MARIANA DE PAULA EDUARDO
Desempenho e Homogeneidade de Cultivos em Meio Sólido de
Monascus sp. em Biorreator do Tipo Tambor com Agitação Interna:
Efeitos do Padrão de Agitação.
São Paulo
2010
MARIANA DE PAULA EDUARDO
Desempenho e Homogeneidade de Cultivos em Meio Sólido de
Monascus sp. em Biorreator do Tipo Tambor com Agitação Interna:
Efeitos do Padrão de Agitação.
Tese apresentada à escola Politécnica da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Doutor em Engenharia
São Paulo
2010
MARIANA DE PAULA EDUARDO
Desempenho e Homogeneidade de Cultivos em Meio Sólido de
Monascus sp. em Biorreator do Tipo Tambor com Agitação Interna:
Efeitos do Padrão de Agitação.
Tese apresentada à escola Politécnica da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Engenharia
Área de concentração: Engenharia Química
Orientador: Profa Dra Beatriz Vahan Kilikian
São Paulo
2010
“Embora ninguém possa voltar atrás e
fazer um novo começo, qualquer um pode
começar de novo e fazer um novo fim.”
(Chico Xavier)
AGRADECIMENTOS
A Profa. Dra. Beatriz Vahan Kilikian, pelo incentivo, amizade, orientação e
dedicação.
Aos Professores Aldo, Andreas, Maria Cândida e Pedro pelo apoio, sugestões e
amizade.
Aos funcionários do laboratório, Andrea, Flávia, Orlinda e Valter pela ajuda e
colaboração em todos os momentos.
Aos funcionários do departamento, Alexandre, Antonio Carlos, Elisete, Graça,
Tadeu e Terezinha. Às bibliotecárias Lúcia e Fátima pelo auxílio.
Aos meus amigos Bianca, Bruno, Cadu, Cintia, Dani, Danielle, Felipe, Iara,
Isabela, Juliana, Kelly, Marcos, Marilena, Paula, Roberta, Saul, Thiago e todos
aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização do trabalho.
Ao meu amigo José Paulo pela ajuda em todos os momentos e pela amizade.
Ao meu marido Rodrigo e meu filho pela compreensão, paciência e amor.
À minha família por todo apoio e incentivo.
À Fapesp pela concessão de bolsa de estudos e apoio financeiro no projeto.
À todas as pessoas e instituições que de alguma forma, direta ou indiretamente,
colaboraram para a realização deste trabalho.
RESUMO
Este trabalho teve por objetivo verificar a influência da agitação no cultivo em meio
sólido, FES, quanto a crescimento microbiano, homogeneização do meio e remoção de
calor. As correlações obtidas contribuem na definição de critérios para ampliação de escala
da FES. O modelo adotado foi o cultivo do fungo Monascus sp. em arroz.
Os experimentos foram conduzidos em reator tubular horizontal de 40 l, com
agitação interna intermitente, camisa de resfriamento e vazão de ar de 2 l.min-1.Kgms-1. Os
cultivos foram realizados com base num planejamento fatorial rotacional: 12 a 60 rotações
das pás em 24 horas; 2 a 12 horas de intervalo entre os eventos de agitação. A intensidade
do crescimento celular foi considerada com base no consumo de O2, produção de CO2,
concentrações de proteína e ergosterol.
O consumo de O2 apresenta correlação de 81% com os padrões de agitação sendo
que tanto o número de rotações quanto o intervalo entre os eventos de agitação influenciam
negativamente o crescimento celular assim estimado. Por outro lado, a máxima velocidade
de consumo de oxigênio, OUR, obtida por volta de 24 horas, em cultivos com menores
intervalos entre os eventos de agitação, indica efeito positivo da agitação sobre a velocidade
do crescimento de fungos em superfície, enquanto não ocorre compactação do meio de
cultivo. Conclui-se, portanto, que a natureza do substrato empregado, arroz, cuja reologia é
sensivelmente alterada pela agitação, contribuiu de modo deletério à respiração celular e
que a adoção de reatores com agitação na FES, requer substrato com baixo teor de amido e
elevado teor de fibras.
As medidas de ergosterol apresentaram correlação de 85% com os padrões de
agitação mostrando que o intervalo entre os eventos de agitação é o fator com maior
impacto nesta resposta e os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação e
maior número de voltas apresentaram concentrações aproximadamente dez vezes maiores
de ergosterol em relação aos outros ensaios.
Os coeficientes de variação de umidade em cinco pontos do reator representam a
homogeneidade pois relacionam-se com os padrões de agitação com correlação de 95%.
Palavras-chave: Fermentação em meio sólido. Biorreator. Monascus.
Respiração. Agitação. Homogeneidade.
ABSTRACT
This investigation aimed to verify the influence of mixing microbial growth, medium
homogenization and heat removal within a solid state fermentation (SSF) bioreactor. The
correlations obtained will help to establish the scale-up criteria. The model system involved
the cultivation of the fungi Monascus sp. on rice. The assays were performed in a 40 l
bioreactor under internal intermittent mixing with a cooling jacket and an air flux of 2 l.min-
1kgdm-1. The cultivations followed a rotational factorial plan: 12 to 60 paddle revolutions in 24
hours; with an interval of 2 to 12 hours between mixing events.
Cellular growth rate was estimated by O2 consumption, CO2 production, and protein
and ergosterol concentrations. The O2 consumption showed an 81% correlation with the
revolutions pattern, and both the number of revolutions and interval between mixing events,
influenced cell growth negatively. The maximal oxygen consumption rate (OUR) was
reached after about 24 hours in cultivations submitted to shorter intervals between mixing
events which indicates a positive effect of shaking on the fungal growth rate on the particle
surface, as long as no medium compaction occurs. Thus it was concluded that the kind of
used substrate (rice), whose reology was perceptively modified by the mixing process, acted
harmfully on microbial respiration. If mixing is to be used in SSF bioreactors, the substrate
used should have a low starch content and a high fiber content
Ergosterol content showed an 85% positive correlation with the revolution pattern,
indicating that the interval between mixing events is the most important factor. Assays
performed with longer intervals between mixing events and greater numbers of turns
achieved about 10 times higher ergosterol concentration than the others
The coefficient of variation of the moisture at five sites of the reactor represents the
homogeneity, since they are related to the revolution patterns by 95%.
Key-words: Solid state fermentation. Bioreactors. Monascus. Respiration. Agitation.
Homogeneity.
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – Composição centesimal do arroz (adaptação de TABELA BRASILEIRA
DE COMPOSIÇÃO DE ALIMENTOS, 2010) .......................................... 26
Tabela 2 - Resumo dos pontos monitorados no biorreator........................................ 38
Tabela 3 - Condições dos ensaios preliminares do conjunto I, na ordem de
execução. ............................................................................................... 43
Tabela 4 - Variáveis e níveis do Conjunto de Ensaios II ........................................... 44
Tabela 5 - Conjunto II de ensaios propostos em planejamento fatorial. .................... 44
Tabela 6 - Variáveis e níveis do conjunto III .............................................................. 45
Tabela 7 - Conjunto III de ensaios propostos em planejamento fatorial composto
rotacional. ............................................................................................... 45
Tabela 8 - Resultados ensaios do conjunto I de experimentos ................................. 61
Tabela 9 - Balanço de nitrogênio nos cultivos com suplementação de meio ............ 65
Tabela 10 - Consumo total de oxigênio, OU, em 138 horas de cultivo. ..................... 76
Tabela 11 - Análise de variância para consumo de oxigênio total. ............................ 77
Tabela 12 - Coeficientes de regressão estimados para o consumo de oxigênio total
............................................................................................................... 77
Tabela 13 - Velocidade de consumo de oxigênio em 138 horas de cultivo. .............. 81
Tabela 14 - Análise de variância para OUR máximo ................................................. 81
Tabela 15 - Coeficientes de regressão estimados para o OUR máximo ................... 82
Tabela 16 - Produção de dióxido de carbono em 138 horas de cultivo. .................... 85
Tabela 17 - Análise de variância para a variável resposta produção de CO2 ............ 85
Tabela 18 - Coeficientes de regressão estimados para o OUR máximo ................... 86
Tabela 19 - Medidas de Concentração de proteína e balanço de nitrogênio. ........... 90
Tabela 20 - Análise de variância para a concentração de proteína ........................... 92
Tabela 21- Dois métodos de extração de ergosterol ................................................. 93
Tabela 22 - Teor de ergosterol após 138 horas de cultivo ........................................ 96
Tabela 23 - Análise de variância para variável resposta teor de ergosterol .............. 96
Tabela 24 - Coeficientes de regressão estimados para concentração de ergosterol 97
Tabela 25 - Parâmetros da respiração calculados pelos modelos .......................... 100
Tabela 26 - Volume de água (mL) adicionado em cada ensaio para reposição de
água evaporada. .................................................................................. 103
Tabela 27 - Razão entre produção de pigmentos vermelho e laranja para os ensaios
do planejamento fatorial e os ensaios teste 1 e 3 ................................ 110
Tabela 28 - Coeficientes de variação médios (em função do tempo) entre os pontos
amostrados (a, b, c, d e e) do reator. ................................................... 121
Tabela 29 - Análise de variância para variável resposta coeficiente de variação
médio da umidade ................................................................................ 122
Tabela 30 - Coeficientes de regressão estimados para coeficiente de variação médio
da umidade ........................................................................................... 122
Tabela 31 – Dados do balanço de energia nos cultivos em reator .......................... 127
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - (A) Hifas de Monascus ruber cultivadas em meio líquido, observados em
microscópio, aumento de 1000x, (B) Monascus ruber em arroz,
observado em microscópio, aumento de 100x (fotos tiradas no
LEB/DEQ/EPUSP). ................................................................................... 23
Figura 2- Preparo de estoque de células congeladas para os cultivos em reator. .... 36
Figura 3 - Esquema do biorreator para fermentação semi-sólida do
LEB/DEQ/EPUSP ..................................................................................... 38
Figura 4 - Esquema lateral e frontal do reator com indicação dos diferentes pontos
de amostragens axial (A,B e C) e radial (D e E). ...................................... 39
Figura 5 - Umidades em base úmida medidas em estufa e no analisador de umidade
Ohaus, para amostras de sílica. ............................................................... 48
Figura 6 - Hidrólises ácidas de meio fermentado ao longo do cultivo. ...................... 49
Figura 7 - Determinações de AR nos ensaios testes 1, 2 e 3 .................................... 50
Figura 8 - Determinação de ART ............................................................................... 51
Figura 9 - Métodos de análise de ART. ..................................................................... 52
Figura 10 - (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □)
e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 1 em função do tempo
de cultivo (B) Análises químicas e físicas do meio fermentado.. .............. 55
Figura 11 - Fotos do meio em fermentação do ensaio 1 em diferentes tempos do
cultivo- (A) 67 horas, (B) 139 horas, (C) 185 horas. ................................. 56
Figura 12- (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □)
e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 2 em função do tempo
de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado.. ............................ 57
Figura 13- Fotos do meio em fermentação do ensaio 2 em diferentes tempos do
cultivo- (A) 45 horas, (B) 90 horas, (C) 187 horas. ................................... 58
Figura 14 - (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □)
e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 3 em função do tempo
de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado.. ............................ 59
Figura 15 - Fotos do meio em fermentação do teste 3 em diferentes tempos do
cultivo- (A) 48 horas, (B) 114 horas, (C) 228 horas. ................................. 60
Figura 16 - (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □)
e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 4 em função do tempo
de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado.. ............................ 60
Figura 17 - Aspecto do substrato do ensaio 1 após 24 (A), 48 (B), 96 (C) e 144 horas
(D) de cultivo. ........................................................................................... 62
Figura 18 - Aspecto do substrato do ensaio do ponto central no tempo inicial (A),
após 24 (B), 48 (C) e 72 horas (D). .......................................................... 63
Figura 19 - Redução de massa seca em ensaio com suplementação de N. ............. 64
Figura 20 - Massa total de proteína em ensaio de suplementação. .......................... 64
Figura 21 - Identificação dos experimentos com base nos fatores de agitação
definidos no planejamento fatorial rotacional............................................ 66
Figura 22 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊), produção de CO2 (CER, □) e
coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos
ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação (ensaios C, H e
D). ............................................................................................................. 67
Figura 23 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e
coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos
ensaios do ponto central (I, J e K) e ensaios com intervalo médio (7 horas)
entre os eventos de agitação (ensaios E e F). ......................................... 68
Figura 24 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e
coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos
ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação (ensaios A, G e
B). ............................................................................................................. 69
Figura 25 - Esquema do reator e dos pontos de monitoramento da temperatura no
meio sólido (TFS-01, TFS-02, TFS-03 e TFS-04), do ar de entrada (TAR-
01), da fase gasosa (TFG-02) e de entrada e saída da água na camisa
(TAC-01 e TAC-02) .................................................................................. 71
Figura 26 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de
cultivo nos ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação
(ensaios C, H e D).. .................................................................................. 72
Figura 27 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de
cultivo nos ensaios do ponto central (I, J e K) e ensaios com intervalo
médio (7 horas) entre os eventos de agitação (ensaios E e F).. .............. 73
Figura 28 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de
cultivo nos ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação
(ensaios A, G e B).. .................................................................................. 74
Figura 29 - Distribuição dos resíduos de consumo total de oxigênio ........................ 78
Figura 30 - Superfície de resposta e gráfico de contorno do consumo de oxigênio em
função do numero de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos
de agitação. .............................................................................................. 79
Figura 31 - Distribuição dos resíduos de velocidade máxima observada de consumo
de oxigênio ............................................................................................... 83
Figura 32 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da velocidade de oxigênio
máximo em função do numero de rotações em 24 horas e intervalo entre
os eventos de agitação. ............................................................................ 84
Figura 33 - Distribuição dos resíduos para a produção de dióxido de carbono. ........ 87
Figura 34 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da produção de CO2 em
função do numero de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos
de agitação. .............................................................................................. 88
Figura 35 - (A) Massa total de proteína em função do tempo de cultivo para os
ensaios (B) Massa total média de proteína em função do tempo de cultivo
para os ensaios no ponto central. As barras representam o desvio padrão
................................................................................................................. 91
Figura 36 - Correlação entre a massa de ergosterol e a massa seca de células. ..... 93
Figura 37 - Concentração específica de ergosterol em relação à massa de células
durante o cultivo em meio líquido. ............................................................ 94
Figura 38 - (A) Concentração de ergosterol em função do tempo de cultivo para os
ensaios.; (B) Concentração de ergosterol em função do tempo de cultivo
para os ensaios no ponto central. ............................................................. 95
Figura 39 - Análise de resíduos do ajuste da superfície de resposta para a
concentração de ergosterol ...................................................................... 98
Figura 40 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da concentração de
ergosterol em função do número de rotações em 24 horas e intervalo
entre os eventos de agitação.................................................................... 99
Figura 41 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios com maior intervalo
entre os eventos de agitação.................................................................. 103
Figura 42 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios no ponto central F.
............................................................................................................... 104
Figura 43 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios com menor
intervalo entre os eventos de agitação. .................................................. 104
Figura 44 - Concentração de ART em função do tempo de cultivo ......................... 105
Figura 45 - Concentração de AR em função do tempo de cultivo, ( ) ensaio A; ( )
ensaio B; ( ) ensaio C; (-) ensaio I (ponto central) e ( ) ensaio G. .......... 105
Figura 46 - Pigmentos vermelhos (absorbância a 500nm) em função do tempo para
(A) ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação (B) cultivos
no ponto central e com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de
agitação (C) cultivos com menor intervalo entre os eventos de agitação
............................................................................................................... 107
Figura 47 - Pigmentos laranja (absorbância a 400nm) em função do tempo para (A)
ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação (B) cultivos no
ponto central e com intervalo médio ( 7 horas) entre os eventos de
agitação (C) cultivos com menor intervalo entre os eventos de agitação
............................................................................................................... 108
Figura 48 - Pigmentos em função do tempo para os ensaios teste 1 e ensaio teste 3.
............................................................................................................... 110
Figura 49: Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com
maiores intervalos entre os eventos de agitação, C, H e D em diferentes
pontos do reator ..................................................................................... 112
Figura 50 - Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com
intervalo médio entre os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto
central (I, J e K) em diferentes pontos do reator. .................................... 113
Figura 51 - Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com
menores intervalos entre os eventos de agitação, A, G e B em diferentes
pontos do reator ..................................................................................... 114
Figura 52 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com
maiores intervalos entre os eventos de agitação (C, H e D) em diferentes
pontos do reator ..................................................................................... 115
Figura 53 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com
intervalos médios entre os eventos de agitação (E e F) em diferentes
pontos do reator ..................................................................................... 116
Figura 54 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com
maiores intervalos entre os eventos de agitação (C, H e D) em diferentes
pontos do reator. .................................................................................... 117
Figura 55 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em
função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos
de agitação em diferentes pontos do reator. .......................................... 118
Figura 56 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em
função do tempo para os ensaios com intervalos médios entre os eventos
de agitação (E e F) e ensaios no ponto central (I, J e K)em diferentes
pontos do reator. .................................................................................... 119
Figura 57 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em
função do tempo para os ensaios com menores intervalos entre os
eventos de agitação em diferentes pontos do reator. ............................. 120
Figura 58 - Análise de resíduos do ajuste da superfície de resposta para o
coeficiente de variação médio da umidade ............................................ 123
Figura 59 - Superfície de resposta e gráfico de contorno do coeficiente de variação
médio da umidade em função do número de rotações em 24 horas e
intervalo entre os eventos de agitação. .................................................. 124
Figura 60 - Diferenças em relação à temperatura de ”set point” em função do tempo.
............................................................................................................... 125
Figura 61 - Calor removido e gerado nos ensaios com maiores intervalos entre os
eventos de agitação em função do tempo de cultivo .............................. 128
Figura 62 - Calor removido e gerado nos ensaios com intervalo médio (7 horas) entre
os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto central (I, J e K)em
função do tempo de cultivo ..................................................................... 129
Figura 63 - Calor removido e gerado nos ensaios com menores intervalos entre os
eventos de agitação em função do tempo de cultivo .............................. 130
ÍNDICE DE SÍMBOLOS
µ Velocidade específica de crescimento
ρágua Densidade da água
ρar Densidade do ar seco
AR Açúcares redutores
ART Açúcares redutores totais
BSA Soro de albumina bovina
c Calor específico (J/kg.K).
CE Produção de dióxido de carbono (mol)
CER Velocidade de produção de dióxido de carbono
CV Coeficiente de variação
DEQ Departamento de engenharia química
DNS Ácido dinitrossalicílico
EPUSP Escola Politécnica da Universidade Estadual de São Paulo
F Vazão
FES Fermentação no estado sólido
GOD Glicose oxidase
he Entalpia do ar de entrada
hs Entalpia do ar de saída
Hv Calor latente de vapor de água a 0°C
I Intervalo entre os eventos de agitação
Jcamisa Calor removido pela camisa do reator (W).
Jevap Calor removido por evaporação (W).
LEB Labpratório de Engenharia Bioquímica
mo Coeficiente de manutenção
NR Número de rotações
OU Consumo de oxigênio
OUR Velocidade de consumo de oxigênio (mol O2.h-1)
PBa Pressão barométrica
PH2O Pressão de vapor da água
R Constante universal dos gases
Rmet Calor produzido pelo metabolismo do fungo (W).
RQ Coeficiente respiratório
T Temperatura
TAC Temperatura da água da camisa
TAR Temperatura do ar
TFG Temperatura da fase gasosa
TFS Temperatura da fase sólida
Ts Temperatura da água na saída da camisa, °C.
U Unidade de absorbância
UA Umidade absoluta do ar, kg de água / kg de ar seco.
YCO2 Fração molar de CO2 (na entrada e na saída do reator)
YO2 Fração molar de O2 (na entrada e na saída do reator)
Yx/o Fator de conversão de oxigênio a células
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
ÍNDICE DE TABELAS
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE SÍMBOLOS
1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 20
2. OBJETIVOS ....................................................................................... 22
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 23
3.1. Monascus sp ......................................................................................... 23
3.2. Arroz ...................................................................................................... 25
3.3. Fermentação no estado semi-sólido .................................................. 26
3.4. Estimativa de crescimento em FSS .................................................... 30
3.5. Reatores para FES ............................................................................... 31
4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................. 35
4.1. Microrganismo: armazenamento e inóculo ........................................ 35
4.2. Meios de cultivo ................................................................................... 36
4.2.1. Tratamento térmico do substrato para os cultivos em reator ......... 36
4.3. Inóculo do reator .................................................................................. 37
4.4. Biorreator .............................................................................................. 37
4.5. Etapas dos ensaios em biorreator ...................................................... 39
4.6. Metodologia Analítica .......................................................................... 40
4.6.1. Umidade......................................................................................... 40
4.6.2. Extrato etanólico ............................................................................ 40
4.6.3. Pigmentos vermelhos .................................................................... 40
4.6.4. Açúcares redutores (AR), açúcares redutores totais (ART) ........... 41
4.6.5. Proteína total .................................................................................. 41
4.6.6. Análise de ergosterol ..................................................................... 42
4.6.7. Análise do gás de saída do reator ................................................. 42
4.7. Cultivos ................................................................................................. 43
4.8. Balanços ............................................................................................... 45
4.8.1. Balanço de entalpia no reator ........................................................ 45
4.8.2. Cálculo do calor metabólico gerado ............................................... 46
4.8.3. Cálculo do calor removido pela camisa ......................................... 46
4.8.4. Cálculo do calor removido por evaporação .................................... 47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 48
5.1. Padronização das metodologias de análise ...................................... 48
5.1.1. Umidade......................................................................................... 48
5.1.2. Hidrólise ácida para dosagem de ART .......................................... 49
5.1.3. Determinação de ART e AR........................................................... 50
5.1.4. Extração de pigmentos .................................................................. 52
5.2. Mudanças estruturais no reator .......................................................... 53
5.3. Ensaios para definição do tratamento térmico do substrato no
reator 54
5.4. Ensaios preliminares em reator – Conjunto I .................................... 55
5.4.1. Teste 1 ........................................................................................... 55
5.4.2. Teste 2 ........................................................................................... 56
5.4.3. Teste 3 ........................................................................................... 58
5.4.4. Teste 4 ........................................................................................... 60
5.4.5. Ensaios em reator - Conjunto II ..................................................... 62
5.5. Ensaio complementar com suplementação ....................................... 63
5.6. Ensaios em reator ................................................................................ 66
5.6.1. Desempenho do processo de cultivo em função da agitação ........ 66
5.6.1.1. Crescimento celular ............................................................... 75
5.6.1.2. Análises de Umidade, ART e Produção de Pigmentos ....... 102
5.6.2. Homogeneidade ........................................................................... 111
5.6.3. Balanço de energia térmica ......................................................... 126
6. CONCLUSÕES ................................................................................ 132
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 136
Introdução
20
1. INTRODUÇÃO
Fermentação no estado sólido, FES, é definida como o crescimento
microbiano em partículas sólidas na ausência de água livre (MOO-YOUNG;
CANNEL, 1980; PANDEY, 2003; MITCHELL; KRIEGER; BEROVIC, 2006). O
substrato deve possuir água suficiente para garantir o crescimento microbiano.
Quando a capacidade de saturação do substrato sólido é excedida, ocorre água
livre, caracterizando a fermentação semi-sólida (FSS). Os cultivos em meio sólido
são mais restritivos quanto aos tipos de microrganismos capazes de se desenvolver,
recaindo praticamente nos bolores. No caso da fermentação semi-sólida, como há
água livre, bactérias e leveduras também podem se desenvolver, o que torna o
processo mais susceptível a contaminações.
FSS oferece várias oportunidades para o processamento e aproveitamento de
resíduos agro-industriais como casca e bagaço de mandioca, bagaço de cana e de
frutas, utilizados em bioprocessos para a produção de etanol, enzimas, ácidos
orgânicos, aminoácidos e metabólitos secundários biologicamente ativos. O Brasil
por ser uma das mais importantes economias agrícolas do mundo gera resíduos que
podem ser usados como substrato para produção de substâncias de alto valor
agregado.(SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003). Segundo Pandey (2003), processos
de fermentação semi-sólida resultam em menor quantidade de água residual e
menos danos ao meio ambiente do que fermentações submersas, minimizando os
problemas de disposição de resíduos.
Por outro lado, entre as desvantagens da FSS, pode-se citar a dificuldade
para remover o calor e CO2 gerados metabolicamente durante o crescimento,
sobretudo em escala industrial, devido à baixa capacidade de condução de calor do
substrato e da impossibilidade de submeter o cultivo a uma agitação vigorosa, que
pode causar aglomeração do meio ou desprendimento do microrganismo da
superfície do substrato (DOELLE ;MITCHELL; ROLZ, 1992).
Um grande número de patentes (ISI WEB OF KNOWLEDGE, 2006) e
trabalhos sobre fermentação semi-sólida tem sido publicado, enfocando
desenvolvimento e projeto de biorreatores, modelagem e produção de produtos de
interesse comercial, tais como alimentos, metabólitos primários e secundários (ácido
Introdução
21
cítrico, β-galactosidase, enzimas, pigmentos).
A despeito da produção de metabólitos primários ou secundários – produção
específica em relação à biomassa ou massa de meio - ser freqüentemente maior em
cultivos semi-sólidos em comparação a cultivos submersos, verifica-se limitada
aplicação industrial desses processos, sobretudo devido à incipiente tecnologia
quanto a reatores e critérios de ampliação de escala. Muitos processos de
fermentação semi-sólida em escala industrial são realizados em pequenos frascos,
sacos ou bandejas, para os quais a ampliação de escala resume-se ao aumento da
quantidade destes frascos, sacos ou bandejas. No caso de biorreatores, a ampliação
de escala deve considerar a capacidade de remoção do calor, transferência de O2 e
manutenção da umidade do meio (RAGHAVARAO; RANGANATHAN; KARANTH,
2003).
Nesta tese estudou-se o efeito da agitação nos cultivos em meio sólido, foi
usado o cultivo de Monascus sp. em arroz e produção de metabólitos secundários
como estudo de caso. A produção de pigmentos orgânicos de cor vermelha
(rubropuntamina e monascorubramina) por Monascus sp. apresenta interesse devido
à sua aplicação na indústria de alimentos, uma vez que, atualmente, grande parte
dos corantes utilizados são importados. Além disso, pigmentos de Monascus podem
ser usados em substituição parcial ou total dos colorantes utilizados em produtos
cárneos (nitritos e nitratos), os quais dão origem a nitrosaminas (substâncias
cancerígenas) (BAKOŠOVÁ et al., 2001).
Espécies de Monascus produzem outros metabólitos, além dos pigmentos,
tais como: mevinolina (molécula de ação anticolesterolêmica), ácido dimerúmico
(antioxidante que retarda o envelhecimento e melhora a capacidade de memória) e
antibióticos (LIN et al., 2008). Por outro lado, Monascus sp. produz uma molécula
nefrotóxica, a citrinina, cuja produção é indesejável em alimentos. Para os pigmentos
vermelhos produzidos por Monascus sp., verificaram-se valores de absorbância (U)
da ordem de 10 a 15 vezes maiores na fermentação semi-sólida em comparação
aos cultivos submersos (OROZCO; KILIKIAN, 2008).
Objetivos
22
2. OBJETIVOS
O objetivo geral foi verificar a influencia da agitação em cultivo no estado
sólido visando o crescimento de Monascus sp. em arroz e produção de metabólitos
secundários. Para tanto, procurou-se atingir os seguintes objetivos específicos:
• Indicação das variáveis de operação do biorreator com influência significativa
no estabelecimento da homogeneidade térmica e química do meio.
• Estabelecer, através de análise fatorial, os parâmetros mais importantes no
crescimento,remoção de calor e homogeneidade de reatores com agitação.
• Determinação da cinética de crescimento, consumo de substrato e produção de
metabólitos secundários sob diferentes condições de agitação do substrato.
• Realizar balanços de massa e de energia, nos cultivos em biorreator.
Revisão bibliográfica
23
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Monascus sp
Monascus sp. são classificados como fungos filamentosos e são pertencentes a
classe dos Ascomicetos, isto é, que produzem esporos em corpos de frutificação
específicos chamados ascos. Os fungos do gênero Monascus são divididos em 24
espécies (THE DICTIONARY OF THE FUNGI, 2006). O fungo é constituído por
hifas, formadas por células longas e ramificadas de cerca de 5 µm de espessura
que, em conjunto com outras hifas formam o micélio. A reprodução assexuada
ocorre via formação de conídios e a reprodução sexuada envolve a formação dos
ascos. As células são típicamente constituídas por uma parede tubular de quitina e
β-Glicanos e são dividas por septos que dão estabilidade às hifas, já que evitam a
possibilidade de perda de citoplasma no caso de haver algum dano ou ruptura da
membrana celular (CARELS;SHEPHERD, 1975). Macroscopicamente, fazem parte
do grupo dos bolores, por apresentarem colônias filamentosas conforme ilustrado na
figura 1.
Figura 1 - (A) Hifas de Monascus ruber cultivadas em meio líquido, observados em microscópio, aumento de 1000x, (B) Monascus ruber em arroz, observado em microscópio, aumento de 100x (fotos tiradas no LEB/DEQ/EPUSP).
Historicamente, Monascus sp. tem sido utilizado em diversos países, sobretudo
China e Japão, para produção de vinho de arroz, queijo vermelho de soja e Anka
(arroz vermelho), através de cultivos semi-sólidos em arroz (LIN, 1973). Nestes
(A) (B)
Revisão bibliográfica
24
países, produtos preparados com Monascus sp. são consumidos como alimentos
funcionais, para a prevenção de problemas gástricos e intestinais, controle dos
níveis de colesterol, estimulante da circulação sangüínea e da digestão.
Na Ásia, enzimas e metabólitos secundários de fungos são produzidos em
larga escala por fermentação em meio sólido, os processos variam de região para
região e são passados de pai para filho (HOLKER; LENZ, 2005)
O metabolismo dos microrganismos pode ser dividido em primário e
secundário. O metabolismo primário envolve as vias de síntese de produtos
intermediários de baixa massa molecular objetivando a produção de energia para as
reações de biossíntese de macromoléculas essenciais para a estrutura e o
funcionamento celular. O metabolismo secundário em fungos compreende vias
síntese de compostos que, a princípio, não apresentam papel essencial ao
crescimento e que são sintetizados a partir de precursores e energia gerados ao
longo do metabolismo primário (PAZOUKI; PANDA,2000).
O Monascus sp., bem como outros fungos filamentosos, utilizam
preferencialmente carboidratos como fonte de carbono e energia e produzem
compostos como etanol e enzimas e metabóilitos secundários pela via policetídica
(JUZLOVA; MARTINKOVA; KREN, 1996). Várias destas moléculas são de interesse
comercial como pigmentos para alimentos (rubropuntamina e monascorubramina),
anticolesterolêmico (mevinolina), antioxidantes, anti-hipertensivos, antibióticos (LIN
et al., 2008).
As principais vias glicolíticas para a utilização de carboidratos como fonte de
energia em fungos são a via de Embden-Meyerhof e a via das pentoses. As
moléculas de piruvato geradas nas vias glicolíticas podem seguir basicamente dois
caminhos (1) ciclo de Krebs, que degrada o piruvato a unidades de CO2 com
simultânea geração de coenzimas reduzidas do tipo NADH e FADH2 e precurssores
da síntese de aminoácidos (2) sob condições limitadas de oxigênio, o Monascus
ruber apresenta metabolismo respirofermentativo verificado através da produção de
etanol (HAJJAJ et al., 1999).
Dentre os metabólitos secundários produzidos pelo gênero Monascus, os
pigmentos são os mais estudados por seu potencial de aplicação na indústria de
alimentos (BAKOŠOVÁ et al., 2001) e são conhecidas duas moléculas vermelhas
(rubropuntamina e monascorubramina), duas moléculas de cor laranja
(rubropuntatina e monanascorubrina) e duas moléculas amarelas (monascina e
Revisão bibliográfica
25
ancaflavina). Os pigmentos laranjas são sintetizados através da via dos policetídeos
e não são hidrossolúveis. Reações com aminoácidos levam à formação dos
pigmentos vermelhos, que são hidrossolúveis (HAJJAJ et al.,2000).
A produção dos pigmentos em Monascus sp. pode ocorrer simultaneamente à
produção de citrinina (monascidina A), molécula nefrotóxica, que não é produzida
por todas as espécies de Monascus e pode ter sua produção reduzida sob certas
condições de cultivo.
Atualmente, a principal molécula de interesse produzida por Monascus sp. é a
mevinolina, também conhecida como lovastatina que é um anticolesterolêmico por
ser um inibidor competitivo da enzima limitante da biossíntese do colesterol
(CHANG, 2002, VALERA, 2006, MIYAKE, 2006, PANDA, 2009)
Tradicionalmente Monascus sp. é cultivado em arroz, produto que é
amplamente consumido nos países asiáticos. Os pigmentos de Monascus,
entretanto, são proibidos no ocidente para uso como aditivo alimentar por causa da
ocorrência da citrinina. No Brasil é permitida a venda de um medicamento de nome
Monaless® que é indicado para redução dos níveis de colesterol sanguíneo e é
constituído exclusivamente de arroz fermentado por Monascus purpureus.
3.2. Arroz
O arroz (Oryzae sativa) é originário do sudeste da Ásia e as mais antigas
referências ao arroz são encontradas na literatura chinesa, há cerca de 5.000 anos.
O arroz foi levado para Europa pelos árabes entre os séculos VII e VIII e os
espanhóis o trouxeram para as Américas (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2010). A
tabela 1 apresenta a composição centesimal do arroz.
A produção de pigmentos por Monascus sp. em arroz é superior a outros
substratos sólidos (JOHNS; STUART, 1991) provavelmente por causa de sua
composição ou de sua estrutura microscópica que permite a penetração das hifas e
difusão dos pigmentos (EVANS; WANG, 1984 ; JUZLOVA; MARTINKOVA; KREN,
1996).
Revisão bibliográfica
26
Tabela 1 – Composição centesimal do arroz (adaptação de TABELA BRASILEIRA DE COMPOSIÇÃO DE ALIMENTOS, 2010)
Valor por 100g (base úmida) Valor por 100g (base seca) Umidade (g) 12,33 -
Energia (kcal) 346 - Energia (kJ) 1.450 - Proteínas (g) 6,73 7,70
Lipídios Totais (g) 0,89 1,02 Carboidratos Totais (g) 79,57 90,80
Cinzas (g) 0,48 0,55 Fibra alimentar total 1,69 1,90
3.3. Fermentação no estado semi-sólido
A Fermentação em Estado Sólido (FES) tradicionalmente é definida como o
processo no qual microrganismos crescem em substrato insolúvel em água na
ausência de água livre (MOO-YOUNG; CANNEL, 1980). Neste tipo de cultivo, a
umidade necessária para o crescimento microbiano existe em estado absorvido ou
complexado na matriz sólida o que favorece a transferência de oxigênio para o meio,
pois o microrganismo permanece em contato direto com uma corrente de ar
(RAGHAVARAO; RANGANATHAN; KARANTH, 2003). Quando ocorre água livre, o
cultivo é definido como Fermentação em Estado Semi-Sólido (FSS) (PANDEY, 2003
; COUTO; SANROMÁN, 2006). Há ainda outras definições de fermentação. De
acordo com Auria et al. (1993), o cultivo em meio sólido é caracterizado como um
sistema de 4 fases onde a fase móvel é o ar (ou mistura de gases), a fase sólida é
composta por um suporte insolúvel em água, contendo uma fase correspondente a
uma solução de nutrientes. O microrganismo constitui a quarta fase, e cresce no
interior ou superfície do suporte insolúvel. Pandey, Soccol e Mitchell (2000) definiram
2 tipos de processos: (1) Fermentação em Substrato Sólido, em que o substrato
serve como fonte de carbono, e o microrganismo cresce na ausência de água livre e
(2) Fermentação em Estado Sólido, em que a matriz sólida serve apenas como
suporte inerte.
Substratos sólidos tradicionalmente empregados para cultivo de
microrganismos incluem uma variedade de produtos agrícolas como grãos, polpa de
frutas e resíduos agrícolas, palhas, restos florestais e bagaços. Estes substratos são
Revisão bibliográfica
27
naturalmente ricas fontes de açúcares (amido, glicose, sacarose) e nutrientes,
muitas vezes requerendo somente a adição de água para o cultivo. Em alguns
casos, um pré-tratamento ou preparo do substrato é necessário, incluindo etapas
como:
• Redução do tamanho das partículas por moagem ou quebra;
• Hidrólise enzimática, física ou química dos polímeros de açúcar;
• Suplementação com nutrientes (fósforo, nitrogênio e elementos traço),
adequação do pH e umidade;
• Cozimento ou tratamento com vapor de água para pré-degradação da
estrutura macromolecular e eliminação de contaminantes.
A literatura tem reportado a versatilidade do uso de FES, mostrando a
possibilidade de produção de uma variedade de produtos de interesse comercial,
como o cultivo de cogumelos (BANO et al., 1996), produção de enzimas (PANDEY
et al., 1999), ácidos orgânicos (VANDENBERGHE et al., 2000), antibióticos
(GONZALEZ et al., 1988), biopesticidas (DESGRANGES et al., 1993), etc.
Para alguns produtos, a FES apresenta vantagens em relação à fermentação
submersa (FSm), como por exemplo na economia de água, produtividade elevada,
utilização de fontes de carbono baratas (resíduos agrícolas) e reduzida possibilidade
de contaminação, já que a umidade utilizada nestes cultivos é baixa e restritiva para
muitos microrganismos (PANDEY; SOCCOL; MITCHELL, 2000). Além disso,
disponibilidade restrita de água em FES pode estimular a produção de alguns
produtos específicos que não seriam produzidos na fermentação submersa
(HOLKER; HOFER; LENZ, 2004) e, em alguns casos onde os produtos podem ser
produzidos por FES ou fermentação submersa, a FES apresenta uma maior
produtividade volumétrica (MOO-YOUNG; MOREIRA; TENGERDY, 1983; SATO;
SUDO, 1999).
A FES é indicada para o crescimento de fungos filamentosos, especialmente
em situações onde pode ocorrer repressão catabólica, já que FES apresenta fontes
de carbono de mais difícil acesso em relação a cultivos submersos (FAVELA-
TORRES et al., 1998). Viniegra-González et al. (2003), cultivando Aspergillus niger
em diversas fontes de carbono em FES e FSm, mostrou que em FES não ocorre a
repressão catabólica e que o consumo de substrato e produção de biomassa é mais
eficiente neste processo. Tengerdy (1996) relata que a eficiência da produção de
celulase por FES pode ser de cem vezes em relação a cultivos submersos.
Revisão bibliográfica
28
O cultivo em substrato sólido pode apresentar dificuldades, como a elevada
demanda de energia em caso de processos que utilizem agitação contínua.
Substratos naturais são de composição variável, proporcionando fontes de carbono
mistas e fontes complexas de nutrientes, dificultando a padronização e
reprodutibilidade do processo. A formação de gradientes de temperatura ao longo do
leito de cultivo, devido à geração de calor metabólico é um fator prejudicial, pois
altas temperaturas não são favoráveis para o crescimento dos microrganismos, bem
como para a formação do produto.
O Brasil, assim como outros países com alta produção agrícola, apresenta
potencial para o desenvolvimento da tecnologia de FES. A atividade agroindustrial
gera grande quantidade de resíduos que podem ser aproveitados como substrato de
baixo custo gerando menos impacto ambiental e produzindo compostos de maior
valor agregado como ácido cítrico, ácido giberélico, corantes e aromas, entre outros
(PANDEY; SOCCOL; MITCHELL, 2000)
A dificuldade de aplicação da tecnologia de FES em larga escala são as
limitações na transferência de massa e calor que dificultam o controle das condições
de crescimento dos microrganismos. Associado a isso, a dificuldade de modelagem
dos reatores para FES em virtude da heterogeneidade do meio se traduz em
reatores construídos de forma empírica, gerando baixa eficiência e baixo
desempenho econômico. (MITCHELL; KRIEGER; BEROVIC, 2006).
A modelagem de FES passou a despertar maior interesse por volta de 1990 e,
apesar dos avanços obtidos desde então, muitos aprimoramentos são necessários
antes que os modelos sejam rotineiramente usados no projeto de reatores de FES
(MITCHELL; KRIEGER; BEROVIC, 2006).
Cada modelo matemático deve considerar as variáveis relevantes do
processo que são os fenômenos de transferência de calor e massa e a cinética de
crescimento dos microrganismos. Desse modo os modelos matemáticos em dois
submodelos:
• Submodelo cinético que descreve como o organismo cresce em função das
condições ambientais (especialmente fatores como gradientes de
temperatura, gradientes de umidade e gradientes de concentração de
oxigênio).
Revisão bibliográfica
29
• Submodelo de transferência de massa e calor que descreve como o
crescimento do microrganismo e as condições de operação afetam a
temperatura, concentração de oxigênio e a umidade do ambiente em função
do tempo e da posição dentro do reator.
Com respeito aos submodelos de transferência de massa e calor, os
mecanismos são bem descritos matematicamente por serem princípios básicos da
engenharia química tradicional, embora cada novo substrato demande a
necessidade de determinação dos parâmetros de transferência de massa e calor.
Devido à natureza sólida dos substratos, é muito difícil homogeneizar uniformemente
o leito e, como resultados, os gradientes de temperatura, água e metabólitos são
inevitáveis (ASHLEY; MITCHELL; HOWES, 1999), e geram dificuldades de aumento
de escala, principalmente associadas com a remoção do calor metabólico gerado
pelo crescimento dos microrganismos (LEKANDA; PÉREZ-CORREA, 2004).
Um aspecto pouco conhecido é a influência do crescimento modificando os
parâmetros de transferência de calor e massa devido a alterações nas propriedades
do meio. A agitação é outro parâmetro pouco descrito. Schutyser et al. (2004)
publicaram resultados de pesquisa especialmente focada em análises experimentais
e matemáticas da mistura de leitos de substratos sólidos.
Com respeito aos submodelos de cinética, as equações freqüentemente
incorporadas na modelagem do reator são inadequadas. Por exemplo, o modelo
logístico é tipicamente usado para descrever o crescimento devido a sua
simplicidade matemática. Porém esse modelo não é adequado para descrever o
efeito da variação da temperatura que ocorre no leito nos parâmetros da equação de
crescimento ou os efeitos dos danos causados pela agitação no micélio e
conseqüente redução da velocidade de crescimento ou produção de metabólitos.
Além disso, o modelo logístico não descreve a complexidade dos processos de
reação e difusão que ocorrem na micro escala e que podem influenciar o
crescimento (RAHARDJO; TRAMPER; RINZEMA, 2006). É necessário agora,
demonstrar que essas estratégias podem otimizar a performance dos processos e
melhorar os modelos matemáticos para que eles possam ser usados para
estabelecer critérios para a ampliação de escala. Outros aspectos chave em FES
são a seleção das variáveis do processo que possuem efeito sobre o mesmo, bem
como a sua otimização. Nisso incluem-se os parâmetros físico-químicos e
Revisão bibliográfica
30
bioquímicos, tais como: tamanho de partícula, umidade inicial, pH, pré-tratamento
dos substratos, umidade relativa, temperatura de incubação, agitação, aeração,
idade e tamanho do inóculo, suplementação de nutrientes, extração do produto e
purificação do mesmo, entre outros (PANDEY, 2003). Para a otimização dessas
variáveis a utilização da metodologia de planejamento de experimentos e análise de
superfície de respostas é uma boa ferramenta e pode auxiliar na escolha das faixas
apropriadas que levam a otimização do processo (RODRIGUES; IEMMA, 2005).
Entretanto, as correlações entre as condições do meio como demanda de oxigênio,
umidade e temperatura dificultam o controle das variáveis (HOLKER; LENZ, 2005).
Um exemplo disso é a evaporação da água, através da aeração, que facilita a
retirada de calor, porém resseca o meio e conseqüentemente pode ser prejudicial ao
microrganismo. Outro exemplo é que baixas umidades dificultam o transporte de
nutrientes, porém altas umidades dificultam a difusão de oxigênio (PANDEY, 2003).
3.4. Estimativa de crescimento em FSS
A dificuldade de separar o conteúdo de células do substrato é uma grande
dificuldade na modelagem do crescimento microbiano uma vez que o crescimento
não pode ser estimado. A falta de precisão na estimativa do crescimento celular é
uma desvantagem para a evolução da pesquisa em FES em relação aos cultivos
submersos (SMITS et al., 1996).
Desgranges e colaboradores (1991) classificaram os métodos indiretos de
medida de biomassa em FES em 3 categorias, (1) determinação de constituintes
celulares, tais como quitina, ergosterol, ácidos nucléicos, glicosamina e proteínas;
(2) determinação de atividade biológica, tais como ATP, atividade enzimática,
velocidade de respiração; e (3) consumo de nutrientes.
Nenhum método indireto de estimativa de biomassa é universal para todos os
substratos e microrganismos e para cada situação deve ser escolhido qual o método
mais eficiente baseado no custo, simplicidade e precisão (ROCHE et al., 1993;
KRISHNA, 2005).
Dentre os componentes celulares, o ergosterol é um componente da
membrana que não está presente nos vegetais. Desgranges et al. (1991) e Ooijaas;
Tramper; Buitelar (1998) verificaram grande variação no conteúdo de ergosterol de
Revisão bibliográfica
31
acordo com a idade da cultura e não recomendam o uso desta metodologia,
entretanto, Matcham; Jordan; Wood (1985) e Raimbault (1998) indicam essa medida
para a estimativa de biomassa por ser mais simples e sensível que a medida de
glicosamina.
A medida do consumo de oxigênio e da produção de dióxido de carbono é,
provavelmente, o método de estimativa de crescimento celular mais estudado pois
são medidas “online” (RAIMBAULT, 1998) e que não necessitam de amostragem.
Muitos autores propuseram modelos de estimativa de crescimento baseada
na respiração. Sato et al. (1983) fizeram a medida de biomassa baseada no
consumo de oxigênio pelo microrganismo, para o cultivo de Candida lipolytica em
FES. A medida era feita a partir de dados de velocidade de consumo de O2 (OUR),
fator de conversão de O2 a células (YX/O) e coeficiente de manutenção celular de
oxigênio (m0). Rodriguez et al. (1988) também estimaram o crescimento de
Aspergillus niger através da respiração. Esta abordagem foi posteriormente
adaptada por Maiorano (1990) para o cultivo de Aspergillus oryzae em meio sólido,
com as constantes YX/O e m0 estimadas em cultivo submerso. A maior dificuldade de
utilização desta metodologia é a determinação dos parâmetros YX/O e m0. Koutinas;
Wang; Webb (2003) usam a produção de CO2 para estimar o crescimento e apesar
de conseguirem estimar velocidade específica de crescimento compatível com
dados de literatura, 0,21 h-1, concluem que o fator de conversão de CO2 a células
(YX/CO2) varia com as condições de cultivo causando erros. Marsh et al. (1998)
sugerem que não se deve converter o oxigênio consumido em biomassa pois
consumo de oxigênio é associado ao crescimento e à manutenção e então a
correlação com a biomassa não é direta. Além disso, os modelos de estimativa se
baseiam em parâmetros determinados na temperatura ótima de crescimento o que
não ocorre na maioria dos biorreatores.
3.5. Reatores para FES
A maior parte dos trabalhos publicados em FES reportam a produção em
escala de laboratório. A ampliação de escala é desafiante por causa da formação de
gradientes de temperatura, umidade e concentração de substrato, os quais se
intensificam ao longo do cultivo e têm efeito adverso sobre o crescimento
Revisão bibliográfica
32
especialmente em leitos estáticos mas também em leitos com agitação (HOLKER;
LENZ, 2005).
Agitação ou rotação em fermentação em meio sólido é usada para aumentar
a velocidade de transferência de massa e calor, porém forças de cisalhamento
causadas pelo movimento podem ter efeitos adversos no micélio ou na porosidade
do meio (COUTO SANROMAN, 2006).
Ocorrem muitas variações nas construções e operação dos reatores para
tentar solucionar ou minimizar os problemas relacionados à ampliação de escala de
FES. Para a escolha do modelo de reator a ser utilizado deve ser considerada a
possibilidade de monitoramento e controle dos parâmetros do processo,
características do microrganismo e do substrato e custos envolvidos
(RAGHAVARAO; RANGANATHAN; KARANTH, 2003). Mitchell et al. (2004) fazem
uma revisão dos modelos difusão de oxigênio, enzimas e substrato em meio sólido
que auxiliam no entendimento de sua influência no crescimento celular e no
desempenho de reatores.
Muitos reatores podem ser utilizados em FES e baseado em sua construção e
operação podem classificados em grupos pelo tipo de aeração e pelo sistema de
agitação (MITCHELL; KRIEGER; BEROVIC, 2006):
• Biorreatores de bandejas onde o leito permanece estático e o ar é
circulado sobre a camada de substrato.
• Biorreatores de leito fixo onde o meio de cultivo permanece estático e o
ar é forçado através do leito.
• Tambores rotativos ou agitados onde o leito é continuamente ou
intermitentemente agitado e o ar é circulado em torno ou sobre o meio.
• Reatores de mistura ou leitos fluidizados onde o meio é continuamente
ou intermitentemente agitado e o ar é forçado através do leito.
Os reatores de leito fixo, tanto com aeração forçada quanto em bandejas, são
recomendados para processos em que a agitação é prejudicial ao substrato e ao
microrganismo. A simplicidade e facilidade de operação são as vantagens desse tipo
de reator (DURAND, 2003). Entretanto, em larga escala os reatores em bandejas
ocupam muito espaço e mão de obra. Já os reatores de leito fixo, principalmente
quando se visa a larga escala, têm o inconveniente de gerar gradientes térmicos e
de nutrientes e dificuldade de aeração homogênea (ASHLEY; MITCHELL; HOWES,
Revisão bibliográfica
33
1999). A remoção de calor por evaporação pode ser um mecanismo de controle da
temperatura de cultivo, porém em leito fixo a reposição da água evaporada é difícil.
Os biorreatores do tipo tambor rotativo podem sofrer agitação contínua ou
descontínua e se comportam como bandejas no período em que estão estáticos
(MITCHELL, 2000). A agitação branda impede a formação de grumos pelo
microrganismo que se adere ao substrato (KRISHNA, 2005), além disso, apresenta
bom potencial para a transferência de calor, de umidade e de nutrientes. Por um
lado, a agitação promove trocas gasosas e remoção de calor, por outro lado, pode
perturbar o crescimento. Uma desvantagem em relação aos reatores agitados é que
a ocupação deve ser de 30% a 50% da capacidade, ou a agitação não será
eficiente. (COUTO SANROMAN, 2006).
Os reatores agitados, ou seja, com agitação interna tem a desvantagem de
demandar mais energia e provocar mais danos ao microrganismo devido às forças
de cisalhamento do que os reatores rotativos. Teng e Feldheim (2000) relataram que
a produção de pigmentos por Monascus sp. é afetada pela agitação, porém a
influência da agitação é diferente para cada tipo de pigmento. A produção de
pigmentos vermelhos é reduzida quando se aplica maior agitação enquanto que a
produção de pigmentos amarelos não é afetada.
Os reatores com agitação e aeração forçada têm a perspectiva para a
ampliação de escala uma vez que podem promover a homogeneidade térmica e
mássica e a remoção de calor e permitem a reposição de água e nutrientes. Nagel et
al (2001) estudaram a remoção de calor no crescimento de Aspergillus oryzae em
reator com agitação interna e concluiram que acima de 2 m3 de volume de meio a
remoção de calor por evaporação é crucial para manter a temperatura controlada,
pois a remoção de calor por condução é insuficiente.
Apesar do interesse em desenvolver novos modelos de reatores que atendam
as necessidades específicas dos cultivos, é reduzido o número de artigos que
estuda o efeito da agitação sobre os cultivos. O consumo de oxigênio em cultivos de
Rhizopus sp. em reator do tipo tambor rotativo de 200 l foi estudado por Marsh et al.
(1998) que o uso de aletas na construção do reator para a promoção da
homogeneidade aumenta o dano ao microrganismo. Han; Kiers e Nout (1999)
estudaram duas cepas de Rhizopus cultivadas em soja e concluíram que alguns
microrganismos são mais resistentes à agitação.
Revisão bibliográfica
34
Prado et al. (2004) compararam a produção de ácido cítrico por Aspergillus
niger em colunas de leito fixo e reatores tipo tambor rotativo concluindo que a
produção é maior em colunas e sob condições limitadas de crescimento. Gasiorek
(2008) verifica a melhor condição de operação (agitação e aeração) de um reator
com agitação interna para cultivo de Aspergillus niger em polpa de beterraba para a
produção de ácido cítrico e também conclui que a melhor condição de crescimento
não é a que favorece a produção de ácido cítrico.
Materiais e Métodos
35
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Microrganismo: armazenamento e inóculo
O Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB/DEQ/EPUSP) possui uma
coleção de Monascus sp. (micoteca) da qual fazem parte microrganismos isolados a
partir de produtos comerciais e cepas de coleções de cultura. Na referida micoteca,
esporos das cepas são preservados através de cultivos subseqüentes em arroz. O
uso de arroz – habitat comum de Monascus sp. – tem por objetivo manter o
desempenho das cepas, sobretudo quanto à produção de pigmentos.
Para esse trabalho foi utilizada a cepa LEB A1-3 de Monascus ruber, isolada
no LEB a partir de produto comercial (MIYASHIRA, 2003).
No preparo do estoque, esporos da cepa armazenada em arroz foram
suspensos em água e inoculados em 30 g de arroz, em erlenmeyer, e cultivados por
20 dias a 300C. Foram adicionados, então, 100 ml de água sob agitação manual. A
suspensão resultante (cada 20 ml) foi utilizada para inocular 100 ml de meio
glicosado líquido, contido em erlenmeyer de 500 ml, previamente esterilizado por 20
minutos, a 121ºC. Essa suspensão foi colocada em incubador rotativo a 300 rpm e
30ºC, até surgimento de coloração alaranjada (cerca de 40 horas), resultando em
suspensão de células vegetativas, com concentração celular de cerca de 3 g.l-1. Em
seguida, 10 ml dessa suspensão inocularam novamente 100 ml de meio glicosado
líquido, em erlenmeyers de 500 ml, e seguiram para propagação das células em
incubador rotativo a 300 rpm e 30ºC. À suspensão de células assim obtida (3 g.l-1),
adicionou-se solução de glicerol a 20% (v/v), em proporções iguais, resultando
suspensão de células em glicerol a 10% (v/v) que foi colocada em tubos criogênicos
de 10 ml. Os tubos foram armazenados em ultrafreezer a – 80ºC. A figura 2 mostra o
fluxograma de preservação e preparo do estoque de microrganismos.
Materiais e Métodos
36
Figura 2- Preparo de estoque de células congeladas para os cultivos em reator.
4.2. Meios de cultivo
• Meio glicosado líquido: peptona (5 g.l-1); extrato de carne (3 g.l-1) e glicose
(10 g.l-1).
• Arroz polido, água suficiente para umidade de 45% (base úmida).
Os meios foram preparados com água destilada e esterilizados em autoclave
121°C, por 20 minutos.
4.2.1. Tratamento térmico do substrato para os cultivos em reator
Para cada ensaios, foram preparados seis sacos de polipropileno com 1250 g
de arroz polido cada (totalizando 7500 g para uma batelada no reator) e água
destilada suficiente para resultar 45% de umidade em base úmida. Os sacos foram
colocados em autoclave a 121 ºC por 20 minutos para esterilização e gelatinização
do amido.
Micoteca em Arroz
Geração de esporos em arroz
Crescimento em meio glicosado líquido (2 etapas)
Congelamento para estoque em solução de glicerol 10 % (v/v) a -800C
Repiques em arroz para
preservação
Materiais e Métodos
37
4.3. Inóculo do reator
Para preparo do inóculo dos cultivos em reator, 20 ml de suspensão de
células congeladas inoculavam 100 ml de meio glicosado líquido, a seguir os frascos
foram colocados em incubador rotativo a 300 rpm e 30 ºC, até surgimento de
coloração alaranjada, resultando dessa forma uma suspensão de células
vegetativas, com concentração celular de cerca de 3 g.l-1.
Para cada ensaio em biorreator, foram utilizados 7,5 kg de arroz (o que
representa uma ocupação de cerca de 47 % do volume do reator), inoculados com
750 ml de inóculo, correspondendo a uma concentração de aproximadamente 0,3
mg de células por grama de substrato seco.
4.4. Biorreator
O Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) possui um biorreator do tipo
tambor com agitação interna, construído com o projeto PIPE (99/01861-0) (Nagel et
al., 2001), dotado de recursos para controle da aeração, temperatura, agitação e
umidade.
O biorreator, apresentado na figura 3, é composto por um tambor cilíndrico
com diâmetro interno de 325 mm e comprimento de 500 mm, com corpo de aço inox,
tendo um volume de 40 l. O sistema de agitação permite a variação da rotação do
eixo entre 2 e 20 rpm, com possibilidade de programação para função intermitente
ou seja, pode-se ajustar o intervalo de tempo sob agitação e sob repouso.
A parte superior do reator é dotada de dois bocais os quais foram previstos
para adição de água (reposição da água perdida por evaporação), suspensão de
células ou solução de nutrientes. O ar é distribuído no interior do reator entrando
pelo eixo central e saindo pelo suporte de cada pá, havendo dois orifícios no corpo
do reator para saída de gases. Na parte inferior do biorreator, há uma válvula
esterilizável por vapor, para a retirada de amostras.
A camisa de resfriamento permite troca de calor entre o meio e a parede,
parcela importante na remoção do calor metabólico gerado durante o crescimento
celular.
O reator conta ainda com um sistema de geração e vapor d’água e tanque de
Materiais e Métodos
38
condensado que permite a esterilização do reator de forma automática.
Os sensores e medidores do reator estão descritos na tabela 2 e a figura 3
apresenta um esquema do reator.
Tabela 2 - Resumo dos pontos monitorados no biorreator
Item Quantidade Total
Camisa Temperatura de entrada de água 1 Temperatura de saída da água 1 Vazão de água 1 Corpo do reator Temperatura da fase gasosa 2 Temperatura da fase sólida 4 Temperatura do ar de entrada 1 Temperatura do ar de saída 1 Umidade da fase gasosa interna 0 Umidade do ar de entrada 0 Pressão 1 Periféricos Medidor de fração molar de O2 na saída do gás 1 Medidor de fração molar de CO2 na saída do
gás 1
Controlador da vazão de ar 1
Figura 3 – Esquema do biorreator para fermentação semi-sólida do LEB/DEQ/EPUSP
Entrada de Ar
Água
Água da camisa Amostrador
Motor
Água da camisa
Entrada de Ar
Água
Água da camisa Amostrador
Motor
Água da camisa
Materiais e Métodos
39
4.5. Etapas dos ensaios em biorreator
Os ensaios em biorreator compreendem as seguintes etapas: esterilização do
meio nos sacos de polipropileno; esterilização do reator vazio; carregamento do
reator com o substrato esterilizado; preparo do meio no reator (ajuste da umidade
inicial, estabilização da temperatura e do fluxo de água na camisa); inoculação e
cultivo com amostragens periódicas (uma vez ao dia).
Os ensaios em biorreator foram conduzidos nas seguintes condições:
ocupação de cerca de 47 % do volume do reator, temperatura do meio de cultivo
ajustada inicialmente a 30ºC e umidade inicial do meio de cerca de 45% em base
úmida. As características da agitação e vazão de ar variaram como descrito no item
4.7.
Amostras foram retiradas em diferentes pontos do reator antes dos eventos
de agitação (figura 4) para avaliar a homogeneidade do meio de cultivo após o maior
período sem agitação em cada experimento, e pela válvula amostradora, no caso
das amostragens após o evento de agitação.
As amostras retiradas foram secas em estufa a 50ºC por 48 horas, moídas em
moinho de facas marca Marconi (modelo M345) por 1 minuto e armazenadas em
refrigerador.
Figura 4 - Esquema lateral e frontal do reator com indicação dos diferentes pontos de amostragens
axial (A,B e C) e radial (D e E).
A B CMotor
Camisa
Amostrador inferior
A B CMotor
Camisa
Amostrador inferior
Motor
Camisa
MotorMotor
Camisa
Amostrador inferior
Amostrador superior
D
E
Amostrador superiorAmostrador superior
D
E
Materiais e Métodos
40
4.6. Metodologia Analítica
4.6.1. Umidade
A umidade das amostras do meio de cultura foi determinada em analisador de
umidade por infravermelho, marca Ohaus, modelo M35. O conteúdo de umidade foi
expresso em porcentagem, tomando-se a razão entre o conteúdo de água expresso
em gramas e a massa do meio úmido (g água.g amostra úmida-1).
A umidade também foi feita em estufa a 50OC até peso constante.
4.6.2. Extrato etanólico
Suspenderam-se 0,5 g de amostra seca e moída em 25 ml de etanol 70% v/v.
A suspensão foi homogeneizada sob agitação em vórtice, levada a banho à 60ºC por
duas horas e filtrada através membrana de ésteres de celulose de porosidade 0,45
µm, sob vácuo.
4.6.3. Pigmentos vermelhos
O extrato etanólico filtrado foi analisado em espectrofotômetro de varredura
(Beckman DU®530, EUA). Os valores de absorbância nos comprimentos de onda de
400 e 500 nm foram utilizados para a quantificação indireta dos pigmentos de cor
laranja e vermelha, respectivamente. O resultado foi expresso em unidades de
absorbância por grama de massa seca da amostra (U.gms–1), considerando-se a
diluição para obtenção do extrato etanólico (equação 1 e 2). A relação entre de
produção de pigmentos vermelhos e laranjas é calculada como a razão entre a
absorbância a 500 nm e a 400 nm, conforme equação 3. A diluição utilizada variou
conforme as amostras.
diluição secaMassa
AbsvermelhosPigmentos 500nm ×= Eq. 1
Materiais e Métodos
41
diluiçãolaranjaPigmentos ×=seca Massa
Abs 400nm Eq. 2
nm 400
nm 500
Abs
Abs=pigmentosdeRazão Eq. 3
4.6.4. Açúcares redutores (AR), açúcares redutores totais (ART)
Para quantificar os AR suspendeu-se 0,5 g de amostra seca em 50 ml de
água em erlenmeyer de 250 ml. Colocou-se a suspensão em incubador rotativo a
30ºC, 300 rpm por 30 minutos. Em seguida a suspensão foi filtrada em papel de filtro
sob vácuo.
A despeito da notação “AR” trata-se de “glicose” uma vez que 80% do arroz é
amido, principal fonte de carbono e energia do meio de cultura.
Para quantificação dos ART foi feita a hidrólise de 0,1 g de meio fermentado
seco e moído, em 8 ml HCl 2 mol.l-1, em banho a 80°C por 1 hora. O pH da
suspensão foi elevado para 4, e filtrada em papel de filtro. A glicose foi dosada no
hidrolisado pelo método enzimático da glicose-oxidase (GOD) empregando-se o
Auto Analyzer II (Technicon). A curva de calibração foi feita utilizando-se glicose
como padrão em concentrações de 0 a 1 g.l-1. O resultado foi expresso em grama de
ART por grama de massa seca (g ART.gms-1).
Realizou-se também a análise dos ART pelo método do ácido dinitrosalicílico,
DNS (MILLER, 1959), para as análises de padronização e comparação de métodos
(item 5.1.2).
4.6.5. Proteína total
A dosagem de proteína total foi realizada pelo método Folin-Ciocalteau
(LOWRY, 1951), após a hidrólise de 0,1 g de meio fermentado seco e moído em 20
ml de NaOH 0,5 mol.l-1, a 100°C por 5 min. A curva de calibração foi feita utilizando-
se soro albumina bovina (BSA) como padrão em concentração de 0 a 2 g.l-1. O
Materiais e Métodos
42
resultado foi expresso em grama de proteínas por grama de massa seca (g
proteína.gms-1).
4.6.6. Análise de ergosterol
Implantou-se metodologia para dosar ergosterol para estimativa de
crescimento celular baseada em Carvalho et al. (2006): a 1 g de amostra adicionou-
se 4 ml de etanol e 2 ml NaOH (2M). Incubou-se a suspensão em banho a 70ºC por
30 minutos. Em seguida foram adicionados 4 ml de HCl, 2 ml de KHCO3 e 4 ml de
hexano. A suspensão foi então centrifugada a 3000 x g por 10 minutos para
separação da fase leve. A fase pesada foi “lavada” com 4 ml de hexano por 3 vezes.
Toda a fase leve foi então levada a um banho a 70ºC para evaporação em capela de
exaustão, até a secagem completa. A amostra foi, então, suspendida em 10 ml de
metanol. A quantificação foi realizada em HPLC com coluna C18 (Waters -
µBondapack) em detector UV com comprimento de onda de 282 nm e 1 ml.min-1 de
metanol como fase móvel.
4.6.7. Análise do gás de saída do reator
As concentrações de O2 e CO2 no gás de saída do reator foram analisadas
com sensor de oxido de zircônio e de infravermelho em analisador de gases,
modelo EX-2000, New Brunswick Scientific Co.
A velocidade de consumo de oxigênio, OUR , a velocidade de produção de
CO2, CER, e o coeficiente respiratório, RQ, foram calculados através de balanços
materiais de O2 e CO2 no biorreator e determinados pelas seguintes equações:
F T R
)Y - (Y )P(POUR
saídaOentradaOH2Oba 2 2
××
×−= Eq. 4
F T R
)Y - (Y )P(PCER
entrada COsaídaCOH2Oba 2 2
××
×−= Eq. 5
Materiais e Métodos
43
OUR
CER=RQ Eq. 6
Onde:
OUR - Velocidade de consumo de oxigênio (mol O2.h-1)
CER - Velocidade de produção de dióxido de carbono (mol CO2.h-1)
RQ – coeficiente respiratório F - Vazão total de gás de entrada no reator (l.h-1) R - Constante universal dos gases = 62,361 (mmHg.l.K-1.mol-1) T - Temperatura (K) PBa - Pressão barométrica no instante de medida e corrigida conforme norma ABNT – MB 372 (mmHg) PH2O - Pressão de vapor da água a 30°C (mmHg) YO2 - Fração molar de O2 (na entrada e na saída do reator) YCO2 - Fração molar de CO2 (na entrada e na saída do reator)
O consumo de oxigênio é destinado ao crescimento e à manutenção celular e
pode ser descrito pela equação 7 (RODRIGUEZ LEON et al., 1988)
+×= OURO Xm
dt
dXOUR .
Y
1
X/O
Eq. 7
4.7. Cultivos
Foram realizados 4 experimentos em reator, conjunto I, para obtenção de
dados preliminares e estabelecimento dos níveis adequados das variáveis
envolvidas para elaboração do planejamento fatorial conforme a tabela 3.
Tabela 3 - Condições dos ensaios preliminares do conjunto I, na ordem de execução.
Ensaio Substrato Aeração Agitação Objetivos
Teste 1 Arroz polido 8 l/min 10 voltas a
cada 24 horas Realizar um primeiro teste no reator
Teste 2 Arroz integral 8 l/min 10 voltas a
cada 24 horas Testar o substrato arroz integral para melhorar a reologia do meio.
Teste 3 Arroz polido
20 l/min 10 voltas a cada 24 horas Aumentar a vazão de ar.
Teste 4 Arroz polido 20 l/min 1 volta a cada
2 horas
Manter as condições do teste 3, porém mudando o padrão de agitação.
Materiais e Métodos
44
Mediante avaliação dos resultados e dificuldades encontradas durante a
realização dos ensaios do Conjunto I, definiram-se os níveis das variáveis para o
Conjunto II, conforme descrito na Tabela 4.
Tabela 4 - Variáveis e níveis do Conjunto de Ensaios II
Variáveis Níveis
-1 +1 PC (0) Aeração 8l/min 20l/min 14l/min Intervalo das agitações 2 h 12 h 7 h Numero de voltas/24horas 12 120 66
Com base na Tabela 4, foi projetado o conjunto de experimentos da Tabela 5
em delineamento fatorial completo totalmente casualisado com 4 repetições no
ponto central. A casualização da ordem de execução dos ensaios foi realizada no
programa Minitab.
Tabela 5 - Conjunto II de ensaios propostos em planejamento fatorial.
Ensaios propostos Aeração
Intervalo agitações
Número de voltas/24horas Padrões de agitação
Ensaio 1 -1 +1 -1 6 voltas/12 horas Ensaio 2 -1 +1 +1 60 voltas/12 horas Ensaio 3 -1 -1 -1 1 volta/2 horas Ensaio 4 -1 -1 +1 10 voltas/2 horas Ensaio 5 +1 +1 -1 6 voltas/12 horas Ensaio 6 +1 +1 +1 60 voltas/12 horas Ensaio 7 +1 -1 -1 1 volta/2 horas Ensaio 8 +1 -1 +1 10 voltas/2 horas 4 repetições no ponto central
0 0 0 16 voltas/6 horas
Baseado nos resultados do conjunto I, nos dois primeiros ensaios do conjunto
II proposto e visando incluir os pontos rotacionais no delineamento experimental,
fez-se a modificação dos níveis anteriormente estipulados para a agitação
Materiais e Métodos
45
diminuindo o número máximo de voltas de 120 para 60 e retirando a variável
aeração que tornou-se parâmetro fixado em 14l/min. A tabela 6 apresenta as
variáveis e seus níveis modificados e a tabela 7 o novo conjunto de experimentos do
planejamento fatorial completo (conjunto III):
Tabela 6 - Variáveis e níveis do conjunto III
Variáveis Níveis
-1,41 -1 PC (0) +1 +1,41 Intervalo entre as agitações 2 h 3h 7 h 11h 12 h Numero de voltas/24horas 12 19 36 53 60
Tabela 7 - Conjunto III de ensaios propostos em planejamento fatorial composto rotacional.
Ensaios Propostos Numero de
voltas/24horas Intervalo agitações Padrões de Agitação
Ensaio A -1 -1 8,72 voltas/11 horas Ensaio B +1 -1 6,63 voltas/3 horas Ensaio C -1 +1 2,38 voltas/3 horas Ensaio D +1 +1 24,31 voltas/11 horas Ensaio E -1,41 0 3,5 voltas/7 horas Ensaio F +1,41 0 17,5 voltas/7 horas Ensaio G 0 -1,41 3 voltas/2 horas Ensaio H 0 +1,41 18 voltas/12 horas 3 repetições no ponto central 0 0 10,5 voltas/7 horas
As análises estatísticas foram feitas de acordo com o delineamento composto
central rotacional totalmente casualisado.
4.8. Balanços
4.8.1. Balanço de entalpia no reator
Utilizando a vazão de água na camisa, dados de temperatura da água que
entra e da água que sai da camisa, do ar que entra e do gás que sai do reator,
efetua-se o balanço de entalpia. Considerou-se que o ar de entrada está seco pois
vem diretamente do compressor e passa por uma coluna se sílica. Para o cálculo
mais preciso da entalpia no gás de saída seria necessária a medida de umidade,
porém como não foi possível essa medida, considerou-se o gás de saída como ar
Materiais e Métodos
46
saturado.
O balanço de entalpia para o biorreator compreende três parcelas de fluxos: o
calor removido pela água da camisa Jcamisa, o calor removido pelo ar circulante Jevap,
e o calor gerado pelo metabolismo microbiano Rmet (Nagel et al., 2001).
evapcamisamet
i
ii JJRcmdt
dT−−=∑ . Eq. 8
Onde:
dT/dt : variação de temperatura no biorreator. mi : é a massa do i-ésimo componente do meio fermentado (biomassa, amido,
fibras) (kg). ci : calor específico do i-ésimo componente (J/kg.K). Jcamisa : calor removido pela camisa do reator (W). Jevap : calor removido por evaporação (W). Rmet : calor produzido pelo metabolismo do fungo (W).
4.8.2. Cálculo do calor metabólico gerado
O calor gerado devido ao processo de respiração microbiana foi determinado
a partir da correlação entre o consumo de oxigênio e a geração de calor (Roels et
al., 1983).
][ 10.460 23 Wdt
dORmet ⋅= Eq. 9
sendo dO2/dt a demanda microbiana por oxigênio, em mol/s.
4.8.3. Cálculo do calor removido pela camisa
O calor removido pela camisa será determinado pela diferença de
temperatura entre os sensores na entrada e saída de água da camisa, e pela vazão
mássica de água.
Materiais e Métodos
47
][ )( , WFCTTJ águaáguaáguapescamisa ρ⋅⋅⋅−= Eq. 10
Onde:
Ts : temperatura da água na saída da camisa, °C. Te : temperatura da água na entrada da camisa, °C. Cp,água : calor específico da água, com o valor de 4175 J/(kg de água .°C). Fágua : vazão volumétrica de água, l/ s. ρágua : densidade da água, com o valor de 1,0 kg/l.
4.8.4. Cálculo do calor removido por evaporação
O cálculo da entalpia do ar envolve a determinação de uma parcela de calor
sensível e uma parcela de calor latente, esta última dependente da determinação do
valor de umidade absoluta do ar a partir dos valores de pressão absoluta, umidade
relativa e temperatura. A entalpia do ar é dada pela equação:
( ) ]/[,, kgJ TCHUTCh arvpvAararp ⋅+⋅+⋅= Eq. 11
Onde:
Cp,ar : calor específico do ar, com o valor de 1005 J / (kg de ar seco .°C) Tar : temperatura do ar, °C. UA : umidade absoluta do ar, kg de água / kg de ar seco. Hv : calor latente de vapor de água a 0°C, sendo 2,5.106 J/ kg. Cp,v : calor específico da água, com o valor de 1884 J/(kg de ar seco .°C) O calor removido por evaporação é calculado pela diferença de entalpia do ar
de entrada e do gás de saída do reator
][ )( WFhhJ araresevap ρ⋅⋅−= Eq. 12
Onde:
hs : entalpia do ar de saída, J/ kg de ar seco. he : entalpia do ar de entrada, J/ kg de ar seco. Far : vazão do ar, l de ar seco/s. ρar : densidade do ar seco, com o valor de 1,29. 10-3 kg / l de ar seco.
Resultados e Discussão
48
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Padronização das metodologias de análise
As metodologias de análise de umidade, açúcares redutores e extração de
pigmentos foram testadas a fim de modificá-las e torná-las mais confiáveis. Foi
estabelecida a análise de ergosterol visando a estimativa de crescimento celular.
5.1.1. Umidade
O uso do analisador de umidade por aquecimento infravermelho Ohaus visa a
diminuição do tempo de resposta, de 48 horas para, aproximadamente, 15 minutos,
da análise de umidade para a correção da umidade do meio em fermentação no
reator.
Foram realizados testes para aferição da precisão do analisador de umidade.
Para tanto comparou-se a umidade de algumas amostras de sílica submetidas a
secagem em estufa até massa constante, com as medidas realizadas no analisador
Ohaus, com duas massas de amostras, 3 e 7 g. A figura 5 apresenta os resultados
obtidos com base nos 2 métodos para 5 valores de umidade inicial.
Figura 5 - Umidades em base úmida medidas em estufa e no analisador de umidade Ohaus, para amostras de sílica de, ( ) 3 g, ( ) 7 g.
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20 25
Umidade da estufa (%)
Um
idad
e n
o A
nal
isad
or
(%)
Resultados e Discussão
49
A relação entre a umidade medida pelo analisador e a umidade medida na
estufa é dada pela equação 15.
Umidade Analisador = 0,989 * Umidade Estufa Eq. 13
A correlação entre os dois métodos foi boa, sendo que o R2 para amostras de
3 g foi de 0,9872 e para 7 g foi de 0,9903. Também foi analisada uma mesma
amostra com 9 repetições no analisador Ohaus obtendo-se umidade média de
13,45% com desvio padrão de 0,37. A partir desses resultados, foi possível afirmar
que o analisador de umidade é eficiente para uma medida mais rápida em
comparação com a secagem em estufa, permitindo a reposição de água perdida por
evaporação de forma controlada.
5.1.2. Hidrólise ácida para dosagem de ART
Foram testadas diferentes concentrações de HCl para a hidrólise do amido
residual do meio em fermentação, e, em seguida, os açúcares redutores foram
quantificados pelo método do DNS. A figura 6 apresenta a diferença obtida entre a
hidrólise com HCl 1 mol.l-1 e HCl 2 mol.l-1.
Figura 6 - Hidrólises ácidas de meio fermentado ao longo do cultivo. ( ) HCl 1 mol.l-1, ( ) HCl 2 mol.l-1
Como o conteúdo de amido no arroz polido é da ordem de 80% foi possível
concluir que a hidrólise com o ácido mais concentrado (2 mol.l-1) resulta melhor
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tempo de cultivo (h)
Conc
ent
raçã
o AR
T (g
AR
T/gm
s)
Resultados e Discussão
50
desempenho. Também foram feitas hidrólises usando HCl 3 mol.l-1 porém os
resultados não diferiram da hidrólise com 2 mol.l-1, sendo então adotada esta
concentração de HCl na metodologia.
5.1.3. Determinação de ART e AR
Foi feita a comparação dos métodos de dosagem de açúcares redutores por
DNS e pelo método enzimático da glicose oxidase. A figura 7 mostra os gráficos com
os resultados obtidos nas amostras das fermentações do item 4.7 (tabela 3).
Figura 7 – Determinações de AR nos ensaios testes 1, 2 e 3 através do método do. ( ) DNS e ( ) GOD
teste 3
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
conc
entra
ção (g
AR/g
ms)
teste 2
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
Conc
entraç
ão (g
AR/g
ms)
teste 1
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
Con
cent
raçã
o (g
AR/g
ms)
Resultados e Discussão
51
Os dados mostram que a análise de açúcares redutores quando feita pelo
método do DNS quantifica mais açúcares. Isso ocorre porque esse método não
quantifica apenas glicose mas qualquer substância redutora. Dessa forma, foi
adotado o método enzimático de dosagem, por ser mais específico para as análises
de AR.
Além disso, verificou-se o desempenho da análise enzimática após a hidrólise
ácida do amido a valores de pH 6,0 e 8,0. A figura 8 mostra a diferença de
resultados da dosagem com glicose oxidase (GOD) para pH 6 e 8 (após a hidrólise),
em comparação com dosagem por DNS.
Figura 8 – Determinação de ART através dos métodos, ( ) GOD com pH 6, ( ) GOD com pH 8 e ( )
DNS
Verifica-se que o pH menor aumentou a atuação da enzima reduzindo a
diferença entre os resultados obtidos pelos dois métodos. A fim de verificar se um
pH menor após a hidrólise se aproximaria mais do resultado obtido pelo método
DNS, testou-se também a dosagem por glicose oxidase com pH 4 para a análise
ART em outra amostra (Figura 9).
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
Tempo de cultivo (h)
Conce
ntraç
ão (g /g d
e m
assa
sec
a)
Resultados e Discussão
52
Figura 9 - Métodos de análise de ART.( ) DNS, ( ) GOD em pH 4
Os resultados correspondem ao Teste 1 (descrito no item 4.7) que mostram
que no pH 4 os valores encontrados se aproximam, principalmente no início, quando
o teor de ART é conhecido e próximo de 80%. A diferença no final da fermentação
pode se dever ao aumento das substâncias redutoras que elevam as leituras em
DNS, assim como comentado para as análises de AR. Dessa forma a dosagem com
glicose-oxidase também foi a metodologia escolhida para quantificar ART usando pH
4 após a hidrólise.
5.1.4. Extração de pigmentos
Após a extração observou-se que a amostra residual conservava a coloração
inicial, um indicativo de que a extração do pigmento não era completa. Por isso
buscou-se um protocolo de extração para uma maior eficiência.
Foram testados 4 novos processos:
• Uso de α-amilase para a hidrólise do amido e possível maior liberação do
pigmento
• Uso de glucanase para a hidrólise da parede celular do microrganismo
• Uso de sonicador para a ruptura da parede celular do microrganismo
• Uso de glutamato para conversão de pigmentos da cor laranja a vermelhos
Todas as leituras de absorbância a 500 nm foram semelhantes às leituras do
padrão e, portanto não houve aumento na extração em nenhum dos procedimentos
testados e a metodologia não foi modificada.
teste 1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tempo de cultivo (h)
Con
cent
raçã
o AR
T (gA
RT/g
ms)
Resultados e Discussão
53
5.2. Mudanças estruturais no reator
Foram realizadas algumas mudanças estruturais no reator a fim de melhorar
seu desempenho e adequá-lo à aquisição de dados necessários. Com a realização
de ensaios preliminares foi possível detectar quais alterações eram necessárias.
• Inicialmente havia sido previsto modificar os modelos das pás, porém foi
verificado que para o uso proposto o modelo existente é adequado desde que
se mudasse a posição das mesmas dentro do reator. As pás estavam
posicionadas no eixo do reator, em forma de rosca sem fim, o que causava
acúmulo de meio na parte frontal do tambor. As pás foram inclinadas
(giradas), aproximadamente 30º na direção contrária da rosca, para
compensar essa movimentação.
• O sensor de umidade relativa (Marcare) foi substituído por um modelo da
mesma marca supostamente mais adequado que suportaria a condição de
saturação do ar com água durante a fermentação e as temperaturas de
esterilização o que não ocorreu. O sinal do sensor oscilou continuamente e
portanto os valores registrados não eram confiáveis. Além disso, o sensor
novo, por conter cobre, provocou corrosão no corpo do reator e em um dos
dois sensores de temperatura que foram introduzidos no corpo do reator após
5 dias de fermentação. Desta forma, não foi possível utilizar o medidor de
umidade na fase gasosa.
• Dois sensores de temperatura foram introduzidos em dois pontos no corpo do
reator para medir a temperatura no meio do substrato e não só na superfície
interna da parede do reator (em contato com a camisa), como era a
configuração inicial.
• Foi feita uma abertura no corpo do reator para introdução de amostradores
para que fosse possível a retirada de amostras em diferentes pontos do
reator, tanto na direção radial quanto na axial.
• Foi introduzida uma linha de ar estéril no sistema de aspersão de água, a fim
de provocar nebulização da mesma na tentativa de uma aspersão
homogênea no meio quando houvesse necessidade de reposição de água.
Durante os ensaios preliminares esse sistema foi ajustado. Porém, ocorreu
um dano na comunicação do sistema com o controlador que impediu a sua
Resultados e Discussão
54
utilização pois não foi possível restabelecer a comunicação em tempo hábil. O
problema foi posteriormente resolvido.
• Outro problema constatado foi a condensação de água na linha do gás de
saída do reator. Isso acontece pois o ar entra seco no reator e ocorre a
evaporação de água do meio e a umidade do ar de saída é alta. Essa água,
condensada na tubulação, molha o filtro hidrofóbico existente na saída do gás
e provoca o aumento da pressão dentro do reator. Para solucionar esse
problema foi adicionado um ciclone com um dreno antes do filtro para que a
água pudesse ser separada do gás.
5.3. Ensaios para definição do tratamento térmico do substrato no
reator
Foram realizados ensaios a fim de testar qual o tratamento térmico do
substrato (arroz), mais adequado à reologia do meio durante o cultivo. A primeira
tentativa foi a esterilização do reator vazio, seguida do preenchimento com arroz cru
e a passagem de vapor pelo mesmo para gelatinização do amido e esterilização.
Esse processo além de tornar o meio aglomerado e de consistência heterogênea
ainda dificulta o controle da umidade inicial do cultivo.
A segunda tentativa foi a esterilização do reator vazio, seguida do
preenchimento com arroz cru estéril (por radiação) e água na quantidade adequada
para a umidade inicial requerida (45%). O arroz ficou sob maceração por 24 horas e,
em seguida, ocorreu a passagem de água a 80ºC pela camisa do reator apenas para
gelatinização do amido. Esse processo se mostrou demorado, levando cerca de 2
horas. O meio ficou muito heterogêneo e aglomerado, pois o arroz não absorveu
toda a água e houve necessidade de agitação constante para que todo substrato se
mantivesse a 80ºC.
Finalmente estabeleceu-se submeter o arroz a esterilização em autoclave, em
sacos de polipropileno (item 4.2.1) e subseqüentemente, preencher o reator
previamente esterilizado. O substrato foi transferido por uma abertura no corpo do
reator de forma asséptica.
Resultados e Discussão
55
5.4. Ensaios preliminares em reator – Conjunto I
5.4.1. Teste 1
O ensaio teste 1 foi realizado com aeração de 8l. min-1 que corresponde a 1,2
l.min-1.kgms inicial-1 , em arroz polido com 45% de umidade inicial em base úmida. A
agitação adotada foi de 12 voltas a cada 24 horas. Os resultados da análise dos
gases de saída (OUR e CER) do reator e do meio fermentado estão apresentados
na figura 10.
Figura 10 – (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 1 em função do tempo de cultivo (B) Análises químicas e físicas
do meio fermentado. ( ) concentração de ART, ( ) produção de pigmentos ( ) concentração de proteína e ( ) umidade. A interrupção corresponde a dados não registrados por falha elétrica.
Teste 1
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(m
mol
/h)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
RQ
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
Con
cent
raçã
o (g
.gm
s-1)
,
umid
ade
(gH
2O.g
-1)
0
100
200
300
400
500
600
Abs
500
nm
(U
.gm
s-1)
A
B
Resultados e Discussão
56
Neste cultivo o RQ permaneceu abaixo de 1 ao longo de todo o ensaio
indicando o consumo de outras fontes de carbono que não a glicose.
A umidade aumentou no decorrer do processo indicando fixação de água
durante o crescimento. Houve consumo de amido indicado pela redução da medida
de ART, porém a produção de proteína, principalmente nos primeiros três dias foi
baixa. A produção de pigmento vermelho atingiu 63 U.gms-1 que fica muito abaixo de
valores atingidos em experimentos do LEB/DEQ/EPUSP, em colunas de leito fixo
com aeração forçada, que chegam a 3000 U.gms-1 (dados não publicados).
O meio adquiriu consistência pastosa ao longo dos dias, provavelmente devido ao
aumento da umidade associado à agitação, dificultando a transferência de O2. A
figura 11 mostra fotos das amostras retiradas do reator.
Figura 11 - Fotos do meio em fermentação do ensaio 1 em diferentes tempos do cultivo- (A) 67 horas,
(B) 139 horas, (C) 185 horas.
5.4.2. Teste 2
Para melhorar a reologia do meio, o segundo cultivo em reator foi realizado
mantendo a aeração de 8 l.min-1 que corresponde a 1,2 l.min-1. kg ms inicial-1 e o
regime de agitação mas utilizando arroz integral com 45% de umidade em base
úmida. Os resultados da análise dos gases de saída do reator e do meio fermentado
estão apresentados na figura 12.
A B C
Resultados e Discussão
57
Figura 12- (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 2 em função do tempo de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado. ( ) concentração de ART, ( ) produção de pigmentos ( ) concentração de proteína e ( )
umidade. A interrupção corresponde a dados não registrados por falha elétrica.
A análise dos gases de saída do reator mostra uma maior atividade
respiratória em relação ao teste 1 até aproximadamente 64 horas de cultivo, com o
RQ chegando a 1,2 e a concentração de CO2 no gás de saída atingindo valores em
torno de 4,5%. Porém, essa condição não se manteve e tanto o consumo de O2
quanto a produção de CO2 tiveram um declínio importante até aproximadamente 100
horas. Neste momento, o RQ, estava em torno de 0,8, apresentando variações
intensas que podem se explicadas pelo baixo consumo de O2 que interfere na
sensibilidade do analisador.
Pode-se observar que o consumo de substrato, estimado através do ART,
tem forte declínio até 100 horas assim como a atividade respiratória a despeito da
disponibilidade de fonte de carbono (ART) indicando que pode ter havido
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo(h)
OU
R,
CE
R (
mm
ol/h
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
RQ
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
Conce
ntraçã
o (g.g
ms-
1),
um
idade (gH
2O
.g-1
)
0
100
200
300
400
500
600
Abs
500 n
m (U
.gm
s-1)
A
B
Resultados e Discussão
58
aglomeração do meio prejudicando a transferência de oxigênio (aumento do RQ) e a
dissipação de calor.
A figura 13 mostra fotos das amostras retiradas do reator em diferentes
instantes. A umidade que, assim como no ensaio 1, ficou acima de 60% em base
úmida, provavelmente influenciou na aglomeração do meio de cultura.
Figura 13- Fotos do meio em fermentação do ensaio 2 em diferentes tempos do cultivo- (A) 45 horas,
(B) 90 horas, (C) 187 horas.
A foto (B) indica que com 90 horas de cultivo o meio já se encontrava
bastante compactado, impedindo a transferência de O2 para o interior do substrato.
Comparando-se os ensaios 1 e 2, observa-se que para a mesma umidade (em torno
de 60%) o arroz integral, além de aglomerar mais, propiciou menor produção de
pigmento (43 U.gms-1).
5.4.3. Teste 3
A fim de controlar a umidade no reator e fornecer melhores condições de
crescimento, o ensaio 3 teve a vazão de ar aumentada para 20 l.min-1 ou 3 l.min-
1.kgms inicial-1. O regime de agitação foi mantido em 12 voltas a cada 24 horas. Os
resultados da análise dos gases de saída do reator e do meio fermentado estão
apresentados na figura 14.
A B C
Resultados e Discussão
59
Figura 14 - (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 3 em função do tempo de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado. ( ) concentração de ART, ( ) produção de pigmentos ( ) concentração de proteína e ( )
umidade.
O RQ se manteve constante e próximo a 1 durante todo o cultivo. Apesar da
análise dos gases indicar que esta era uma condição favorável ao crescimento, a
quantificação da proteína não mostrou crescimento acentuado.
O aumento da vazão de ar resultou em um maior ressecamento do meio e foi
necessário o controle de umidade nesse ensaio, com a adição de 500 ml de água
nos instantes 48, 118, 163, 187, 231 horas de cultivo. Dessa maneira, a umidade se
manteve em torno de 45 %, conservando o meio sem aglomerações até o final do
cultivo (figura 15), porém a vazão de ar adotada nesse cultivo (20 l.min-1) pode ser
considerada alta uma vez que demandou diversas reposições de água. A produção
de pigmentos atingiu 300 U.gms-1 em 192h que é mais do que o triplo dos ensaios
anteriores para o mesmo tempo de fermentação.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(m
mol
/h)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
RQ
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
Conce
ntraçã
o (g.g
ms-
1),
um
idade (gH
2O
.g-1
)
0
100
200
300
400
500
600
Abs
500 n
m (U
.gm
s-1)
A
Resultados e Discussão
60
Figura 15 - Fotos do meio em fermentação do teste 3 em diferentes tempos do cultivo- (A) 48 horas,
(B) 114 horas, (C) 228 horas.
5.4.4. Teste 4
Para o ensaio 4 foi mantida a vazão de ar de 20 l.min-1 ou 3 l.min-1.kgms
inicial-1 e foi modificado o padrão de agitação tornando os eventos mais freqüentes
e melhor distribuídos ao longo de 24 horas (1 volta a cada 2 horas). Os resultados
são apresentados na figura 16.
Figura 16 - (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 4 em função do tempo de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado. ( ) concentração de ART, ( ) produção de pigmentos ( ) concentração de proteína e ( )
umidade.
A B C
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 48 96 144 192 240 288 336 384 432
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(m
mol/h
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
RQ
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 48 96 144 192 240 288 336 384
Tempo de cultivo (h)
Conc
entra
ção
(g.g
ms-
1),
um
idade (g
H2O
.g-1
)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Abs
500 n
m (U
.gm
s-1)
B
A
Resultados e Discussão
61
Observa-se um aumento maior da quantidade de proteína nas amostras a
partir de 48 horas atingindo valores três vezes maiores que o inicial após 12 dias de
cultivo. Houve também um aumento de 50% na produção de pigmentos vermelhos
em relação ao ensaio 3 porém cerca de 4 a 5 dias mais tarde, provavelmente devido
ao maior crescimento microbiano que retardou a síntese de metabólitos secundários.
A tabela 8 mostra um resumo dos resultados obtidos para os 4 testes
preliminares realizados.
Tabela 8 - Resultados ensaios do conjunto I de experimentos
Tipo de
arroz
Umidade
final (%)
OUR máximo
(mmol O2.h-1)
Proteína máxima
(g proteína. gms-1)
Consumo de
ART (%)
Teste 1 Polido 65 720 (63-87h) 0,15 67,5
Teste 2 Integral 61 900(42–66h) 0,23 65,5
Teste 3 Polido 41 750 (46–106h) 0,17 58,0
Teste 4 Polido 42 600 (58–160h) 0,21 76,2
Descartado o arroz integral por ter adquirido consistência pastosa, a análise
geral dos resultados para arroz polido mostra maior crescimento celular com base no
aumento da concentração de proteína, para o teste 4, no qual aplicou-se a maior
vazão de ar, igual a 20 l.min-1, também aplicada no teste 3, que todavia sofreu
agitação somente a cada 24h, em contraste com o teste 4, onde a agitação ocorreu
a cada 2h. É, portanto, uma conclusão preliminar, a vantagem de uma menor
intermitência na agitação, provavelmente pela melhor condição de retirada de calor.
Aumentando a aeração (teste 3) obteve-se uma reologia bem melhor, pois a
umidade se manteve entre 35% e 45% (foi necessária a adição de água) e a
produção de pigmentos aumentou 8 vezes em relação ao teste 1. No teste 4, o meio
ressecou mais, demandando maior adição de água para manter a umidade nos
mesmos níveis.
No teste 4, a relação entre a massa de proteína e de matéria seca chegou a
0,21 g por grama de massa seca e o pigmento aumentou mais 50% em comparação
com os valores obtidos no teste 3. Tal variação na concentração final de proteína,
tomando-se os testes 3 e 4, não se correlaciona com a variação no consumo de
Resultados e Discussão
62
ART, o que denota uma variabilidade do metabolismo, não denunciada pelo valor de
RQ, ligeiramente inferior a 1,0.
Os resultados obtidos nos ensaios teste, indicando a ordem de grandeza das
variáveis, levam a propor um conjunto inicial de ensaios que contemple apenas a
fase de crescimento do fungo (2 a 5 dias) por ser aquela em que há maior demanda
de retirada de calor do meio.
5.4.5. Ensaios em reator - Conjunto II
Foram iniciados os ensaios do conjunto II de acordo com o delineamento
fatorial totalmente casualizado. Foram realizados dois experimentos: ensaio 1 e
ponto central (Tabela 4, item 4.7) de acordo com o sorteio do programa Minitab.
Nesses experimentos iniciou-se a amostragem em diversos pontos do reator
com a introdução de amostradores esterilizados no corpo do reator durante a
fermentação (Figura 4). Houve contaminação dos experimentos, provavelmente
devido a esse novo procedimento, pois nenhuma outra modificação foi realizada em
relação aos experimentos do conjunto I.
O ensaio 1 (aeração de 8 l.min-1 e agitação de 6 voltas a cada 12 horas)
decorreu no tempo inicialmente previsto de 6 dias, mesmo contaminado. O ensaio
no ponto central (aeração de 14 l.min-1 e agitação de 16 voltas a cada 6 horas) foi
interrompido no terceiro dia devido à contaminação e também à fragmentação dos
grãos de arroz. As Figuras 17 e 18 ilustram o meio em fermentação retirado através
do amostrador imediatamente após um ciclo de agitação.
Figura 17 - Aspecto do substrato do ensaio 1 após 24 (A), 48 (B), 96 (C) e 144 horas (D) de cultivo.
Resultados e Discussão
63
Figura 18 - Aspecto do substrato do ensaio do ponto central no tempo inicial (A), após 24 (B), 48 (C) e 72
horas (D).
Observa-se na figura 17 D, ensaio 1, que o meio de cultivo se torna
aglomerado e de consistência pastosa. A contaminação pode ter contribuído para
que isso ocorresse, porém esse ensaio tem o menor nível de agitação e aeração do
conjunto escolhido e era esperado que não fosse a melhor condição de cultivo.
A figura 18 mostra que o ensaio no ponto central apresentava contaminação
visível em 48 horas e 24 horas mais tarde o cultivo foi inteiramente tomado, levando
à interrupção do experimento. Apesar disso, foi possível verificar que o nível de
agitação (16 voltas a cada 6 horas) foi muito intenso, causando a fragmentação do
substrato em apenas 72 horas. Essas observações foram relevantes para a decisão
de mudança nos níveis das variáveis escolhidas anteriormente. Além disso, optou-se
por não retirar amostras nos diversos pontos do reator durante as primeiras 48 horas
do ensaio para evitar a contaminação na fase de adaptação do microrganismo.
5.5. Ensaio complementar com suplementação
Foi realizado um experimento com suplementação do meio de cultivo para
verificar a possibilidade de os cultivos realizados em reator estarem sendo
limitados pela falta de nitrogênio no meio.
O experimento foi conduzido em frascos erlenmeyer de 100 ml contendo 50 g
de massa seca de arroz com umidade inicial de 45%, autoclavado a 120oC por 20
minutos. Foram testadas as seguintes suplementações:
A) sem suplementação
B) 5% de sulfato de amônio
C) 1% de sulfato de amônio
Resultados e Discussão
64
D) 0,1 % de glutamato monossódico
Os cultivos foram realizados em duplicata e foram retiradas amostras após 24,
48, 96, 240 e 288 horas. As figuras 19 e 20 apresentam a perda de massa seca
durante o cultivo e os resultados em massa total de proteína. A Tabela 9 apresenta
os dados de balanço de nitrogênio.
Figura 19 – Redução de massa seca em ensaio com suplementação da fonte de N : sulfato de
amônio no meio ( ) 0%, ( ) 5%, ( ) 1% e com suplementação de glutamato monossódico (x) 0,1 %.
Figura 20 – Massa total de proteína em ensaio de suplementação de amônio no meio: ( )
0%, ( ) 5%, ( ) 1% e com suplementação de glutamato monossódico (x) 0,1 %.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 48 96 144 192 240 288
Tempo de cultivo (h)
Mass
a se
ca (g
ms/
gm
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icia
l)
0
2
4
6
8
10
12
0 48 96 144 192 240 288
Tempo de cultivo (h)
Mass
a d
e p
rote
ina (g)
Resultados e Discussão
65
Tabela 9 - Balanço de nitrogênio nos cultivos com suplementação de meio
Início Final Massa de nitrogênio (g) Massa de
meio (g) Concentração de proteína (g.gms-1)
Massa de nitrogênio **(g) Substrato* adicionada Total
A 0,88 0 0,88 16,72 0,36 0,71 B 0,88 0,525 1,405 38,21 0,10 0,45 C 0,88 0,105 0,985 36,63 0,20 0,87 D 0,88 0,0042 0,8842 13,62 0,34 0,54 *Calculada com a composição elementar do arroz : CH1,4455O0,7973N0,0335 (Rosemblitt et al., 2000) **Calculado considerando toda proteína contida no microrganismo. Composição elementar do Monascus : CH1,4737O0,8118N0,0947 (Rosemblitt et al., 2000).
Os resultados mostram que a suplementação com sulfato de amônio inibiu o
crescimento nas duas concentrações utilizadas em relação ao ensaio padrão. O
ensaio B aumentou em 60 % o nitrogênio disponível e o ensaio C em 12 %. Apesar
da suplementação com glutamato não ter alterado significativamente a
disponibilidade de nitrogênio no ensaio D, este não apresentou o mesmo
desempenho que o ensaio padrão quanto à concentração de proteína, porém foi
importante para o aumento da produção de pigmentos vermelhos de 1910 U.gms-1
no padrão para 4340 U.gms-1 no ensaio suplementado ao final de 288 horas de
cultivo. A produção de pigmentos de cor laranja também aumentou de 2730 U.gms-1
para 9840 U.gms-1 no ensaio suplementado com glutamato. Nota-se que a razão
entre pigmentos vermelhos e laranjas é de 0,70 para o ensaio padrão e cai no
ensaio suplementado com glutamato para 0,44 provavelmente a falta de oxigênio
para a conversão do pigmento laranja em vermelho. Com base nesses resultados
todos os cultivos deveriam ter sido suplementados com glutamato pois valores
maiores de produção de pigmentos reduziriam as margens de erro das medidas,
mas isso demandaria repetir todos os cultivos realizados até então. Desta forma
decidiu-se continuar os experimentos sem suplementação.
Resultados e Discussão
66
5.6. Ensaios em reator
5.6.1. Desempenho do processo de cultivo em função da agitação
Na Figura 21 indicam-se os experimentos realizados de acordo com o
planejamento fatorial rotacional. Os ensaios foram nomeados de acordo com a
ordem padrão dos experimentos fatoriais rotacionais (4.7 de materiais e métodos) e
foram realizados de maneira aleatória através de sorteio.
Figura 21 - Identificação dos experimentos com base nos fatores de agitação definidos no
planejamento fatorial rotacional
As Figuras de 22, 23 e 24 apresentam as velocidades de consumo de
oxigênio (OUR (mmol.h-1)), produção de dióxido de carbono (CER (mmol.h-1)) e o
quociente respiratório (RQ) em função do tempo de cultivo dos experimentos. As
Figuras à direita apresentam os mesmos dados, porém somente até 36 horas de
cultivo, momento em que todos os ensaios já apresentam declínio na velocidade de
crescimento. Os gráficos foram divididos em 3 grupos: (a) ensaios com maior
intervalo entre os eventos de agitação (C, H e D); (b) ensaios do ponto central (I, J e
K) e ensaios com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de agitação (E, F); (c)
E
C
A BG
DH
FI, J, K
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50 60
Número de Voltas a cada 24 horas
Inte
rval
o e
ntr
e os
even
tos
de
agitaç
ão (h)
Resultados e Discussão
67
ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação (ensaios A, G e B). Os
ensaios no ponto central foram feitos em triplicata.
Figura 22 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊), produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos ensaios com maior intervalo entre os eventos
de agitação (ensaios C, H e D).
Ensaio D (24,3 voltas/11 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio C (8,72 voltas/11 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio H (18 voltas/12 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio D (24,3 voltas/11 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio C (8,72 voltas/11 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)O
UR
, CE
R (m
mol
/h).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio H (18 voltas/12 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Resultados e Discussão
68
Figura 23 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos ensaios do ponto central (I, J e K) e ensaios
com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de agitação (ensaios E e F).
Ensaio K (10,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio J (10,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio I (10,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio F (17,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio E (3,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio K (10,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio J (10,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio I (10,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)O
UR
, CE
R (m
mol
/h).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio F (17,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio E (3,5 voltas/7 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Resultados e Discussão
69
Figura 24 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos ensaios com menor intervalo entre os eventos
de agitação (ensaios A, G e B).
Ensaio A (2,83 voltas/3 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio G (3 voltas/2 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio B (6,63 voltas/3 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio G (3 voltas/2 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio B (6,63 voltas/3 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Ensaio A (2,83 voltas/3 horas)
0
200
400
600
800
1000
0 6 12 18 24 30 36
Tempo de cultivo (h)
OU
R, C
ER
(mm
ol/h
).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
RQ
Resultados e Discussão
70
Observa-se que os cultivos com maiores intervalos entre as agitações (figura
22) apresentam uma fase lag de 6 a 12 horas e que entre esses ensaios (C, H e D),
a OUR máxima é decrescente com o aumento do número de voltas, variando de 600
a 400 mmol.h-1, indicando que a agitação interfere no crescimento de forma
negativa.
Para o grupo de ensaios com intervalo médio entre as agitações a fase lag se
estende por aproximadamente 12 horas (figura 23). As OUR máximas alcançam
valores próximos de 700 mmol.h-1 para os ensaios E e F e 600 mmol.h-1 para os
ensaios do ponto central com exceção do I que chega a 750 mmol.h-1 apenas após
48 horas.
Para o grupo dos ensaios com menores intervalos entre os eventos de
agitação (figura 24), a fase lag se prolonga além de 12 horas, chegando a 18 horas
para o ensaio B e a OUR máxima fica próxima de 800 mmol.h-1, sendo que para o
ensaio G os dados de OUR para as primeiras 40 horas não foram apresentados por
problemas ocorridos com o analisador.
Desta forma nota-se que a agitação no início do cultivo pode estar
aumentando a fase lag, o que pode ser atribuído a uma maior dificuldade das hifas
se fixarem sobre o substrato, em resultado à agitação mais freqüente. Entretanto,
esses mesmos ensaios, isto é, os ensaios com os menores intervalos entre os
eventos de agitação alcançaram valores de OUR mais altos. Há algumas hipóteses
para explicar o decaimento da velocidade de consumo de oxigênio a partir de um
determinado instante do cultivo (1) a temperatura do meio alcança níveis deletérios
para o microrganismo, (2) ocorre a compactação do meio dificultando a transferência
de oxigênio e a remoção de calor. A primeira hipótese explicaria a OUR ter atingido
valores mais altos nos cultivos com maior agitação, pois teria havido maior
dissipação de calor e, inclusive, de gases do metabolismo. Teng e Feldheim (2000)
enfatizam a necessidade de remoção de CO2 para promover o crescimento e
também a produção de pigmentos. A segunda hipótese explicaria o declínio rápido
da respiração nos cultivos com maior número de voltas (ensaios B e F). Todos os
cultivos atingiram temperaturas elevadas e não foi possível separar o efeito deletério
da temperatura dos efeitos da agitação.
Durante os cultivos foram monitoradas temperaturas nos pontos indicados por
TFS na Figura 25.
Resultados e Discussão
71
Figura 25 - Esquema do reator e dos pontos de monitoramento da temperatura no meio sólido (TFS-
01, TFS-02, TFS-03 e TFS-04), do ar de entrada (TAR-01), da fase gasosa (TFG-02) e de
entrada e saída da água na camisa (TAC-01 e TAC-02)
As figuras 26, 27 e 28 apresentam os dados de temperatura armazenados “on-line”
durante os cultivos.
Motor
Camisa
Amostrador inferior
TAC-02
TAC-01
TFS-02TFS-01
TFS-03
TFS-04
TFG-02
TAR-01
3 cm 8 cm
Motor
Camisa
MotorMotor
Camisa
Amostrador inferior
TAC-02
TAC-01
TFS-02TFS-01
TFS-03
TFS-04
TFG-02
TAR-01
3 cm 8 cm
Resultados e Discussão
72
Figura 26 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de cultivo nos ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação (ensaios C, H e D). Temperatura do ar de entrada, ( ); temperatura da fase gasosa, ( ); temperatura do meio na parede (próximo à saída de água da camisa), ( ); temperatura do meio na parede (próximo à entrada de água da camisa), ( ); temperatura do meio a 8 cm da parede, ( ); temperatura do meio a 3 cm da parede, ( ).
Ensaio C (8,72 voltas/11 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Ensaio D (24,3 voltas/11 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Ensaio H (18 voltas/12 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Resultados e Discussão
73
Figura 27 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de cultivo nos ensaios do ponto central (I, J e K) e ensaios com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de agitação (ensaios E e F). Temperatura do ar de entrada,( ); temperatura da fase gasosa,( ); temperatura do meio na parede (próximo à saída de água da camisa),( ); temperatura do meio na parede (próximo à entrada de água da camisa),( ); temperatura do meio a 8 cm da parede, ( ); temperatura do meio a 3 cm da parede, ( ).
Ensaio I (10,5 voltas/7 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Ensaio E (3,5 voltas/7 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Ensaio J (10,5 voltas/7 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Te
mpe
ratu
ra (o
C)
Ensaio F (17,5 voltas/7 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Ensaio K (10,5 voltas/7 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Resultados e Discussão
74
Figura 28 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de cultivo nos ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação (ensaios A, G e B). Temperatura do ar de entrada,( ); temperatura da fase gasosa,( ); temperatura do meio na parede (próximo à saída de água da camisa),( ); temperatura do meio na parede (próximo à entrada de água da camisa),( ); temperatura do meio a 8 cm da parede, ( ); temperatura do meio a 3 cm da parede, ( ).
Os perfis de temperatura no interior do meio de cultura têm as mesmas
características dos perfis de respiração (figuras 22, 23 e 24), isto é, a temperatura do
meio inicialmente sobe para em seguida decrescer tal como verificado com o valor
de OUR, indicando que os padrões de agitação aplicados e a camisa de
resfriamento do reator não são suficientes para retirar, de forma eficiente, o calor
gerado pelo microrganismo. Todos os cultivos atingem temperaturas entre 46 e 48oC
a 8 cm da parede do reator. Entretanto, cultivos como os do ponto central mantêm
Ensaio B (6,63 voltas/3 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Ensaio A (2,83 voltas/3 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)T
empe
ratu
ra (o
C)
Ensaio G (3 voltas/2 horas)
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Tem
pera
tura
(oC
)
Resultados e Discussão
75
temperaturas acima de 30oC até próximo de 144 horas (figura 27), indicando
produção de calor e crescimento, enquanto que nos ensaios mais agitados como o B
e o F (figuras 27 e 28), a temperatura no meio (8 cm da parede) se estabiliza perto
do valor de controle, 30oC, por volta de 72 horas.
5.6.1.1. Crescimento celular
A quantificação do crescimento celular nos cultivos em meio sólido deve
prescindir da separação entre biomassa e meio de cultivo, uma vez que tal
separação é inviável. Dentre os métodos indiretos, foram analisados neste trabalho
o consumo de oxigênio, a produção de CO2, a concentração de proteína e de
ergosterol.
A respiração microbiana apresenta a vantagem não só de dispensar a
extração da biomassa mas também de dispensar a amostragem do meio, a qual não
é representativa uma vez que não é possível assegurar a homogeneidade como nos
cultivos submersos. Considerando que os cultivos de Monascus sp. foram realizados
sob aeração a vazão molar conhecida e controlada e análise da composição do gás
de saída, pôde-se estimar o crescimento celular indiretamente através do consumo
de oxigênio (item 4.6.7). O crescimento celular assim estimado foi relacionado aos
padrões de agitação aplicados e ao consumo total de oxigênio, OU, através do
ajuste de um modelo e análise de variância. A Tabela 10 mostra os valores do
consumo de oxigênio nos cultivos.
Resultados e Discussão
76
Tabela 10 - Consumo total de oxigênio, OU, em 138 horas de cultivo.
Número de rotações em
24 horas Intervalo entre os
eventos de agitação
Consumo de oxigênio (OU) (138 horas)
Ensaios Não
codificada Codificada Não
codificada Codificada (mol de O2)
A 17 -1 3 -1 68 B 53 1 3 -1 30 C 17 -1 11 1 50 D 53 1 11 1 50 E 12 -1,41 7 0 49 F 60 1,41 7 0 31 G 36 0 2 -1,41 68 H 36 0 12 1,41 35 I 36 0 7 0 71 J 36 0 7 0 37 K 36 0 7 0 31
Para o ajuste do modelo foi excluído o ensaio I que é um ponto central pois
apresentou consumo de oxigênio (OU) muito acima dos valores encontrados para as
duas outras repetições (ensaios J e K). Uma possível explicação para a falta de
reprodutibilidade pode estar na esterilização do substrato. O arroz é um material
composto principalmente de amido (80%) que é suscetível ao calor e a umidade.
Apesar dos cuidados tomados para minimizar as diferenças, as condições de
esterilização podem causar diferenças de consistência no meio modificando o
desempenho microbiano.
Os valores de consumo de oxigênio (OU) determinados nos cultivos deste
trabalho são da mesma ordem de grandeza de valores relatados na literatura. Marsh
et al. (1998) encontraram valores de 7,5 a 19,5 mol de O2/kg de substrato inicial
cultivando Rhizopus oligosporus em arroz, por 50 horas, em tambor rotativo.
Transformando os dados deste trabalho para as mesmas unidades obteve-se de 2 a
3 mol de O2/kg de substrato inicial em 50 horas e de 4,5 a 10 mol de O2/kg de
substrato inicial ás 138 horas de cultivo. Em ensaios em colunas de leito fixo
utilizando o mesmo microrganismo utilizado neste trabalho, obteve-se 3,5 mol de
O2/kg de substrato inicial nas primeiras 50 horas de cultivo e 10 mol de O2/kg de
substrato inicial ás 138 horas de cultivo (dados de trabalho de iniciação científica).
Desta forma, conclui-se que para os ensaios A, G e I não houve efeito deletério da
Resultados e Discussão
77
agitação sobre o consumo total de oxigênio. A Tabela 11 apresenta a análise da
variância do consumo total de oxigênio.
Tabela 11 - Análise de variância para consumo de oxigênio total.
Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 1523,23 304,65 3,38 0,131 Linear 2 754,35 377,18 4,19 0,104 Quadrático 2 426,63 213,31 2,37 0,210 Interação 1 342,25 342,25 3,80 0,123 Resíduo 4 360,19 90,05 Falta de ajuste 3 342,43 114,14 6,43 0,280 Erro puro 1 17,76 17,76 Total 9 1883,42
Através da análise da variância é possível afirmar que pelo menos uma das
variáveis tem significância ao nível de 85%. O “P” para a fonte regressão é maior
que 0,1, ou seja, não há significância ao nível de 90% mas podemos considerar que
85% é razoável por se tratar de um processo biológico sujeito a alta variabilidade.
Além disso, o erro devido ao ajuste do modelo tem valor de P igual a 0,28 sugerindo
que o modelo se ajusta aos dados. A tabela 12 apresenta os coeficientes calculados
para as variáveis codificadas e o P estimado para cada termo e a figura 29
apresenta os resíduos para o consumo de oxigênio total.
Tabela 12 - Coeficientes de regressão estimados para o consumo de oxigênio total
Termo Coef SE Coef T P
Constante 34,25 6,71 5,104 0,007
numero de rotações (NR) -7,87 3,36 -2,346 0,079
Intervalo (I) -5,69 3,36 -1,695 0,165
numero de rotações*numero de rotações 3,83 4,44 0,862 0,437
intervalo*intervalo 9,65 4,44 2,175 0,095
numero de rotações*intervalo 9,25 4,75 1,950 0,123
R-Sq = 80,88%
Resultados e Discussão
78
Excluindo o termo quadrático da variável número de rotações por não
apresentar significância ao nível de 85%, a equação do modelo ajustado para as
variáveis codificadas é a seguinte:
Consumo de O2 = 34,25 - 7,87*NR - 5,69*I + 9,65*I 2 + 9,25*NR*I Eq. 14
Observa-se que tanto a variável “número de voltas” quanto a “intervalo entre
os eventos de agitação” influenciam negativamente o desempenho do processo pois
apresentam coeficientes negativos. Todavia, os termos quadrático do intervalo e a
interação entre as variáveis têm sinal positivo. O coeficiente de correlação é de 0,81.
Figura 29 - Distribuição dos resíduos de consumo total de oxigênio
151050-5-10-15
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Residual
Perc
ent
Normal Probability Plot(response is OUR acumulado)
7060504030
10
5
0
-5
-10
Fitted Value
Residual
Versus Fits(response is OUR acumulado)
Resultados e Discussão
79
Através da figura 29, pode-se notar que os resíduos seguem uma distribuição
normal (todos os pontos estão próximos a linha azul) e que os resíduos estão
aleatoriamente distribuídos em torno do zero no gráfico de resíduos versus valores
ajustados, significando que a variância é constante para todos os níveis dos fatores
e não há nenhum ponto discrepante.
A figura 30 apresenta a superfície de resposta para a variável consumo de O2
Figura 30 - Superfície de resposta e gráfico de contorno do consumo de oxigênio em função do
numero de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.
O maior consumo de oxigênio (OU) ocorre com menor número de voltas e
menor intervalo entre os eventos de agitação, ou seja, cultivos pouco agitados mas
40
60
80
2040
80
100
6
3
60
9
6
12
OUR acumulado
intervalo
numero de rotações
OUR acumulado (138h)
numero de rotações
inte
rvalo
6050403020
11
9
7
5
3
>
–
–
–
–
< 30,0
30,0 40,0
40,0 50,0
50,0 60,0
60,0 70,0
70,0
acumulado
OUR
OUR acumulado (138 h)
A B
J, K
G
C
E
H
D
F
OU
OU
Resultados e Discussão
80
com eventos freqüentes (ensaio A). Isso pode ser explicado pela necessidade de
agitação para remoção de calor e metabólitos gasosos mas sem que o meio de
cultivo seja danificado ou compactado pela ação das pás.
Com base na equação 7 (Materiais e Métodos), verifica-se que a correlação
entre o aumento da biomassa e o consumo de oxigênio depende dos parâmetros
fator de conversão de oxigênio em biomassa (Yx/o) e coeficiente de manutenção (mo)
que refere-se à respiração necessária para manutenção da vida. Esses parâmetros
são na maioria das vezes determinados em meio líquido e em temperatura
controlada o que não ocorre nos cultivos em meio sólido em biorreatores. Dessa
forma pode-se optar por não converter o consumo de oxigênio em biomassa, a
exemplo de Marsh et al. (1998). Rearranjando a equação 7 (IKASARI;
MITCHELL,1998):
+== OO m
X
OURq
X/OY 2
µ Eq.15
A aplicação das equações 7 ou 18, em geral, pressupõe que YX/O seja
constante durante o cultivo, entretanto estes parâmetros não o são, pois dependem
da fisiologia do microrganismo, sendo que no início do cultivo e na fase exponencial
do crescimento mO pode ser desprezado em relação a µ. Assumindo-se YX/O e mO
constantes, tem-se que a maior velocidade especifica de crescimento, µ, ocorre com
a maior velocidade específica de consumo de oxigênio, qO2. Além disso, dado que
consumo de oxigênio e crescimento celular apresentam estreita correlação, pode-se
afirmar que ao maior consumo de oxigênio corresponde o cultivo com melhor
desempenho quanto ao crescimento.
Para determinar se existe relação entre a máxima velocidade de consumo de
oxigênio (OUR) observada e o padrão de agitação, foi feito um ajuste de modelo e
uma análise de variância para essa variável resposta (Tabelas 13 e 14).
Resultados e Discussão
81
Tabela 13 - Velocidade de consumo de oxigênio em 138 horas de cultivo.
Número de rotações em
24 horas Intervalo entre os
eventos de agitação OUR máximo
Ensaios Não
codificada Codificada
Não codificada
Codificada (mmol.h-1 de O2)
A 17 -1 3 -1 818 B 53 1 3 -1 779 C 17 -1 11 1 738 D 53 1 11 1 577 E 12 -1,41 7 0 705 F 60 1,41 7 0 720 G 36 0 2 -1,41 912 H 36 0 12 1,41 570 I 36 0 7 0 826 J 36 0 7 0 540 K 36 0 7 0 573
Para o ajuste deste modelo também foi excluído o ensaio I que é um ponto
central pois assim como no cálculo do consumo total do O2, também apresentou
valor discrepante dos valores encontrados para as duas outras repetições (ensaios J
e K).
Os valores apresentados para a velocidade máxima observada de O2 estão
na unidade de mmol.h-1. Quando apresentamos os dados em função da massa seca
inicial obtemos valores entre 80 e 122 µmol.h-1.gms-1 que são muito próximos dos
valores apresentados por Han and Mudgett (1992) que variaram de 113 a 156
µmol.h-1.gms-1 para cultivo de Monascus purpureus em coluna de leito fixo
suplementado com sulfato de zinco.
Tabela 14 - Análise de variância para OUR máximo
Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 128526 25705,1 8,75 0,028 Linear 2 77275 38637,6 13,16 0,017 Quadrático 2 47529 23764,7 8,09 0,039 Interação 1 3721 3721,0 1,27 0,323 Resíduo 4 11748 2937,0 Falta de ajuste 3 11203 3734,5 6,86 0,272 Erro puro 1 544 544,5 Total 9 140274
Resultados e Discussão
82
Através da análise da variância é possível afirmar que o termo linear e
quadrático da regressão têm influência ao nível de 90% e que, além disso, o erro
devido ao ajuste do modelo tem um p de 0,27 que sugere que o modelo se ajusta
aos dados de forma significativa. Os coeficientes calculados para as variáveis
codificadas e o P estimado estão na tabela 15
Tabela 15 - Coeficientes de regressão estimados para o OUR máximo
Termo Coef SE Coef T P
Constante 556,50 38,32 14,522 0,000
Numero de rotações (NR) -22,35 19,16 -1,166 0,308
Intervalo -95,71 19,16 -4,995 0,008
Número de Rotações*Número de Rotações 78,31 25,35 3,090 0,037
Intervalo*Intervalo 92,56 25,35 3,652 0,022
Número de rotações*intervalo -30,50 27,10 -1,126 0,323
R-Sq = 91,62%
Excluindo o termo da interação das variáveis por não apresentar significância
ao nível de 85%, a equação do modelo ajustado para as variáveis codificadas é a
seguinte:
OUR máx (mmol.h-1) = 556,5 - 22,35*NR - 95,71*I + 78,31*NR2 + 92,56*I 2 Eq. 16
Observa-se que tanto a variável “número de rotações” quanto a “intervalo
entre os eventos de agitação” influenciam negativamente a resposta pois
apresentam coeficientes negativos. Também se observa a maior influência do
intervalo pois seu coeficiente é mais que 4 vezes maior que o do número de
rotações. O coeficiente de correlação para esta variável resposta é de 0,92. A figura
31 apresenta a distribuição dos resíduos para a OUR máxima
Resultados e Discussão
83
Figura 31 - Distribuição dos resíduos de velocidade máxima observada de consumo de oxigênio
Através da figura 31 pode-se notar que os resíduos seguem uma
distribuição aproximadamente normal (todos os pontos estão próximos a linha azul)
e que os resíduos estão aleatoriamente distribuídos em torno do zero no gráfico de
resíduos versus valores ajustados, significando que a variância é constante para
todos os níveis dos fatores e não há nenhum ponto discrepante.
A figura 32 apresenta a superfície de resposta para a variável OUR máxima
100500-50-100
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Residual
Perc
ent
Normal Probability Plot(response is max OUR)
900850800750700650600550
50
25
0
-25
-50
Fitted Value
Residual
Versus Fits(response is max OUR)
Resultados e Discussão
84
Figura 32 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da velocidade de oxigênio máximo em
função do numero de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.
Pode-se observar que para essa variável resposta existe um valor mínimo, ou
seja a OUR será mínima com 40 rotações em 24 horas e com 9 horas de intervalo
entre os eventos de agitação.
A evolução da concentração de CO2 no gás de saída do biorreator pode ser
utilizada para acompanhar a respiração e conseqüentemente o crescimento celular.
A tabela 16 apresenta a produção total de CO2 dos cultivos.
numero de rotações
inte
rvalo
6050403020
11
9
7
5
3
>
–
–
–
–
< 600
600 700
700 800
800 900
900 1000
1000
max OUR
OUR máxima
500
750
2040
1000
6
3
60
9
6
12
max OUR
intervalo
numero de rotações
OUR máximo
A B
J, K
G
C
HD
F
Resultados e Discussão
85
Tabela 16 - Produção de dióxido de carbono em 138 horas de cultivo.
Número de rotações em 24 horas
Intervalo entre os eventos de agitação
Produção de CO2
Ensaios Não codificada
Codificada Não codificada
Codificada (moles CO2)
A 17 -1 3 -1 61 B 53 1 3 -1 35 C 17 -1 11 1 47 D 53 1 11 1 61 E 12 -1,41 7 0 63 F 60 1,41 7 0 42 G 36 0 2 -1,41 57 H 36 0 12 1,41 50 I 36 0 7 0 71 J 36 0 7 0 50 K 36 0 7 0 49
Para o ajuste deste modelo também foi excluído o ensaio I que é um ponto
central pois assim como no cálculo do consumo total do O2 e OUR máxima, este
também apresentou valor discrepante dos valores encontrados para as duas outras
repetições (ensaios J e K). A Tabela 17 apresenta a análise de variância para os
valores experimentais de produção de CO2
Tabela 17 - Análise de variância para a variável resposta produção de CO2
Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 637,32 127,46 4,91 0,074 Linear 2 224,09 112,04 4,32 0,100 Quadrático 2 10,43 5,22 0,20 0,826 Interação 1 402,80 402,80 15,52 0,017 Resíduo 4 103,80 25,95 Falta de ajuste 3 103,11 34,37 50,22 0,103 Erro puro 1 0,684 0,684 Total 9 741,12
Através da análise da variância é possível afirmar que os termos lineares tem
influência ao nível de 90% e os termos quadráticos não tem influência significativa.
Desse modo os coeficientes calculados para as variáveis codificadas e o P estimado
estão na tabela 18
Resultados e Discussão
86
Tabela 18 - Coeficientes de regressão estimados para o OUR máximo
Termo Coef SE Coef T P
Constante 49,34 3,60 13,70 0,000
Numero de rotações (NR) -5,28 1,80 -2,933 0,043
Intervalo 0,33 1,80 0,19 0,862
Número de Rotações*Número de Rotações 1,15 2,38 0,48 0,654
Intervalo*Intervalo 1,38 2,38 0,58 0,595
Número de rotações*intervalo 10,03 2,55 3,94 0,017
R-Sq = 85,99%
Excluindo os termos quadráticos das variáveis por não apresentar significância ao
nível de 90%, a equação do modelo ajustado para as variáveis codificadas é a
seguinte:
Produção de CO2 (mol) = 49,34 - 5,28*NR + 0,33*I + 10,03*NR*I Eq. 17
Observa-se que a variável “intervalo entre os eventos de agitação” tem pouca
influência na resposta pois o coeficiente é baixo e o valor p não tem significância ao
nível de 90%. O coeficiente de correlação do modelo é de 0,86. A figura 33
apresenta a distribuição dos resíduos para a produção total de CO2
Resultados e Discussão
87
Figura 33 - Distribuição dos resíduos para a produção de dióxido de carbono.
Através da figura 33 pode-se notar que os resíduos seguem uma
distribuição normal (todos os pontos estão próximos a linha azul) e que os resíduos
estão aleatoriamente distribuídos em torno do zero no gráfico de resíduos versus
valores ajustados, significando que a variância é constante para todos os níveis dos
fatores e não há nenhum ponto discrepante.
A figura 34 apresenta a superfície de resposta para a produção de CO2.
7065605550454035
5,0
2,5
0,0
-2,5
-5,0
Fitted Value
Residual
Versus Fits(response is produção de CO2)
1050-5-10
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Residual
Percent
Normal Probability Plot(response is produção de CO2)
Resultados e Discussão
88
Figura 34 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da produção de CO2 em função do numero
de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.
Da mesma forma que para o cálculo do consumo de total de oxigênio,
os maiores valores de produção de CO2 são os dos ensaios com menor número de
voltas e frequentemente agitados (ensaio A). As duas superfícies, apesar de
apresentarem curvaturas diferentes, têm o mesmo perfil (figuras 30 e 34). Os
ensaios na região de maior número de voltas e maior intervalo entre os eventos de
agitação também apresentam alta produção de CO2.
20
40
60
2040
60
80
6
3
60
9
6
12
CO2 (moles)
intervalo
numero de rotações
Produção de CO2
numero de rotações
inte
rvalo
6050403020
11
9
7
5
3
>
–
–
–
–
–
< 30
30 40
40 50
50 60
60 70
70 80
80
de CO2
produção
Produção de CO2 (moles)
A B
J, K
G
C
E
H
D
F
Resultados e Discussão
89
Ao observarmos a máxima OUR alcançada, notamos que o ensaio A
também fica na região de maiores valores. O ensaio B também se localiza numa
região de valores elevados de máxima OUR, porém em relação ao consumo total de
O2 e produção de CO2 está localizado na região de pior desempenho. Isso
provavelmente ocorre pois a maior e mais freqüente agitação na fase de
crescimento favorece a dissipação de calor e a homogeneidade mas também
compacta o meio dificultando a transferência de oxigênio e a continuidade do cultivo.
A Figura 22 mostra claramente queda da respiração a partir de 50 horas para o
ensaio B.
Foram feitas medidas de proteína total, com amostras retiradas a cada 24
horas (sempre após um evento de agitação) a fim de tentar estimar o crescimento
celular apesar da concentração inicial de proteína no arroz ser significativa (cerca de
7% em massa) e única fonte de nitrogênio (TABELA BRASILEIRA DE
COMPOSIÇÃO DE ALIMENTOS, 2010).
O conteúdo de proteína no instante inicial dos cultivos corresponde apenas ao
substrato, sendo desprezível a parcela relativa ao inóculo. Conforme o crescimento
microbiano evolui, o nitrogênio presente no arroz, quase que unicamente na forma
de proteína, vai sendo consumido pelo microrganismo e incorporado à proteína
celular. Desta forma não é possível determinar, qual a proporção de proteína
presente nas células, e qual a proporção que ainda não foi consumida e encontra-se
no substrato.
Durante os cultivos em reator são perdidos de 30 a 50 % da massa seca na
forma de CO2 e outros compostos voláteis como etanol e ácidos orgânicos. Essa
perda de massa chega a 60 % em cultivos em erlenmeyer (item 5.5). Deste modo, a
concentração de proteína deve ser corrigida.
É conhecida apenas a massa seca inicial, que consiste em substrato e
inóculo, e a massa seca final que resta no reator ao término do cultivo. Utilizando as
medidas de proteína e a composição elementar do arroz e do microrganismo
(ROSEMBLITT et al., 2000), foi feito um balanço entre o conteúdo de nitrogênio
inicial e final. Os resultados não são precisos devido a erros de medida da massa
final (perda de massa durante a retirada de amostras) ou algumas considerações
como utilizar apenas a composição elementar do microrganismo no cálculo do
nitrogênio ao final do cultivo uma vez que não é possível saber qual é a proporção
de arroz e de microrganismo no meio. As quantidades de proteína e nitrogênio no
Resultados e Discussão
90
inóculo foram consideradas desprezíveis pois são aproximadamente 800 ml com 2,5
g/l de massa seca, o que significa 0,9 g de proteína por ensaio distribuídos em 6750
g de arroz das quais, 230 g são proteína. As quantidades de proteína e nitrogênio no
inóculo foram desprezadas, pois num inóculo de aproximadamente 800 ml de
suspensão de células a 2,5 g/l, haveria 0,9 g de proteína distribuída em 6750 g de
arroz das quais 479 g são proteína, portanto, o aporte de proteína através do
inóculo, representa somente 0,2% da proteína do arroz. A tabela 19 apresenta os
dados de proteína e balanço de nitrogênio.
Tabela 19 - Medidas de Concentração de proteína e balanço de nitrogênio.
Instante inicial (0 h) Instante final (138 h) Massa
seca substrato
(g)
Proteína medida
(g.gms-1)
Proteína Total (g)*
Nitrogênio (g) **
Massa seca meio (g)
Proteína (g.gms-1)
Proteína Total (g)
Nitrogênio (g) ***
A 6750 0,054 479 119 3277 0,27 885 105 B 6750 0,075 479 119 4247 0,21 892 106 C 6750 0,061 479 119 3646 0,34 1240 147 D 6750 0,080 479 119 3266 0,35 1143 135 E 6750 0,040 479 119 3288 0,32 1052 125 F 6750 0,100 479 119 4737 0,43 2037 241 G 6750 0,081 479 119 3105 0,26 807 96 H 6750 0,090 479 119 4133 0,45 1860 220 I 6750 0,069 479 119 3708 0,27 1001 118 J 6750 0,060 479 119 3695 0,3 1108 131 K 6750 0,070 479 119 3707 0,4 1483 175 *Calculada utilizando o valor de 0,071 g.gms-1 (média das medidas nos instantes inicias). **Composição elementar do arroz : CH1,4455O0,7973N0,0335 (Rosemblitt et al., 2000) ***Calculado considerando toda proteína contida no microrganismo. Composição elementar do Monascus : CH1,4737O0,8118N0,0947 (Rosemblitt et al., 2000).
Observa-se que há um substancial aumento na massa de proteína, chegando
esse aumento a quatro vezes para o ensaio F, entretanto a massa de nitrogênio se
mantém da mesma ordem de grandeza no início e no final do cultivo para a maioria
dos ensaios como seria o esperado. Os ensaios F, H e K apresentam conteúdos de
nitrogênio acima do esperado. Uma possível explicação seria o erro nas análises
uma vez que a concentração inicial de proteína nesses ensaios é maior do que os
demais. A medida de concentração de proteína no início dos cultivos variou de 4 a
10% sendo que a matéria prima usada foi sempre a mesma.
Resultados e Discussão
91
Para a correção da concentração de proteína foi estabelecida uma curva de
decaimento de massa seca, utilizando dados de experimentos em coluna e em
frascos (como os do ensaio de suplementação, item 5.5), com base nas quais se
aproximou uma função linear entre a massa (inicial e final) e o tempo de cultivo. A
figura 35 apresenta os resultados de dosagem de proteína para os ensaios e a
média dos pontos centrais com o desvio padrão.
Figura 35 - (A) Massa total de proteína em função do tempo de cultivo para os ensaios. Os ensaios com intervalos maiores entre os eventos de agitação têm símbolos cheios – ( ) ensaio C, ( ) ensaio D e ( ) ensaio H; os ensaios com os menores intervalos entre os eventos de agitação têm os símbolos vazados – ( ) ensaio A, ( ) ensaio B e ( ) ensaio G; os ensaios com os intervalos de agitação médios são – (∗) ensaio E e (+) ensaio F; (B) Massa total média de proteína em função do tempo de cultivo para os ensaios no ponto central. As barras representam o desvio padrão
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo (h)
Mas
sa d
e p
rote
ína
(g)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 24 48 72 96 120 144
Tempo (h)
Mas
sa d
e p
rote
ína
(g)
A
B
Resultados e Discussão
92
Verifica-se que os resultados são muito próximos para todos os cultivos, com
exceção dos ensaios H e F que assim como no conteúdo de nitrogênio, apresentam
valores acima dos demais conforme já foi discutido com base na Tabela 19.
Esse comportamento é confirmado pelo ajuste de um modelo para uma
superfície de resposta para a concentração de proteína que apresenta um
coeficiente de correlação menor do que 55%. A tabela 20 apresenta análise de
variância para os resultados de concentração de proteína.
Tabela 20 - Análise de variância para a concentração de proteína
Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 0,031726 0,006345 1,24 0,408 Linear 2 0,030037 0,015019 2,95 0,143 Quadrático 2 0,000464 0,000232 0,05 0,956 Interação 1 0,001225 0,001225 0,24 0,645 Resíduo 5 0,025492 0,005098 Falta de ajuste 3 0,016225 0,005408 1,17 0,492 Erro puro 2 0,009267 0,004633 Total 10 0,057218
Os valores de P indicam que os fatores estudados não tem efeito sobre a
variável resposta ao nível de 90% de significância. Isso mostra que não se encontra
relação direta entre a concentração de proteína e o padrão de agitação aplicado
durante os cultivos.
Outro método para a estimativa de concentração celular é o uso de medidas
de componentes celulares que são exclusivos do microrganismo como o ergosterol
que é um componente da membrana celular
Para implantação da rotina de ergosterol foram consideradas algumas
metodologias publicadas (MONTGOMERY et al., 2000; KLAMER e BAATH, 2004) e
entre elas optou-se por testar aquelas empregadas por Carvalho e colaboradores
(2006), que usou o método na determinação de ergosterol em Monascus, e
Jedlickova e colaboradores (2008), que apresentam a concentração de ergosterol
em variedades de malte e cevada e é o artigo mais recente. A tabela 21 mostra
resumidamente os métodos testados.
Resultados e Discussão
93
Tabela 21- Dois métodos de extração de ergosterol
Etapas Carvalho et al.. (2006) Jedlickova (2008) Substrato 0,5 g 10 g Solvente 2 ml etanol + 1ml NaOH (2M) 50 ml metanol Incubação 700C por 30 min 650C por 30 min
Solvente 2ml HCl + 1ml KHCO3 + 2ml
hexano 3 g KOH + 10 ml hexano + 5 ml
água Centrífugação 3000 g por 10 min _ Extração 2 ml hexano (3x) 10 ml hexano (3x) Evaporação Vácuo 350C 700C até secar Ressuspensão 200 ml hexano 5 ml metanol
Embora a estimativa de crescimento celular através da medida de ergosterol
seja contestada por haver mudanças de seu conteúdo nas células em diferentes
estágios do crescimento (Desgranges et al.,1991), os resultados obtidos para
Monascus sp. cultivado em meio líquido foram bastante satisfatórios. A figura 36
mostra a correlação da massa de ergosterol e da massa seca e a figura 37 mostra a
concentração de ergosterol nas células em função do tempo de cultivo.
Figura 36 - Correlação entre a massa de ergosterol e a massa seca de células.
y = 2.8428x - 0.142
R2 = 0.8486
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 0.1 0.2 0.3 0.4
Massa celular seca (g)
Erg
ost
erol
(mg
)
Resultados e Discussão
94
Figura 37 - Concentração específica de ergosterol em relação à massa de células durante o cultivo
em meio líquido.
O valor médio da concentração de ergosterol foi de 2,16 mg.gcél-1. Observa-
se que a distribuição dos pontos é homogênea e que não há tendência de aumento
com o tempo apesar do valor do desvio padrão ser de aproximadamente 17%.
A figura 38 mostra a variação da concentração de ergosterol ao longo do
cultivo para os experimentos do planejamento fatorial rotacional.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Co
ncen
traçã
o de
erg
ost
erol
(m
g/gc
él)
Resultados e Discussão
95
Figura 38 - (A) Concentração de ergosterol em função do tempo de cultivo para os ensaios. Os ensaios com intervalos maiores entre os eventos de agitação têm símbolos cheios – ( ) ensaio C, ( ) ensaio D e (•) ensaio H; os ensaios com os menores intervalos entre os eventos de agitação têm os símbolos vazados – ( ) ensaio A, ( ) ensaio B e ( ) ensaio G; os ensaios com os intervalos de agitação médios são – (∗) ensaio E e (+) ensaio F; (B) Concentração de ergosterol em função do tempo de cultivo para os ensaios no ponto central. As barras mostram o desvio padrão.
Observa-se que os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de
agitação apresentaram maiores valores de ergosterol, com exceção do ensaio C,
indicando maior crescimento celular.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 24 48 72 96 120 144
Tempo (h)
Erg
ost
ero
l (m
g/g
ms)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 24 48 72 96 120 144
Tempo (h)
Erg
oste
rol (
mg/
gm
s)
A
B
Resultados e Discussão
96
Para verificar se existe influência dos padrões de agitação sobre a
concentração de ergosterol foi feita uma análise de regressão dos experimentos
realizados.
A tabela 22 mostra os resultados obtidos para cada experimento.
Tabela 22 - Teor de ergosterol após 138 horas de cultivo
Número de rotações em 24
horas Intervalo entre os eventos
de agitação Ergosterol
Ensaios Não codificada Codificada Não
codificada Codificada (mg. gms-1)
A 17 -1 3 -1 0,25 B 53 1 3 -1 0,06 C 17 -1 11 1 0,17 D 53 1 11 1 0,72 E 12 -1,41 7 0 0,43 F 60 1,41 7 0 0,31 G 36 0 2 -1,41 0,29 H 36 0 12 1,41 0,54 I 36 0 7 0 0,65 J 36 0 7 0 0,55 K 36 0 7 0 0,62
Tabela 23 - Análise de variância para variável resposta teor de ergosterol
Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 0,403296 0,080659 6,37 0,032 Linear 2 0,112895 0,056448 4,46 0,077 Quadrático 2 0,151644 0,075822 5,99 0,047 Interação 1 0,138756 0,138756 10,96 0,021 Resíduo 5 0,063309 0,012662 Falta de ajuste 3 0,058042 0,019347 7,35 0,122 Erro puro 2 0,005267 0,002633 Total 10 0,466605
Através da análise da variância, é possível afirmar que os termos linear,
quadráticos e a interação têm influência ao nível de 90%. Desse modo, os
coeficientes calculados para as variáveis codificadas e o P estimado para cada
efeito do modelo estão na tabela 24.
Resultados e Discussão
97
Tabela 24 - Coeficientes de regressão estimados para concentração de ergosterol
Termo Coef SE Coef T P Constante 0,60667 0,06497 9,338 0,000 Numero de rotações 0,02530 0,03978 0,636 0,553 intervalo 0,11607 0,03978 2,918 0,033 Numero de rotações*numero de rotações -0,14271 0,04735 -3,014 0,030 intervalo*intervalo -0,11896 0,04735 -2,512 0,054 Numero de rotações*intervalo 0,18625 0,05626 3,310 0,021 R-Sq = 86,43%
A equação do modelo ajustado para as variáveis codificadas é a seguinte:
Ergosterol = 0,61 + 0,021*NR + 0,12*I - 0,14*NR2 - 0,12*I2 + 0,19*NR*I Eq. 18
(mg. gms-1)
Através dos valores de P é possível afirmar que todos os efeitos têm
influência sobre o modelo exceto o fator número de rotações linear, pois o
coeficiente é pequeno em relação aos outros efeitos e o p não indica significância ao
nível de 85%. O coeficiente de correlação do modelo é de 0,86.
As análises de distribuição não mostram desvios da normalidade (figura 39) e
as superfícies de resposta geradas estão apresentadas na figura 40.
Resultados e Discussão
98
Figura 39 - Análise de resíduos do ajuste da superfície de resposta para a concentração de ergosterol
0,20,10,0-0,1-0,2
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Residual
Perc
ent
Normal Probability Plot(response is Teor ergosterol)
0,70,60,50,40,30,20,10,0
0,15
0,10
0,05
0,00
-0,05
-0,10
-0,15
Fitted Value
Residual
Versus Fits(response is Teor ergosterol)
Resultados e Discussão
99
Figura 40 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da concentração de ergosterol em função do
número de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.
A Figura 40 mostra que a região de maior concentração de ergosterol, e
portanto de maior crescimento microbiano, ocorre entre os cultivos com maior
número de voltas e maiores intervalos entre os eventos de agitação e os pontos
centrais. Isso indica que agitação favoreceu o aumento de biomassa desde que
usado em níveis adequados.
A tabela 25 apresenta um resumo dos resultados de consumo de oxigênio
(OU), produção de CO2 (CE) e concentração de ergosterol calculados pelos modelos
numero de rotações
inte
rvalo
6050403020
11
9
7
5
3
>
–
–
–
< 0,0
0,0 0,2
0,2 0,4
0,4 0,6
0,6
ergosterol
Teor
Teor de ergosterol
A B
I, J, K
G
C
E
H nume ro de rotações
intervalo
6050403020
119
753
D
F
-0,5
0,0
2040
0,5
6
3
60
9
6
12
Teor ergosterol
intervalo
numero de rotações
Teor ergosterol
Resultados e Discussão
100
(equações 15, 19 e 20), apresenta também os resultados de proteína total e RQ. O
coeficiente respiratório foi calculado separadamente para cada fase dos cultivos: (1)
fase de maior crescimento (entre 6 e 30 horas), (2) fase entre o início do decaimento
da respiração até a OUR atingir 250 mmoles.h-1. Abaixo desse valor, o erro de
medida do equipamento fica grande em relação ao valor da leitura, distorcendo os
resultados.
Tabela 25 - Parâmetros da respiração calculados pelos modelos
Ensaios OU (138 horas) CE (138 horas)
RQ1* RQ2
** Proteína Ergosterol
(mol) (mol) (g) (mg/gms) A 69,44 66,34 1,13 0,87 885 0,39 B 35,20 35,71 1,20 1,12 892 0,07 C 39,57 46,93 1,08 1,02 1240 0,25 D 42,33 56,44 1,07 1,21 1143 0,67 E 49,76 58,83 1,09 1,30 1052 0,29 F 27,50 43,89 1,36 1,20 2037 0,36 G 62,69 50,89 - 0,86 807 0,20 H 46,61 51,82 1,57 1,3 1860 0,53 I 38,62 51,36 1,13 0,88 1001 0,61 J 38,62 51,36 1,43 1,29 1108 0,61 K 38,62 51,36 1,46 1,42 1483 0,61
* RQ calculado para a fase de crescimento ** RQ calculado para a fase após o declínio da respiração
Nota-se que não existe relação direta entre os parâmetros adotados para
estimativa do crescimento celular.
A região de mínimo consumo de O2 (figura 30) é também a região de mínima
produção de CO2 (figura 34) e de mínima concentração de ergosterol (figura 40),
enquanto que a região de máxima concentração de ergosterol também apresenta
alto consumo de O 2 e alta produção de CO2, embora não sejam os pontos de
máximo. Isso deve ocorrer devido à adaptação do metabolismo do fungo às
diferentes condições do meio. O crescimento ocorre em fases e é dependente de
uma série de fatores, como temperatura, umidade, pH, disponibilidade de nutrientes
e oxigênio, consistência do substrato. Desta forma é possível pensar que para cada
fase do crescimento deva ser adotado um tipo de controle e também que cada
variável seja mais adequada para avaliar o desempenho de diferentes etapas.
Resultados e Discussão
101
Os ensaios que apresentaram as menores fases lag foram dos ensaios com
maiores intervalos entre os eventos de agitação (figura 22), desta forma, para
minimizar o tempo de adaptação do microrganismo ao meio, talvez deva-se deixar o
leito sem agitação, uma vez que não há calor a retirar do meio e o microrganismo
poderia “colonizar” o substrato sem interferência.
A obtenção de energia pelo microrganismo pode oscilar entre aeróbia e
respirofermentativa durante todo o cultivo. Num mesmo instante é possível haver
pontos no reator onde esteja ocorrendo aerobiose enquanto que em outros, ocorre
anaerobiose devido a não homogeneidade do meio. O consumo de glicose como
fonte de carbono e energia por vias aeróbias resulta RQ muito próximo a 1,
entretanto Bajracharya e Mudgett (1980) consideram RQ entre 1,3 e 1,0 como
crescimento tipicamente aeróbio de Aspergillus oryzae cultivado em arroz.
No metabolismo respirofermentativo ocorre formação de etanol e produção de
CO2 sem consumo de O2 e portanto o RQ seria maior que 1. O Monascus sp. é
produtor de etanol (ROSENBLITT et al., 2000) e também o utiliza como fonte de
carbono e energia (JUZLOVA et al., 1994). O consumo de fontes de carbono tais
como ácidos graxos e ácidos orgânicos, em cujo catabolismo é consumido maior
número de moléculas de oxigênio do que liberação de moléculas de CO2 resulta RQ
menor do que 1. Deste modo o RQ oscila durante todo o cultivo trazendo pouca
informação.
Os cultivos mais freqüentemente agitados (A, G e B) atingiram valores
maiores de OUR, indicando que agitação promoveu a retirada de calor e as
transferências gasosas necessárias. Porém, principalmente o ensaio B parece ter
sido afetado pelo excesso de agitação uma vez que a respiração cai rapidamente e
chega a menos de 200 mmol.h-1 (leitura de 20,3 de oxigênio) perto de 72 horas.
Ensaios que não atingem OUR tão altas, como os do ponto central e os menos
agitados, como o G e o E, permanecem com velocidades de respiração maiores que
200 mmol.h-1 por mais de 120 horas. O ensaio A apresentou alta OUR com 24 horas
e permaneceu com atividade até 144 horas.
O parâmetro conteúdo de proteína não apresentou correlação com os
padrões de agitação adotados, porém, os resultados estão de acordo com os de teor
de ergosterol. Os melhores resultados ocorrem para os cultivos na região mais
agitada e com intervalos maiores entre os eventos de agitação como os pontos
centrais e os ensaios F e H. Nessa região, o consumo de oxigênio abaixo do
Resultados e Discussão
102
consumo máximo pode ser atribuído à agitação excessiva, que compacta o meio
mais rapidamente.
5.6.1.2. Análises de Umidade, ART e Produção de Pigmentos
Além das medidas relacionadas ao crescimento celular, também foram
determinadas as variáveis ART (açúcares redutores totais), umidade do meio e
produção de pigmentos de cor vermelha e laranja. As medidas dessas variáveis
permitiram não somente avaliar o desempenho do cultivo de Monascus sp., bem
como avaliar a homogeneidade do meio com base na variação dos valores das
referidas variáveis em diferentes pontos do reator, contemplando assim, o objetivo
de definir metodologia para ampliação de escala no reator com agitação interna.
A medida de ART representa o consumo da fonte de carbono mais abundante
– glicose – além de representar indiretamente o crescimento celular. Considerando-
se que ácidos orgânicos e produtos de fermentação também podem ter sido
empregados pelo fungo para crescimento e manutenção, fica claro que relacionar o
consumo de ART ao crescimento celular é uma aproximação. Já a quantificação dos
pigmentos não pode ser diretamente relacionada ao crescimento uma vez que se
trata de metabólito secundário.
A medida de açúcares redutores, AR, foi na verdade a medida exclusiva de
glicose, de modo que havendo AR, é possível supor que há limitação ao consumo
da mesma pelo fungo, que não a limitação pela disponibilidade da fonte de carbono
e energia.
Para padronizar os ensaios, tentou-se manter a umidade constante e próxima
a 45% em base úmida. Para tanto, se recorreu à reposição de água quando a
umidade, medida, no analisador infravermelho, resultava abaixo de 45%.
Padronizou-se adicionar a água juntamente com um evento de agitação para que
essa fosse imediatamente misturada ao meio sem a necessidade de alterar o padrão
de agitação estabelecido. A tabela 26 apresenta as quantidades de água e os
instantes em que foram adicionadas.
Resultados e Discussão
103
Tabela 26 - Volume de água (mL) adicionado em cada ensaio para reposição de água evaporada.
Tempo Ensaios 24 horas 48 horas 96 horas
A 500 ml 500ml B 500 ml C 500 ml 500 ml D 500 ml E 500 ml 500 ml F G 500 ml H I 750 ml 500 ml J K 500 ml
O planejamento inicial previa a adição gradual de água para que não
houvesse oscilações na umidade, porém problemas de comunicação entre o sistema
de aspersão e o computador impediram seu uso como relatado no item 5.2.
As figuras 41, 42 e 43 apresentam os valores de umidade retirados pelo
amostrador após um evento de agitação dos ensaios em função do tempo de cultivo.
Figura 41 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação, ( ) ensaio C, ( ) ensaio D e ( ) ensaio H.
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
H2O
/g t
ota
l)
Resultados e Discussão
104
Figura 42 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios no ponto central, (-) ensaio I, ( ) ensaio J e ( ) ensaio K e com intervalo médio entre os eventos de agitação, (∗) ensaio E, (+) ensaio
F.
Figura 43 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação, ( ) ensaio A, ( ) ensaio G e ( ) ensaio B.
Observa-se que a umidade permaneceu estável durante os cultivos com
menor intervalo entre os eventos de agitação, A, G e B, entre 0,45 e 0,5. Os cultivos
com intervalos médios entre os eventos de agitação oscilaram um pouco mais.
As figuras 44 e 45 apresentam os valores de ART e AR em função do tempo.
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
H2O
/g t
ota
l)
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
H2O
/g t
ota
l)
Resultados e Discussão
105
Figura 44 - Concentração de ART em função do tempo de cultivo, ( ) ensaio A; ( ) ensaio B; ( )
ensaio C e (-) ensaio I (ponto central)
Figura 45 - Concentração de AR em função do tempo de cultivo, ( ) ensaio A; ( ) ensaio B; ( ) ensaio
C; (-) ensaio I (ponto central) e ( ) ensaio G.
Observa-se que houve um consumo entre 45% (ensaio A) e 60 % (ensaio I)
do ART inicial (amido), ou seja, havia fonte de carbono na forma de amido quando
da cessação do crescimento, mas, provavelmente inacessível por estar no interior
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
AR
T (
g g
lico
se/g
ms)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
AR
(g
gli
cose
/gm
s)
Resultados e Discussão
106
dos grãos ou por outros fatores como a compactação do meio. Somente alguns
ensaios foram apresentados, pois, alguns resultados foram perdidos.
A figura 45 mostra que há uma tendência de aumento na concentração de AR
por volta de 48 de cultivo, momento em que a OUR já começa a diminuir para todos
os cultivos. Entretanto, não há queda no consumo de substrato nesse momento,
indicando apenas que a quantidade de amido que está sendo hidrolisada está sendo
gradativamente consumida. O excesso de glicose pode induzir a formação de etanol
pela via aeróbia (PASTRANA et al., 1995 e ROSENBLITT et al., 2000), porém isso
inibe a produção de pigmentos (CARELS e SHEPHERD, 1975 e CHEN e JOHNS,
1994).
As figuras 46 e 47 apresentam os resultados da medida da absorbância 500
nm (pigmentos vermelhos) e 400 nm (pigmentos laranja) em função do tempo de
cultivo
Resultados e Discussão
107
Figura 46 - Pigmentos vermelhos (absorbância a 500nm) em função do tempo para (A) ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação, ( ) ensaio C, ( ) ensaio D e ( ) ensaio H. (B) cultivos no
ponto central, (-) ensaio I, ( ) ensaio J e ( ) ensaio K e com intervalo médio ( 7 horas) entre os eventos de agitação, (∗) ensaio E, (+) ensaio F; (C) cultivos com menor intervalo entre os eventos de
agitação , ( ) ensaio A, ( ) ensaio G e ( ) ensaio B.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ab
s (5
00n
m)/
gm
s
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ab
s (5
00n
m)/
gm
s
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ab
s (5
00n
m)/
gm
s
A
C
B
Resultados e Discussão
108
Figura 47 - Pigmentos laranja (absorbância a 400nm) em função do tempo para (A) ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação, ( ) ensaio C, ( ) ensaio H e ( )ensaio D. (B) cultivos no
ponto central, (-) ensaio I, ( ) ensaio J e ( ) ensaio K e com intervalo médio ( 7 horas) entre os eventos de agitação, (∗) ensaio E, (+) ensaio F; (C) cultivos com menor intervalo entre os eventos de
agitação , ( ) ensaio A, ( ) ensaio G e ( ) ensaio B.
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ab
s (4
00n
m)/
gm
s
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ab
s (4
00n
m)/
gm
s
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ab
s (4
00n
m)/
gm
s
A
B
C
Resultados e Discussão
109
Nota-se que os ensaios com intervalos menores entre os eventos de agitação
produziram significativamente menos pigmentos nos dois comprimentos de onda e
que o ensaio mais agitado (ensaio B) foi o que menos produziu, provavelmente pela
dificuldade de transferência de oxigênio causada pela compactação do meio. Para
os ensaios com intervalos médios entre os eventos de agitação houve bastante
variação na produção, principalmente entre os ensaios no ponto central,
evidenciando a grande variabilidade do processo e impedindo o ajuste de uma
superfície de resposta.
Os perfis de produção de pigmentos vermelhos e laranja são muito
semelhantes para todos os cultivos, indicando que as produções são dependentes.
Porém todos os ensaios produziram cerca de 2 a 4 vezes mais pigmentos laranja do
que vermelho o que pode ser resultado da limitação por glutamato monossódico, o
qual participa da reação química de conversão da cor laranja à vermelha (Li e
Demain, 1991) ou falta de oxigênio.
Rosenblitt et al. (2000) encontraram quantidades insignificantes de pigmentos
vermelhos em relação aos laranjas em cultivos de Monascus em arroz (quantificando
em HPLC) e atribuem isso ao fato de não terem usado peptona como suplemento,
uma vez que produção total de pigmentos se compara à obtida por Chen e Johns
(1994) que usaram o suplemento.
Quando se compara a produção de pigmentos nos ensaios teste 1 e 3, cuja
diferença é a vazão específica de ar, de 1,2 e 3,0 l.min-1.kgms inicial-1
respectivamente, com padrão de agitação de 10 rotações a cada 24 horas item
5.1.4), observa-se que a razão entre os pigmentos vermelho e laranja, de 0,4 vezes
no ensaio 1 aumenta para 0,7 no ensaio 3 que é a mesma razão obtida para o
ensaio de suplementação padrão em frascos (item 5.5).
A figura 48 apresenta a evolução da produção de pigmentos para os ensaios
teste 1 e 3 e a Tabela 27 apresenta as relações entre a produção de pigmentos
laranja e vermelho.
Resultados e Discussão
110
Figura 48 - Pigmentos em função do tempo para os ensaios teste 1 ( ) 400 nm, ( ) 500 nm e ensaio
teste 3 ( ) 400 nm, ( ) 500 nm.
Tabela 27 - Razão entre produção de pigmentos vermelho e laranja para os ensaios do planejamento
fatorial e os ensaios teste 1 e 3
Absorbância 500nm/Absorbância 400nm
Tempo 1* 3* A B C D E F G H I J K
0 0,93 1,00 0,38 0,38 1,00 0,50 0,00 0,32 1,00 0,43 0,26 0,45 0,33
24 0,86 0,50 0,26 0,38 0,27 0,26 0,23 0,22 0,53 0,30 0,21 0,22 0,24
48 0,48 0,31 0,26 0,33 0,37 0,23 0,26 0,24 0,31 0,28 0,25 0,28 0,25
72 0,49 0,58 0,26 0,29 0,31 0,30 0,29 0,25 0,27 0,26 0,30 0,25 0,25
96 0,42 0,72 0,26 0,29 0,29 0,30 0,30 0,25 0,23 0,27 0,37 0,60 0,28
120 0,44 0,65 0,29 0,32 0,37 0,41 0,34 0,26 0,22 0,29 0,51 0,27 0,28
144 0,39 0,70 0,34 0,33 0,42 0,44 0,35 0,26 0,24 0,28 0,47 0,30 0,33
• Ensaios teste (5.1.4)
De acordo com a Tabela 27, a razão entre pigmentos vermelho e laranja é
maior no ensaio mais aerado (teste 3) em relação a todos os outros ensaios. Além
disso, verifica-se com base nos dados das figuras 46, 47 e 48 que a produção de
pigmentos vermelhos atingiu 144 U.gms-1 no ensaio 3 (10 rotações em 24 horas) e
75 U.gms-1 no ensaio F (melhor produção do planejamento fatorial), indicando que a
0
100
200
300
400
500
600
0 48 96 144 192 240
Tempo de cultivo (h)
Ab
s /g
ms
Resultados e Discussão
111
aeração influencia na produção de pigmentos e na razão entre os pigmentos
vermelhos e laranjas. Juzlova; Martinkova e Kren (1996) escreveram que a falta de
oxigênio prejudica mais a produção de pigmentos do que o crescimento, uma vez
que o fungo é capaz de fermentar. Pereira; Tonso e Kilikian (2008) verificaram
aumento de 100% na produção de pigmentos vermelhos em cultivos líquidos
aumentando a concentração de oxigênio dissolvido de 10 para 60%.
Observando o ensaio teste 4 (item 5.4.1), também pode-se notar que há um
atraso na produção de pigmentos em relação ao ensaio teste 3. A diferença entre
esses cultivos é o intervalo entre os eventos de agitação. O ensaio 3 foi agitado 10
rotações das pás a cada 24 horas e o ensaio 4 foi agitado com 1 rotação das pás a
cada 2 horas. Esse resultado está de acordo com os resultados obtidos nos ensaios
do planejamento fatorial que mostram os ensaios mais frequentemente agitados com
a produção menor de pigmentos até 144 horas (figura 47c).
A maior produção ocorreu no ensaio F e foi, até 144 horas, de 75 U.gms-1 de
pigmentos vermelhos e de 287,2 U.gms-1 de pigmentos laranjas. Vale ressaltar que a
produção de pigmentos laranjas para o ensaio 3 foi de 207 U.gms-1 em 144 horas
mas chegou a 668 U.gms-1 em 255 horas.
Os experimentos foram conduzidos até 144 horas para privilegiar o estudo do
crescimento do microrganismo e foram executados com aeração média (14 l.min-1),
o que pode ter ocasionado falta de oxigênio para a produção de pigmentos por
deficiência da transferência ou por compactação do meio devido a agitação. Isso
explicaria o fato dos cultivos A ,G e o I, que consumiram tanto oxigênio quanto os
cultivos em colunas conduzidos sob a mesma vazão específica de ar (2 l.gms-1.h-1),
terem produzido, respectivamente, 37, 14 e 43 U.gms-1 contra 450 U.gms-1 em
colunas (trabalho de iniciação científica desenvolvido no laboratório).
5.6.2. Homogeneidade
Foram retiradas amostras de diferentes pontos do reator antes dos eventos de
agitação conforme descrito no item 4.5 (figura 4), para avaliação da homogeneidade
do meio com base na determinação da umidade, proteína e pigmentos. As figuras
49, 50 e 51 apresentam a variabilidade da umidade nos pontos amostrados durante
o cultivo.
Resultados e Discussão
112
Figura 49: Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação, C, H e D em diferentes pontos do reator ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.
Ensaio C
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Ensaio D
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Ensaio H
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Resultados e Discussão
113
Figura 50 - Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com intervalo médio
entre os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto central (I, J e K) em diferentes pontos do
reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.
Ensaio E
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Ensaio F
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Ensaio I
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Ensaio J
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Ensaio K
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Resultados e Discussão
114
Figura 51 - Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com menores intervalos
entre os eventos de agitação, A, G e B em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.
Os valores de umidade nos diferentes pontos amostrados no reator ilustram a
maior ou menor homogeneidade do meio de cultivo. Os ensaios com maiores
intervalos entre os eventos de agitação (figura 49) apresentam maiores diferenças
entre os pontos amostrados e, entre esses ensaios, o número de voltas também
influencia. O ensaio C (figura 49) apresenta maior variação de umidade entre os
pontos amostrados. Os ensaios com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de
agitação também apresentam diferenças e mais uma vez o número de rotações
influenciou e o ensaio com menor numero de rotações (E) apresentou maiores
Ensaio A
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Ensaio B
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Ensaio G
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Um
idad
e (g
/g)
Resultados e Discussão
115
diferenças enquanto que o ensaio com maior número de voltas se mostrou bastante
homogêneo. Dentre os ensaios mais frequentemente agitados (figura 51), o ensaio B
(um dos mais agitados) apresenta maior homogeneidade. Observa-se que para a
maioria dos ensaios os pontos “d” e “e” que foram retirados da superficie e do fundo
do reator respectivamente, apresentam umidades muito próximas indicando maior
homogeneidade no sentido radial. As maiores diferenças ocorrem no sentido axial
(pontos a, b e c). Essa constatação sugere a necessidade de projeto de reator e
sistema de agitação que melhore a homogeneidade no sentido axial.
As figuras 52, 53 e 54 apresentam os resultados de concentração de proteína
para os diferentes pontos amostrados.
Figura 52 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação (C, H e D) em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+)
e.
Ensaio H
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Ensaio D
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Ensaio C
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Resultados e Discussão
116
Figura 53 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com intervalos médios entre os eventos de agitação (E e F) em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.
Ensaio K
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Ensaio J
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Ensaio I
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)Ensaio F
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Ensaio E
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Resultados e Discussão
117
Figura 54 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação (C, H e D) em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+)
e.
Os resultados de concentração de proteína não ilustram a diferença nos
padrões de agitação, ou seja, apesar de haver diferença de umidade não foi possível
notar diferença de concentração de proteína nos diversos pontos amostrados.
Foi feita também a medida de produção de pigmentos vermelho e laranja nos
pontos amostrados (figura 55, 56 e 57).
Ensaio G
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Ensaio B
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Ensaio A
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
conc
entr
ação
(g
prot
eina
/gm
s)
Resultados e Discussão
118
Figura 55 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação em diferentes
pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.
Ensaio C
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio C
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Ensaio H
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio H
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Ensaio D
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio D
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Resultados e Discussão
119
Figura 56 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em função do tempo para os ensaios com intervalos médios entre os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto
central (I, J e K)em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.
Ensaio E
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio E
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Ensaio I
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio I
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Ensaio J
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio J
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Ensaio K
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio K
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Ensaio F
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio F
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Resultados e Discussão
120
Figura 57 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em função do tempo para os ensaios com menores intervalos entre os eventos de agitação em diferentes pontos do reator,
( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.
Os resultados obtidos para pigmentos, assim como os de umidade, podem ser
usados para a medida da homogeneidade do reator porém pode-se notar que uma
maior homogeneidade (figura 57) não tem relação com o aumento da produção de
pigmentos uma vez que nos ensaios menos homogêneos como o E (figura 56) o
ponto de menor produção ao final do cultivo atingiu concentração da ordem de 50
Uabs.gms-1 para pigmentos vermelhos enquanto que os pontos do ensaio B que são
homogêneos atingiram no máximo 15 U.gms-1 para a mesma absorbância. O cultivo
F é o que apresentou maiores produções de pigmentos sendo que é um cultivo de
intervalos entre as agitações médio e alto número de rotações em 24 horas (60
voltas).
Ensaio A
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio A
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Ensaio G
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio G
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(40
0nm
)/gm
s
Ensaio B
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Uab
s(50
0nm
)/gm
s
Ensaio B
0
50
100
150
200
250
300
350
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)U
abs(
400n
m)/
gms
Resultados e Discussão
121
Os ensaios no ponto central apresentaram muitas diferenças entre si, como já
foi discutido no item anterior, mostrando a dificuldade na reprodutibilidade dos
experimentos. O melhor resultado no ponto central, ensaio K, apresenta bons
resultados de produção de pigmentos e também apresenta homogeneidade entre os
pontos amostrados, ou seja, deve existir um nível de agitação que favoreça as
trocas gasosas e a transferência de calor, sem prejudicar o meio de fermentação
causando compactação.
Para estabelecer um critério de homogeneidade, ou seja, para definir se o
meio está ou não homogêneo, foram calculados os coeficientes de variação para
cada tempo de fermentação nos diversos parâmetros analisados. A tabela 25 mostra
os coeficientes de variação médios para os parâmetros umidade, proteína e
pigmento nos dois comprimentos de onda analisados.
Tabela 28 - Coeficientes de variação médios (em função do tempo) entre os pontos
amostrados (a, b, c, d e e) do reator.
O coeficiente de variação da umidade pode ser considerado um bom
indicador de homogeneidade, devido aos diferentes valores nos coeficientes de
variação observados para cada padrão de agitação. O coeficiente de variação da
umidade vai de 1,3 % para o ensaio B que é um dos ensaios com maior agitação
(maior número de voltas com menor intervalo de tempo entre os eventos de
agitação) até 8,5 para o ensaio C que é um dos ensaios com menor agitação.
O coeficiente de variação da produção de pigmentos também pode ser
considerado um indicador de homogeneidade, pois varia de 33% no ensaio C para
9,4% no ensaio B. No ensaio C o coeficiente de variação para a produção de
pigmentos chega a 54% no tempo de 96 horas. A proteína, no entanto, não
Coeficientes de variação (%) A B C D E F G H I J K
Umidade 4,0 1,3 8,5 3,1 7,1 2,2 2,9 4,5 3,9 4,0 3,9 Proteína 9,1 8,6 7,5 5,0 9,6 4,6 5,7 7,0 8,6 10,4 5,3 Pigmento (500nm) 21,6 9,4 33,1 13,5 15,2 12,4 13,6 15,0 18,3 24,9 10,2
Pigmento (400nm) 19,5 11,9 29,3 14,8 19,2 11,9 11,4 16,7 16,1 28,3 10,7
Resultados e Discussão
122
apresenta diferenças nos coeficientes de variação entre os ensaios com diferentes
padrões de agitação. Não é possível estabelecer se há homogeneidade no reator
através da medida de proteína. A fim de verificar qual dos parâmetros tem relação
com o padrão de agitação aplicado, foi feito a análise de variância para os
coeficientes de variação da umidade e do pigmento (400 nm). A Tabela 29
apresenta a análise da variância do coeficiente de variação da umidade.
Tabela 29 - Análise de variância para variável resposta coeficiente de variação médio da umidade
Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 40,28 8,06 18,14 0,003 Linear 2 37,40 18,70 42,11 0,001 Quadrático 2 1,06 0,53 1,19 0,378 Interação 1 1,82 1,82 4,10 0,099 Resíduo 5 2,22 0,44 Falta de ajuste 3 2,21 0,74 221,36 0,005 Erro puro 2 0,0067 0,003 Total 9
Através da análise da variância, é possível afirmar que os termos lineares e a
interação tem influência ao nível de 90% . Desse modo, os coeficientes calculados
para as variáveis codificadas e o P estimado para cada efeito do modelo estão na
tabela 30
Tabela 30 - Coeficientes de regressão estimados para coeficiente de variação médio da umidade
Termo Coef SE Coef T P Constante 3,933 0,38 10,22 0,000 Numero de rotações -1,879 ,24 -7,97 0,001 intervalo 1,070 0,236 4,54 0,006 Numero de rotações*numero de rotações 0,371 0,280 1,32 0,243 intervalo*intervalo -0,1042 0,280 -0,37 0,726 Numero de rotações*intervalo -0,675 0,333 -2,03 0,099 R-Sq = 94,78%
Excluindo os termos quadráticos das variáveis por não apresentarem
significância ao nível de 90%, a equação do modelo ajustado para as variáveis
codificadas é a seguinte:
Resultados e Discussão
123
CV (umidade) = 3,933 – 1,879*NR + 1,070*I - 0,675*NR*I Eq. 19
Através dos valores dos coeficientes é possível afirmar que quanto maior o
valor do fator “número de rotações”, menor o coeficiente de variação (sinal negativo),
ou seja, maior a homogeneidade. Enquanto que, quanto maior o intervalo entre os
eventos de agitação maior o coeficiente de variação, ou seja, menor a
homogeneidade. O coeficiente de correlação do modelo é de 0,95.
As análises de distribuição não mostram desvios da normalidade (figura 58) e
as superfícies de resposta geradas estão apresentadas na figura 59.
Figura 58 - Análise de resíduos do ajuste da superfície de resposta para o coeficiente de variação
médio da umidade
87654321
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
Fitted Value
Residual
Versus Fits(response is CV umidade)
1,51,00,50,0-0,5-1,0
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Residual
Perc
ent
Normal Probability Plot(response is CV umidade)
Resultados e Discussão
124
Figura 59 - Superfície de resposta e gráfico de contorno do coeficiente de variação médio da umidade
em função do número de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.
Nota-se que dois ensaios que ficam na região de maior homogeneidade da
superfície de resposta (B e F) apresentaram os menores e os maiores resultados de
produção de pigmentos respectivamente. Esse fato reforça a idéia de que é possível
agitar o meio e ter um bom resultado de crescimento e produção de pigmentos. O
ensaio F tem maior número de voltas do que o B, mas o fato do intervalo ser maior
pode ter favorecido o desempenho do cultivo.
Além das diferenças de composição do meio nos pontos amostrados, outro
parâmetro para verificar a homogeneidade do meio poderia ser a temperatura. A
numero de rotações
inte
rvalo
6050403020
11
9
7
5
3
>
–
–
–
< 2
2 4
4 6
6 8
8
umidade
CV
CV umidade
A B
I, J, K
G
C
E
H nume ro de rotações
intervalo
6050403020
119
753
D
F
3
6
2040
9
6
3
60
9
6
12
CV umidade
intervalo
numero de rotações
CV umidade
Resultados e Discussão
125
figura 60 apresenta o perfil dos desvios em relação ao “set point” medido a 3 cm da
parede e a 8 cm da parede.
Figura 60 – Diferenças em relação à temperatura de ”set point” em função do tempo para os cultivos com maiores intervalos entre os eventos de agitação, ( ) C, ( ) H e (-) D; para os cultivos com
intervalos médios entre os eventos de agitação (+) E e (-) F; para ensaio no ponto central ( ) I, ( ) J e ( )K e ensaios com menores intervalos entre os eventos de agitação (∗) A, ( ) G e (x) B.
-10
-5
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Gra
die
nte
de
tem
per
atu
ra (
0 C)
3 c
m d
a p
ared
e
-10
-5
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Gra
die
nte
de
tem
per
atu
ra (
0 C)
8 c
m d
a p
ared
e
-10
-5
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Gra
die
nte
de
tem
per
atu
ra (
0 C)
3 c
m d
a p
ared
e
-10
-5
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Gra
die
nte
de
tem
per
atu
ra (
0 C)
8 c
m d
a p
ared
e
-10
-5
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Gra
die
nte
de
tem
per
atu
ra (
0 C)
3 c
m d
a p
ared
e
-10
-5
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Gra
die
nte
de
tem
per
atu
ra (
0C
) 8
cm
da
par
ede
-10
-5
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Gra
die
nte
de
tem
per
atu
ra (
0 C)
3 c
m d
a p
ared
e
-10
-5
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Gra
die
nte
de
tem
per
atu
ra (
0 C)
8 c
m d
a p
ared
e
Resultados e Discussão
126
Observa-se que a 3 cm da parede as temperaturas permanecem mais
próximas do “set point” do que a 8 cm para todos os ensaios. Entretanto, nos
ensaios mais freqüentemente agitados, as temperaturas a 3 cm da parede
apresentam um gradiente maior em relação ao set point e ficam mais próximas da
temperatura a 8 cm da parede. Isso deve ocorrer pois a temperatura a 3 cm da
parede fica mais equilibrada com a temperatura a 8 cm. Os ensaios com intervalos
médios entre os eventos de agitação apresentam altos gradientes a 8 cm, porém a 3
cm as temperaturas se mantêm próximas ao “set point”. Os resultados no ponto
central mostram que, diferente de outros parâmetros analisados, os ensaios são
reprodutíveis pois as repetições apresentam perfis muito semelhantes.
Nota-se também que alguns padrões de agitação como os ensaios com maior
número de rotações das pás e mais freqüentemente agitados (F e B) e os ensaios
pouco agitados e com intervalos grandes entre os eventos de agitação (C e H)
equilibraram a temperatura a 8 cm da parede com aproximadamente 72 horas de
cultivo. Isso indica o final do crescimento e conseqüentemente da produção de calor.
Porém somente os ensaios F e H produziram pigmentos.
As temperaturas registradas abaixo da temperatura de “set point” podem estar
em equilíbrio com a temperatura do ar de entrada no reator que é de
aproximadamente 250C, ou ainda mais baixas devido ao efeito de resfriamento do
meio pela evaporação. Isso indica necessidade de controlar a temperatura do ar de
entrada.
5.6.3. Balanço de energia térmica
Foi feito o balanço de energia térmica no reator conforme item 4.8.1 para
verificar se o calor gerado pelo microrganismo foi removido e de que forma ocorreu.
A tabela 31 apresenta os valores da temperatura ambiente média dos
cultivos, a vazão de água na camisa de resfriamentos e os valores dos cálculos de
calor removido e gerado estimado a partir da integração das equações apresentadas
no item 4.8.1. Para os cálculos, considerou-se que não houve perda de energia
térmica para o ambiente uma vez que o reator possui isolamento térmico.
Resultados e Discussão
127
Tabela 31 – Dados do balanço de energia nos cultivos em reator
Temperatura
ambiente média
Vazão de água na camisa
Calor removido Calor gerado camisa evaporação microrganismo
0C l.min-1 J J J A 24,0 2,0 -39,5 3918,6 9004,6 B 24,2 1,0 400,5 3443,2 8808,7 C 22,0 2,0 -5260,7 3560,7 6698,0 D 24,7 1,0 3671,2 3308,1 6442,1 E 24,4 1,0 3838,5 3237,9 6190,9 F 24,9 0,9 1413,3 3030,2 4054,8 G 26,0 1,1 1085,0 3457,2 7316,4 H 26,6 1,0 3607,0 3058,5 4524,7 I 24,4 1,0 3220,2 3420,1 9549,0 J 26,0 1,1 3197,3 3041,8 4786,7 K 26,5 1,0 3637,2 3172,6 4047,7
Houve muita variação nos valores de calor removido pela camisa para os
ensaios. Foi adotada uma estratégia de elevar a temperatura da camisa para 320C
no início dos cultivos a fim de elevar a temperatura do meio para a temperatura de
“set point” (300C) rapidamente e assim tentar diminuir a fase lag.
A vazão da água da camisa foi fixada em 1,0 l.min-1 com exceção dos ensaios
A e C nos quais a vazão foi de 2,0 l.min-1. Esses foram os primeiros ensaios e notou-
se que com a vazão mais alta, a diferença de temperatura da entrada e da saída da
camisa ficou muito pequena e a temperatura de saída acabou muitas vezes menor
do que a de entrada. Dessa forma optou-se por diminuir a vazão de água para
aumentar a diferença das temperaturas e tornar possível o cálculo do balanço. Além
disso, a temperatura ambiente média dos ensaios variou de 22 a 26,60C sendo que
no ensaio C, além da vazão alta da água da camisa, a temperatura de entrada do ar
foi muito baixa o que pode ter contribuído para que a camisa ao invés de retirar
calor, cedesse calor tornando o valor tão discrepante dos outros ensaios.
Apesar da temperatura na parede do reator ter precisado de calor para se
manter na temperatura de “set point”, o meio de cultivo alcançou gradientes de
temperatura de até 150C em resultado à baixa condutividade do meio de cultivo.
As figuras 61, 62 e 63 apresentam os perfis da remoção de calor pela parede
e por evaporação e a geração de calor pelo microrganismo.
Resultados e Discussão
128
Figura 61 – Calor removido e gerado nos ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação em função do tempo de cultivo ( ) calor gerado pelo microrganismo, ( ) calor removido pela
camisa, ( ) calor removido por evaporação
Ensaio C
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Cal
or (
W)
Ensaio H
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Cal
or (
W)
Ensaio D
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Cal
or (W
)
Resultados e Discussão
129
Figura 62 – Calor removido e gerado nos ensaios com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto central (I, J e K)em função do tempo de cultivo ( ) calor gerado
pelo microrganismo, ( ) calor removido pela camisa, ( ) calor removido por evaporação
Ensaio E
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ca
lor
(W)
Ensaio F
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ca
lor
(W)
Ensaio I
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ca
lor
(W)
Ensaio J
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ca
lor
(W)
Ensaio K
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Cal
or (
W)
Resultados e Discussão
130
Figura 63 – Calor removido e gerado nos ensaios com menores intervalos entre os eventos de agitação em função do tempo de cultivo ( ) calor gerado pelo microrganismo, ( ) calor removido pela
camisa, ( ) calor removido por evaporação
Não foi possível estabelecer uma relação entre os padrões de agitação e a
remoção de calor. Entretanto, nota-se que o calor removido pela evaporação é
praticamente constante para todos os cultivos durante todo o tempo. Esse fato pode
Ensaio A
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ca
lor (
W)
Ensaio G
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ca
lor (
W)
Ensaio B
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96 120 144
Tempo de cultivo (h)
Ca
lor
(W)
Resultados e Discussão
131
ser explicado pois o calor removido por evaporação é dependente da vazão de ar
que é igual para todos os ensaios; da temperatura na fase gasosa do reator que
variou muito pouco para todos os ensaios e da umidade absoluta que foi estimada
considerando o gás saturado o tempo todo.
Para melhorar a remoção de calor durante os cultivos, poder-se-ia aumentar a
vazão de ar, porém será necessário fazer um controle rigoroso da reposição de água
para prevenir o ressecamento do meio. Jorge (2005), trabalhando no mesmo reator
e usando vazão de ar de 8 l.min-1 também obteve remoções de calor constantes mas
da ordem de 10 J.h-1. Neste trabalho com vazão de ar de 14 l.min-1 obteve-se
remoção de aproximadamente 25 J.h-1.
A figura 64 mostra que para todos os cultivos a retirada de calor pela parede
tem relação direta, ou seja, é proporcional ao calor gerado que foi estimado pelo
consumo de oxigênio. Porém, as considerações feitas para o balanço estão
acarretando erros pois ensaios como H, J e K teriam balanços negativos, ou seja, o
calor removido teria sido maior do que o calor gerado e as medidas de temperatura
no interior do meio de cultivo mostram que há a formação de gradientes de
temperatura em todos os cultivos.
Observa-se também que assim como para os gradientes de temperatura
(figura 60), a agitação freqüente dificultou a retirada de calor pela camisa (figura 64)
pois esses ensaios apresentaram as maiores diferenças entre o calor retirado pela
camisa e o calor gerado pelo microrganismo.
Conclusões
132
6. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos na padronização das metodologias permitem as seguintes
conclusões:
• Na dosagem de ART o meio oriundo da hidrólise ácida deve ter pH ajustado
para 4 a fim de permitir a ação da enzima.
• Na dosagem de pigmentos, o uso de α-amilase, glucanase, sonicador e
glutamato não melhoraram a extração dos pigmentos das amostras.
As mudanças estruturais feitas no reator permitem a seguinte conclusão:
• Por ser um equipamento montado no laboratório para pesquisa, o reator
precisa de constantes modificações e correções em sua construção a fim de
atender e melhorar a aquisição de dados. No caso do tratamento térmico do
substrato, a inserção de vapor direto no meio de cultura não resultou
adequada. A distribuição de vapor não é homogênea no meio e dificulta o
controle da umidade.
• É necessário melhorar a distribuição do ar no interior do reator, fazendo com
que o ar passe mais eficientemente pelo meio em fermentação.
Os resultados obtidos no ensaio de suplementação permitem as seguintes
conclusões:
• Glutamato monossódico, embora não seja fonte de nitrogênio para o
crescimento do fungo, foi eficaz no aumento da produção de pigmentos, a
qual foi de 1910 U.gms-1 para o ensaio padrão e de 4340 U.gms-1 para o
ensaio suplementado. A produção de pigmentos laranjas passou de 2730
U.gms-1 no ensaio padrão para 9840 U.gms-1 no ensaio suplementado.
• O sulfato de amônio adicionado nas concentrações de 1 e 5% da massa seca
inibiu o crescimento em relação ao ensaio sem suplementação.
Conclusões
133
• O elevado residual em ART ao término dos cultivos não pode ser atribuído a
uma limitação por nitrogênio, visto que a adição deste nutriente não resultou
aumento na concentração protéica nem aumento da redução da massa seca.
Os resultados obtidos nos ensaios em reator permitem as seguintes conclusões:
• Os diferentes padrões de agitação causaram diferentes comportamentos nas
variáveis avaliadas.
• Os resultados de respiração indicam que o crescimento foi afetado tanto pela
agitação que causou a compactação do meio (ensaio B) quanto pela falta de
agitação que pode ter prejudicado a transferência de oxigênio (ensaio A).
• O consumo de oxigênio pode ser um bom indicador on-line de crescimento e
tem correlação com o padrão de agitação adotado. O ajuste do modelo
explica 81% dos dados e é igualmente afetado pelo número de rotações e
pelo intervalo entre os eventos de agitação. O maior consumo de oxigênio, 68
mol, e, portanto, o maior crescimento foi obtido para cultivos com menor
número de rotações e menores intervalos entre os eventos de agitação,
enquanto o menor consumo foi de 30 mol.
• Existe correlação entre a máxima OUR e o padrão de agitação adotado com
coeficiente de correlação de 92%. Tanto o fator intervalo entre os eventos de
agitação quanto o número de rotações influenciam negativamente a máxima
OUR, ou seja, quanto maior o intervalo ou maior o número de rotações menor
a OUR máxima. Além disso, o fator intervalo entre os eventos de agitação é
quatro vezes mais significativo do que o número de rotações.
• Também existe correlação entre a produção de CO2 e o padrão de agitação
empregado. O modelo se ajusta com coeficiente de correlação de 86% e para
esse parâmetro o fator intervalo entre os eventos de agitação é pouco
significativo e o número de rotações influencia negativamente.
Conclusões
134
• A medida de proteína como parâmetro de estimativa de crescimento
apresentou resultados satisfatórios. Não foi possível relacionar o padrão de
agitação e a massa total de proteína.
• A medida de ergosterol, apesar da variação de seu teor em células cultivadas
em meio líquido com desvio padrão da ordem de 17%, apresentou correlação
com o padrão de agitação empregado. As maiores concentrações de
ergosterol ocorreram nos ensaios com maior número de rotações e maiores
intervalos entre os eventos de agitação
• Não foi possível estabelecer correlação entre as metodologias adotadas para
a estimativa de crescimento.
• Não ocorre limitação de crescimento pela falta de fonte de carbono (amido),
pois o consumo é de aproximadamente 60 % da massa inicial. É possível que
o amido esteja inacessível no interior dos grãos.
• O intervalo entre os eventos de agitação afeta significativamente a produção
de pigmentos. Os ensaios frequentemente agitados (A, B e G) produziram
menos pigmentos vermelhos e laranjas do que os demais. Porém, o consumo
de oxigênio também é afetado pelo intervalo entre os eventos de agitação e
os ensaios A e G foram os ensaios que mais consumiram oxigênio. O ensaio
B alcançou a maior OUR e provavelmente sofreu a compactação do meio
pelo excesso de rotações.
• Parâmetros como a umidade e a produção de pigmentos podem ser bons
indicativos da homogeneidade do meio. A concentração de proteína não
variou entre os pontos amostrados para nenhum dos ensaios indicando que
não foi um bom indicador de homogeneidade.
• O coeficiente de variação da umidade possui boa correlação com os padrões
de agitação aplicados. O modelo se ajusta com coeficiente de correlação de
Conclusões
135
95%. Quanto menor o coeficiente de variação, maior a homogeneidade do
meio.
• Padrões de agitação com maior número de rotações das pás e mais
freqüentemente agitados (F e B) e os ensaios pouco agitados e com
intervalos grandes entre os eventos de agitação (C e H) equilibraram a
temperatura no valor do “set-point” a 8 cm da parede com aproximadamente
72 horas de cultivo indicando uma sensível redução da velocidade do
crescimento.
• Para todos os cultivos a retirada de calor pela parede tem relação direta, ou
seja, é proporcional ao calor gerado pelo microrganismo que foi estimado pelo
consumo de oxigênio.
• Controle da FES é possível com base na velocidade de respiração, OUR, com
base na qual o sistema de agitação pode ser acionado e a vazão de ar
ajustada. Medidas de umidade em diferentes pontos do reator, também
podem auxiliar não controle dos eventos de agitação. A agitação por si só não
é suficiente para remover o calor metabólico gerado, requerendo maior
participação da remoção de calor por evaporação, o que, por conseguinte,
demandará mais freqüente adição de água com efeito positivo no controle da
temperatura.
• Ampliação de Escala de FES em reator com agitação interna deve modular a
aplicação dos eventos de agitação os quais devem ser pouco freqüentes na
fase de colonização do meio pelo fungo (fase “lag”); mais freqüentes na fase
de crescimento celular intenso; e, finalmente, após a desaceleração da OUR,
controlados pelo gradiente de temperatura na fase de acúmulo de produtos
oriundos de metabolismo secundário. Devem ainda ser consideradas a
eficiência da aeração e natureza do substrato.
Referências Bibliográficas
136
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