a quantidade de material que se deseja separar por fator de 20-60. A coluna empacotada deverá ter cerca de 10 a 15 cm. O tamanho das partículas da fase fixa afeta substancialmente na resolução. À medida que o tamanho destas aumenta, ocorre perda de resolução. A resolução poderá ser mantida ou melhorada pelo aumento do diâmetro da coluna. A escolha do eluente é feita da mesma forma que na coluna normal, por cromatografia em camada delgada, e recomenda-se o eluente que eleva o componente desejado da mistura ao Rf = 0,35 naquela técnica.

2 Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A.; Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate

Resolution. J. Org. Chem., 1978, 43, 2923.

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Figura 7. Coluna para cromatografia rápida.

A coluna é preenchida com adsorvente e o solvente de escolha é eluído sob pressão até que a coluna esteja empacotada. Adiciona-se, então, a amostra no topo da coluna e procede-se a eluição sob pressão a uma velocidade controlada (≈ 2 pol/min). Uma separação típica por esta técnica é mostrada na Figura 8. Os passos seguintes são realizados como descrito no procedimento em colunas cromatográficas comuns (recolhimento de frações, análise e evaporação do solvente, etc.). Por essa técnica também se recomenda não deixar a coluna secar.

Figura 8. Separação típica em cromatografia rápida.

A cromatografia rápida é um método geral para a separação de componentes de uma mistura com resolução moderada, entretanto, operações sob pressão, utilização de aparelhagem sofisticada (colunas com válvula para controle de pressão, reservatório de solvente, cilindro de gases), necessidade de colunas com diâmetros variáveis, constituem fatores limitantes dessa técnica. Coluna Cromatográfica Rápida e a Seco (dry-column flash chromatografy)3 Mais recentemente foi desenvolvido um método cromatográfico alternativo à coluna cromatográfica rápida – cromatografia rápida a seco. Essa técnica combina as vantagens da aparelhagem e da operação. Um fator de distinção entre ambas é o uso de sucção em lugar da pressão positiva. Um segundo fator de diferenciação é que os solventes de eluição são

3 Harwood, L. M.; “Dry-Column” Flash chromatography. Aldrichimica Acta, 1985, 18, 25; (b) Yau, E. K.; Coward, J.

K.; Filtering-Column Chromatography - A Fast, Convenient Chromatographic Method - Aldrichimica Acta, 1988, 21, 106.

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adicionados em volumes pré-determinados e a coluna vai até a secura, antes da adição de uma nova fração do eluente. A aparelhagem usada nessa técnica é simples, constituindo-se apenas de um funil cilíndrico sintetizado, adaptado em um balão com saia para uma trompa de vácuo (Figura 9).

Figura 9. Equipamento para cromatografia rápida a seco.

A tabela abaixo fornece uma orientação para escolha do tamanho do funil sinterizado, a

quantidade de adsorvente, de amostra e do solvente utilizados.

Tamanho do funil (mm) diâmetro/comprimento

Sílica (g)

Quantidade de amostra

Fração de solvente (mL)

30/46 15 15-500 mg 10-15 40/50 30 500 mg – 3 g 15-30 70/55 100 2-15 g 20-50

O procedimento técnico envolve o preenchimento do funil com o adsorvente e aplicação

de sucção, de forma que se obtenha uma superfície superior uniforme. Sob vácuo, pré-elua a coluna com eluente de menor polaridade no qual a mistura dos produtos é solúvel. Se a coluna estiver empacotada corretamente, a frente de solvente será vista descendo em uma linha horizontal. Se não se observa isto, repita o procedimento de empacotamento da coluna. Forneça o eluente na superfície da coluna até que a frente do solvente passe para o frasco receptor. Nesse momento cesse o fornecimento do eluente e seque adsorvente sob sucção.

Introduza a amostra a ser preparada no topo da coluna pelos métodos usuais, e proceda a eluição dos produtos por adição sucessiva de porções definidas do solvente, aumentando a polaridade da mistura de solventes, deixando que a coluna seque a cada adição (a superfície do adsorvente não deverá ser perturbada durante a adição de solvente). Geralmente o aumento de polaridade no gradiente do solvente deverá ser alterado em uma faixa de 5-10%. Sob essas condições, o produto é usualmente eluído pela mistura de solventes na qual apresenta ΔRf = 0,5 em ccd.

Por esse procedimento, com um mínimo de experiência, separações com eficiência similar as obtidas em cromatografia em camada delgada são facilmente realizadas. Ocorre uma perda mínima de material e economiza-se em tempo e solventes. Durante separações prolongadas com solventes voláteis, mistura atmosférica pode condensar no aparelho; embora esse fato não interfira na eficiência da separação, isto pode ser minimizado substituindo por solventes menos voláteis. Nenhum solvente é particularmente não recomendado para essa técnica, mas combinações de pentano (hexano), éter, acetato de etila e metanol são adequados para a maioria das separações. A baixa difusão das bandas do produto durante a cromatografia usualmente significa que cada componente é eluído em uma ou duas frações, resultando em perda mínima do produto em frações contaminadas.

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EXPERIMENTAL DA PARTE B-I. ESCOLHA DE SOLVENTE DE DESENVOLVIMENTO PARA SEPARAÇÃO DA MISTURA DE NITROFENÓIS EM COLUNA CROMATOGRÁFICA

Objetivo: Escolher o solvente de desenvolvimento para uso na separação de o- e p-nitrofenol

por meio uso da cromatografia em camada delgada.

Para esse estudo serão utilizadas a solução padrão 1 (p-nitrofenol PA), a solução padrão 2 (o-

nitrofenol PA) e a solução 3 (mistura reacional da nitração do fenol). A solução 3 foi preparada diluindo-se o produto bruto resultante da nitração do fenol (substituição eletrofílica aromática), previamente realizada pelo instrutor, segundo o esquema abaixo:

OH

HNO3-H2O

OH

NO2

OH

NO2

+

Procedimento:

1. Prepara-se três câmaras cromatográficas com alguns mL dos solventes em ensaio (sugestão: diclorometano, hexano, metanol). Para saturação com vapores do solvente rapidamente, nas câmaras coloca-se meia folha de papel de filtro encostada à parede do recipiente.

2. Prepara-se três lâminas revestidas com sílica gel. Em cada uma das lâminas aplicar por meio de tubo capilar em três diferentes pontos de aplicação correspondentes a: solução padrão 1 (p-nitrofenol PA), a solução padrão 2 (p-nitrofenol PA) e a solução 3 (mistura

reacional da nitração do fenol), segundo as orientações do instrutor. A mancha resultante deve ter um tamanho inferior a 4 mm e estar distanciada da borda inferior cerca de 1 cm.

3. Marca-se a linha desejada para a chegada do solvente - cerca de 1 cm do bordo superior da placa.

4. Mergulha-se ligeiramente cada lâmina em diferente solvente de desenvolvimento de modo que a zona onde se encontre o ponto de aplicação não fique imersa. Quando o eluente subir até à linha da frente retirá-la da câmara.

5. Registrar as distâncias percorridas pela frente do solvente nos diferentes solventes

(desenhar as cromatoplacas).

Discussão:

1. Com base nas cromatoplacas escolha o melhor solvente de desenvolvimento. 2. Determine o valor Rf de cada componente detectado no melhor solvente de

desenvolvimento. 3. Você pode inferir inequivocamente que além do o- e p-nitrofenol, existe um outro

componente na solução 3? Em caso afirmativo, que impureza (contaminante) poderia está presente na solução reacional? Explique.

4. Qual (ais) dos eluentes testados você recomendaria para eluir a coluna cromatográfica? Justifique.

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EXPERIMENTAL DA PARTE B-II. SEPARAÇÃO DE UMA MISTURA O- E P-NITROFENOL POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA - EXPERIMENTO DEMONSTRATIVO

Objetivo: Separar os constituintes de uma mistura contendo o- e p-nitrofenol por meio da

técnica de cromatografia em coluna.

A separação do o- e p-nitrofenol constitui-se um bom exemplo do efeito da quelação sobre as

propriedades físicas dos compostos. No isômero orto, os grupos OH e NO2 podem associar-se internamente por meio de ligações hidrogênio formando quelatos de seis átomo, tendo o átomo de hidrogênio como elemento de enlace.

Procedimento

1. Preparação da coluna.

Coloca-se uma fina camada de algodão hidrófilo na base inferior da coluna com o auxílio de uma vareta e introduz-se o primeiro eluente da série (diclorometano) na coluna até cerca de 1/4 da altura total desta. Verifica-se o funcionamento da torneira.

Pesam-se aproximadamente 20 g de sílicagel para um béquer de 100 mL, a este se adiciona quanto baste do primeiro eluente, para formar uma papa homogênea (sílica-solvente), mistura-se com um bastão de vidro.

Abre-se um pouco a coluna deixando-a gotejar para dentro de um frasco Erlenmeyer durante o processo de enchimento.

Com a ajuda da vareta de vidro deitar de modo contínuo a suspensão de sílica na coluna (o solvente recolhido no frasco Erlenmeyer deve ser introduzido novamente na coluna).

Deixa-se gotejar o solvente 5-10 minutos após o enchimento da coluna para facilitar a sedimentação dos grânulos de sílica (empacotamento). Fecha-se a torneira deixando o solvente cobrir a parte superior da coluna.

Coloca-se uma rodela de papel de filtro ou uma fina camada de algodão no topo da coluna proteger a superfície, com auxílio da vareta se necessário.

Deixa-se o solvente eluir por a coluna até este ficar 2-3 mm acima do nível do algodão.

2. Preparação e aplicação da amostra.

Mede-se cerca de 2 mL da solução de mistura de nitrofenóis e aplica-se a mistura lentamente no topo da coluna, com auxílio de pipeta ou seringa.

Deixa-se gotejar o solvente da coluna até que a solução a cromatografar desça ao nível do algodão. Se necessário, introduz-se mais solvente para uma melhor penetração da amostra

na coluna de sílica.

3. Eluição dos componentes da amostra.

De um reservatório de solvente ou funil de decantação (colocada com o auxílio de um anel metálico sobre a coluna) deixa-se gotejar os eluentes pela ordem seguinte: cerca de 100 mL de diclorometano; 50 mL de diclorometano:acetato de etila (50:50); 50 mL de acetato de etila (se necessário)

Recolhem-se aproximadamente 8 mL de eluído em tubos de ensaio de 10 mL, previamente

numerados.

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O monitoramento da separação cromatográfica deve ser realizado por cromatografia em camada delgada (ccd). A eluição deverá ser continuada até a saída total de todos os componentes da mistura.

As frações eluídas contendo o-nitrofenol e p-nitrofenol puros deverão ser reunidas em balões

apropriados e o eluente evaporado com auxílio de rotoevaporador.

Acondicionar os sólidos puros em frascos fornecidos pelo instrutor.

4. Controle da pureza/identidade das frações recolhidas.

Segundo orientação do instrutor, reserve algumas frações que por ccd apresentam-se contendo os isômeros puros (um de cada) para que sejam injetadas no cromatógrafo a gás. Os cromatogramas obtidos pelo uso da cromatografia gasosa (CG) deverão ser

posteriormente analisados juntamente com o professor.

Notas:

i. Por vezes torna-se difícil arrastar a suspensão de sílica do béquer para a coluna, a qual poderá ser arrastada com a ajuda da vareta de vidro e/ou

pela ajuda de um volume maior de.

ii. Quando se interrompe a adição da suspensão na coluna por algum tempo, a sílica tende a sedimentar e formam-se zonas estratificadas. Uma maneira de

evitar esta situação é agitar o solvente na coluna com uma vareta de vidro

entre duas adições sucessivas.

iii. Nunca deixar a superfície da coluna de sílica gel sem eluente, porque esta se quebra em contacto com o ar.

Discussão:

1. Com base em argumentos estruturais, comente sobre a separação do o- e p-nitrofenol. Que outras diferenças em termos de propriedades físicas desses isômeros também podem ser explicadas usando os mesmos argumentos? Em anexo você encontrará as propriedades de todos os isômeros, como descritas no Index Merck (EM ANEXO).

2. Compare os Rf oriundos da técnica de cromatografia em camada delgada com os tempos de retenção observados na cromatografia gasosa (CG) (CROMATOGRAMAS EM ANEXO).

3. Sobre a técnica cromatografia em coluna, responda: Quais os fundamentos básicos? Cite os usos mais consagrados da técnica (importância). Enumere as vantagens e desvantagens da técnica.

4. (Provão 2001) Um químico deseja separar os compostos abaixo por cromatografia em coluna, utilizando sílica como adsorvente.

CH2CH3 CH2CH3

N

CH2CH3

(X) (Y) (Z)

Para tal, percolou a coluna seqüencialmente com os solventes I, II e III, que formam uma série eluotrópica. A primeira fração continha o composto X, a segunda fração, o composto Y, e a última fração, o composto Z. Qual dos sistemas de solventes abaixo serve como fase

líquida para justificar a ordem de eluição encontrada?

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Solvente I Solvente II Solvente III

(A) hexano acetonitrila tolueno

(B) hexano tolueno CH2Cl2

(C) tolueno hexano acetonitrila

(D) acetonitrila CH2Cl2 hexano

(E) CH2Cl2 tolueno hexano

5. (Provão 2001) A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um dos métodos

cromatográficos mais modernos utilizados em análise (CLAE analítica) e separação/purificação de misturas (CLAE preparativa). Abaixo são dados os cromatogramas X, Y e Z de uma mistura de compostos presentes em analgésicos: aspirina (A), cafeína (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando três fases móveis diferentes,

no modo isocrático, em uma mesma coluna.

Avaliando esses cromatogramas, responda às perguntas abaixo. (a) Qual a fase móvel mais apropriada para ser utilizada em escala preparativa, e a fase móvel

mais adequada para utilização em escala analítica, considerando um grande número de amostras a serem analisadas? Justifique sua resposta.

(b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada nestes três experimentos?

Justifique sua resposta. (c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o composto de maior tempo de

retenção? Justifique sua resposta.

DISPOSIÇÃO DOS RESÍDUOS E INSUMOS

Alguns resíduos aquosos poderão ser descartados na pia com água corrente. O demais

resíduos líquidos e sólidos (solventes, mistura de solventes, sílica, etc.) deverão ser acondicionados em frascos apropriados, segundo orientação do instrutor.

Os produtos sólidos e líquidos deverão ser reservados, após a purificação, para utilização como insumos em práticas posteriores.