ii

Adriana Micheli

Variabilidade intraespecífica, inimigos naturais e avaliação da mistura de

fungos entomopatogênicos e inseticidas para o controle de Diabrotica

speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae).

Dissertação apresentada à Coordenação do Curso

de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Área

de Concentração em Entomologia, da

Universidade Federal do Paraná como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas.

Orientador: Dr. Daniel R. Sosa-Gómez

Curitiba, PR

2005

Variabilidade intraespecífica, inimigos naturais e avaliação da mistura de fungos entomopatogênicos e inseticidas para o controle de Diabrotica

speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae).

Por

Adriana Micheli

Tese aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em

Ciências Biológicas, no Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Área de

Concentração em Entomologia da Universidade Federal do Paraná, pela banca

examinadora:

__________________________________

Dr. Daniel R. Sosa-Gómez

(Orientador - Embrapa Soja)

___________________________________

Dr. Ítalo Delalibera Jr.

(Esalq - USP)

___________________________________

Dra. Sônia M. N. Lazzari

(UPPR)

A Deus

Ofereço

À minha mãe Sueli

Dedico

Agradecimentos

Ao Dr. Daniel R. Sosa-Gómez, pela orientação, amizade e apoio irrestritos.

À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Entomologia da UFPR e aos

professores, pela oportunidade de freqüentar o curso.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

bolsa de estudo concedida.

Ao Centro Nacional de Pesquisa de Soja, da Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuária (Embrapa Soja), pelo fornecimento da estrutura necessária à

realização deste trabalho.

Aos funcionários do Laboratório de Patologia de Insetos Ivanilda Soldorio, Fábio

Paro e José Jairo da Silva, pela inestimável colaboração na condução dos

trabalhos de laboratório, por serem profissionais tão competentes nos momentos

necessários e amigos de todas as horas.

Ao funcionário do Laboratório de Bioecologia de Percevejos, Jovenil José da Silva,

pelo constante auxílio na realização deste trabalho.

Ao funcionário do Laboratório de Criação de Lagartas, Adair Carneiro, pelo valioso

trabalho fotográfico.

Aos funcionários de campo Elias, Eupídio, Oriverto, Pavão, Valter e Wilson, pela

valiosa colaboração na coleta dos insetos.

Aos funcionários do Laboratório de Biotecnologia Vegetal, César, Silvana e Vera,

pelo apoio técnico (e psicológico) nos trabalhos moleculares.

v

Aos funcionários do Laboratório de Tecnologia e Patologia de Sementes, pela

convivência sempre tão agradável.

À Dra. Beatriz Corrêa-Ferreira, Rose e Joacir, pela colaboração na realização dos

experimentos em casa de vegetação.

Aos amigos Edson Hirose, Ednéia Borges, Frederico Henning e Marliton Barreto,

pelos ensinamentos, pelo companheirismo e amizade.

Aos amigos e colegas do Curso de Mestrado do ano 2003, em especial Adelita,

Ana Paula, Anamaria, Céuli, Fernanda, Elis, Gil Felipe, Mari e Venício. O tempo de

convivência foi curto, mas o carinho é enorme. Aos colegas do doutorado Leandro

e Geane.

Ao Dr. Rui Scaramella Furiatti (UEPG), Dr. Luís Alves (UNOESTE), Francisco

Lozano Leonel Júnior (Bayer CropScience) pelo envio de insetos.

Ao Dr. Ronaldo Toma, pela identificação das moscas parasitóides.

Ao MSc. Luciano Moura, da Fundação Zoobotânica do Rio Grande do Sul, pelo

auxílio na identificação das espécies de Cerotoma e pelo apoio constante nos

estudos com Diabrotica.

À Professora Valéria Langendick, pela revisão da gramática e ortografia.

Ao Dr. Flávio Moscardi, pelo eterno bom humor.

À Dra. Ivana Barbola, por ter sido a primeira a me ensinar Entomologia.

Ao Rangel, por estar sempre ao meu lado para absolutamente tudo!

vi

À minhas amigas... Milena Raimam, Silvia Beatriz e Vilmarise Bobato. “O

verdadeiro amigo é aquele que nos faz melhor do que somos”.

Em especial a minha mãe e meu pai, pelo exemplo distinto de honestidade e

perseverança, que contribuíram de forma relevante no meu desenvolvimento

pessoal. Aos meus irmãos Juliano e Luciana, por plantarem em meu coração a

amizade sincera. Obrigada pelo apoio, incentivo e patrocínio!

A todos que, de alguma forma, contribuíram na realização deste trabalho.

“O homem que venceu na vida é aquele que viveu bem, riu muitas vezes e amou

muito; que conquistou o respeito dos homens inteligentes e o amor das crianças,

que preencheu um lugar e cumpriu uma missão; que deixa o mundo melhor do

que encontrou, seja com uma flor, um poema perfeito ou o salvamento de uma

alma; que procurou o melhor nos outros e deu o melhor de si”.

R. L. Stevenson

Sumário

Agradecimentos.................................................................................. v

Resumo............................................................................................... xii

Abstract............................................................................................... xiv

Lista de Tabelas.................................................................................. xv

Lista de Figuras.................................................................................. xviii

Capítulo 1. Introdução e Revisão Bibliográfica

1.1. Introdução........................................................................................... 1

1.2. Revisão Bibliográfica.......................................................................... 2

1.2.1. Importância econômica de Diabrotica speciosa................................. 2

1.2.2. Uso de marcadores moleculares RAPD em estudos de

variabilidade genética.........................................................................

4

1.2.3. Estudos moleculares realizados com espécies do gênero

Diabrotica............................................................................................ 6

1.2.4. Ocorrência de inimigos naturais em D. speciosa................................ 8

1.2.5. Utilização de fungos entomopatogênicos em programas de controle

de insetos............................................................................................

9

1.3. Literatura citada.................................................................................. 14

Capítulo 2. RAPD para estudo de populações de Diabrotica

speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae)

2.1. Introdução........................................................................................... 26

2.2. Material e Métodos............................................................................. 27

2.2.1. Extração de DNA................................................................................ 28

ix

2.2.2. Quantificação de DNA........................................................................ 29

2.2.3. Análise molecular do DNA através da técnica de RAPD.................... 29

2.2.4. Análise de dados................................................................................ 30

2.3. Resultados e Discussão..................................................................... 31

2.4. Conclusões......................................................................................... 35

2.5. Literatura citada.................................................................................. 36

Capítulo 3. Ocorrência de Protozoários, Parasitóides e Fungos em Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae)

3.1. Introdução........................................................................................... 41

3.2. Material e Métodos............................................................................. 44

3.2.1. Avaliação de inimigos naturais em populações de campo de D.

speciosa.............................................................................................. 44

3.2.2. Densidade do inóculo de fungos entomopatogênicos relacionada à

área foliar............................................................................................ 44

3.3. Resultados e Discussão..................................................................... 45

3.4. Conclusões......................................................................................... 52

3.5. Literatura citada.................................................................................. 53

Capítulo 4. Eficiência de isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em mistura com inseticidas no controle de Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae)

4.1. Introdução........................................................................................... 60

x

4.2. Material e Métodos............................................................................. 61

4.2.1. Seleção de isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium

anisopliae em Diabrotica speciosa..................................................... 61

4.2.2. Determinação da DL50 dos isolados de Beauveria bassiana em

Diabrotica speciosa.

64

4.2.3. Determinação da DL5 dos inseticidas em D. speciosa....................... 65

4.2.4. Efeito de Beauveria bassiana em mistura com inseticidas na

infecção de Diabrotica speciosa......................................................... 66

4.2.4.1. Infecção de Diabrotica speciosa após aplicação de Beauveria

bassiana em mistura com inseticidas em laboratório......................... 66

4.2.4.2 Infecção de Diabrotica speciosa após aplicação de Beauveria

bassiana em mistura com inseticidas em casa de vegetação............ 68

4.2.5. Consumo foliar de Diabrotica speciosa em trifólios de soja tratados

com fungos e inseticidas..................................................................... 69

4.3. Resultados e Discussão..................................................................... 69

4.4. Conclusões......................................................................................... 108

4.5. Literatura citada.................................................................................. 109

Considerações finais........................................................................ 115

xi

Resumo Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae) é

um inseto polífago considerado praga importante na cultura de milho (Zea mays

L.). Na soja [Glycine max (L.) Merril], os adultos podem causar danos ao

desenvolvimento das plantas quando o ataque é intenso. Este trabalho foi

realizado com o objetivo de caracterizar populações geográficas de D. speciosa

mediante a utilização de marcadores moleculares à base de RAPD, bem como

estabelecer a ocorrência dos inimigos naturais em populações de campo e

determinar o potencial de controle de isolados de fungos entomopatogênicos à

este inseto através da utilização conjunta com inseticidas químicos em baixas

dosagens. Utilizando marcadores moleculares pela técnica de RAPD contatou-se

que houve a formação de grupos diferentes dentro de cada população geográfica,

embora a presença de indivíduos de outras regiões nos agrupamentos indique a

freqüência elevada de migração desses insetos entre locais distantes. Os insetos

das populações de Florestópolis (PR), Primavera do Leste (MT), Paulínia (SP) e

Ponta Grossa (PR) formaram agrupamentos com índices de similaridade de Dice

próximos a 37 %, indicando elevado polimorfismo entre os indivíduos. Os

indivíduos da população da Warta (PR) mostraram baixo índice de similaridade (8

%). Entre os inimigos naturais encontrados sobre D. speciosa, a maior ocorrência

foi do protozoário Gregarina (97 %) seguida por moscas parasitóides do gênero

Celatoria sp. (Diptera: Tachinidae) (26 %). Os maiores índices de parasitismo

ocorreram durante os meses de fevereiro e março/2004. Durante a safra de soja

2003/04 a maior ocorrência de fungos entomopatogênicos nos folíolos de soja, foi

do fungo Beauveria sp. Este resultado está relacionado com a ocorrência natural

do fungo sobre D. speciosa (10 %). Para avaliar o potencial de controle de fungos

entomopatogênicos à vaquinha patriota, isolados de Beauveria bassiana e de

Metarhizium anisopliae foram utilizados para os testes de patogenicidade. Os

isolados de B. bassiana com maior virulência foram utilizados em bioensaios com

os inseticidas fipronil e imidacloprid. Os bioensaios foram realizados em

laboratório e em casa de vegetação. Apesar da germinação dos fungos não ter

sido afetada pelos inseticidas, os tratamentos de fungos em mistura com os

xii

inseticidas não apresentaram efeito sinérgico no controle de D. speciosa. Foi

observado que os insetos apresentaram um maior consumo de plantas

pulverizadas com fipronil do que daquelas com imidacloprid.

xiii

Abstract Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae) is a

poliphagous insect and important pest on corn (Zea mays L.). In soybean [Glycine

max (L.) Merril], the adults cause yield reduction when high population density

occurs. The aim of this work was to characterize geographically populations of D.

speciosa using RAPD molecular markers, as well to determine the occurrence of

natural enemies on field populations and determine the control potential of

entomopathogenic fungi to this insect, using combination fungi with low dosages of

insecticides. The analyses with RAPD markers showed that the individuals were

clustered separately inside each geographic population, although some specimens

clustered with individuals from other regions. This fact suggests a high level of

migration between distant regions. The insects from Florestopolis (PR), Primavera

do Leste (MT), Paulínia (SP) e Ponta Grossa (PR) clustered with Dice’s similarity

near 37 %, indicating high polymorphism between this individuals. The individuals

from Warta (PR) showed low similarity (8 %). Among the natural enemies of D.

speciosa, the most important were the Gregarina protozoa (97%) and Celatoria sp.

(Diptera: Tachinidae) (26%). The highest parasitism and infection rates occurred

on February and March of 2004. The number of B. bassiana colony forming units

on the leaves were high during the period that the infection on D. speciosa reach a

maximum of 10 % prevalence. To evaluate the entomopatogenic fungi potencial to

control D. speciosa, Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae isolates were

used in the pathogenicity tests. The most virulent B. bassiana isolates were used in

bioassays with fipronil and imidacloprid insecticides. The bioassays were done in

laboratory and greenhouse. Insecticides do not affect the fungus germination, but

the combination of insecticides and fungi did not show synergistic effect on D.

speciosa control. It was observed that the feeding activity was enhanced by fipronil

applications compared with those plants treated with imidacloprid.

xiv

Lista de Tabelas

Capítulo 2

Tabela 1. Origem, data de coleta e plantas hospedeiras das populações

de D. speciosa analisadas com marcadores moleculares para

avaliação de variabilidade intraespecífica.....................................28

Tabela 2. Número de bandas geradas cada iniciador utilizado no estudo

de variabilidade genética entre populações de D.

speciosa........................................................................................31

Tabela 3. Distância (km) entre as localidades onde foram coletadas as

populações de D. speciosa........................................................... 35

Capítulo 3

Tabela 1. Lista de inimigos naturais de Diabrotica speciosa registrados

para a América do Sul...................................................................

43

Capítulo 4

Tabela 1. Lista de isolados de fungos entomopatogênicos utilizados nos

ensaios..........................................................................................

64

Tabela 2. Mortalidade total e confirmada (% média ± EP) de adultos de

Diabrotica speciosa durante 15 dias após inoculação com

isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae...........72

Tabela 3. Mortalidade (% média ± EP) de adultos de Cerotoma arcuata

durante 15 dias após inoculação com isolados de Beauveria

bassiana........................................................................................80

Tabela 4. DL50 de Beauveria bassiana sobre adultos de Diabrotica

speciosa expostos a diferentes doses de conídios, com base na

xv

mortalidade total (com e sem sinais do patógeno) 7 dias após

inoculação.....................................................................................

83

Tabela 5. DL50 de Beauveria bassiana sobre adultos de Diabrotica

speciosa expostos a diferentes doses de conídios, com base na

mortalidade confirmada (com sinais do patógeno) 7 dias após

inoculação.....................................................................................83

Tabela 6. Doses (ng i.a./inseto) de fipronil em adultos de Diabrotica

speciosa 96 horas após inoculação.............................................. 84

Tabela 7. Doses (ng i.a./inseto) imidacloprid sobre adultos de Diabrotica

speciosa 96 horas após inoculação.............................................. 84

Tabela 8. Germinação dos conídios de Beauveria bassiana após 24

horas. Os conídios foram nebulizados sobre lâminas com meio

de cultura BDA e sulfato de streptomicina após 4 horas de

contato com o inseticida fipronil....................................................88

Tabela 9. Germinação dos conídios de Beauveria bassiana após 24

horas. Os conídios foram nebulizados sobre lâminas com meio

de cultura BDA e sulfato de streptomicina após 4 horas de

contato com o inseticida imidacloprid............................................89

Tabela 10. Peso micelial (g) de isolados de Beauveria bassiana em meio

de cultura líquido batata-dextrose e sulfato de streptomicina,

após 10 dias de agitação contínua................................................89

Tabela 11. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de

Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb59 e sua compatibilidade com fipronil

durante 10 dias de avaliação em laboratório.................................90

Tabela 12. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de

Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb61 em compatibilidade com fipronil durante

xvi

10 dias de avaliação em laboratório.............................................. 91

Tabela 13. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de

Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb467 em compatibilidade com fipronil

durante 10 dias de avaliação em laboratório.................................92

Tabela 14. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de

Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb59 em compatibilidade com imidacloprid

durante 10 dias de avaliação em laboratório.................................94

Tabela 15. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de

Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb61 em compatibilidade com imidacloprid

durante 10 dias de avaliação em laboratório.................................95

Tabela 16. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de

Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb467 em compatibilidade com imidacloprid

durante 10 dias de avaliação em laboratório.................................96

Tabela 17. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de

Cerotoma arcuata em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb61 em compatibilidade com imidacloprid

durante 10 dias de avaliação em laboratório.................................99

Tabela 18. Mortalidade total (com e sem sinais do patógeno) (média % ±

DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com isolados de

Beauveria bassiana em mistura com inseticidas durante 10 dias

de avaliação em casa de vegetação.............................................102

Tabela 19. Mortalidade confirmada (com sinais do patógeno) (média % ±

DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com isolados de

Beauveria bassiana em mistura com inseticidas durante 10 dias

xvii

de avaliação em casa de vegetação............................................ 103

Tabela 20. Área foliar de soja consumida por 5 adultos de Diabrotica

speciosa após períodos de 24 e 48 horas, sob condições

controladas de 26 ± 1oC, 60 % UR e fotofase de 14 horas...........106

Tabela 21. Mortalidade média (%) de D. speciosa alimentada com trifólios

de soja pulverizados com inseticidas e fungos, sob condições

controladas de 26 ± 1oC, 60 % UR e fotofase de 14 horas...........106

xviii

Lista de Figuras

Capítulo 2

Figura 1. Amostras de DNA de D. speciosa da região de Warta, Londrina

(PR) amplificadas com o iniciador OPC-04 através da técnica de

RAPD. λ DNA foi utilizado como marcador molecular (M).

Controle negativo (N)....................................................................32

Figura 2. Amostras de DNA de D. speciosa da região de Paulínia (SP)

amplificadas com o iniciador OPC-04 através da técnica de

RAPD. λ DNA foi utilizado como marcador molecular (M).

Controle negativo (N).................................................................... 32

Figura 3. Índice de Similaridade de Dice. Dendrograma de populações de

Diabrotica speciosa PG = Ponta Grossa (PR), Flo =

Florestópolis (PR), W = Warta, Londrina (PR), Pau = Paulínia,

(SP) e PL = Primavera do Leste (MT)........................................... 33

Capítulo 3

Figura 1. Mosca parasitóide Celatoria sp. (Diptera: Tachinidae).................. 46

Figura 2. Prevalência (%) de Celatoria sp. sobre populações de

Diabrotica speciosa durante a safra de soja (2003/04) em

Londrina, PR.................................................................................. 46

Figura 3. Mosca parasitóide Strongygaster sp. (Diptera: Tachinidae)

registrada em adulto de Cerotoma arcuata, em Londrina, PR......47

Figura 4. Trofozoítos do protozoário Gregarina sp. encontrados na

hemolinfa de Diabrotica speciosa (aumento 100X)....................... 49

Figura 5. Prevalência (%) de Gregarina sp. em populações de Diabrotica

speciosa durante a safra de soja (2003/04), em Londrina. PR..... 50

xix

Figura 6. Oocisto de Gregarina encontrado na hemolinfa de Diabrotica

speciosa (aumento 400X).............................................................. 50

Figura 7. Densidade do inóculo dos fungos entomopatogênicos Beauveria

sp. e Metarhizium anisopliae (UFC) em folíolos de soja ao longo

da safra de soja 2003/04 em Londrina, PR................................... 52

Capítulo 4

Figura 1. Adulto de Diabrotica speciosa com conidiogênese de (a)

Beauveria bassiana e (b) Metarhizium anisopliae......................... 71

Figura 2. Mortalidade média (%) de Diabrotica speciosa nos tratamentos

com Beauveria bassiana em mistura com fipronil, 7 dias após

inoculação. Médias seguidas de mesma letra nas barras de

mesma cor, não diferem significativamente entre si pelo teste de

Tukey (p < 0,05)....................................................... 93

Figura 3. Mortalidade média (%) de Diabrotica speciosa em tratamentos

de Beauveria bassiana em compatibilidade com imidacloprid 7

dias de avaliação. Médias seguidas de mesma letra nas barras

de mesma cor, não diferem significativamente entre si pelo teste

de Tukey (p < 0,05)....................................................................... 97

Figura 4. Mortalidade média (%) de Cerotoma arcuata nos tratamentos

com o isolado de Beauveria bassiana CNPSo-Bb61,

imidacloprid, CNPSo-Bb61 + imidacloprid, e testemunha aos 7

dias de avaliação em laboratório. Médias seguidas de mesma

letra nas barras de mesma cor, não diferem significativamente

entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).......................................... 98

Figura 5. Consumo foliar de Diabrotica speciosa em plantas de soja

(cultivar Paraná) pulverizadas com: (a) fungos em mistura com

o inseticida fipronil comparadas com plantas sem tratamento;

xx

(b) fungos em mistura com o inseticida imidacloprid comparadas

com plantas sem tratamento; (c) inseticidas comparadas com

plantas sem tratamento; (d) fungos comparadas com plantas

sem tratamento.............................................................................. 105

Capítulo 1. Introdução e Revisão Bibliográfica 1.1. Introdução

O gênero Diabrotica (Chevrolat, 1844) (Coleoptera: Chrysomelidae:

Galerucinae) é composto por 338 espécies, sendo a maior diversidade de

espécies encontrada na região Neotropical, e apenas sete espécies são

encontradas na região Neártica. O gênero é separado em três grupos: signifera,

fucata e virgifera (Wilcox 1972). Nos dois últimos, encontram-se insetos pragas de

importância econômica e por esse motivo são os mais estudados.

Uma das espécies do grupo fucata mais conhecidas, e com ocorrência em

todos os estados brasileiros, é Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Krysan, 1986),

um crisomelídeo polífago conhecido popularmente como vaquinha patriota. Esse

inseto é considerado praga importante do milho (Zea mays L.), causando durante

sua fase larval danos consideráveis ao sistema radicular. Na soja [Glycine max

(L.) Merril], os adultos podem causar danos ao desenvolvimento das plantas

quando o ataque é intenso (Gallo et al. 2002). Segundo Hofmann-Campo et al.

(2000), esse inseto vem causando preocupação a sojicultores da região oeste e

sudoeste do Paraná.

Os insetos, em geral, têm suas populações controladas naturalmente por

predadores, parasitóides e doenças, se condições adequadas forem oferecidas.

Afortunadamente, a conscientização do impacto ambiental causado pelos

produtos químicos vem aumentando entre a população, e novas formas de

controle de pragas baseadas em procedimentos biológicos vêm sendo utilizadas

(Charnley 1997).

Um dos métodos de controle biológico mais utilizados é o uso de fungos

entomopatogênicos, sendo os mais estudados Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e

Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Os fungos não precisam ser ingeridos

para causar doenças aos insetos, eles podem invadir seus hospedeiros através

das membranas segmentares do exoesqueleto, todavia a umidade relativa e a

2

temperatura podem ser fatores limitantes ao seu desenvolvimento. Dessa forma,

algumas estratégias vêm sendo desenvolvidas para aumentar a eficiência dos

fungos, entre as quais a combinação de fungos com baixas dosagens de

inseticidas (Charnley 1997). O uso adequado de produtos químicos e a

associação desses com inimigos naturais fazem parte de programas de manejo de

controle.

Considerando a ampla distribuição desse inseto nos estados brasileiros e

sua importância econômica foi realizado o estudo da variabilidade genética entre

indivíduos geograficamente distintos mediante a utilização de marcadores

moleculares à base de RAPD, de maneira a fornecer informações básicas para

implementar os programas de controle, com dados de dispersão, diferenciação de

espécies crípticas e caracterização de raças. Outro objetivo foi estabelecer a

ocorrência de seus inimigos naturais e avaliar o potencial de controle de fungos

entomopatogênicos em misturas com inseticidas sobre esse inseto. Devido ao

elevado custo da produção de fungos entomopatogênicos e sua eficiência

dependente das condições ambientais, a utilização conjunta do inseticida químico

em baixas dosagens com o agente de controle biológico poderiam compensar

essas deficiências com um menor impacto ambiental.

1.2. Revisão bibliográfica

1.2.1. Importância econômica de Diabrotica speciosa

O adulto desse inseto, com aproximadamente 4,5 mm de comprimento, é

popularmente conhecido como vaquinha patriota pela sua cor verde, com três

manchas amarelas sobre os élitros, sendo a basal mais longa e avermelhada,

principalmente na região do calo humeral. Possui antenas escuras, sendo os três

segmentos basais mais claros principalmente o escapo; cabeça variando do pardo

avermelhado ao negro; labro, escutelo, metatórax, tíbias e tarsos negros (Marques

1941). A postura é realizada no solo, com cerca de 30 ovos/massa. O período de

3

incubação dos ovos é de 3 a 4 dias, e após esse período as larvas se

desenvolvem passando por três instares para pupa e adulto (Milanez 1995). As

larvas são brancas, tendo o tórax, a cabeça e as pernas torácicas pretas. Segundo

Ávila & Parra (2002), a duração da fase larval dos insetos e seu tamanho variam

de acordo com a planta hospedeira em que o inseto se encontra, de forma que a

duração do período larval em soja é de aproximadamente 27 dias.

D. speciosa é um inseto polífago, sendo que os adultos têm preferência

alimentar por folhas de leguminosas (folhas largas), como feijão (Phaseolus

vulgaris L.) e soja [Glycine max (L.) Merrill] em relação às gramíneas (folhas

estreitas) (Marques 1999) e, ainda, pode ser encontrado em lentilha (Lens

esculenta N.), batatinha (Solanum tuberosum L.), curcubitáceas como melancia

(Citrullus lanatus Thumb. Mansf.), melão (Cucumis melo L.), pepino (Cucumis

sativus L.) e abóbora (Curcubita spp.), tomate (Lycopersicon esculentum Mill.),

berinjela (Solanum melongena L.), pimentão (Capsicum annuum L.) (Gallo et al.

2002) girassol (Helianthus annus L.), banana (Musa spp.), algodão (Gossypium

hirsutum L.) (Zucchi et al. 1993) uva (Vitis vinifera L.) (Roberto et al. 2001), trigo

(Triticum aestivum L.) (Cividanes et al. 1987) e fumo (Nicotiana tabacum L.)

(Bertels 1962).

Segundo Milanez (1995b), alguns fatores como sistemas de produção de

milho, novos híbridos, manejo do solo, rotação com outras culturas e baixo índice

de parasitismo foram determinantes para o desenvolvimento e adaptação dessa

praga à cultura do milho, causando danos consideráveis ao sistema radicular

dessa gramínea à semelhança de outras espécies do mesmo gênero nos EUA

(Marques et al. 1999). Nos EUA, Metcalf (1986) estimou em um bilhão de dólares

os custos com inseticidas e as perdas na produção devido ao ataque de espécies

do gênero Diabrotica. O dano mais severo causado pelas larvas de D. speciosa à

raiz do milho, é tornar as plantas mais suscetíveis ao tombamento (pescoço de

ganso), aumentando as perdas na colheita mecânica, bem como facilitar a entrada

de fitopatógenos através dos orifícios que fazem ao se alimentar das raízes,

reduzindo a produtividade da planta (Silva 1995).

4

1.2.2. Uso de marcadores moleculares RAPD em estudos de variabilidade genética

A reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR),

desenvolvida por Kary Mullis na década de 80, foi um dos passos revolucionários

na genética molecular, pois se tornou possível a produção de múltiplas cópias de

seqüências específicas de DNA sem a necessidade de clonar esses segmentos

(Alberts et al. 1994). A PCR explora as características da duplicação do DNA e

consiste em desnaturar o DNA genômico, submetendo-o a uma alta temperatura

e, desse modo, permitindo que as duas fitas simples originadas sejam duplicadas.

Nesse ponto reside um dos trunfos dessa técnica, que é a utilização de uma

enzima extraída da bactéria Thermus aquaticus, a Taq polimerase. Essa bactéria

habita locais quentes e sua enzima suporta temperaturas de até 94 ºC, sendo que

sua temperatura ótima é de 72 ºC. Essa peculiaridade permite que o processo

seja realizado em aparelho termociclador com programas pré-estabelecidos com

alterações de temperatura. Além da Taq polimerase, são necessários dois

iniciadores de seqüência conhecida, que irão anelar-se às fitas simples do DNA

em suas extremidades 3’, que obviamente tenham seqüências complementares, e

direcionar a polimerase na síntese da seqüência desejada. Ambas as fitas servem

como moldes e o resultado de “n” ciclos de PCR é a formação de 2n duplas fitas

de DNA, que são cópias da seqüência flanqueada pelos iniciadores (Alberts et al.

1994).

As vantagens dessa técnica são muitas, entre elas a quantidade de DNA

necessária para a reação, na ordem de dezenas de nanogramas. Entre as

principais utilidades da reação em cadeia da polimerase estão os estudos de

evolução molecular, diferenciação de grupos taxonômicos, identificação de genes

específicos, entre outras.

As limitações da PCR residem no fato de que a contaminação com DNA

alheio pode prejudicar a análise dos resultados e da necessidade de se conhecer

a seqüência que flanqueia determinado segmento a ser amplificado para que os

oligonucleotídeos possam ser construídos. Para resolver esse problema

5

desenvolveu-se uma técnica denominada RAPD (Random Amplified Polymorphic

DNA) “Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso” que utiliza oligonucleotídeos

(iniciadores) curtos (10 nucleotídeos) de seqüência arbitrária para dirigir a reação

de amplificação (Ferreira & Grattapaglia 1998).

Essa técnica foi desenvolvida independentemente por dois grupos nos

Estados Unidos. Williams et al. (1990) denominaram a tecnologia como RAPD,

enquanto Welsh & McClelland (1990) propuseram a denominação AP-PCR

(Arbitrary Primed-Polymerase Chain Reaction), “Reação em Cadeia da Polimerase

com Oligonucleotídeos Arbitrários”, já que os oligonucleotídeos possuem

seqüência arbitrária, mas a amplificação não ocorre ao acaso e sim em lugares

específicos do genoma. Nessa técnica, a PCR utiliza apenas um oligonucleotídeo

arbitrário por reação e a amplificação ocorrerá quando esta mesma seqüência

reconhecer um sítio de homologia em uma das fitas e também o mesmo sítio, com

orientação invertida, na outra fita da molécula de DNA. Os produtos da

amplificação são submetidos à eletroforese em gel de agarose, de maneira que os

fragmentos de tamanhos distintos resultem em bandas no gel. Cada banda é

resultante da interação entre o oligonucleotídeo e o DNA molde. Se entre os sítios

para o oligonucleotídeo ocorrer a inserção de alguma base, o fragmento gerado

será mais longo e a banda produzida por sua amplificação terá maior peso

molecular, por outro lado, se houver uma deficiência, o fragmento será menor e a

banda terá também menor peso molecular. Os polimorfismos são reconhecidos

pela presença de um fragmento amplificado em um dos genótipos em relação à

ausência deste mesmo fragmento em outro genótipo (Dalzoto 1999).

As aplicações dos marcadores moleculares RAPD incluem: obtenção de

“impressões digitais” (fingerprintings) genômicas de indivíduos, variedades e

populações; análise de estrutura e diversidade genética em populações naturais;

definição das relações filogenéticas entre diferentes espécies; construção de

mapas genéticos de alta cobertura genética e a localização de genes (Ferreira &

Grattapaglia 1998).

6

1.2.3. Estudos moleculares realizados com espécies do gênero Diabrotica

O gênero Diabrotica (Chevrolat, 1844) é composto por 338 espécies (Wilcox

1972) caracterizadas pela similaridade morfológica entre os indivíduos, comum em

outros gêneros da subfamília Galerucinae (Coleoptera: Chrysomelidae) (Wilcox

1965). Por esse motivo, há grande dificuldade na identificação das espécies, de

modo que esse gênero nunca foi revisado sistematicamente (Krysan 1986). Frente

à dificuldade na identificação das espécies, estudos de ecologia, evolução e

relação filogenética entre os indivíduos limitam-se àquelas espécies reconhecidas

como pragas de importância agrícola, geralmente as mais estudadas.

Um dos complexos de pragas mais importantes economicamente para a

cultura de milho dos Estados Unidos é composto por espécies desse gênero. Por

esse motivo, o uso de marcadores moleculares vem sendo a ferramenta utilizada

por pesquisadores para solucionar problemas como identificação de espécies,

bem como estudar relações filogenéticas entre os indivíduos, diversidade genética

entre populações, entre outros (Francisco 2002, Silvestre 2002).

A maioria dos estudos realizados com indivíduos do gênero Diabrotica

limita-se ao estudo das relações filogenéticas das espécies que ocorrem na

América do Norte, bem como a identificação dessas espécies. Como exemplo,

Szalanski & Powers (1996) utilizaram a técnica de PCR-RFLP para diferenciação

de larvas de D. undecimpunctata howardi, D. barberi e D. virgifera virgifera, visto

que a identificação de larvas desse gênero pode ser difícil e até mesmo impossível

(Krysan 1986). A identificação de espécimes parcialmente destruídos também

pode ser facilitada através desse método, pois uma pequena quantidade de tecido

do inseto (perna, cabeça, antena) pode ser suficiente para realizar a análise

molecular mediante a utilização da técnica de PCR.

Uma das vantagens do método é a rapidez e baixo custo para identificação

das espécies (Taylor et al. 1996). Como exemplo, Roehrdanz (2003) comparou

seqüências de nucleotídeos dos genes da enzima citocromo oxidase I (COI) e

citocromo oxidase II (COII) para diferenciar larvas de D. virgifera virgifera e D.

barberi, as quais podem ser encontradas nas mesmas áreas. Também testou

7

iniciadores específicos para cada espécie, permitindo maior rapidez para

identificação de estágios imaturos. Essas seqüências do genoma do DNA

mitocondrial são indicadas para estudos taxonômicos porque parecem evoluir

mais rapidamente do que o genoma nuclear, podendo assim detectar diferenças

mesmo entre espécies próximas (Francisco 2002).

Clark et al. (2001), baseados na seqüência da subunidade I da enzima

citocromo oxidase e região intergênicas de genes ribossomais ITS 2, estudaram a

filogenia de nove das dez espécies conhecidas que ocorrem nos EUA, e algumas

espécies que ocorrem na Américas Central e do Sul. A análise dos resultados

desse estudo colocou as espécies nos seus grupos morfológicos tradicionais e, ao

contrário de Krysan et al. (1989), afirmam que as espécies da região Neártica não

podem ser consideradas um grupo monofilético, pois verificaram que as espécies

não podem ser separadas de acordo com a região geográfica em que se

encontram. Szalanski et al. (2000) baseados em seqüências de rDNA e mtDNA

confirmam a separação das espécies em grupos (fucata e virgifera), mostrando

que D. undecimpunctata howardi e D. balteata formam um clado (grupo fucata) e

D. barberi, D. virgifera virgifera e D. virgifera zeae formam outro clado (grupo

virgifera).

Poucos são os estudos sobre a variabilidade genética entre indivíduos

geograficamente distintos. Szalanski et al. (1999), através da análise das regiões

ITS 1 e de genes das subunidades ribossômicas do genoma mitocondrial,

observaram maior variabilidade entre indivíduos de D. virgifera zeae Krysan &

Smith do que entre indivíduos geograficamente distintos de D. virgifera. virgifera.

Baixos níveis de diversidade genética das regiões ITS1 e mtDNA entre indivíduos

de populações amplamente dispersas têm sido relatadas para espécies de insetos

que possuem grande mobilidade (migração). O fluxo gênico é aumentado pela

migração em algumas espécies de insetos. A expansão geográfica das espécies

de insetos pode ser favorecida pela introdução em novos habitats. Esses fatores

podem contribuir para a falta de variação genética entre populações, como o caso

de populações de D. virgifera virgifera. O baixo nível de diferenciação genética

observado entre indivíduos de D. virgifera virgifera e D. virgifera zeae Krysan &

8

Smith indica uma história evolucionária recente entre os indivíduos (Szalanski et

al. 1999).

1.2.4. Ocorrência de inimigos naturais em D. speciosa

O uso de produtos químicos tem sido a principal forma de controle de

insetos nos últimos 50 anos. Porém, com o surgimento da resistência aos

inseticidas, ressurgência de pragas e conscientização do impacto ambiental

causado pelos produtos agrícolas, a atenção às formas alternativas de controle de

pragas baseado em procedimentos biológicos vem aumentando (Charnley 1997).

Devido à importância econômica das espécies do gênero Diabrotica e ao

alto custo com produtos químicos utilizados para seu controle, a observação de

seus principais inimigos naturais fornece informações para o aprimoramento de

programas de controle biológico. A conservação e a utilização de agentes de

controle biológico dentro dos agroecossistemas é uma das principais estratégias

adotadas no manejo integrado de pragas (Batista Filho et al. 2003).

As espécies do gênero Diabrotica têm sido encontradas parasitadas por

taquinídeos, nematóides, protozoários, fungos entomopatogênicos e um

braconídeo (Kuhlmann & van der Burgt 1998).

Os taquinídeos parasitóides encontrados sobre Diabrotica são: na América

do Sul, Celatoria bosqi Blanchard com parasitismo de 0,1 a 30,2% sobre D.

speciosa (Heineck-Leonel & Salles 1997); no México, Celatoria compressa Wulp,

com parasitismo de 10,2 % sobre D. balteata LeConte e D. scutellata Baly e 10,1

% sobre D. tibialis Baly (Eben & Barbercheck 1996), e na América do Norte, mais

precisamente Carolina do Sul e do Norte, Celatoria diabroticae (Shimer) com

índices de 3 a 15 % de parasitismo sobre Diabrotica undecimpunctata howardi

Barber (Meinke & Gould 1987 citados por Krysan 1999).

Entre os fungos entomopatogênicos encontrados em D. speciosa, a espécie

Beauveria bassiana foi observada em maior proporção em comparação com

9

Metarhizium anisopliae, sendo que B. bassiana pode causar mortalidade entre 5 e

10% (Hohmann & Carvalho 1989).

As espécies de protozoários do gênero Gregarina têm sido descritas e

listadas como parasitas de besouros crisomelídeos, porém a taxonomia do grupo

é bastante precária, pela falta de descrições e de taxonomistas desse grupo no

Brasil. Segundo Clopton et al. (1992), existem mais de 1.400 nomes de espécies

na literatura, porém o que geralmente ocorre é o uso do gênero como um nome

coletivo do grupo para qualquer tipo de gregarina, sem se importar com suas

características taxonômicas. Clopton et al. (1992) descreveram uma nova espécie

de gregarina, Gregarina coronata, infectando D. undecimpunctata howardi. Este

trabalho possui informações como estrutura do oocisto e os tamanhos

morfométricos das fases de desenvolvimento endógeno, permitindo a identificação

desse protozoário. Os protozoários do gênero Gregarina são comumente

encontrados em criações de laboratório, tornando-se um problema, pois diminuem

a fecundidade e aumentam a mortalidade dos insetos (Singh & Moore 1985).

Poucos são os inimigos naturais de Diabrotica spp. Segundo Metcalf

(1994), esse fato é resultado, em grande parte, pela adaptação entre Galerucinae

e Curcubitaceae. Os insetos adultos alimentam-se de plantas dessa família e

armazenam substâncias tóxicas (curcubitacinas) em seus corpos gordurosos, as

quais possuem propriedades deterrentes aos predadores, parasitóides e

patógenos. Confirmando a teoria de Metcalf (1994), Tallamy et al. (1998)

encontraram patogenicidade reduzida de M. anisopliae em ovos e larvas de D.

undecimpunctata howardi que possuíam cucurbitacina armazenada.

1.2.5. Utilização de fungos entomopatogênicos em programas de controle de insetos

Os fungos entomopatogênicos B. bassiana e M. anisopliae são

deuteromicetos da família Moniliacea. Os deuteromicetos são considerados

fungos imperfeitos por não apresentarem ciclo sexual. A reprodução desses

10

fungos ocorre por simples divisão mitótica, e os conídios são formados a partir de

estruturas hifais diferenciadas, os conidióforos. Entretanto, foi descoberta uma

forma alternativa de divisão celular em B. bassiana, permitindo que ocorra

recombinação genética, o ciclo parassexual e sua variação, a parameiose

(Paccola-Meirelles & Azevedo 1991, Dalzoto 1999). B. bassiana foi descrito pela

primeira vez por Bassi, em 1835, como causador da “muscardina”, uma doença

que atingia as lagartas do bicho-da-seda (Lepidoptera: Bombicidae).

Em 1879, Metschnikoff descreveu pela primeira vez o fungo M. anisopliae

parasitando larvas do besouro Anisoplia austriaca Herbst, 1783 (Coleoptera:

Scarabaeidae) denominado-o então, Entomophthora anisopliae. Após uma série

de proposições de diversas denominações, Sorokin, em 1883, descreveu-o como

Metarhizium anisopliae (Ribeiro, 2002).

Os fungos não precisam ser ingeridos para causar infecções aos insetos,

sendo assim podem infectar estágios de insetos que não se alimentam, como

ovos e pupas. O sítio de invasão é geralmente entre as peças bucais ou através

dos espiráculos, onde a pouca esclerotinização facilita a penetração dos conídios.

Os fungos B. bassiana e M. anisopliae possuem conídios hidrofóbicos que se

aderem à cutícula dos insetos através de interações não-específicas. A falha na

adesão do conídio à cutícula do inseto pode ser um dos fatores de especificidade

do fungo ao hospedeiro, dessa forma a cutícula do inseto também pode ser não

somente a primeira, mas a maior barreira para invasão no hospedeiro (Charnley

1997). Além dos requisitos químicos, a topografia da cutícula também tem sido

fator determinante na formação do apressório de adesão (St. Leger et al. 1991

citado por Sosa-Gómez 1997).

O ciclo da relação fungo-hospedeiro está completo quando ocorre a

esporulação no cadáver do inseto infectado, permitindo a transmissão horizontal

do entomopatógeno na população do inseto (Charnley 1997). Mas, para que a

doença causada pelo fungo no inseto alcance a fase de esporulação, vários

fatores estão relacionados, entre os quais as condições ambientais, nutricionais e

bióticas (Alves & Lecuona 1998). Fernandes et al. (1989) avaliaram o efeito da

temperatura, umidade relativa e concentração do inóculo de B. bassiana para o

11

controle de Cerotoma arcuata, outro crisomelídeo, e relataram que o

desenvolvimento da infecção e morte do inseto independente da umidade relativa

é devido à existência, na superfície do inseto, de uma camada de ar com umidade

alta, pouco influenciada pela umidade relativa atmosférica. Segundo Fargues et al.

(1997), a média de crescimento em laboratório de isolados de fungos de diferentes

regiões foi significativamente afetada pela temperatura e isolado do fungo. Em

contrapartida, Luz et al. (1998) encontraram diferença na virulência de B. bassiana

e M. anisopliae a Triatoma infestans (Klug, 1834) (Hemiptera: Reduviidae) quando

submetidos à baixa umidade relativa (50%). Os isolados de B. bassiana

mostraram-se mais virulentos quando submetidos a temperaturas de 25 e 30 ºC

do que a 15 e 20 ºC. Sosa-Gómez & Alves (2000) concluíram que o número de

conídios de B. bassiana formados foi função da umidade relativa, temperatura,

isolado de fungo, espécie hospedeira, fase do hospedeiro e tempo de infecção.

O impacto nas populações de insetos causado por epizootias naturais,

especialmente por fungos e vírus, demonstra o potencial desses microrganismos

para o controle de pragas e, em meados de 1960, vários produtos à base dos

fungos B. bassiana e M. anisopliae foram desenvolvidos e registrados (Lacey &

Goettel 1995). Os exemplos mais importantes de programas que utilizam fungos

entomopatogênicos se desenvolvem na China, África e Colômbia. No Brasil, a

empresa BIOTECH produz o fungo M. anisopliae, recomendado para o controle de

cigarrinhas das pastagens e cana-de-açúcar (Sosa-Gómez 1999).

Devido aos inúmeros fatores que podem interferir no processo infectivo dos

fungos entomopatogênicos, algumas estratégias vêm sendo desenvolvidas para

aumentar a eficiência dos mesmos e dessa forma aumentar a mortalidade dos

insetos, como, por exemplo, a combinação de fungos com baixas dosagens de

inseticidas. Em 1982, Dr. Walter M. Zeck, membro do Grupo de Pesquisas da

Bayer, descobriu que doses subletais de inseticidas com componentes de

nitroguadinina, incluindo imidacloprid, aumentavam a suscetibilidade de cupins

subterrâneos a vários fungos oportunistas, incluindo B. bassiana e M. anisopliae

(Quintela & McCoy 1998). Essa abordagem está baseada na suposição de que o

inseto se torna mais vulnerável ao ataque do entomopatógeno quando submetido

12

a outro agente estressor. A etapa inicial para realizar estudos de sinergismo é a

determinação da compatibilidade do inseticida com o organismo

entomopatogênico. Gardner & Kinard (1998) não encontraram diferenças

significativas na resposta dos fungos B. bassiana e M. anisopliae em estudos de

compatibilidade com imidacloprid, utilizando diferentes métodos de avaliação,

germinação e crescimento. Quintela & McCoy (1998a) encontraram efeito

sinérgico entre B. bassiana e imidacloprid na mortalidade de Diaprepes

abbreviatus (Linnaeus) (Coleoptera: Curculionidae) quando incorporados no solo.

O tempo letal causado pelo fungo M. anisopliae a D. abbreviatus foi menor quando

associado a imidacloprid em baixas dosagens (Quintela & McCoy 1997). O

conhecimento da compatibilidade de fungos e inseticidas pode facilitar os modos

de aplicação dos fungos, visto que estes podem ser aplicados da mesma maneira

que os pesticidas químicos, através de pulverizadores (Wilson, 1970). Todavia,

alguns estudos revelam que fungicidas, herbicidas e inseticidas podem evitar a

germinação e/ou crescimento micelial do fungo in vitro (Hirose et al. 2001, Oliveira

et al. 2003) enquanto outros (Boucias et al. 1996, Moino Jr. & Alves 1998, Furlong

& Groden 2001) revelaram o efeito sinérgico entre fungos e inseticidas.

Alves et al. (1998) sugerem uma padronização dos estudos de

compatibilidade para melhor comparação entre os resultados obtidos. Esse

sistema baseia-se em valores médios de porcentagem de conidiogênese e

crescimento vegetativo das colônias dos fungos, para testes in vitro, realizados em

meio de cultura sólido. O índice leva em conta a produção de conídios como fator

mais importante, quando comparado com o crescimento vegetativo, já que são os

propágulos do fungo que vão atuar no desenvolvimento da doença. Porém, existe

a possibilidade de o inseticida precipitar no meio de cultura, não permitindo total

contato do fungo inoculado no meio com o produto químico (Sosa-Gómez,

comunicação pessoal). Portanto, existem outros métodos para avaliação da

compatibilidade de fungos e inseticidas como o crescimento do patógeno em meio

líquido contendo o produto a ser avaliado, a implantação de pedaços de papel

impregnados com os produtos no meio de cultura, entre outros (Alves et al. 1998).

13

Os fungos M. anisopliae e B. bassiana são habitantes naturais da fauna do

solo (Yaginuma et al. 1994), portanto o incremento de propágulos dos fungos ao

solo vem sendo utilizado como alternativa para aumentar a eficiência dos fungos

entomopatogênicos no controle de insetos. Krueger & Roberts (1997)

demonstraram que, através da incorporação de micélio seco ao solo, M. anisopliae

foi eficiente no controle de larvas de D. undecimpunctata Mannerheim em cultura

de milho, protegendo as raízes dos danos causados por esses insetos. Bruck &

Lewis (2001), utilizando o mesmo método, avaliaram B. bassiana para o controle

de D. virgifera virgifera LeConte e D. barberi Smith & Lawrence e encontraram

baixa infectividade do fungo ao inseto, em condições de semeadura direta e

convencional, revelando que a porcentagem de infecções não foi afetada pela

prática cultural adotada. Entretanto Sosa-Gómez et al. (2001) observaram que a

maior incidência dos fungos entomopatogênicos B. bassiana e M. anisopliae no

solo ocorreu sob condições de semeadura direta em cultura de soja, mas a

ocorrência dos fungos sobre os folíolos não foi afetada pelas condições de

semeadura direta ou modo convencional. Bidochka et al. (1998) examinaram

amostras de solo da região de Ontario, Canadá, e registraram a maior ocorrência

de B. bassiana em solos de ambientes naturais, enquanto M. anisopliae ocorreu

mais freqüentemente em solos de áreas cultivadas. Com base nesses resultados,

os autores inferem que o fungo B. bassiana ocorreu com maior freqüência em

solos que não sofreram os distúrbios ocasionados pelas práticas culturais.

14

1.3. Literatura citada

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Capítulo 2. RAPD para estudo de populações de Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae) Resumo Regiões do DNA de indivíduos de D. speciosa, praga agrícola encontrada em

todos os estados brasileiros, foram amplificadas através da técnica RAPD

(Random Amplified Polymorphic DNA - Polimorfismo de DNA amplificado ao

acaso) a fim de avaliar a diversidade genética de populações de diferentes locais.

As populações foram coletadas em Primavera do Leste (MT), Paulínia (SP),

Florestópolis, Ponta Grossa e Warta, Distrito de Londrina (PR). O DNA de 27

indivíduos de cada população foi obtido dos tecidos da cabeça e protórax dos

insetos através do método de extração com sais de CTAB. O DNA dos indivíduos

foi amplificado através de 11 iniciadores. Todos os iniciadores selecionados

possibilitaram a amplificação do DNA de D. speciosa, gerando bandas com pesos

moleculares variáveis. Os indivíduos formaram grupos diferentes dentro de cada

população geográfica, embora tenha sido registrada a presença de indivíduos de

outras regiões nos agrupamentos. As populações que apresentaram

agrupamentos com maior homogeneidade foram as de Ponta Grossa e Paulínia.

Os indivíduos das populações de Florestópolis, Primavera do Leste, Paulínia e

Ponta Grossa formaram agrupamentos com índices de similaridade de Dice

próximos a 37 %. A população da Warta apresentou maior heterogeneidade de

genótipos, tendo indivíduos com índice de similaridade de 8 %. A ocorrência de

indivíduos de outras regiões nos agrupamentos, indica uma freqüência elevada de

migração desses insetos mesmo entre locais distantes, como em Primavera do

Leste (MT) e Paulínia (SP).

25

Abstract DNA region of individuals of D. speciosa, an important agricultural pest with

distribution in all the country, were amplified by RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA) to evaluat the genetic diversity among populations from

Primavera do Leste (MT), Paulínia (SP), Florestópolis, Ponta Grossa and Warta,

(PR). The DNA of twenty-seven insects from each population was obtained from

head and prothorax tissues following the CTAB extraction method. The DNA was

amplified with eleven primers. The primers produced variable molecular bands with

different weight. The D. speciosa individuals clustered separately inside each

geographical population. Individuals from Florestopolis, Primavera do Leste,

Paulinia and Ponta Grossa clustered with Dice’s similarity near 37 %. Ponta

Grossa and Paulinia clusters had high homogeneity, and Warta had the highest

genotipic heterogeneity (8 %). Some specimens clustered with individuals from

other regions, suggesting migration between distant regions, like the case of

Primavera do Leste (MT) and Paulinia (SP).

26

2.1. Introdução

Um dos complexos de pragas do milho mais importantes dos EUA é

composto por insetos do gênero Diabrotica (Chevrolat, 1844) (Coleoptera:

Chrysomelidae). Os indivíduos desse gênero possuem grande semelhança

morfológica, o que dificulta a identificação das espécies (Krysan 1986). Essas

espécies que ocorrem na América do Norte estão distribuídas em regiões

geograficamente distintas e, por esse motivo, são conhecidas de acordo com a

região onde ocorrem. Como, por exemplo, Diabrotica virgifera virgifera LeConte é

conhecida vulgarmente como larva do milho da região oeste. Entretanto essas

espécies estão se sobrepondo e a identificação através de caracteres

morfológicos de espécies simpátricas não está sendo possível. Por esse motivo,

as técnicas da genética molecular vêm sendo utilizadas para facilitar a

identificação das espécies desse gênero (Szalanski & Powers 1996, Clark et al.

2001, Roehrdanz 2003). Dessa maneira, a variabilidade genética entre indivíduos

de diferentes regiões também vem sendo realizada através da análise de

sequências do DNA nuclear e mitocondrial com a técnica de PCR-RFLP

(Szalanski et al. 2000, Szalanski & Powers 1996).

Diabrotica speciosa (Germar, 1824) é uma das espécies desse gênero mais

conhecidas na América do Sul e com ocorrência em todos os estados brasileiros

(Krysan 1896). Segundo Szalanski et al. (1999), a expansão geográfica das

espécies de insetos pode favorecer a variabilidade genética. Porém não existem

estudos sobre a variabilidade genética dessas espécies no Brasil. A maioria dos

estudos realizados com indivíduos geograficamente distintos de Diabrotica spp.

limitam-se ao estudo das espécies que ocorrem na América do Norte.

Como exemplo, Szalanski et al. (1999), através da análise das seqüências

dos genes das regiões ITS 1 e de genes das subunidades ribossômicas do

genoma mitocondrial, observaram variação substancialmente maior entre

indivíduos geograficamente distintos de Diabrotica virgifera zeae Krysan & Smith

do que entre indivíduos de D. v. virgifera LeConte. O baixo nível de diferenciação

27

genética observado entre indivíduos de D. v. virgifera e D. v. zeae indica uma

história evolucionária recente entre os mesmos.

Para avaliar a variabilidade genética entre indivíduos geograficamente

distintos de uma espécie ou de espécies diferentes, alguns estudos têm utilizado a

técnica de marcadores moleculares RAPD. Essa técnica vem sendo utilizada com

sucesso para avaliar a variabilidade genética entre e dentro de populações

geográficas, para determinar a estrutura genética das populações (Apostol et al.

1996, Stott et al. 1997, Brown et al. 1997, Sidorenko & Berezovskaya 2001, Sosa-

Gómez et al. 2004, Sosa-Gómez 2004). As aplicações dos marcadores RAPD

incluem ainda obtenção de impressões digitais (fingerprintings) genômicas de

indivíduos, variedades e populações; estabelecimento de relacionamentos

filogenéticos entre diferentes espécies; construção de mapas genéticos de alta

cobertura genética e a localização de genes de interesse econômico, além de ser

uma técnica rápida e simples (Williams et al. citados por Sidorenko &

Berezovskaya 2001).

O objetivo deste estudo foi gerar informações sobre a variabilidade genética

de D. speciosa através de marcadores RAPD, visto que, além de ser uma das

espécies do gênero Diabrotica mais conhecidas na América do Sul, é considerada

praga de várias culturas, em especial leguminosas, curcubitáceas, solanáceas e

gramíneas (Zucchi et al. 1993).

2.2. Material e Métodos A pesquisa foi conduzida no Laboratório de Biotecnologia Vegetal, da

Embrapa Soja, em Londrina, Paraná.

As populações analisadas foram coletadas em áreas de soja de Primavera

do Leste (MT), Florestópolis, Ponta Grossa e Warta, Distrito de Londrina (PR) e

em áreas de feijão na região de Paulínia (SP) (Tabela 1). Todos os indivíduos de

uma mesma população foram coletados em uma única data. Os insetos coletados

foram mantidos em sílica gel a -20 oC até extração do DNA.

28

Tabela 1. Origem, data de coleta e plantas hospedeiras das populações de D.

speciosa analisadas com marcadores moleculares para avaliação de variabilidade

intraespecífica.

Local de coleta Data de coleta Planta hospedeira

Warta, Londrina

(PR) 14 de junho, 2004 soja

Florestópolis

(PR) 18 de agosto, 2004 soja

Ponta Grossa, Fazenda Escola

da Univ. Est. de Ponta Grossa

(PR)

04 de maio, 2004 soja

Paulínia, Estação Agrícola Exp.

Bayer Cropscience

(SP)

28 de junho, 2004 feijão

Primavera do Leste

(MG) 20 de julho, 2004 soja

2.2.1. Extração do DNA O DNA de 27 indivíduos de cada população foi extraído dos tecidos da

cabeça e protórax dos insetos, a fim de diminuir a possibilidade de ocorrência de

microorganismos naturalmente presentes na hemolinfa (Capítulo 3). A extração foi

realizada de acordo com o protocolo de Rogers & Bendich (1988) com poucas

modificações, relatadas a seguir.

Para cada cabeça e protórax de D. speciosa foram utilizados 480 µL de

tampão de extração, com concentração final de 200 mM Tris-HCl (pH 8,0), 70 mM

EDTA, 2 M NaCl e 1 % de β-mercaptoetanol, maceradas em microtubos com

auxílio de pistilo. Na seqüência, adicionou-se 120 µL de CTAB (10 %), e após ser

homogeneizado, foi levado em banho-maria (65 oC) por 5 minutos. Ao decorrer

esse tempo, adicionou-se 6 µL de proteinase K (10 mg/mL), e novamente incubou-

se em banho-maria (65 oC) por 60 minutos. Após esse período, as amostras foram

mantidas à temperatura ambiente, e centrifugadas a 14.000 rpm durante 15

29

minutos. A fase aquosa foi recuperada e transferida para outro microtubo,

adicionando o mesmo volume de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). Após a leve

homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 15 minutos,

e em seguida recuperou-se a fase aquosa a qual foi transferida para outro

microtubo, onde os ácidos nucléicos foram precipitados com 2 volumes de

isopropanol 100 % gelado e 45 % do volume de NH4OAc 10M. Esse material

permaneceu duas horas a -20oC. As amostras foram centrifugadas após esse

período, a 14.000 rpm por 15 minutos, descartando o sobrenadante e lavando o

pellet com etanol 70 %. Após a centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos o etanol

foi descartado e os pellets secos em estufa a 37 oC. Os pellets foram

ressuspendidos com tampão TE com RNAse adicionada na concentração final de

40 µg/mL e mantidos a 37 oC por 30 minutos. As amostras foram mantidas a -20 oC até serem utilizadas para amplificação (Sosa-Gomez et al. 2004).

2.2.2. Quantificação de DNA O DNA foi quantificado através de gel de agarose (0,8%) corado com

10mg/mL de brometo de etídio. A eletroforese foi conduzida em tampão TBE 1X

(216 g de Tris; 110 g ácido bórico; 80 mL de EDTA 0,5M e água destilada para

completar 2L) a 120V por 1 hora. A visualização do gel foi feita em transluminador

THX-35M (Life Technologies) de luz ultravioleta (UV) e a aquisição das imagens

em sistema Kodak Digital DC 290. No mesmo gel foram colocadas amostras de λ

DNA com concentrações de 5, 10, 15 e 20 ng/µL, para que fosse possível estimar

a concentração das amostras de D. speciosa.

2.2.3. Análise molecular do DNA através da técnica de RAPD A amplificação foi realizada em um volume final de 25 µL contendo 9 ng de

DNA, previamente diluído, 14,6 µL de água Mili Q (bidestilada), 2,5 µL de tampão

30

10X, 1,0 µL de dNTP’s (2,5 mM), 2,5 µL de iniciador (4 µM), 1,2 µL de MgCl2 (50

mM) e 0,2 µL de enzima Taq polimerase (Gibco BRE) (5 unidades/µL) por

microtubo de amplificação de PCR. Como controle negativo foi utilizada uma

amostra que continha todos os reagentes, exceto DNA do inseto. As reações PCR

foram realizadas em termociclador GeneAmp-9600 (Perkin Elmer) com o seguinte

programa: 45 ciclos a 94 oC por 15 segundos, 35 oC por 30 segundos e 72 oC por

1 minuto; e uma extensão final a 72 oC por 7 minutos.

Entre quatorze iniciadores (Operon Technologies. Alameda, CA, USA)

previamente testados, 11 foram selecionados para o estudo das populações de D.

speciosa.

O resultado da amplificação de cada amostra (25 µL) foi aplicado em gel de

agarose 1,3 % com 3,0 µL de brometo de etídio e submetida a eletroforese em

tampão TBE 1X a 120V por 2,5 horas. A visualização do gel foi feita em

transluminador THX-35M (Life Technologies) de luz ultravioleta (UV) e a aquisição

das imagens em sistema Kodak Digital DC 290.

2.2.4. Análise dos Dados Baseando-se nas fotografias dos géis apenas as bandas mais visíveis e

reproduzíveis foram usadas como marcadores (Roderick 1996), sendo que bandas

com mobilidade similar àquelas registradas no controle negativo não foram

registradas (Thormann et al. 1994). Para esse experimento foi gerada uma matriz

binária (1 – presença de banda e 0 – ausência de banda) e, utilizando o programa

NTSYS-pc versão 2.02 i (Rholf 1993), foram construídas matrizes de similaridade

utilizando-se o índice de similaridade de Dice (1945).

31

2.3. Resultados e Discussão As amplificações foram visíveis com a concentração de 9 ng de DNA de D.

speciosa. Todos os 11 iniciadores selecionados possibilitaram a amplificação do

DNA de D. speciosa, gerando bandas que variaram de 493 a 2409 pares de

bases. O número de bandas produzidas variou de acordo com o iniciador utilizado

na reação (Fig. 1 e 2). Dentre os iniciadores testados, os que produziram maiores

números de bandas foram OPC-04 (20), OPE-11 (20) e OPH-02 (20), e o que

produziu menor número de bandas foi o OPG-07 (13) (Tabela 2).

Tabela 2. Número de bandas geradas por cada iniciador utilizado no estudo de

variabilidade entre populações de D. speciosa.

Iniciador1 Sequência Número de bandas

OPA-11 5’-CAATCGCCGT-3’ 19

OPC-04 5’-CCGCATCTAC-3’ 20

OPC-06 5’-GAACGGACTC-3’ 19

OPC-18 5’-TGAGTGGGTG-3’ 17

OPE-11 5’-GAGTCTCAGG-3’ 20

OPF-03 5’-CCTGATCACC-3’ 20

OPG-07 5’-GAACCTGCGG-3’ 13

OPH-02 5’-TCGGACGTGA-3’ 20

OPJ-06 5’-TCGTTCCGCA-3’ 17

OPJ-14 5’-CACCCGGATG-3’ 19

OPN-07 5’-CAGCCCAGAG-3’ 18 1- denominação usada pela empresa Operon Technologies

Pode ser observado na Figura 3 que a maioria dos indivíduos agrupam-se

de acordo com a região geográfica onde foram coletados. As populações que

apresentaram agrupamentos com maior homogeneidade foram as de Ponta

Grossa e Paulínia, sendo a população da Warta que apresentou maior

heterogeneidade de genótipos, com indivíduos apresentando índice de

similaridade de 8 %. Os indivíduos que apresentaram maior semelhança

genotípica foram os de Ponta Grossa (PG25 e PG27) e de Paulínia (Pau155 e

32

Pau161). Os indivíduos das populações de Florestópolis (PR), Primavera do Leste

(MT), Paulínia (SP) e Ponta Grossa (PR) formaram agrupamentos com índices de

similaridade próximos a 37 %.

M 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 91 N M

s

1120

784

1584

2027

493

Figura 1. Amostras de DNA de D. speciosa da região de Warta,

amplificadas com o iniciador OPC-04 através da técnica de RAP

utilizado como marcador molecular (M). Controle negativo (N).

M 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 169 170 171 172 173 174

493

1120

784

1584

2027

Figura 2. Amostras de DNA de D. speciosa da região de

amplificadas com o iniciador OPC-04 através da técnica de RAP

utilizado como marcador molecular (M). Controle negativo (N).

Florestópoli

Londrina (PR)

D. λ DNA foi

175 176 177 179 N M

Paulínia (SP)

D. λ DNA foi

33

34

Nos agrupamentos pode ser observada a ocorrência de indivíduos de

outras regiões, indicando a seqüência elevada de migração desses insetos

nt r a do L P

distantes entre si 1.099 km (Tabela 3).

igração ocorre porque Diabrotica possui elevada capacidade de vôo.

ry 9), dispersão esses inse s através d vôo está

elacionada com alimentação e oviposição e difere entre espécies. Desta maneira,

nsiderado como “relocação”, visto que o objetivo ecológico é colocar a

u difere este o ou d ante.

Os adu iabro p. po m dois tip vôos: s “triviais”

enos que 20 ou 30 minutos, e “sustentados” com duração maior a 20

u 30 minutos. Vôos “sustentados” ocorrem em ¼ de fêmeas mais jovens, e sua

cidência diminui de acordo com a idade dos insetos. Estes vôos podem ser

s da síndrome da oogênese”, visto que é comum entre fêmeas

rávidas”. Podem durar de 30 a 230 minutos, atingindo um distância de até 35

1 m

gera

fracos, com picos pela manhã e sob temperaturas amenas (20 - 35º C). A

e

199

mesmo entre locais dista es, como P imaver este (MT) e aulínia (SP),

Esta m

Segundo K san (199 a d to o

r

deve ser co

progênie em m lugar nte, seja próxim ist

ltos de D tica sp ssue os de vôo

que duram m

o

in

chamados de “vôo

“g

Km por dia em D. v. virgifera. A maioria dos vôos é do tipo “trivial” com duração de

inuto ou menos, com 10 a 20 cm de distância, sendo que as paradas

lmente ocorrem para reorientação. A maioria dos vôos ocorre com ventos

dif rença do vôo entre os sexos está relacionada com a duração e idade (Krysan

9).

35

Tabela 3. Distância (km) entre as localidades onde foram coletadas as populações

e D. speciosa. d

Localidades Primavera do Leste, MT

Paulínia, SP Warta, Londrina, PR

Florestópolis, PR

Ponta Grossa, PR

PrimLes

avera do te, MT

0 - - - -

Paulínia, SP 1098,7 km 0 - - -

WaLon

FlorPR

onta Grossa, R

402 km 225 282 km 0

rta, drina, PR

932 km 411 km 0 - -

estópolis, 875 km 431 km 57 km 0 -

1156 kmPP

. Conclusões 2.4

, embora a presença de indivíduos de outras regiões nos

agrupamentos indique a freqüência elevada de migração entre locais

-

sa e Paulínia, sendo a população da Warta que

apresentou maior heterogeneidade de genótipos;

- ilaridade (8 %) foram os

indivíduos da Warta, Distrito de Londrina (PR).

- Os indivíduos de D. speciosa formam grupos diferentes dentro de cada

população geográfica

distantes;

As populações que apresentaram agrupamentos com maior homogeneidade

foram as de Ponta Gros

- Os indivíduos que apresentaram maior semelhança genotípica foram os de

Ponta Grossa (PR) (PG25 e PG27) e de Paulínia (Pau155 e Pau161);

Os indivíduos que apresentaram menor índice de sim

36

2.5. Literatura citada

ostol, B.L., W.C. Black, P. Reiter & B.R. Miller. 1996. Population gene

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RAPD-PCR markers: the breeding structure of Aedes aegypti in Puerto Rico.

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Zucchi, R.A., S. Silveira Neto & O. Nakano. 1993. (eds.) Guia de identificação de

pragas agrícolas. Piracicaba, FEALQ, 139p.

Capítulo 3. Ocorrência de Protozoários, Parasitóides e Fungos em Diabrotica

seriadas de lavagens de folíolos de

Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

mediante a contagem das colônias. A superfície

edida em um integrador de área foliar,

da relação UFC por mm2 de área foliar. A maior incidência

D. speciosa foi durante os meses de fevereiro e março/2003,

Gregarina ocorreu em 97% dos indivíduos e adultos da

Celatoria sp. (Diptera: Tachinidae) ocorreram em 26 % de indivíduos

ia de uma mosca parasitóide do gênero

sobre Cerotoma arcuata. Durante a safra de soja 2003/04 a maior

líolos de soja foi do fungo Beauveria sp, resultado

D. speciosa.

speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae)

“A melhor maneira de evitar que os insetos tomem conta de todo o

mundo é não impedir a guerra que eles travam entre si”.

Metcalf

Resumo Foi avaliada a incidência de parasitóides, protozoários e fungos em populações de

Diabrotica speciosa, em Londrina, PR e região. Para avaliação de moscas

parasitóides e fungos, 25-30 indivíduos foram coletados e avaliados

semanalmente durante o período da safra de soja (2003/04). A incidência de

protozoários foi observada através de preparados microscópicos com alíquotas de

hemolinfa e tubo digestivo durante um ano (agosto/2003 a agosto/2004). A

flutuação da densidade do inóculo de fungos entomopatogênicos relacionada à

área foliar foi avaliada através de diluições

soja plaqueadas em meio seletivo. As

dos fungos foram quantificadas

de cada folíolo amostrado teve sua área m

para o estabelecimento

de parasitismo sobre

sendo que o protozoário

mosca

observados. Foi registrada a ocorrênc

Strongygaster

ocorrência de fungos nos fo

este, relacionado com a ocorrência desse fungo sobre adultos de

40

Abstract The occurrence of parasitoids, protozoa and entomopathogenic fungi was

evalua

re analized. The

entom

ted on D. speciosa populations in Londrina, PR in the North of Parana State.

Samples of 25-30 insects were weekly collected in soybean fields (2003/04). The

protozoa incidence was observed during one year (August/2003 - August/04).

Fresh microscope preparations with mesenteron of each insect we

opathogenic fungi density variation related to the leaflet area (Colony

Forming Units/mm2) was evaluated through seried dilutions of washed leaflets

plated on selective medium. The soybean leaflets area was measured to establish

the CFU by mm2. The major incidence of parasitism on D. speciosa was in

February and March/2003. The protozoa Gregarina occurred on 97% of the insects

and the adults of parasitoid Celatoria sp. (Diptera: Tachinidae) occurred on 26 % of

the insects. During the soybean season, the fungus Beauveria sp. was prevalent

that can be related to major occurrence of this fungus on adults of D. speciosa.

41

3.1. Introdução

O gênero Diabrotica possui 15 espécies e subespécies identificadas como

pragas de 61 tipos de plantas cultivadas. A espécie mais conhecida desse gênero

e com ampla distribuição na América do Sul é Diabrotica speciosa (Germar, 1824)

(Krysan 1986), conhecida popularmente como vaquinha patriota.

No Brasil, D. speciosa encontra-se distribuída em todo o território nacional

(Magalhães e Carvalho 1988), sendo considerada praga principal de várias

cultura

tas, fazendo um

grande

batatinha (Solanum tuberosum L.), abrindo buracos e

epreciando-os comercialmente. Quando as larvas atacam as raízes adventícias

o milho (Zea mays L.) causam um crescimento irregular das plantas, que se

rnam recurvadas. Esse sintoma é conhecido como “pescoço de ganso” ou “milho

joelhado” (Gallo et al. 2002).

Não existe uma estimativa dos danos causados por esse inseto no Brasil,

as Metcalf (1986) estimou em um bilhão de dólares os gastos com inseticidas e

s perdas na produção devido ao ataque de Diabrotica sp. nos EUA.

Por esse motivo, conhecer os inimigos naturais dessa espécie praga, pode

rnecer informações para o aprimoramento de técnicas de controle. O uso de

gentes biológicos em programas de controle de pragas é uma das estratégias do

anejo integrado de pragas (Batista Filho et al. 2003).

Para que os inimigos naturais sejam capazes de reduzir ou prevenir o

umento populacional das pragas, deve-se estimular a ocorrência natural desses

gentes de controle biológico, não só preservando o potencial já existente, mas

inda propiciando condições para sua efetivação. Portanto, o uso de inseticidas

eve ser restringido às condições de ocorrência de pragas apenas quando há

níveis de danos econômicos, utilizando doses mínimas e, se possível, produtos

s, em especial leguminosas, curcubitáceas, solanáceas e gramíneas

(Zucchi et al. 1993). Os adultos atacam as folhas novas das plan

número de pequenas perfurações, que afetam o desenvolvimento da

planta. As larvas atacam as raízes, provocando redução do sistema radicular e,

portanto, atraso no desenvolvimento e secamento da planta. Também danificam

os tubérculos de

d

d

to

a

m

a

fo

a

m

a

a

a

d

42

seletivos, evitando o controle preventivo de pragas. Boetel et al. (2003)

observaram que aplicações apropriadas de inseticidas propiciaram maior proteção

s de milho ao at e D. virgifera. Além disso, o uso

restrito de inseticidas e a utilização de agentes biológicos no manejo integrado de

pragas é ação efetiva no retardamento do desenvolvimento da resistência dos

inseticidas ). Os agroecossist

manejados de forma inteligente, através dos mais variados métodos de controle

an

á diversas a ência de inimi is de D.

tado na Tabela

e b formações sobre a ocorrência e

e inimigo e em cultura de soja na região de

o de

nos folíolos de soja.

de raíze Zea mays (L.) aque d

insetos a (Huang et al. 1994 emas precisam ser

(Metcalf & Luckm 1982).

H referências sobre ocorr gos natura

speciosa na América do Sul, conforme apresen 1.

O objetivo d ste trabalho foi o ter in

flutuação d s naturais de D. sp ciosa

Londrina, PR, enfatizando a flutuaçã inóculos de fungos entomopatogênicos

43

Tabela 1. Lista de inimigos naturais de Diabrotica speciosa registrados para a

mérica do Sul. A

Espécie Ordem: Família Local Referência

Chrysopa sp. Neuroptera: Chrysopidae Bercellini & Malacalza

1994

Eriopis s

Celatoria

als.) Vuill.

Hyphomycetes:

Moniliaceae

Brasil Hohmann & Carvalho

1989, Heineck-Leonel &

Salles 1997

. Moniliaceae 1997

aecilomyces

mosor

Brasil Tigano-Milani et al. 1995

p. Coleoptera: Coccinelidae Bercellini & Malacalza

1994

Lebia concinna Brullé Coleoptera: Carabidae Brasil Milanez 1984

Nabis sp. Heteroptera: Nabidae Brasil Milanez 1984

Cycloneda sanguinea (L.) Coleoptera: Coccinelidae Brasil Hohmann 1989

Doru lineare (Eschsholtz) Dermaptera: Forficulidae Brasil Milanez 1984

Scymnus sp. Coleoptera: Coccinelidae Brasil Hohmann 1989

bosqi Blanchard Diptera: Tachinidae Argentina, Uruguai, Brasil Magalhães & Quintela

1987, Heineck-Leonel &

Salles 1997

Centistes gasseni Shaw Hymenoptera: Braconidae Brasil Heineck-Leonel & Salles

1997, Walsh et al. 2003

Beauveria bassiana

(B

Metarhizium anisopliae

(Metsch.) Sorok

Hyphomycetes: Brasil Heineck-Leonel & Salles

P

fu oseus

Paecilomyces lilacinus Brasil Tigano-Milani et al. 1995

Hexamermis sp. Nematoda: Mermithidae Peru, Brasil Nickle et al. 1984,

Heineck-Leonel & Salles

1997

Micoletzkya vidalae

Stock, 1993

Nematoda:

Diplogasteridae

Argentina Stock 1993

44

3.2. Material e Métodos 3.2.1. Avaliação de inimigos naturais em populações de campo de D.

peciosa

cas parasitóides e fungos, amostras de 25 - 30

divíduos foram observados periodicamente durante o período da safra de soja

acional de Pesquisa de Soja – CNPSo, localizado no Distrito de Warta,

ondrina (PR), foram mantidos dentro de gaiolas teladas (15 cm X 15 cm X 15 cm)

durant

xperimental da Embrapa Soja

foram

0,2 mL/placa de Petri) em meio

seletivo à base do fungicida dodine: água de fervura com 20g de aveia, 20g de

ágar, 0,46g de dodine, 0,01g de cristal violeta e 0,25mg de benlate (Chase et al.

1986). As UFC (Unidades Formadoras de Colônia) dos fungos entomopatogênicos

foram quantificadas mediante contagem das colônias que se desenvolveram sobre

s

Para avaliação das mos

in

(2003/04). Os insetos coletados em cultura de soja do campo experimental do

Centro N

L

e 15 dias em condições controladas de temperatura 26 ± 1°C, 80 %UR e

fotofase de 14 horas. A avaliação de mortalidade foi realizada diariamente.

Para observação da prevalência de protozoários, amostras de 25 - 30

indivíduos coletados em cultura de soja do campo e

observadas semanalmente ou quinzenalmente durante um ano

(agosto/2003 a agosto/2004), imediatamente dissecados para preparados

microscópicos de alíquotas de hemolinfa e tubo digestivo de cada indivíduo. 3.2.2. Densidade do inóculo de fungos entomopatogênicos relacionada à área foliar

Foram realizadas amostras semanais de 15 folíolos de soja no campo

experimental da Embrapa Soja. Os folíolos foram armazenados a -18 oC até o

momento da retirada do inóculo mediante lavagens em água destilada estéril com

Tween 80 (15 µL/L). As suspensões resultantes dessa lavagem foram diluídas

seriadamente (10-1, 10-2, 10-3) e plaqueadas (

45

o meio seletivo após 12 a 20 dias a 26 ± 1,5o C. Foi determinada a superfície de

cada folíolo amostrado, em um integrador de área foliar (modelo Stationary LI

3100), para o estabelecimento da relação U.F.C. por mm2 de área foliar.

3.3. Resultados e Discussão

3.3.1. Avaliação de inimigos naturais de D. speciosa em populações de campo

Os inimigos naturais encontrados em D. speciosa foram moscas

parasitóides do gênero Celatoria Coquillett, 1890 (Diptera: Tachinidae),

protozoários do gênero Gregarina (Dufour, 1828) (Apicomplexa: Eugregarinida) e

o fungo entomopatogênico Beauveria sp. Vuillemin

A maior ocorrência natural do parasitóide Celatoria sp. (Fig. 1) foi de 26 %

observados (Fig. 2). Foi constatada a ocorrência de apenas um indivíduo do

gênero Strongygaster Macquart, 1834 (Diptera: Tachinidae) (Fig. 3) sobre um

adulto de Cerotoma arcuata (Olivier, 1791), em 25 de março de 2004, embora não

tenha sido realizada a avaliação constante de inimigos naturais sobre este inseto.

Esse indivíduo de C. arcuata foi coletado em cultura de soja, no campo

experimental da Embrapa Soja.

O protozoário Gregarina sp. (Fig. 4) ocorreu em 97 % dos indivíduos

avaliados em março/2004 (Fig. 5), concordando com os resultados de Kuhlmann &

van der Burgt (1998), onde as amostragens ocasionais em campo indicaram

variação da incidência de Gregarina sp. entre 5 a 100 %. Durante agosto/2003 a

agosto/2004, 792 indivíduos foram observados.

durante o mês de março/2004. Durante a safra de soja, 691 indivíduos foram

46

Figura 1. Mosca parasitóide Celatoria sp. (Diptera: Tachinidae).

30,0

sp.

(%) 26,3%

0,0

15,0

11/1

1/03

20/

11/0

3

29/1

2/03

8/1

/04

12/

1/04

20/

1/04

22/

1/04

27/

1/04

2/2

/04

9/2

/04

16/

2/04

17/

2/04

01/

3/04

15/

3/04

25/

3/04

25/

3/04

Datas de coleta

Prev

alên

cia

de C

elat

oria

Celatoria sp.

Celatoria sp. sobre populações de D. speciosa

durante a safra de soja (2003/04) em Londrina, PR.

Figura 2. Prevalência (%) de

47

Figura 3. Mosca parasitóide Strongygaster sp. (Diptera: Tachinidae) registrada em

adulto de Cerotoma arcuata, em Londrina, PR.

O fungo Beauveria sp. teve maior ocorrência sobre D. speciosa durante o

mês de fevereiro/2004 (10 %) (Fig. 2). O fungo Metarhizium. anisopliae (Metsch.)

Sorok. não foi observado em alguns meses do ano, e sua maior ocorrência sobre

os insetos foi de apenas 3,3 % durante o mês de fevereiro. Essa maior prevalência

de Beauveria sp. durante o mês de fevereiro pode ser devido aos maiores níveis

de inóculo, dados já constatados por Sosa-Gómez et al. (2001) na mesma região.

Ao contrário dos índices de parasitismo (26,3 %) de Celatoria sp. em D.

encontrados neste trabalho, Heineck-Leonel e Salles (1997) encontraram

60% de parasitismo de Celatoria bosqi Blanchard em D.

speciosa na região de Pelotas (RS), coletados em diferentes plantas olerícolas,

entre os meses de maio a setembro, diminuindo entre os meses de outubro e

fevereiro, e o maior percentual encontrado foi 84,5 % durante o mês de abril.

speciosa

índices próximos a

48

Esse parasitóide abandona o hospedeiro na forma de larva, empupando

logo a seguir no solo ou, por vezes, dentro do corpo do inseto, que fica oco. O

inseto permanece vivo até momentos antes da saída do parasitóide.

Não foram encontrados na literatura, dados sobre a ocorrência de moscas

parasitóides do gênero Strongygaster em Cerotoma arcuata. Nalepa & Kidd (2002)

registraram a ocorrência de Strongygaster triangulifer (Loew) sobre adultos de

Harmonia axyridis (Pallas) (Coleoptera: Coccinellidae) na Carolina do Norte (EUA)

com 14,2 % de parasitismo. A primeira ocorrência de S. triangulifer em H. axyridis

foi relatada por Katsoyannos & Aliniazee na América do Norte (1998). Esses

autores afirmam que a espécie S. triangulifer está amplamente distribuída na

América do Norte e parasita insetos das Ordens Coleoptera, Lepidoptera,

Dermaptera e Hemiptera.

As espécies de Celatoria têm sido freqüentemente descritas parasitando

Cerotoma sp. Danielson et al. (2000) encontraram adultos de Cerotoma trifurcata

(Forster) parasitados por moscas Celatoria sp. em Nebrasca (América do Norte)

(Shimer). No Brasil, Magalhães e Quintela

(1987) relataram a ocorrência de C. bosqi como parasitóide de C. arcuata.

Com relação às infecções causadas por protozoários, Brooks & Jackson

(1990) afirmam que infecções por Gregarina sp. aumentam a mortalidade de

adultos de D. speciosa e inibem o desenvolvimento normal dos ovários. Entre os

insetos avaliados nesta pesquisa, não foi verificada mudança aparente de

comportamento daqueles indivíduos em que foi confirmada a infecção por

protozoários.

O ciclo de vida dos protozoários do gênero Gregarina é comum para todas

as espécies que parasitam Diabrotica, mas o desenvolvimento pode variar de

acordo com a espécie, alimentação e intensidade da infecção. Os insetos ingerem

oocistos (Fig. 6) quando se alimentam das folhas, depois de quatro dias já

24 a 48 horas, liberam seus

ocistos caso a temperatura esteja próxima de 25 - 26 ºC e 70 % U.R. Os adultos

.

Herzog (1977) e Marrone et al. (1983) encontraram adultos de C. trifurcata

parasitados por Celatoria diabroticae

apresentam gametocistos livres na hemolinfa. Os gametocistos são liberados

juntamente com as fezes dos insetos e, dentro de

o

49

podem livrar-se da infecção dentro de duas semanas, a menos que oocistos

istam relatos superficiais do efeito nocivo desses protozoários

sobre

adicionais sejam ingeridos.

Embora ex

a fecundidade e longevidade de Diabrotica sp. (Brooks & Jackson 1990),

não existem referências sobre o impacto na biologia, fisiologia ou comportamento

desses protozoários. Considerando os elevados índices de prevalência desses

protozoários, estudos adicionais sobre sua importância como reguladores das

populações naturais de D. speciosa são necessários.

Figura 4. Trofozoítos do protozoário Gregarina sp. encontrados na hemolinfa de

Diabrotica speciosa (aumento 100X).

50

0

50

100

12/8

/200

3

18/9

/200

3

9/12

/200

3

22/1

2/20

03

5/1/

2004

22/1

/200

4

9/2/

2004

26/2

/200

4

24/3

/200

4

28/4

/200

4

13/5

/200

4

21/6

/200

4

12/7

/200

4

10/8

/200

4

Pre

valê

ncia

(%)

96,7%

Figura 5. Prevalência (%) de Gregarina sp. em populações de Diabrotica speciosa

durante a safra de soja (2003/04), em Londrina, PR.

Figura

(aume

6. Oocisto de Gregarina encontrado na hemolinfa de Diabrotica speciosa

nto 400X).

51

A ocorrência natural de Beauveria sp. sobre adultos de D. speciosa chegou

a 10 % no mês de fevereiro/2004, enquanto que a ocorrência de M. anisopliae foi

e apenas 3,3 %. Os fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana (Bals.) Vuill,

Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. possuem distribuição global e têm sido

Diabrotica sp. (Daoust & Pereira

1994, Sosa-Gómez et al. 2001). Heineck-Leonel e Salles

média do mês e à umidade relativamente alta durante maior parte do ano nessa

3.3.2. Flutuação da densidade do i

plantas de soja, foi do fungo

relacionado com a ocorrência natural de

sp. sobre as folhas de soja aumentaram entre os

reduzida freqüência sobre as folhas de

Apesar da pouca incidência de M.

sobre D. speciosa, essa pequena porcentagem de indivíduos infectados

durante o mês de fevereiro. A maior prevalência de Beauveria sp. sobre as

D. speciosa pode ser explicada pela elevada pressão de inóculo

bilidade a essa espécie e a senescência

d

e

relatados como causa de mortalidade natural de

1986, Shimazu et al.

(1997) encontraram a ocorrência do fungo B. bassiana de até 77,9% durante o

mês de dezembro na região de Pelotas (RS), devido ao aumento da temperatura

região.

nóculo de fungos entomopatogênicos relacionada á área foliar

Durante a safra de soja 2003/04, a maior ocorrência no fitoplano das

Beauveria sp. (Fig. 7). Esse resultado está

Beauveria sp. sobre D. speciosa. A

Beauveria ocorrência do fungo

meses de fevereiro e março/2004, correspondendo às maiores porcentagens de

insetos com sinais do patógeno. O fungo M. anisopliae foi observado com

soja, correspondendo à baixa porcentagem

de indivíduos com sinais desse patógeno.

anisopliae

foi exatamente no mês de maior ocorrência desse fungo sobre folhas de soja,

populações de

que ocorre nesse período, a maior susceti

das populações desse inseto.

52

10,0M anisopliae

Beauveria sp.

Beauveria sp./D. speciosa

UFC

/mm

² fol

ha

5,0

0,011 16 23 30 7 14 21 27 4 12 20 26 4 11 18

Dez/03 Jan/04 Fev/04 Mar/04

Figura 7. Densidade do inóculo dos fungos entomopatogênicos Beauveria sp. e

200

.4. Conclusões

- As maiores densidades de Beauveria sp. sobre as folhas de soja foram

- Foi constatada, pela primeira vez, a ocorrência de um taquinídeo do gênero

Strongygaster parasitando C. arcuata.

Metarhizium anisopliae (UFC) em folíolos de soja ao longo da safra de soja

3/04 em Londrina, PR.

3

- Os protozoários do gênero Gregarina e as moscas parasitóides do gênero

Celatoria foram os inimigos naturais de maior prevalência sobre D.

speciosa;

constatadas durante os meses de fevereiro e março, correspondendo às

maiores porcentagens de adultos de D. speciosa com sinais de infecção

causada por esse patógeno;

53

3.5. Literatura citada

Ba

67.

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Capítulo 4. Eficiência de isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium

os foram realizados em laboratório e em casa de vegetação.

pesar de a germinação dos fungos não ter sido afetada pelos inseticidas, os

atamentos fungo + inseticida não apresentaram efeito sinérgico no controle de D.

peciosa. Foi observado em casa de vegetação que os insetos alimentaram-se

ais das plantas que receberam tratamento com o inseticida fipronil do que

aquelas com imidacloprid. Em laboratório, após 48 horas de contato, as maiores

reas consumidas por D. speciosa ocorreram em trifólios de soja pulverizadas

om fungos, com o inseticida fipronil em mistura com CNPSo-Bb61 e na

stemunha. Bioensaios realizados com C. arcuata revelam baixa virulência de

olados de B. bassiana e M. anisopliae a esse inseto, porém foi observado efeito

inérgico entre o isolado de B. bassiana CNPSo-Bb61 e imidacloprid.

anisopliae em mistura com inseticidas no controle de Diabrotica

speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae) Resumo O impacto nas populações de insetos causado por epizootias naturais,

especialmente por fungos e vírus, demonstrou o potencial dos organismos

microbiológicos para o controle de pragas. Todavia, considerando o elevado custo

da produção de fungos entomopatogênicos e sua eficiência dependente das

condições ambientais, a utilização conjunta do inseticida químico em baixas

dosagens e o agente de controle biológico poderia compensar essas deficiências

com um menor impacto ambiental. Esse trabalho foi realizado com o objetivo de

determinar o potencial de controle de isolados de fungos entomopatogênicos em

mistura com baixas dosagens de inseticidas sobre a vaquinha patriota.

Suspensões de conídios (32.010 ± 6.632 conídios/inseto) de nove isolados de

Beauveria bassiana e quatro isolados de Metarhizium anisopliae foram utilizados

nos testes de patogenicidade. Os isolados que apresentaram maior virulência

foram utilizados nos ensaios de compatibilidade com os inseticidas fipronil e

imidacloprid. Os ensai

A

tr

s

m

d

á

c

te

is

s

59

Abstract The impact on insect populations caused by natural epizootics, specially by fungi

and v

ns (32.010 ± 6.632 conidia per insect) of

nine i

was greater on leaflets pulverizes with fungi,

insecti

iruses, shows the microorganism potential on pest control. However,

considering the entomopathogenic fungi high cost production and its efficiency

depending on environmental conditions, the use of low dosages of chemical

insecticide with the microbial agent, could compensate these deficiencies with a

minimum of environmental impact. The aim of this work was to evaluate the

potential of entomopathogenic fungi associated with low dosages of insecticides to

control D. speciosa. Conidia suspensio

solates of Beauveria bassiana and four of Metarhizium anisopliae were

tested. The most virulent isolates were tested with fipronil and imidacloprid

insecticides. The biossays were carried out in controlled environments (laboratory

and greenhouse). Insecticides did not affect the germination of the fungi. The

mixture of fungi and insecticide treatments did no show synergistic effect to control

D. speciosa. The feeding activity was enhanced by fipronil applications carried out

in greenhouse. Leaves consumption

cide with the isolate of B. bassiana CNPSo-Bb61 and leaflets not pulverized.

Biossays with C. arcuata showed low virulence of the fungi to this insect, but when

the isolate of B. bassiana CNPSo-Bb61 was applied with imidacloprid synergistic

effect was observed.

60

4.1. Introdução

Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae) é um

inseto altamente polífago conhecido popularmente como vaquinha patriota. A fase

larval deste inseto causa danos consideráveis ao sistema radicular de milho (Zea

mays L.) e vem sendo causa de preocupação a agricultores de soja da região

Oeste e Sudoeste do Paraná (Hoffmann-Campo et al. 2000). Por não serem

geralmente alarmantes, não existem trabalhos referentes aos danos causados por

este inseto em áreas de soja no Brasil.

Os insetos em geral, têm suas populações controladas naturalmente por

predadores, parasitóides e doenças, quando o uso restrito de inseticidas

possibilita a ocorrência desses inimigos naturais no sistema agrícola. Em especial,

os fungos e vírus têm demonstrado potencial de controle de populações de insetos

praga. A vantagem do uso de fungos em programas de controle biológico, é que

esses podem invadir seus hospedeiros diretamente através de áreas

tersegmentares do exoesqueleto.

Com o objetivo de controlar larvas de Diabrotica undecimpunctata

nte praga do milho nos EUA, Krueger & Roberts (1997)

corporaram propágulos dos fungos M. anisopliae e B. bassiana no solo e

demon

am a patogenicidade de B.

assiana e M. anisopliae a larvas de D. speciosa e observaram que os isolados de

No Brasil, Silva-Werneck et al. (1995) avaliaram isolados de B. bassiana e

M. ani

in

Mannerheim, uma importa

in

straram que através de baixas concentrações dos fungos no solo foi

possível proteger as raízes de milho do ataque das larvas desse inseto.

Na Argentina, Consolo et al. (2003) avaliar

b

B. bassiana foram mais virulentos ao inseto em comparação com os isolados de

M. anisopliae.

sopliae para o controle de larvas de D. speciosa em laboratório e obteve-se

baixos índices de infecção dos fungos sobre o inseto. Pianoski et al. (1990)

avaliaram a eficiência de B. bassiana sobre D. speciosa na cultura de feijão com

diferentes adubações e concluíram que B. bassiana foi mais eficiente no controle

do inseto quando aplicado em áreas sem adubação. Os autores inferiram que a

61

planta subnutrida pode ter alterado alguma característica do inseto, facilitando a

ação do patógeno.

Entretanto, sabe-se que os fungos possuem fatores limitantes à sua eficiência de

controle, como umidade relativa, temperatura, concentração do inóculo e fatores

químicos e físicos que impedem a adesão dos conídios à cutícula do inseto. Por

esse motivo, algumas estratégias vêm sendo desenvolvidas para aumentar a

eficiência dos fungos no controle de insetos, entre as quais a utilização de fungos

em mistura com baixas dosagens de inseticidas (Quintela & McCoy 1998, Moino

Jr. & Alves 1998, Furlong & Groden 2001).

O objetivo deste trabalho foi avaliar a patogenicidade de isolados de B. bassiana e

M. anisopliae e sua compatibilidade com inseticidas para o controle de adultos de

D. speciosa em laboratório e casa de vegetação, de maneira a reduzir o uso de

pesticidas químicos e proporcionar o controle natural desse inseto através de

inimigos naturais. O consumo de plantas de soja tratadas com fungos e inseticidas

por D. speciosa também foi avaliado.

4.2. Material e Métodos

A pesquisa foi conduzida no Laboratório de Patologia de Insetos da

Embrapa Soja, em Londrina, Paraná; seguindo os protocolos adotados por esse

laboratório para os testes realizados neste trabalho.

4.2.1. Seleção de isolados de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em Diabrotica speciosa

Foram obtidas culturas puras de isolados de B. bassiana e M. anisopliae do

Banco de Fungos da Embrapa Soja (Tabela 1). Para tanto, os isolados estocados

a -20oC em sílica gel foram multiplicados em placas de Petri com meio de cultura

batata-dextrose-ágar (BDA) e sulfato de streptomicina. As placas foram incubadas

em condições controladas a 26 ± 1 oC, escotofase 24 horas, durante o período de

62

12 a 14 dias. Após esporulação, os conídios foram coletados por raspagem da

superfície do meio de cultura com auxílio de uma espátula e transferidos para

tubos de ensaio contendo água destilada estéril com espalhante adesivo -

Tween® 80 (15 µL/L). As suspensões foram filtradas para eliminação do micélio e

homogeneizadas em agitador de tubos para contagem de conídios em

hemocitômetro (Câmara de Neubauer). Para avaliação da viabilidade dos

con

e

isola

ento

0 cm) onde

ermaneciam até a inoculação. As concentrações das suspensões foram

alibradas para aproximadamente 1 X 107/mL. Com auxílio de uma seringa

coplada a um micropipetador automático (modelo Arnold LV6 da Burkard

anufacturing Co. Ltda), 2 µL de suspensão foram inoculados no metaesterno

egião ventral), sendo que cada inseto recebeu aproximadamente 32.010 ± 6.632

onídios. Os insetos inoculados eram acondicionados em caixas Gerbox (cada

ma com 10 insetos) forradas com papel filtro estéril, mantidas em BOD a 26 ± 1

e 60 %U.R. e fotofase de 14 horas. Em cada Gerbox foram colocados pedaços

e cenoura e algodão umedecido com água destilada estéril para manter a

limentação dos insetos, os quais eram trocados diariamente ou assim que

ouvesse necessidade. O grupo testemunha recebeu 2 µL de água destilada

stéril com espalhante adesivo - Tween® 80 (15 µL/L) e foram acondicionados

ídios, as suspensões foram nebulizadas durante um minuto, com auxílio de um

nebulizador (ST SUPER-NS) sobre lâminas contendo meio de cultura BDA e

sulfato de streptomicina. As lâminas foram colocadas em caixas Gerbox (3 cm X 3

cm X 11 cm) e acondicionadas em condições controladas a 26 ± 1 oC, escotofase

24 horas e condições de umidade dentro da caixa Gerbox próxima à saturação.

Após 24 horas, os conídios germinados foram contados. Foram avaliados nov

dos de B. bassiana e quatro isolados de M. anisopliae (Tabela 1) nos

bioensaios de patogenicidade com D. speciosa. Foram realizadas três repetições

de 30 insetos para cada isolado.

Os insetos adultos utilizados nos bioensaios foram coletados com rede

mológica em áreas cultivadas com soja, feijão e curcubitáceas, localizadas no

campo experimental da Embrapa Soja, em Londrina, Paraná. Após a coleta, os

insetos foram transferidos para gaiolas teladas (50 cm X 50 cm X 7

p

c

a

M

(r

c

u

ºC

d

a

h

e

63

nas mesmas condições dos grupos que receberam tratamento com fungos. A

mo de fo da d te cul . O

mortos foram acondicionados em câmara úmida (placa de Petri plástica contendo

estéril), mantida sob condições

controladas a 26 ºC e e as para confirmação dos insetos

mortos por fungo.

lh lad real s t l m dia (DL50)

sinais do patógeno), vis um s erados na u e

fungos em controle biológico é a bo ação do fungo em cadáveres de

ra sa re inó mbiente e aumentando

Dois isolados de Beauveria bass o-Bb61 e CNPSo-Bb467) (Tabela

C. arcuata

d os a om isol dos foram

e úm to vei po os b aios.

Os resultados dos bioensaios for tidos aos testes de normalidade e

liz oftw ísti stat al. 1

rtalida i avalia iariamen até 15 dias após ino ação s insetos

papel filtro umedecido com água destilada

escotofas de 24 hor

A esco a dos iso os para ização do

rtalidade confirmada (insetos com

estes de dose leta é

foi realizada considerando os dados de mo

to que dos fatore consid tilização d

a exterioriz

insetos, ga ntindo des forma a p sença do culo no a

a capacidade de transmissão horizontal do patógeno (Mulock & Chandler 2001).

iana (CNPS

1) foram avaliados quanto à patogenicidade em . Foram realizadas duas

repetições e 30 inset para cad isolado. S ente esses dois a

avaliados d vido ao n ero de inse s disponí

am subme

s em cam para ioens

heterocedasticidade e analisados mediante teste de comparação de médias de

Student uti ando o s are estat co Sigma (Kuo et 992).

64

Tabela 1. Lista dos isolados de fungos entomopatogênicos utilizados nos ensaios.

Acesso Espécie Hospedeiro Ordem: Família Local de

Nome Científico coleções

Coleta País Acesso outras

CNPSo-Ma12 M. anisopliae solo Londrina, PR Brasil

CNPSo-Ma468 M. anisopliae Timbraca

limbativentris

Hemíptera:

Pentatomidae

Goiânia, GO Brasil CG-1681

CNPSo-Ma469 M. anisopliae Ancogna

scarabae

1 tha

ides

Coleoptera:

Scarabaeidae

Madri,

Cundinamarca

Colombia CG-293

ARSEF-797

CNPSo-M

speciosa Chrysomelidae Tucumán ARSEF-25153

NPSo-Bb21 Beauveria sp. Diabrotica sp. Coleoptera:

Chrysomelidae

Londrina, PR Brasil

NPSo-Bb25 Beauveria sp. Diabrotica sp. Coleoptera: Londrina, PR Brasil

Chrysomelidae

CNPSo-B

-501

a473 M. anisopliae Diabrotica

speciosa

Coleoptera:

Chrysomelidae

Santa Maria, RS Brasil

CNPSo-Bb13 B. bassiana Diabrotica Coleoptera: Blanco Pozo, Argentina ESALQ-4992

C

C

Chrysomelidae

CNPSo-Bb59 Beauveria sp. Diabrotica sp. Coleoptera: Londrina, PR Brasil

b61 Beauveria sp. Diabrotica sp. Coleoptera:

Chrysomelidae

Mangueirinha,

PR

Brasil

CNPSo-Bb71 Beauveria sp. Diabrotica sp. Coleoptera:

Chrysomelidae

Mariópolis, PR Brasil

CNPSo-Bb357 B. bassiana Diabrotica sp. Coleoptera:

Chrysomelidae

Brasília-DF Brasil CG-611

CNPSo-Bb467 B. bassiana Diabrotica

speciosa

Coleoptera:

Chrysomelidae

Warta, Londrina,

PR

Brasil

CNPSo-Bb470 B. bassiana Maecolaspis

monrosi

Coleoptera:

Chrysomelidae

La Virginia Argentina CG-791

ESALQ 2

1 - Coleção de Fungos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen), SAIN - Parque Rural - Caixa Postal

02372, 70

50

Dentre os fungos avaliados, três isolados de Beauveria bassiana CNPSo-

849-970, Brasília, DF - Brasil 2 - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), Departamento de Entomologia. Caixa Postal 9, 13418-900,

Piracicaba, SP - Brasil 3 - ARSEF - USDA Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures Plant Protection Research Unit - US Plant, Soil &

Nutrition Laboratory. Tower Road, Ithaca NY 14853-2901 USA

4.2.2. Determinação da DL dos isolados de Beauveria bassiana em Diabrotica speciosa

Bb 59, CNPSo-Bb 61 e CNPSo-Bb 467, foram selecionados para determinação da

65

DL50. Os métodos de multiplicação, acondicionamento e avaliação de viabilidade

dos conídios foram os mesmos utilizados no item 4.2.1.

Os insetos foram inoculados através de aplicação tópica com doses que

Foram realizadas três

petições para cada isolado.

10 insetos em cada repetição. Os insetos inoculados eram

acond

variaram entre 4.050 a 4.050.000 conídios por inseto. Os insetos inoculados foram

acondicionados conforme descrição no item 4.2.1.

re

Os resultados de mortalidade total acumulada (insetos com e sem sinais do

patógeno) foram analisados para estimativa da DL50 pelo programa Polo-PC

(LeOra Software, 1987).

4.2.3. Determinação da DL5 dos inseticidas em Diabrotica speciosa

Foram utilizados dois produtos comerciais: fipronil (Regent 800 WG) e

imidacloprid (Provado 200 SC). Para determinação da DL5 de fipronil foram

utilizadas doses que variaram entre 1,5 ng a 2000,0 ng de i.a. por inseto. Foram

realizadas três repetições para cada dose, utilizando 30 insetos por repetição. Os

insetos inoculados eram acondicionados conforme item 4.2.1. A mortalidade foi

avaliada diariamente até 96h após a inoculação. Os resultados de mortalidade

total foram analisados pelo programa Polo-PC (LeOra Software, 1987).

Nos ensaios com imidacloprid, foram utilizadas doses que variaram entre

0,000061 ng a 2 ng de i.a. por inseto. Foram realizadas duas repetições para cada

dose, com

icionados conforme descrição no item 4.2.1. A mortalidade foi avaliada

diariamente até 96h após a inoculação. Os resultados foram analisados através do

método 50% endpoint (Reed & Muench 1937) por não se adequarem ao modelo

de Probit.

66

4.2.4. Efeito de Beauveria bassiana em mistura com inseticidas na infecção de Diabrotica speciosa

otofase de 14 horas. Em cada

Gerbo

troladas a 26 ºC, escotofase de

24 hor

Baseando-se nos resultados dos bioensaios realizados com D. speciosa,

ois isolados foram escolhidos para realização do experimento em casa de

egetação. Esses dois isolados foram avaliados novamente para verificar a

4.2.4.1. Infecção de Diabrotica speciosa após aplicação de Beauveria

bassiana em mistura com inseticidas em laboratório

Foram realizados quatro tratamentos em laboratório (fungo, fungo +

inseticida, inseticida e testemunha). O efeito dos inseticidas fipronil e imidacloprid

em mistura com os três isolados de B. bassiana (CNPSo-Bb59, CNPSo-Bb61 e

CNPSo-Bb467) foram avaliados sobre D. speciosa. Foi utilizada a DL50 de cada

isolado e a DL5 de cada inseticida. A DL50 utilizada foi calculada com os resultados

de mortalidade total (com e sem sinais do patógeno) (Tabela 4). Para cada

tratamento foram feitas três repetições, utilizando 30 insetos adultos em cada

repetição, com 10 indivíduos em cada caixa Gerbox. A inoculação dos insetos foi

realizada conforme descrição no item 4.2.1. Os insetos inoculados foram mantidos

em condições controladas a 26 ± 1 ºC, 60 %U.R. e f

x foram colocados pedaços de cenoura como fonte de alimento e algodão

umedecido com água destilada, trocados diariamente. A mortalidade foi avaliada

diariamente até 15 dias após inoculação. Os insetos mortos foram acondicionados

em câmara úmida (placa de Petri plástica contendo papel filtro umedecido com

água destilada estéril) mantida sob condições con

as e umidade próxima da saturação, para confirmação dos insetos mortos

por fungo.

A viabilidade dos conídios no tratamento com os inseticidas foi avaliada

conforme descrição do item 4.2.1. Antes da nebulização sobre as lâminas, as

suspensões permaneceram em agitação durante 4 horas em misturas com os

inseticidas (Sosa-Gómez et al. 2003).

d

v

67

compatibilidade com os inseticidas, através de um método mais agressivo,

discutido a seguir.

Os isolados foram inoculados em placas de Petri com meio BDA e sulfato

de stre

ncia de Kruskal-Wallis

para d dos n

ptomicina. As placas foram mantidas em condições controladas a 26 ºC e

60 %U.R. por um período de 12 a 14 dias. Após esse período, porções das

colônias (4 mm X 4 mm) foram recortadas das placas e colocadas em

Erlenmeyers contendo 50 mL de meio líquido batata-dextrose e sulfato de

streptomicina. Em cada Erlenmeyer foram colocadas três porções das colônias. As

concentrações utilizadas dos produtos comercias foram as mesmas utilizadas no

experimento em casa de vegetação (item 4.2.4.2.). Foram realizadas quatro

repetições de cada inseticida mais a testemunha. Os tratamentos permaneceram

em agitação durante dez dias, a 100 rpm por minuto, em sala climatizada a 25 ± 2

ºC. Após esse período, alíquotas de meio de cultura de cada tratamento foram

avaliadas sob microscópio óptico para verificação da ocorrência de contaminação.

Os micélios foram então filtrados a vácuo, utilizando papel de filtração rápida, e

pesados para determinação do peso úmido e seco.

Somente um isolado de B. bassiana (CNPSo-Bb61) e o inseticida

imidacloprid foram avaliados em bioensaios com Cerotoma arcuata. Foi utilizada a

dose 1 X 107 conídios por indivíduo de CNPSo-Bb61 e a DL5 de Provado 200 SC

avaliada em D. speciosa. Para cada tratamento foram utilizados 15 insetos adultos

acondicionados em caixas Gerbox e 3 repetições.

Os resultados que apresentaram normalidade e heterocedasticidade foram

submetidos à análise de variância (ANVA) e as médias foram comparadas pelo

teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os resultados que não apresentaram os

requisitos para ANVA foram analisados pela análise de variâ

a ão paramétricos. Os testes estatísticos foram realizados através do

software Sigmastat (Kuo et al. 1992).

68

4.2.4.2. Infecção de Diabrotica speciosa após aplicação de Beauveria

bassiana em mistura com inseticidas em casa de vegetação

erizador foi 260 mL/min, com um bico

ônico (Conejet TX-4) e pressão de 40 psi. Para cada repetição foi utilizado um

aso com quatro plantas de soja em estádio vegetativo V3-V4. Após pulverização,

dentro de uma gaiola telada (50 cm X 50 cm X 70

m) onde foram liberados 30 insetos adultos de D. speciosa. O experimento foi

ados dentro da casa de vegetação um termohigrógrafo e um

sicrômetro. A mortalidade foi avaliada diariamente até 15 dias após pulverização.

Em casa de vegetação, foram realizados nove tratamentos (CNPSo-Bb59,

CNPSo-Bb61, imidacloprid, fipronil, CNPSo-Bb59 + imidacloprid, CNPSo-Bb59 +

fipronil, CNPSo-Bb61 + imidacloprid, CNPSo-Bb61 + fipronil e testemunha). Foram

realizadas quatro repetições para cada tratamento. Nos tratamentos com

inseticidas, a concentração utilizada foi 1/5 da dose recomendada para campo em

150 L de água. A concentração de fipronil utilizada foi 20 g PC/ha. Como não há

recomendação de Provado 200 SC para o controle de D. speciosa, a

concentração utilizada (105 mL PC/ha) foi equivalente à recomendada para

Confidor 700 GRDa, que possui o mesmo ingrediente ativo (imidacloprid). As

suspensões de fungos foram preparadas com a concentração correspondente a 1

X 1012 conídios/mL para 1 ha, adicionando-se Tween® 80 (15 µL/L) como

espalhante adesivo. Os tratamentos foram pulverizados sobre vasos com plantas

de soja (cultivar Paraná). A vazão do pulv

c

v

cada vaso de soja foi colocado

c

realizado em casa de vegetação telada. Para registro da temperatura e umidade

foram coloc

p

Os insetos mortos foram acondicionados em câmara úmida, conforme descrito no

item 4.2.1, para confirmação dos insetos mortos por fungo.

Os resultados que apresentaram normalidade e heterocedasticidade

foram analisados pela análise de variância (ANVA) e as médias foram

comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os resultados que não

apresentaram os requisitos para ANVA foram analisados pela análise de variância

de Kruskal-Wallis. O software estatístico utilizado foi Sigmastat (Kuo et al. 1992).

69

4.2.5. Consumo foliar de Diabrotica speciosa em trifólios de soja tratados com fungos e inseticidas O consumo foliar foi avaliado da seguinte maneira: foram oferecidos a D.

speciosa trifólios de soja com os mesmos tratamentos realizados em casa de

vegetação (item 4.2.4.2). A área foliar dos trifólios foi medida antes do consumo

em um integrador de área foliar (modelo Stationary LI 3100), e após 24 e 48 horas

de consumo. Os insetos foram acondicionados em caixas Gerbox (cada uma com

cinco insetos) conforme item 4.2.1. Após 48 horas, os trifólios de soja tratados

com fu

ciosa e

a. O isolado

NPSo-Bb59 apresenta valores de mortalidade total com diferença estatística dos

alores da testemunha a partir do 11o dia após inoculação com o fungo, enquanto

isolado CNPSo-Bb61 apresentou essa diferença 13 dias após inoculação. Esses

isolados causaram valores elevados (%) de mortalidade confirmada (com sinais do

patógeno), em relação a maioria dos isolados (Tabela 2). Os valores de

ngos e inseticidas foram trocados por trifólios de soja sem tratamento, os

quais eram trocados diariamente ou assim que houvesse necessidade. A

mortalidade foi avaliada diariamente até 15 dias após aplicação. Os insetos mortos

foram acondicionados em câmara úmida (placa de Petri plástica contendo papel

filtro umedecido com água destilada estéril), mantida sob condições controladas

de BOD a 26 ºC, escotofase 24 horas e umidade próxima à saturação, para

confirmação dos insetos mortos por fungo.

4.3. Resultados e Discussão

4.3.1. Seleção de isolados de B. bassiana e M. anisopliae sobre D. spe

C. arcuata Os isolados de B. bassiana CNPSo-Bb59, CNPSo-Bb61 (Tabela 2) foram

os que causaram mortalidade total (com e sem sinais do patógeno) com diferença

estatística (p < 0,05) da mortalidade total observada na testemunh

C

v

o

70

mortalidade confirmada foram 60 % para o isolado CNPSo-Bb59 e 54 % para o

isolado CNPSo-Bb61. Entretanto, o isolado que causou maior porcentagem de

mortalidade confirmada foi CNPSo-Bb467 (66,4 %), porém, os valores de

mortalidade total não diferem estatisticamente da testemunha, embora o valor de

mortalidade confirmada corrigida (55,3 %) seja maior que o valor de mortalidade

confirmada corrigida do isolado CNPSo-Bb61. Esses resultados revelam que o

isolado de CNPSo-Bb61 não esporula bem nos cadáveres dos insetos. O isolado

CNPSo-Bb71 causou mortalidade total elevada (95 % ), porém esse valor não

difere estatisticamente (p < 0,05) da testemunha (63 %).

s da análise dos resultados, observa-se que os isolados de B.

assiana são mais virulentos a D. speciosa em comparação com os isolados de

ae

Ao contrário, am maiores porcentagens de

ortalidade com isolados de M. anisopliae onde o isolado CG293 de M. anisopliae

causou maior porcentagem de mortalidade confirmada (30 %). Esse mesmo

isolado foi utilizado para os ensaios de patogenicidade (CNPSo-Ma469) e causou

mortalidade confirmada de 18,9 %. Não é possível comparar os resultados obtidos

devido à diferente metodologia utilizada, visto que Silva-Werneck et al. (1995)

usaram a técnica de imersão de larvas em suspensão de 108conídios/mL.

A mortalidade causada pelos fungos utilizados ocorreu predominantemente

entre os dias 5 - 13. Poucos indivíduos ( < 5 %) morreram após o 13o dia.

A vantagem de trabalhar com dose letal é que os resultados podem ser

facilmente comparados entre experimentos. Nos trabalhos realizados com

concentração letal média (CL50), não é possível estabelecer precisamente o

número de conídios que entraram em contato com cada inseto, dificultando a

comparação entre experimentos realizados com diferentes métodos.

Atravé

b

M. anisopli , concordando com os resultados obtidos por Consolo et al. (2003).

Silva-Werneck et al. (1995) encontrar

m

Figura 1.

71

Ad

ulto de Diabrotica speciosa com i g ese d

s na e (b) Meta

ba sia rhizium anisopliae

a

con dio ên

.

e (a

b

B u eria ) ea v

72

Tabela 2. Mortalidade total e confirmada (% média ± EP) de adultos de Diabrotica speciosa durante 15 dias após inoculação com isolados de

Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae. Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb13 3,6±3,a

6 3 6a

4,8±4,8 a

4,8±4,8 a

7,0±5,6 ns

1a

5,2±8,8 18a

,7±9,5 29,a

3±14,7 40,a

5±14,0 43,a

8±14,0 48,a

4±12,5 56,a

4±11,6 58,a

7±12,0 6a

,2±11,1 5,4±10,9 67,6±8,9 a

Testemunha ±1,1 ±2,2 1,9 ,4 a a

6,6a a a a a a a a

±3,0

este t 0,7 0,5 0,3 0,9 1,2 1,5 1,9 1,8 2,3 2,3 2,2 2,2 1,8 1,8

1,1a

2,2a

3,3±a

6,7±3ns

6,6±3,4 6,6±3,4 ±3,4 13,3±3,9 16,7±5,1 20,0±1,9 28,9±4,0 31,1±3,0 37,8±3,0 45,6±3,0 51,1a

T

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb13 0n

0,0 ns

1,2±1,ns

4,7±2a

5,9±a

14,0a a a

19a

24a

2a

20,0 ns

,0 s

2 ,4 3,2 ±7,1 15,1±6,0 19,8±7,5 ,8±7,5 ,1±4,7 5,3±4,8 6,4±3,8 a

28,6±3,9 a

29,7±3,1 a

Testemunha ns

0,0 ns

1,1±1,1 ns

1,1±1,1 a

1,1±1,1 a

1,1±1,1 a a a a a a

±6,7

este t 1,4 1,4 1,8 2,0 2,0 1,9 1,8 1,8 2,1 2,4 2,2

0,0 0,0 ns

2,2±2,2 3,3±3,4 4,4±3,0 8,9±7,4 10,0±7,0 11,1±7,0 a

11,1±6,2 a

13,4a

T

Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb21 1n

1a

2a

4a

4a a

1a

7n

,2±1,2 s

7a

,9±6,2

1,6±4,8

2,0±9,7

22,0±9,7a

26,9±10,0a

35,5±8,9 a

4,2±12,1 7,9±9,5 50,4±10,1 7 ,1±11,9 7a

9,0±11,9

9,0±11,9s

82,7±9,7 a

82,7±9,7 a

Testemunha 1 ,1 a a a a a b

±9,0 ±8,9

este t 0,9 1,4 1,2 1,0 1,5 1,6 1,7 2,2 2,1 3,4 3,2 2,3 2,0

,1ns

±1 2,2±1,1 4,5±2,3 10,0±3,4a

11,1±4,2a

11,1±4,2 a

16,8±8,1 a

22,2±4,6 24,4±5,4 26,6±5,8 36,5±6,6 37,6±5,7 b

41,9±3,7 ns

52,0a

56,4a

T

Mortalidade confirmada

10 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 12 13 14 15

CNPSo-Bb21 0n

7±

6, 6,7±6,7 ns

6,7 a

14,1a

15,3±a

31,1±1a

9,0±22a

9,0±22,4 ,2±22,3 2±22,3 ,0 s

6,7±6,7 ns

6,s

6,7 n

6,7± 7 ns

6,7±ns

9,1±5,9 a

14,1±7,1 ±7,1 7,9 7,5 3 ,4 3a

40 a

40,a

Testemunha 0 0,0 ns

1, 1,1±1,1 ns

1,1±1,1 ns a a

3,2±3,3 a

7,5±7,6a

7,5±7,6 a

7,5±7,6 a

7,5±7,6 a

8,6±8,7 a

este t 0,8 0,8 0,8 1,4 1,6 1,4 1,4 1,2 1,3 1,3 1,4 1,3

,ns

0 0,0 ns

1ns

,1± 1 1,1±1,1 a

2,2±2,2 3,2±3,3

Tcontinua...

73

Tabela 2. Continuação... Mortalidade total

1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 2 1 13 14 15

CNPSo-Bb25

1,1±1,2 a

1,1±1,2 a

12,9±7,5a

14,0±8,7a

28,0±12a

,3 31,4±15,a

7 54,6±15a

,3 66,6±11,a

1 66,6±11a

,1 78,8±10,a

5 84,7±8,3a

85,8±7,2a

89,3±4,0 a

90,4±5,1 a

90,4±5,1 a

Testemunha 7,0±3,2a

,7

11,4±7,7 a

16,1±10a

,5 25,3±1a

6 8 8 8 5, 2 7

t ,6 ,3 ,2 4 ,7 ,7 ,1 ,4 3

,2 37,5±2a

,4 37,5±2a

,4 41,2±2a

,2 46,3±2a

5 46,3±25a

,5 50,2±23,a

6 52,8±2a

,2 58±19,a

60±18,3a

62±17,7 a

63±17,2 a

Teste -1 -1,7 -0,2 -0 -0 -0 0, 0 0 1 1 1, 1,5 1,6 1,5

Mortalidade confirmada

1 2 5 6 7 8 9 0 1 3 4 1 1 12 13 14 15

CNPSo-Bb25 0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

2,3±2ns

,3 3,4±3,ns

5 15,7±8ns

,0 22,9±5,ns

0 26,3±2,ns

2 33,9±8,2a

38,6±7,9a

39,8±7,7 a

43,2±8,1 a

44,4±6,9 a

44,4±6,9 a

Testemunha 0

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

,0 7

0,0ns

0,sn

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

1,3±1,3b

1,3±1,3b

1,3±1,3 b

1,3±1,3 b

1,3±1,3 b

1,3±1,3 b

teste t 4 4, 5,0 5,2 6,2 6,2

Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb59 0 1 , 6 ,8 2 0,0 ns

4,4±4,5a

7,0±3,9a

7,0±3,9 a

7,0±3,9 a

20,3±13,3 a

33,2±17,3a

50,8±19,a

53,0±21,a

67,2±13a

9 76,4±8,a

78,6±10a

84,4±8,a

84,4±8,2a

85,5±7,9a

Testemunha ,9 9 1 8

1,1±0ns

1,1±0,a

5,5±2,2a

9,9±4,2 a

9,9±4,2 a

19,9±7,1 a

23,5±5,7 a

26,1±4,3 a

31,2±5,0a

33,4±4,4a

35,5±3,b

36,6±2,7b

38,8±2,b

39,8±3,3b

40,9±4,0b

teste t 0,7 0,3 -0,4 -0,4 0,0 0,5 1,1 0,9 2,1 3,6 3,3 4,6 4,5 4,6

Mortalidade confirmada

1 3 8 9 11 12 13 14 2 4 5 6 7 10 15

CNPSo-Bb59 0,n

0,0 ns

0n

12,2ns

1n

0,0ns

0 s

0,0s n

,0 s

±10,7 7,2±8,3 s

29,9±8,5 ns

34,3±9,ns

6 43,9±ns

4,8 52,0ns

±3,1 54,ns

3±4,2 58ns

,9±4,9 5n

8,9±4,9 s

60,0±5,8 ns

Testemunha 0,n

0,0 ns

0n

0,0 ns

0n

0 0,0 ns

0 0n

este t

0,0ns

0 s

0,0s n

,0 s

,0 s

0,0 ns

0,ns

0,0ns

0,ns

0,ns

0 ,0 s

0,0 ns

t

continua...

74

Tabela 2. Continuação ... Mortalidade total

1 2 3 4 5 10 11 12 13 14 15 6 7 8 9

CNPSBb61

0,0 ns

1,1±1,1 a

1,1±1,1 a a a

44,8±19,3 a

50,4±20,2 a

59,8±14,2 a

62,0±15,0 a

63,2±14,1 68,7±13,9 71,0±14,5 77,9±10,9 84,8±8,6 a

o- 17,8±14,7 32,2±23,2 a a a a a

88,3±6,8

Testemunha , 2

- -

1,1±1,1 ns

3a

,3±1,9

3a

,3±1,9 5a

,5±4,0

5,5±4,0 a

16,7±5,1

18,9±5,6a a

24,4±8,1a

30,0±10,a

1 31,1±11a

2 36,7±8,5a

37,8±8,1a

41,1±6,b

51,1±3,0b

54,5±2,2 b

teste t 1,0 1,0 0,8 1,1 1,4 1,5 2,2 1,8 1,8 2,0 2,0 2,0 3,8 4,8

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 14 15 7 8

CNPSo-Bb61

1,1±1,ns

1,1±1,1 ns ns

9±7,9 18,9±14 ns

27,9±12,5 ns

32,4±14 a

37,0±12,a

39,2±13,a

9,2±13,5 3,7±14,9 ,9±16,0 3±15,9 52,8±14,2 a

1 1,1±1,1 7,ns

,3 ,4 5 5 3a

4a

45a

49,a a

53,9±14,6

Testemunha 0,0ns

0n

,0ns

0,0 ns

1,1a

,4a

4± ±2 5, 6 6, ,5

2,6 2,5 2,5 2,2 2,0 2,3 ,4 3

,0 s

0,0 ns

0,0sn

0 ±1,1 4 ±3,0 4,a

3,0 5,5a

,2 8,9±a

6 11,1±a

,2 11,1±a

2 13,3±8a

14,4±9,6 a

teste t 2,2 2 2,

Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 14 15 7 8

CNPSo b71 2 ±1,1 a a

8±3,0 a

14±5,9 5±10,8 1±11,3 1±10,9 ±8,4 ±8,4 6,3 89±2,7 a a a a

-B 2 ±1,1 a

2a

4a

6a

76a

76a

84±a a

93±2,0 94±3,1 94±3,1 95±2,9

Testemunha 7±3,2 11±a

7,7 10,5 , 2

7 a

16± 25±16a a

2 37±2a

8,4 37±28a

,4 41±28a

,2 46±25,a

5 46±25,a

5 50±23,6a

53±22,a

58±19,7a

60±18,3a

62±17,7 a

63±17,2 a

teste t -1,4 -1,2 -0, -0,7 -0,4 0,1 0,6 1,1 1,1 1,4 1,6 1,8 1,8 1,8 1,9

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 14 15 7 8

CNPSo-Bb71 0,0 ,0 ns

0,0 ns

1,3±1,3 ns

7,6±4,ns

22,8±4,6ns

35,1±9,3 ns

5,1±9,3 1±12,5 42,8±14,8 45,5±17,2 a a a ns

0,0 ns

0 2 3ns

39,a a a

45,5±17,2 46,7±16,2 48,0±17,5

Testemunha 0,0

,0 ns

0,n

0n

0ns

3 a

ns

0,0sn

0 0 s

0,0 ns

,0 s

0, 0,0 ns

0,0 ns

1,3±1,b

1,3±1,3b

1,3±1,3 1,3±1,3 a

1,3±1,3 b

1,3±1,3 a

teste t 3,0 2,8 2,6 2,6 2,8 2,7 continua...

75

Tabela 2. Continuação ...

Mortalidade total

7 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb357

1,1±1,1 ns

3,5±0,1 n

9,3a

6 4 9 3± 2 , 5 6a s

±1,3 10,a

±2,3 18,a

±5,9 26,a

±8,3 29,a

10,0 41,ns

±13,2 49,a

3±13,5 55a

0±14,0 5a

,0±14,0 5a

,1±14,4 61,0±15,9 61,0±15,9a

63,4±15,8a

Testemunha 4,6a

7,1±a

9,3±a

11,9a

11,9±a

15,7ns a a a a a

36,4±3,6

ste t 1,5 1,2 1,3 1,7 1,7 2,3 2,6 2,5 2,5 2,0 1,6 1,7

0,ns

0 0,0 ns

±2,9 1,8 3,8 ±2,7 2,7 ±2,4 16,8±2,8 18,0±1,6 19,2±0,43 20,5±1,3 28,0±4,1 34,1±4,5 a a

te

Mortalidade confirmada

3 4 5 2 11 2 6 7 8 9 10 11 1 3 14 15

CNPSo-Bb357 0,0 ns

,0 ns

3,7ns ns n

6,5 ±4,6 ,0±5,

9,0±5ns

23,8ns

3,ns

2n

0,0s n

0,0 ns

0 0,0 ns

±3,7 6,2±6,2 12,0±7,0 s

14,3±ns

17,7 ns

19ns

7 1 ,7 ±9,0 2 8±9,0 3,8±9,0 s

Testemunha 0 ns

0,0 ns

0,0 ns ns

0,0ns

0,ns ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,ns

teste t

0, 0,0 ns

0,0 0 0,0 ns

0ns

,0 0,0 0

Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb467 0n

4a

,8 ,2 ,3 ,6 8a

8a

0,0 ns

0,0 ns

,0 s

,9±5,0 7,a

1±3,9 16a

±10,2 33,0a

±11,5 47a

±17,3 58a

±11,9 61a

±10,1 67a

,2±8,2 7a

2,7±4,5 4,2±5,8 6,6±5,7 87,7±4,8 a

Testemunha 0a a a

16,9a a a a a a a a

ste t -0,4 -0,6 1,0 -1,3 -1,3 -1,4 -1,4 -1,3 -1,2 -1,2 -1,2 -1,2

0,0ns

0,0 ns

,0 ns

2,5±2,5 4,7±1,4 6,9±0,2 ±4,9 23,7±6,4 34,8±12,1 39,4±12,4 46,2±14,5 51,7±16,8 64,4±16,2 65,6±16,5 67,9±15,7 a

te

Mortalidade confirmada

4 1 1 2 3 5 6 7 8 9 10 1 12 13 14 15

CNPSo-Bb467 0n

0,0 ns

0,0 ns

1,1 6±1,6 3,8±7, 43,8±3a

47,2±a

52,7ns a a a

0,0 ns

0,0 ns

,0 s

4,6±ns

19, 3a a

2 ,6 0,5 ±5,4 58,3±5,5 63,0±4,2 65,3±4,2 66,4±5,3 a

Testemunha ns ns

0,0 ns

0,0 ns ns

1,1±1,1 b

3,3±3,4 b

3,3±3,4 b

3,3±3,4 b

6,7±6,7 ns b b b

11,1±11,2

ste t 9,5 3,9 8,3 13,0 5,3 6,3 5,1 4,5

0,0 0,0 0,0 ns

0,0 7,8±7,9 7,8±7,9 10,0±10,1 b

tecontinua...

76

Tabela 2. Continuação Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb470 1,2±1,2 ns

1,2±1,2 ns

1,2±1,2 a

2,4±2,4 a

5,9±3,2 a

7,1±3,6 a

8,3±4,3 a

17,9±2,1 ns

27,4±5,2 a

32,2±5,5 a

35,7±4,2 a

39,3±3,6a

50,0±4,2 a

51,2±3,2a

57,1±7,2a

Testemunha

0,0 ns

0,0 ns

4,4±3,0 a

4,4±3,0 a

6,7±5,1 a

6,7±5,1 a

9,2±4,0 a

12,9±3,2 ns

19,2±7,0 a

22,5±4,3 a

24,7±3,2 a

26,9±3,5 a

28,0±4,1 b

32,5±4,0 b

35,8±5,5 a

teste t -1,0 0,5 -0,7 0,1 -0,1 1,3 0,9 1,4 2,1 2,5 3,8 3,7

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb470 1,2±1,2ns

1,2±1,2 ns

1,2±1,2 ns

1,2±1,2 ns

2,4±1,2 ns

3,6±2,1 ns

3,6±2,1 ns

9,5±2,4 ns

15,5±4,3 ns

17,9±3,6 ns

17,9±3,6 ns

21,4± ns

28,6±8,3 a

28,6±8,3 a

33,3±12,7 a

Testemunha

0,0ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

1,1±1,1 b

1,1±1,1 b

2,2±2,2 a

teste t 3,3 3,3 2,4

Mortalidade total

1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 3 2 1 1 14 15

CNPSo-Ma12 1 1 1 1 1 9 , , , 5 2,1±1,1a

4,4±1,2 a

8,5±3,7

15,9±9,a a

3 17,0±a

0,4 25,6±a

1,8 28,8±a

3,6 34,3±a

5,4 39,8±a

1,5 50,7±a

,2 52,9±8a

1 58,2±11a

6 62,7±10a

2 64,9±8,a

67,1±8,1 a

Testemunha 1,1 1,1 , 1 1 8 8 9

1 0,0 -0,1 0,2 0,5 1,2 ,0 2 6 0

1,1± 2,2±a ,7

a ,3

7,8±1,1

14,5±1a a

1 15,6±a

,4 25,6±a

0,7 31,3±a

,9 31,3±a

,9 32,4±9a

,0 35,8±a

,0 41,4±7,a

9 42,4±6,8a

44,6±4,6a

52,6±8,9a

54,8±9,2 a

teste t 0 1 0,2 0,1 0, 1 1, 1, 1, 1,0

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 11 12 3 4 6 7 8 9 10 1 1 15

CNPSo-Ma12 0,ns

, ,ns

2,ns

3,ns

6,n

7 ,0 5 ± ±2 2, ,7 70 1,1±1 1 1ns

1±1,1 2±1,1 3±0,1 5±1,9 s

8,ns

±2,9 13ns

±5,0 18,ns

±2,4 26,2ns

2,4 26,2ns

,4 26,2±ns

4 27,3±2ns

27,3±2,ns

28,4±3,4 ns

Testemunha 0,ns

,ns

0,ns

0,ns

0,n

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0

ste t

0 0,0 ns

0 0 0 0 0 s

0,ns

0,0sn

te

continua...

77

Tabela 2. Continuação ... Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 10 11 2 3 7 8 9 1 1 14 15

CNPSo-Ma468 6±4, 1 ± 7 4 2 a 8±3,1 a 22±4,0 a 31±7,9 a 46±7,8 a 5 ±7,5 a 57a

6,6 59±a

,6 59±7,a

6 66±7,a

74±6,3a

76±6,2 a

79±5,2 a

80±4,2 a

81±5,1 a

Testemunha 7±3, 11± ±a

37a

1± 2 2 3 , 7

0,6 0,9 ,9 0

2 a 7,7 a 16a

10,5 25a

±16,2 37±28,4 ±28,4 4a

28,2 46±a

5,5 32±a

5,5 50±2a

,6 53±22a

2 58±19,a

60±18,3a

62±17,7 a

63±17,2 a

teste t -0,3 -0,4 0,6 0,3 0,3 0,5 0,6 0,5 0,5 0 1, 1,0 1,0

Mortalidade confirmada

1 3 7 8 9 1 12 13 14 15 2 4 5 6 10 1

CNPSo-Ma468 1,1ns

3 1, 6,ns

,9±ns

,5± ±5 5,4 4 28a

8,2± ±7, 9 ±1,2 1,1±1,2 ns

2,ns

±1,1 3,4± 9 ns

8±2,0 7 3,1 12ns

6,2 17,0ns

,4 17,0±ns

23,7±7,a

24,8±7,2 a

,2±6,7 2a

6,7 29,4a

9 29,4±7,a

Testemunha 0,0ns

0 0,ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

3±1,3 1,3 b

1,3±1b

1,3±1,3 b

3±1,3

3,0 4,0 3,6 3,6

0,0 ns

0,ns

0,0 ns

0 1,b

1,3±b ,2

1,3±1,3 ,3 1,b

teste t 3 4,0

Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-a469

0,9±0,9 ns

2,1±1,0 ns

2,1±1,0 a

3,2±1,93a

7,9±5,0a

14,6±4,0 a

19,7±4,9 a

28,3±5,9 a

32,5±6,8 a

40,1±6,9 a

42,4±9,0 a

47,8±6,2 a

56,0±5,3 a

58,2±5,9 a

63,0±5,0 a M

Testemunha 0,0 ns

0,0 ns

4,6±2,9 a

6,8±5,0 a

6,8±5,0a

19,4±14,0a

20,6±13,2a

23,2±12,6a

23,2±12,6 a

24,3±13,6a

24,3±13,6a

25,6±13,5a

28,1±13,5a

32,0±14,4a

32,0±14,4a

ste t -0,8 -0,7 0,1 -0,3 -0,9 0,4 0,6 1,0 1,1 1,5 1,9 1,7 2,0 te

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Ma469 0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

1,1±1,1 ns

5,9±4,3 ns

9,2±3,2 ns

11,3±3,1 ns

15,7±1,2 ns

16,7±1,9 ns

18,9±2,9 ns

23,3±1,9 ns

25,2±1,0 ns

31,7±2,5 ns

35,1±4,3 ns

36,2±5,41 ns

Testemunha 0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

teste t

continua...

78

Tabela 2. Continuação ... Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Ma473 0,0 ns

3,3±0,0 ns

6,7±1,92 a

6,7±1,9a

8,9±1,1a

24,4±11,1a

33,3±13,5a

38,9±14,5a

41,1±18,2 a

44,4±20a

,0 46,7±22,2a

50,0±20,4a

54,5±21,5a

55,6±21,1a

55,6±21,1a

Testemunha 0,0 ns

0,0 ns

1,3±1,3 a

3,7±1,3a

3,7±2,1a

6,3±3,4 a

7,5±2,3 a

11,3±4,5 a

11,3±4,5 a

12,5±4,a

teste t 2,3 1,0 2,1 1,6 1,9 1,5 1,6 1,5

7 13,8±5,1 a

15,1±5,9 a

22,6±9,5 a

26,4±17,7a

27,6±12,1a

1,4 1,6 1,4 1,2 1,1

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Ma473 0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

3,3±1,9 ns

4,4±2,9 ns

4,4±2,9 ns

5,5±2,2 ns

10,0±ns

6,7 11,1±6,2 ns

14,4±7,8 ns

16,7±8,4 ns

16,7±8,4 ns

Testemunha 0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

teste t

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

0,0 ns

Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Student

ns: não significativo

79

Os isolados avaliados em adultos de C. arcuata, CNPSo-Bb61 e CNPSo-

causaram mortalidade total e confi da reduzid , revelando

C. arcuata menos susce o que desses iso os B. bassiana em

. tar, ainda, r valor de

foi 27 %,

uanto e em D. speciosa

firm tre todos o valiados ecessidade

C. arcuata. egundo Fernandes et

(198 v lên a B. bassiana a C. arcuata fo elo isolado

izado e concentração do inó

Bb467,

que

comparação com

mortalidade total foi 29 % 15 dias após

O valor de mortalidade confirmada desse isolado em

enq

con

de avaliar um número maior de isolados para

al.

util

rma a (Tabela 3)

é

D. speciosa

tível a

Cabe

ata

ress

lad

que

de

o mal aio

a inoculação com o isolado CNPSo-Bb467.

C. arcuata

qu

(66

esse isolado causou o maior valor de mortalidade

ada ,4 %) en s isolados a . É evidente a n

S

nfluen9), a iru ci i i ciada p

culo.

80

Tabela 3. Mortalidade (% média ± EP) de adultos de Cerotoma arcuata durante 15 dias após inoculação com isolados de Beauveria bassiana.

2 3 5 10 11 12 14 5

Mortalidade total

1 4 6 7 8 9 13 1

CNPSo-Bb61 1,

a

1 , ,0

a

a

8

n

,3

ns

±1

ns

3,5

ns ns

15

ns

,0±3

ns

5

ns

7±1,2 1,7

a

±1,2 1,7±

a

,2 3,3±0

a

0 3,3±0 6,7±0,0 8,3±1,2

ns

,3±1,2 8

s

±1,2 8,3 ,2 11,7± 13,3±4,7 ,0±3,5 15 ,5 18,3±3,

Testemunha 0,

a

, 4±0,1

a

4±0,1

a

1,1

n

5,1

ns

5,1±1

ns

5,1±1,1

ns

±1,1

ns ns

5,1±1,

ns

5,1±1,1

ns

1, 1,0 7,0 6,5

0 0,0

a

0,0

a

1,7±1

a

2 3, 3, 5,1±

ns

5,1±1,1

s

±1,1 ,1 5,1 5,1±1,1 1

teste t 0 1,0 1,0 1,0 - 2 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb61 0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0

a

1,7±1,2

ns

1,7±1,2

ns

1,7±1,2

ns

1,7±1,2

ns

1,7±1,2

ns

1,7±1,2

ns

1,7±1,2

ns

1,7±1,2

ns

3,3±0,0

a

Testemunha 1,8±1,3

a

1,8±1,3

a

1,8±1,3

a

1,8±1,3

a

1,8±1,3

a

1,8±1,3

a

1,8±1,3

ns

1,8±1,3

ns

1,8±1,3

ns

1,8±1,3

ns

1,8±1,3

ns

1,8±1,3

ns

1,8±1,3

ns

1,8±1,3

ns

1,8±1,3

a

teste t -1,0 -1,0 -1,0 -1,0 -1,0 -1,0 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 0,87

Mortalidade total

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

CNPSo-Bb467 0,0

ns

2,5±1,8

a

2,5±1,8

a

2,5±1,8

a

2,5±1,8

a

5,0±3,5

a

7,5±5,3

ns

15,0±10,6

ns

15,0±10,6

ns

15,0±10,6

ns

17,5±12,4

ns

24,2±14,7

ns

26,7±16,5

ns

29,2±18,3

ns

29,2±18,3

ns

Testemunha 0,0

ns

0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0

a

2,8±2,0

ns

2,8±2,0

ns

4,5±0,7

ns

4,5±0,7

ns

4,5±0,7

ns

4,5±0,7

ns

4,5±0,7

ns

4,5±0,7

ns

4,5±0,7

ns

teste t 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 5,5 5,5 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

81

Tabela 3. C

15

ontinuação ...

Mortalidade confirmada

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

CNPSo-Bb467 ±19,4 0,0

ns

0,0

ns

0,0

ns

0,0

ns

0,0

ns

0,0

ns

2,5±1,8

a

10,0±7,1

a

10,0±7,1

a

10,0±7,1

a

10,0±7

a

,1 12,5±8,8

a

22,5±15,9

a

25,0±17,7

a

27,5

a

testemunha

Teste t

0,0

ns

0,0

ns

0,0

ns

0,0

ns

0,0

ns

0,0

ns

0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

0,0

a

0,0

a

0,0

a

0,0

a

1,0 1,0 1,0 1,0

Médias seguidas de mesma letras na coluna não diferem entre si pelo teste de Student

82

4.3.2. Determinação da DL50 dos isolados de B. bassiana sobre D. speciosa

O isolado CNPSo-Bb59 foi o isolado que apresentou menor número de

conídios necessários para matar 50% dos 7.300 nídios), co ase

nos resultados de mortalidade confirmada (c

para matar 50 % dos insetos testados confirma a baixa suscetibilidade de D.

fu B. bassia mparada L50 de izium flavoviride

(8.900 conídios) para adultos do gafanhoto Schistocerca gregaria Forskål

c ae) 1993) e com a DL50 solado CNP -Ma

ios) para adultos de Alphitobius diaperinus

anzer) (Coleoptera: Tenebrionidae) (Chernaki-Leffer 2004).

Não foi possível comparar a suscetibilidade de D. speciosa com outros

os B. bassiana e M. anisopliae.

Por motivo semelhante, não foi possível os res ados obtid com

estudos que avaliaram a suscetibilidade de eciosa a outros isolados de

o al. 2003, Silva-Werneck e 5). Ca altar que uns

trabalhos utilizam erro inação de dose letal (DL50) para valores

realizado por Lawrence &

Khan (2002), no qual obs ue 1,05 X 107 conídios/mL são necessários

0 % e ad ruch

insetos foram mergulhados em suspensões de fungos, e 6 conídios/mL são necessárias para matar 50 %

entes e oferecidas aos insetos. Da

a denominação

90 para concentrações patogênicas de M. anisopliae (3,5 x 10 conídios/mL) a

insetos (69

om sinais do patógeno) referentes ao

co m b

sétimo dia de avaliação (Tabela 5). O elevado número de conídios necessários

speciosa ao ngo na, co com a D Metarh

(Orthoptera: A ridid (Bateman et al. do i So

356 de M. anisopliae (129.794 coníd

(P

insetos, pelo fato que os artigos consultados (Magalhães 1988, Fernandes et al.

1989, Luz et al. 1998, Tamai 2002) utilizam o cálculo da CL50 (concentração letal)

para avaliar a suscetibilidade dos insetos aos fung

comparar

D. sp

ult os

fungos (Cons lo et t al. 199 be ress alg

neamente a denom

de concentração letal (CL50). Como exemplo, o estudo

ervaram q

para matar 5 d ultos de Callosob us maculatus (Fabricius) (Coleoptera:

Bruchidae) quando os

que concentrações de 7,31 X 10

dos insetos quando foram aplicadas sobre sem

mesma maneira, Monteiro et al. (1998) utilizaram erroneamente 5 DL

larvas de Rhipicephalus sanguineus Latreille (Acari: Ixodidae).

83

Tabela 4. DL50 de Beauveria bassiana sobre adultos de Diabrotica speciosa

expostos a diferentes doses de conídios, com base na mortalidade total (com e

(± DP)

sem sinais do patógeno) 7 dias após inoculação.

Isolado n DL50 (IC95%) Coef. Ang. χ2 g.l.

CNPSo-Bb59 586 67.635

(32.2180,8 ± 0,5 21,1

– 122.090) n.s. 15

CNPSo-Bb61 673 89.492

( 360 – 166.2 0,5 n.s. 1

39. 20) 0,7 ± 28,4 2

CNPSo-Bb467 585 110.470 1,1 ± 0,6 10,5 n.s. 15 (80.711 – 147.160)

n.: número de insetos/tratamento; n.s.: não significativo

de Beauveria bassiana sobre adultos de Diabrotica speciosa

xpostos a diferentes doses de conídios, com base na mortalidade confirmada

om sinais do patógeno) 7 dias após inoculação.

(± DP)

Tabela 5. DL50

e

(c

Isolado n DL50 (IC95%) Coef. Ang. χ2 g.l.

CNPSo-Bb59 559 0

(454.497 – 1.210.700) ± 0,4 n.s.697.30 0,5 16,9 17

CNPSo-Bb61 467 569.510

(380.910 - 938.770) 0,7 ± 0,4 17,4 n.s. 14

CNPSo-Bb467 501 1.143.300

(620.960 - 302.210) 0,6 ± 0,5 16,5 n.s. 15

n.: número de insetos/tratamento

n.s.: não significativo

4.3.3. Determinação da DL

a o ins ida fipro l o valor da 5 foi ajustado de 1,426 ng para 1,5 ng

i.a./inseto (Tabela 6). Segundo Scharf & Siegfried (1999), fipronil foi tóxico em

5 dos inseticidas sobre D. speciosa

Par etic ni DL

84

baixas dosagens (DL50 = 0,6 ng i.a./inseto) para adultos de D. v. virgifera, em

tratamento tópico.

O valor da DL5 do inseticida imidacloprid é a dose em aplicação tópica que

ausou 4,5 % de mortalidade dos insetos (0,000061 ng i.a./inseto) (Tabela 7).

ão.

Doses N ng i.a./inseto Coef. Ang. χ2

c

Tabela 6. Doses (ng i.a./inseto) de fipronil sobre adultos de Diabrotica speciosa

após 96 horas de avaliaç

(± DP)

DL5 90 1,426 5,5 ± 1,3 2,4 n.s.

DL 90 8,341 5,5 ± 1,3 2,4 n.s.50

DL 90 33,024 5,5 ± 1,3 2,4 90n.s.

n.: número de insetos testados

n.s.: não significativo

Tabela 7. Doses (ng i.a./inseto) de imidacloprid sobre adultos de Diabrotica

speciosa após 96 horas de avaliação.

total

Doses n vivos (a) Mortos (b)

vivos (c)

mortos (d)

% mortalidade

(e)

0,000061 20 14 6 123 6 4,6

0,00018 20 12 8 109 14 11,3

0,00054 19 18 1 97 15 13,4

0,0016 20 18 2 79 17 17,7

0,0049 21 13 8 61 25 29,1

0,0148 21 15 6 48 31 39,2

0,0156 10 6 4 33 35 51,5

0,0312 21 10 11 27 46 63,0

0,044 19 8 11 17 57 77,0

0,062 21 9 12 9 69 88,5

0,125 21 0 21 0 90 100,0

85

Com base nesses resultados, observa-se que imidacloprid é mais tóxico a

D. speciosa comparado com fipronil, visto que uma quantidade menor de produto

é necessária para matar o mesmo número de insetos inoculados com fipronil.

4.3.4.1

os fungos. Porém, essa

diferen

de Heterotermes

tenuis

4.3.4. Efeito de B. bassiana em mistura com inseticidas na infecção de D.

speciosa e C. arcuata

. Infecção de D. speciosa e C. arcuata após aplicação de B. bassiana

em mistura com inseticidas em laboratório

A mortalidade total (com e sem sinais de patógeno) de adultos de D.

speciosa que receberam o tratamento de fipronil em mistura com os fungos não

difere (p < 0,05) dos valores de mortalidade total daqueles insetos que receberam

aplicação somente com o tratamento de inseticida fipronil (Fig. 3). Em

contrapartida, a mortalidade total dos insetos que receberam aplicação com

imidacloprid em mistura com os fungos foi maior comparada com a mortalidade

total dos insetos que receberam aplicação somente com

ça não foi significativa (p < 0,05). Através desses resultados, observamos

que os fungos em mistura com os inseticidas não apresentaram efeito aditivo, nem

mesmo sinérgico no controle de D. speciosa. Nota-se que o inseticida fipronil

provocou mortalidade elevada em comparação com o inseticida imidacloprid,

concordando com os resultados obtidos por Moino Jr. & Alves (1998), os quais

observaram que o inseticida fipronil causou mortalidade precoce

(Hagen).

Quintela & McCoy (1997), no entanto, observaram efeito sinérgico entre M.

anisopliae e imidacloprid para o controle de Diaprepes abbreviatus (Linnaeus)

(Coleoptera: Curculionidae) quando aplicados via oral ou através de contato.

Porém, quando doses maiores de imidacloprid foram utilizadas, a conidiogênese

sobre o inseto diminuiu. Quintela & McCoy (1998a) obtiveram aumento sinérgico

da mortalidade de larvas de D. abbreviatus (L.) quando incorporaram ao solo

86

misturas de imidacloprid com os fungos B. bassiana e M. anisopliae, comparando

com os valores de mortalidade obtidos quando aplicaram somente os fungos ou o

inseticida.

Os baixos índices de mortalidade de D. speciosa tratadas com fungos em

mistura com os inseticidas deve-se, em parte, à baixa suscetibilidade desses

insetos aos fungos utilizados, como foi verificado nos testes de patogenicidade do

item 4.3.1., ou pela falta de efeito aditivo ou sinérgico entre esses agentes de

controle.

Moino Jr. & Alves (1998) verificaram que imidacloprid provoca alteração no

comportamento de limpeza de Heterotermes tenuis (Hagen) (Isoptera:

Rhinotermitidae), permitindo que um maior número de conídios fique aderido ao

tegumento dos insetos. Esse comportamento não foi observado para o inseticida

fipronil. Essa diferença pode estar relacionada com o modo de ação dos dois

produt

peso molecular, interferem na

adesã

tagem de insetos com sinais do

os. Imidacloprid é um inseticida sistêmico do grupo das nitroguanidinas,

com ação de contato e ingestão, o qual atua como uma neurotoxina, ligando-se ao

receptor nicotínico da acetilcolina. Fipronil é um inseticida do grupo fenilpirazol,

que também atua sobre o sistema nervoso central, porém, como um inibidor

reversível do receptor GABA (ácido gama-aminobutírico).

Além da alteração no comportamento dos insetos causada pelos produtos

químicos, alguns estudos sugerem que os componentes inertes dos inseticidas,

como detergentes, solventes e proteínas com alto

o do conídio ao tegumento do inseto, neutralizando as interações

hidrofóbicas e dessa forma reduzem a adesão do conídio quando em suspensão

com inseticidas (Boucias et al. 1991, Quintela & McCoy 1998b).

Não foi observada inibição na germinação dos isolados de B. bassiana em

contato com o inseticida fipronil (Tabela 8) porém, foi observada uma pequena

inibição na germinação do isolado CNPSo-Bb61 quando colocado em contato com

o inseticida imidacloprid (Tabela 9), porém esse efeito não foi observado no peso

micelial desse isolado utilizando um método mais agressivo de contato (Tabela

10). Podemos afirmar que o inseticida imidacloprid não afetou a viabilidade do

isolado CNPSo-Bb61, visto que a maior porcen

87

patóge

de compatibilidade do fungo com o

seticida.

A metodologia proposta por Alves et al. (1998a) foi utilizada por Duarte et

) encontraram diferença na compatibilidade entre diferentes formulações

do inseticida betacyflutrin e B. bassiana. Porém, essa técnica não permite total

contato do fungo com o inseticida, uma vez que o produ ode precipitar

no meio de cultura (Sosa-Gómez, comun. pess.).

Portanto, existem outros métodos para avaliação da compatibilidade de

fungos e inseticidas, entre os quais a avaliação do crescimento do patógeno em

meio líquido contendo o produto a ser avaliado e a implantação de pedaços de

ssaltar que estudos in vitro expõem ao máximo o microrganismo à ação do

roduto, fato que não ocorre em condições de campo. Assim constatada a

ocuidade de um produto em laboratório, espera-se que o mesmo seja seletivo no

ampo. Por outro lado, a alta toxicidade de um produto in vitro nem sempre indica

sua elevada toxicidade em campo, mas sim a possibilidade da ocorrência de

anos dessa natureza (Moino Jr. & Alves 1998).

no, foi quando esse isolado foi aplicado em mistura com imidacloprid sobre

D. speciosa (Tabela 15), comparando com os valores de mortalidade confirmada

(com sinais do patógeno) dos isolados CNPSo-Bb59 e CNPSo-Bb467 em mistura

com imidacloprid. De modo geral, imidacloprid não teve efeito fungitóxico sobre o

fungo B. bassiana, concordando com os resultados obtidos por Neves et al. 2001,

Cavalcanti et al. 2002, Loureiro et al. 2002, Tamai et al. 2002. A maior parte

desses estudos utiliza a metodologia sugerida por Alves et al. (1998a) para

padronização dos testes de compatibilidade entre fungos e inseticidas. Esse

sistema baseia-se na adição do produto químico ao meio de cultura ainda não

solidificado e posterior inoculação do fungo ao meio de cultura sólido. Os valores

médios de porcentagem de conidiogênese e crescimento vegetativo das colônias

dos fungos são utilizados para calcular o índice

in

al. (1992) para avaliar a compatibilidade de M. anisopliae com inseticidas, de

modo que esses autores sugerem que a formulação do produto pode afetar a

compatibilidade entre fungos e inseticidas. Utilizando o mesmo método, Tamai et

al. (2002

to utilizado p

papel impregnados com os produtos no meio de cultura (Alves et al. 1998a). Cabe

re

p

in

c

a

d

88

Para evitar que problemas de interpretação ocorram, mais de um método

pode ser utilizado para avaliar a compatibilidade entre fungos e produtos químicos,

como por exemplo o trabalho de Gardner & Kinard (1998), onde os autores

avaliaram a compatibilidade dos fungos B. bassiana e M. anisopliae com o

inseticida imidacloprid utilizando metodologias diferentes. No primeiro método,

adicionaram doses de imidacloprid ao meio de cultura (SDA) e após a solidificação

do meio inocularam suspensões dos isolados de fungos. A viabilidade dos

conídios germinados e não germinados foi avaliada após 24 horas. No segundo

método, os autores avaliaram o crescimento micelial inoculando suspensões de

conídios em meio líquido,

ºC. Os autores concluíram que não houve diferença na resposta dos fungos ao

seticida imidacloprid em ambos os métodos.

ram nebulizados sobre lâminas com meio de cultura batata-dextrose-

ágar (BDA) e sulfato de streptomicina após 4 horas de contato com o inseticida

fipronil.

co germinados (

deixando em agitação contínua durante sete dias a 27

in

Tabela 8. Germinação dos conídios de Beauveria bassiana após 24 horas. Os

conídios fo

Tratamentos nídios %) ± DP

CNPSo-Bb59 ± 4,13 a 96,9

CNPSo-Bb61 97,7 ± 2,25 a

CNPSo-Bb467 90,5 ± 5,46 a

CNPSo-Bb59 + fipronil 94,9 ± 4,04 a

CNPSo-Bb61 + fipronil 90,6 ± 3,70 a

CNPSo-Bb467 + fipronil 87,1 ± 5,92 a Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (P < 0,05)

89

Beauveria bassiana após 24 horas. Os

ídios foram o b â inas com meio de cultura batata-dextrose-

eptomicina após 4 horas de contato com o inseticida

Tratamentos conídios germinados (%) ± DP

Tabela 9. Germinação dos conídios de

con

ágar (BDA) e sulfato de str

imidacloprid.

nebulizad s so re l m

CNPSo-Bb59 98,2 ± 0,45 c

CNPSo-Bb61 98,4 ± 0,55 c

CNPSo-Bb467 88,8 ± 2,77 abc

CNPSo-Bb59 + imidacloprid 96,4 ± 1,95 bc

CNPSo-Bb61 + imidacloprid 83,7 ± 12,93 a

CNPSo-Bb467 + imidacloprid 87,6 ± 3,56 ab

Médias seguidas de mesma letra na coluna

Tabela 10. Peso micelial (g) de isolados de

cultura líquido batata-dextros

contínua.

não diferem significativamente entre si pelo teste de Kruskal-Wallis (p < 0,05)

B uv b sia em meio de

ap 10 as de agitação

CN -B NP -Bb

ea eria

a,

as

ós

na

die e sulfato de streptomicin

PSo b59 C So 61

Tra entos Média (g) ± DP Tratamentos Média (g) ± DP tamFungo 0, 0, a b u

Fungo + fipronil 0, 0, a F fipronil 0,15 ± 0,021 a

imidacloprid 0,21 ± 0,006 b Fungo + imidacloprid 0,16 ± 0,027 a

21 ±

22 ±

006

004

F

ungo +

ngo 0,14 ± 0,029 a

Fungo +Médias seguidas de mesma letra na coluna não dife

rem entre si pelo Teste de Tukey (p<0,05)

90

Tabela 11. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb59 e sua compatibilidade com fipronil durante 10 dias de avaliação em laboratório.

Mortalidade total

Dias Tratamentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10CNPSo-Bb59

1,1 ± 1,91

a

5,5 ± 3,88

a

7,7 ± 7,73

a

9,9 ± 8,86

a

14,3 ± 7,79

a

22,1 ± 8,62

a

37,4 ± 4,47

ab

41,9 ± 10,66

ab

50,6 ± 9,05

ab

59,5 ± 10,81

ab

Fipronil 16,2 ± 19,54

a

22,2 ± 13,65

a

29,2 ± 16,63

a

45,8 ± 9,74

b

51,7 ± 8,05

b

62,2 ± 13,87

a

64,6 ± 13,24 c

68,1 ± 11,08

ab

71,6 ± 9,80

ab

72,8 ± 9,31

ab

CNPSo-Bb59 + Fipronil 19,2 ± 12,39

a

25,9 ± 21,18

a

31,5 ± 22,37

a

36,1 ± 20,99

ab

40,7 ± 7,07

ab

47,6 ± 11,29

a

61,2 ± 11,04

bc

70,3 ± 14,19

b

74,8 ± 17,84

b

80,6 ± 16,03

b

Testemunha 2,3 ± 3,98

a

7,0 ± 6,89

a

8,2 ± 7,24

a

11,8 ± 5,00

a

18,9 ± 0,69

a

24,9 ± 10,47

a

33,2 ± 10,38

a

40,4 ± 6,60

a

44,0 ± 5,17

a

45,3 ± 4,36

a

Mortalidade confirmada

Dias Tratamentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10CNPSo-Bb59

0,00

ns

5

a

5

a

88

a a

0

a

1,1 ± 1,8

1,1 ± 1,8

2,2 ± 1,

4,3 ± 4,9

3 9,9 ± 3,3

20,9 ± 3,62

a

24,2 ± 2,19

b

28,6 ± 2,42

b

36,3 ± 6,35

b

Fipronil 0,00

ns

8

a

8

a

16

a

54

a

2

a

2,4 ± 2,0

4,7 ± 2,0

5,9 ± 4,

8,3 ± 5,

9,4 ± 4,2

9,4 ± 4,22

a

10,6 ± 6,29

a

10,6 ± 6,29

a

11,8 ± 5,59

a

CNPSo-Bb59 + Fipronil 3,40

ns

5

a

5

a

98

a

5

a

7

a

3,4 ± 3,4

3,4 ± 3,4

4,6 ± 3,

6,9 ± 5,9

9,2 ± 7,9

19,4 ± 8,14

a

25,1 ± 1,47

b

27,3 ± 3,86

b

33,1 ± 9,13

b

Testemunha 0,00

ns

5

a

5

a

45

a

91

a

6

a

3,5 ± 3,4

3,5 ± 3,4

3,5 ± 3,

5,9 ± 1,

8,3 ± 2,0

10,7 ± 0,40

a

13,1 ± 2,14

ab

14,3 ± 3,93

a

14,3 ± 3,93

a Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05)

ns: não significativo

91

Tabela 12. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb61 em compatibilidade com fipronil durante 10 dias de avaliação em laboratório.

Mortalidade total

Dias Tratamentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10CNPSo-Bb61

2,2 ± 3,85

ns

6

n a

1 3

a

4

a

6 6 7,6 ± 11,55 s

7,8 ± 10,72

1,2 ± 10,66

a

19,1 ± 15,68

a

9,2 ± 11,23 b

8,2 ± 12,86 b

2,7 ± 15,59

a

7,2 ± 13,56

a

0,7 ± 10,45

bc

Fipronil 1 2

n

3

a b

6,0 ± 19,66

ns

1,8 ± 13,93 s

0,0 ± 13,93

46,1 ± 9,28

51,8 ± 7,80

b

62,3 ± 13,73

b

64,6 ± 13,24

b

68,0 ± 11,30

a

71,3 ± 10,19

a

72,5 ± 9,80 c

CNPSo-Bb61 + Fipronil 2,3 ± 1,96

ns

8,1 ± 7,96

n a

4

s

10,3 ± 7,24

13,7 ± 8,94

a

21,7 ± 6,54

a

26,2 ± 10,39

a

33,2 ± 10,43

a

40,0 ± 13,01

a

43,4 ± 16,15

a

8,1 ± 10,75

ab

Testemunha 2,3 ± 3,98

ns

7,0 ± 6,90

n a a

4

s

8,2 ± 7,24

11,8 ± 4,99

18,9 ± 10,71

a

24,9 ± 10,47

a

33,2 ± 10,38

a

40,4 ± 6,61

a

4,0 ± 5,18

a

45,3 ± 4,37

a

Mortalidade confirmada

Dias Tratamentos 1 2 3 4 8 5 6 7 9 10CNPSo-Bb59

1,1 ± 1,92

ns

4,4 ± 7,68

a

5,5 ± 6,93

a

6,7 ± 8,84

a

7,8 ± 10,71

ns

15,6 ±10,10

a

21,2 ± 13,77

a

27,9 ±13,65

a

31,4 ± 13,61

a

32,5 ±12,37

b

Fipronil 1,1 ± 1,92

ns

2

a

,3 ± 2,00

4,6 ± 1,85

a

5,7 ± 3,75

a

8,0 ± 4,99

ns

9,1 ± 3,64

a

9,1 ± 3,64

a

10,2 ± 5,60

a

10,2 ± 5,60

a

11,4 ± 4,94

a

CNPSo-Bb59 + Fipronil 1,1 ± 1,99

ns

4,6 ± 5,23

a

4,6 ± 5,23

a

6,9 ± 3,35

a

10,3 ± 0,36

ns

14,9 ±3,62

a

17,2 ± 3,23

a

19,5 ± 4,92

a

21,7 ± 6,79

a

26,4 ± 1,32

ab

Testemunha 1,1 ± 1,99

ns

3

a

,5 ± 3,45

3,5 ± 3,45

a

3,5 ± 3,45

a

5,9 ± 1,92

ns

8,3 ± 2,06

a

10,7 ± 0,40

a

13,1 ± 2,14

a

14,3 ± 3,93

a

14,3 ± 3,93

ab Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05)

ns - não significativo

92

Tabela 13. lidade confirmada (% média ± DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb467 em compatibilidade com fipronil durante 10 dias de avaliação em laboratório.

Mortalidade total

Dias

Mortalidade total e morta

Tratam 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 entos

CNPSo-Bb467 0 ± 0,00

ns

6,5 ± 6,05

a

10,0 ± 6,00

a

17,6 ± 13,31

ab

21,2 ± 10,10

ab

31,0 ± 9,54

ab

43,3 ± 11,7

a

51,5 ± 4,66

ab

59,0 ± 7,91

ab

67,1 ± 6,83

b

0,

Fipronil 0 ± 19,66

ns

21,8 ± 13,92

a

29,8 ± 16,22

a

46,1 ± 9,25

b

51,8 ± 7,80

b

62,3 ± 13,72

b

64,6 ± 13,24

a

68,0 ± 11,30

b

71,3 ± 10,19

b

72,5 ± 9,80

b

16,

CNPSo-Bb467 + ± 11,55

ns

13,8 ± 14,25

a

16,0 ± 18,08

a

17,1 ± 19,97

ab

26,5 ± 17,53

ab

33,5 ± 17,12

ab

41,5 ± 19,00

a

49,8 ± 15,58

ab

55,8 ± 11,38

ab

62,0 ± 5,47

ab Fipronil

6,6

Testemunha 3 ± 3,98

ns

7,0 ± 6,90

a

8,2 ± 7,24

a

11,8 ± 4,99

a

18,9 ± 10,71

a

24,9 ± 10,47

a

33,2 ± 10,38

a

40,4 ± 6,61

a

44,0 ± 5,18

a

45,3 ± 4,37

a

2,

Mortalidade confirmada

Dias Trata 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mentos

CNPSo-Bb467 0,0 ± 0,00

ns

5,2 ± 6,15

a

5,2 ± 6,15

a

6,5 ± 6,05

a

10,2 ± 8,70

a

17,8 ±12,92

a

23,9 ± 14,15

a

31,2 ±14,59

a

37,4 ± 16,14

a

41,9 ±13,28

ns

Fipronil 1,1 ± 1,92

ns

2,3 ± 2,00

a

4,6 ± 1,85

a

5,7 ± 3,75

a

7,9 ± 5,00

a

9,10 ± 3,64

a

9,1 ± 3,64

a

10,2 ± 5,60

a

10,2 ± 5,60

a

11,4 ± 4,94

ns

CNPSo-Bb467 + Fipron0,0 ± 0,00

ns

1,3 ± 2,31

a

1,3 ± 2,31

a

1,3 ± 2,31

a

4,7 ± 5,03

a

6,9 ±8,72

a

11,5 ± 10,46

a

18,7 ±16,86

a

23,5 ± 20,00

a

28,4 ±23,53

ns il

Testemunha 1,1 ± 1,99

ns

3,5 ± 3,45

a

3,5 ± 3,45

a

3,5 ± 3,45

a

5,9 ± 1,92

a

8,3 ± 2,06

a

10,7 ± 0,40

a

13,1 ± 2,14

a

14,3 ± 3,93

a

14,3 ± 3,93

ns Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05) ns - não significativo

93

0

50

100

CNPSo-Bb59 ip il CNPSoFipr l

Te unh

méd

ia d

e m

orta

lidad

e (%

F ron -Bb59 +oni

stem a

)

% m ortaédia m lidade total% o m

a

a a

bc

a

média m rtalidade confir ada

ab a

ba

c

0

50

100

CNPSo-Bb61 Fipronil CNP Bb6nil

tem

alid

ade

(%

So-Fipro

1 + Tes unha

méd

ia d

e m

ort

)

a

a

ab

a a

b

a

a

0

50

100

CN -Bb467 ipronil CNPSo-Bb467 +Fip

Testemunha

méd

ia d

e m

orta

lidad

e (%

PSo Fronil

)

aaa

aa a a

a

2. Mortali e éd (% e Diabrotica speciosa nos tratamentos com

em mistura com fipronil, 7 dias após inoculação. Médias

Figura

Beauveria bassiana

seguidas de mesma letra nas barras de mesma cor, não diferem

significativamente entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).

dad m ia ) d

94

Tabela 14. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb59 em compatibilidade com imidacloprid durante 10 dias de avaliação em laboratório.

Mortalidade total

Dias Tratamentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10CNPSo-Bb59

1,1 ± 1,91

a

5,

a

,7

a

,0

a

3

a

2,

a

3

ab ab

5 ± 3,90

7 ± 7,73

10 ± 8,86

14, ± 7,77

2 1 ± 8,62

7,4 ± 4,45

41,9 ± 10,62

ab

50,6 ± 9,07

59,5 ± 10,81

b

Imidacloprid 2,5 ± 2,14

a

2,

a

,7

a

3

a

8

a

,

a a a

5 ± 2,14

4 ± 2,06

7, ± 4,10

9, ± 6,10

15 5 ± 2,30

20,4 ± 3,32

23,9 ± 2,79

a

28,7 ± 2,05

28,7 ± 2,05

a

CNPSo-Bb59 + Imidacloprid 0,0 ± 0,00

a

0,

a

,2 ± 9,4

a

10,6

a

6 ± 7,

a

25,

a b

0 ± 0,00

7 7 ± 9,51

15, 52 9 ± 8,47

43,6 ± 6,08

48,3 ± 7,71

b

59,0 ± 14,14

b

60,1 ± 12,94

b

Testemunha 2,3 ± 3,98

a

7,

a

,1

a

,8

a

,9

a

,9

a

3

ab

0 ± 6,90

8 7 ± 7,24

11 ± 4,99

18 ± 10,71

24 ± 10,47

3 ,2 ± 10,41

40,4 ± 6,61

ab

44,0 ± 5,18

ab

45,3 ± 4,37

ab

Dias Mortalidade confirmada

Tratamentos 1 2 3 6 7 4 5 8 9 10CNPSo-Bb59

0,0 ± 0,

00

ns

1,1 ± 1,85

a

5

a

1,1 ± 1,8

2,2 ± 1,89

ns

4,3 ± 4,93

a

9,9 ± 3,30

a

20,9 ± 3,65

ns

24,2 ± 2,19

b

28,6 ± 2,42

b

36,3 ± 6,35

b

Imidacloprid 1,2 ± 2

,0

ns

08

a

8

a

6 1,2 ± 2,

1,2 ± 2,0

2,5 ± 2,14

ns

2,5 ± 2,14

a

5,9 ± 1,80

a

7,2 ± 0,51

ns

7,2 ± 0,50

a

9,53 ± 2,24

a

9,5 ± 2,24

a

CNPSo-Bb59 + Imidacloprid 0,0 ± 0

,0

ns

00

a

2,4 ± 2,08

a ns

0 0,0 ± 0,

2,4 ± 2,06

3,6 ± 3,55

a

11,8 ± 4,27

a

23,5 ± 1,86

ns

25,9 ± 3,90

b

31,8 ± 3,61

b

32,9 ± 3,80

b

Testemunha 1,1 ± 1

,9

ns

45

a

5

a

19 3,5 ± 3,

3,5 ± 3,4

3,5 ± 3,45

ns

5,9 ± 1,91

a

8,3 ± 2,06

a

0,7 ± 0,38

ns

13,1 ± 2,14

a

14,3 ± 3,93

a

14,3 ± 3,93

a Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05) ns - não significativo

95

Tabela 15. Mortalidade total e mortalidade confirmada (% média ± DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb61 em compatibilidade com imidacloprid durante 10 dias de avaliação em laboratório.

Mortalidade total

Dias Tratamentos 1 3 4 5 8 9 2 6 7 10CNPSo-Bb61

17,9 ± 4,69

a

31,9±11,7

9

a a

ab

72,7±5,72 c

37,5±13,3

a

3 48,8±11,2

5 61,5±5,24

b

80,7±3,36

b

88,7±5,25

b

89,9 ± 5,75

b

93,4 ± 3,17

b

Imidacloprid 0

8

a

10

a

0

ab

5

ab

624,1±19,27

a

30,9±25,0

38,8±20,1

a

46,6± 14,

47,8±12,7

50,1±10,4

58,0±6,99

a

64,8±9,61

a

6,0 ± 11,57

a

68,2 ± 12,83

ab

CNPSo-Bb61 + Imidacloprid 23,4±11,91

a

38,7±17,0

9

0

a

42

a

5

b

c

44,3±13,7

a

61,4±15,

69,3±10,6

79,8±10,91

87,5±6,36

b

92,2±8,06

b

93,4 ± 8,43

b

95,5 ± 4,90

b

Testemunha 15,0 ± 4,09

a

17,3±0,60

2 10,11

a

5

a

37,9±6,43

a

a a a

8,6± 34,4±8,4

37,9±6,43

45,8±8,79

48,1±11,57

a

49,3 ± 9,67

a

58,3 ± 17,10

a

Mortalidade confirmada

Dias T 1 2 3 8 ratamentos 4 5 6 7 9 10CNPSo-Bb61

5,8

a

,

a

16

ab

9

5

b

5

b

± 2,12

13 4 ± 3,16

,7 ± 4,59

21,3 ± 4,24

ns

32,9 ± 6,7

b

40,9 ± 9,7

b

45,4 ± 8,84

53,3 ±12,0

b

54,6 ± 14,12

58,0 ±13,91

b

Imidacloprid 3,

a

,6

a

5

a

a

1

a

4 ± 3,4

4 ± 5,25

,7 ± 4,01

6,8 ± 3,45

ns

6,8 ± 3,45

a

6,8 ± 3,45

7,9 ± 3,90

a

11,4 ± 2,1

a

11,4 ± 2,11

12,5 ± 4,07

a

CNPSo-Bb61 + Imidacloprid 9,

a

,

a

9

b

1

0

b

9

b

7 5 ± 7,9

22 5 ± 13,7

2 ,3 ± 13,28

36,1 ± 11,26

ns

45,3 ± 12,13

55,9 ±19,3

b b

63,6 ± 13,2

68,2 ± 11,

69,4 ± 13,9

b

71,6 ±13,31

b

Testemunha 2,

a

,3

a

3,

a

3 ± 2,0

2 ± 2,02

43 ± 0,15

4,6 ± 1,99

ns

5,8 ± 2,14

a

5,7 ± 2,14

a

9,1 ± 3,64

a

9,1 ± 3,64

a

9,1 ± 3,64

a

10,2 ± 5,60

a Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05) ns - não significativo

96

Tabela lidade confirmada (% média ± DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com o isolado de Beauveria

bassiana CNPSo-Bb467 em compatibilidade com imidacloprid durante 10 dias de avaliação em laboratório.

Mortalidade total

Dias

16. Mortalidade total e morta

Tratam 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 entos

CNPSo-Bb467 ± 0,00

ns

3,2 ± 5,48

a

13,0 ± 8,81

ns

14,7 ± 11,36

a

14,7 ± 11,36

a

23,0 ± 12,09

a

36,0 ± 10,00

a

49,1 ± 17,78

ab

62,3 ± 9,53

b

66,7 ± 7,22

b

0,00

Imidacloprid ± 4,42

ns

9,6 ± 4,55

a

15,4 ± 2,85

ns

20,3 ± 6,70

a

26,3 ± 9,05

a

32,2 ± 9,10

a

35,7 ± 11,35

a

40,2 ± 6,88

ab

44,8 ± 9,64

ab

49,5 ± 5,68

ab

6,0

CNPSo-Bb467 + Im± 3,34

ns

8,0 ± 3,73

a

17,3 ± 2,59

ns

24,5 ± 4,58

a

30,3 ± 3,35

a

36,4 ± 10,83

a

51,6 ± 13,51

a

63,2 ± 14,30

b

66,6 ± 15,02

b

74,6 ± 14,8

b idacloprid

3,4

Testemunha ± 0,00

ns

4,5 ± 1,88

a

7,9 ± 1,80

ns

11,4 ± 5,03

a

12,6 ± 5,22

a

18,2 ± 7,19

a

21,8 ± 11,13

a

24,0 ± 9,68

a

26,3 ± 8,35

a

37,8 ± 11,69

a

0,0

Mortalidade confirmada

Dias Tratam 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 entos

CNPSo-Bb467 0 ± 0,00

ns

1,6 ± 2,75

ns

4,6 ± 0,87

a

6,3 ± 3,69

a

6,3 ± 3,69

a

11,6 ± 5,97

a

20,1 ± 5,42

b

30,2 ±18,17

a

41,7 ± 17,48

b

41,9 ±17,48

ns

0,

Imidacloprid 7 ± 6,41

ns

3,7 ± 6,41

ns

6,0 ± 4,42

a

9,7 ± 6,93

a

13,3 ± 6,15

a

14,3 ± 4,42

a

15,6 ± 5,08

ab

15,6 ± 5,08

a

18,9 ± 3,07

ab

20,0 ± 1,94

ns

3,

CNPSo-Bb467 + Imidaclo2 ± 3,85

ns

2,2 ± 3,85

ns

8,0 ± 4,89

a

8,0 ± 4,89

a

11,5 ± 4,76

a

12,7 ± 3,49

a

25,6 ± 2,17

b

30,2 ±6,71

a

31,3 ± 8,73

ab

35,9 ±19,87

ns prid

2,

Testemunha 0 ± 0,00

ns

1,1 ± 1,92

ns

3,4 ± 3,35

a

5,7 ± 1,79

a

5,7 ± 1,79

a

9,0 ± 1,67

a

9,03 ± 1,67

a

10,1 ± 3,10

a

10,1 ± 3,10

a

11,3 ± 1,75

ns

0,

Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05) ns - não significativo

97

0

50

100

CNPSo-Bb59 Imidacloprid CNPSo-Bb59 + Testemunha

méd

ia d

e m

orta

lidad

e (%

)

Imidacloprid

% média mortalidade total% média mortalidade confirmada

abb

ab

a

0

50

100

CNPSo-Bb61 Imidacloprid CNPSo-Bb61 +Imidacloprid

Testemunha

méd

ia d

e m

orta

lidad

e (%

) b

a

b

bb

aa

a

0CNPSo-Bb467 Imidacloprid CNPSo-Bb467 +

ImidaclopridTestemunha

50

100

méd

ia d

e m

orta

lidad

e (%

)

aa

a ab b a

ab

id 7 dias de avaliação.

édias seguidas de mesma letra nas barras de mesma cor, não diferem

ignificativamente entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).

Figura 3. Mortalidade média (%) de Diabrotica speciosa em tratamentos de

Beauveria bassiana em compatibilidade com imidaclopr

M

s

98

Em comp çã com os esultados de ort a D. speciosa, nos

ausou efeito sinérgico na mortalidade

C. arcuata abela 7). m alidade total D pe sa

% alor que não re n tiv ente do valor

causada pela aplicação do fungo em

tura com inseticida 68 %, e o valor da morta ade nd om te o fungo foi

ara o r m alid de

tratamentos com o isolado CNPSo-Bb61

observamos que esses mesmo tratamento c

de

inoculação do tratamento foi

de mortalidade causada pela aplicação somente com o fungo (80 %) (Fig. 4).

Entretanto, a mortalidade total de

mis

aplicado, 11 % (Fig. 5).

em mistura com imidacloprid,

(T 1 A

87

ort

, v

de

dife

. s

sig

cio

ifica

, 7 dias após a

am

C. arcuata

foi lid o e s en

0

50

100

NP b61 loprid CNPSo-Bb61+Imid id

Testemunha

% m

é

C So-B Imidacaclopr

dia

de m

orta

lidad

e total

ac adaumul

aa

a

a

b

aa

a a ua no ra en com o

Beauveria bas ana CNPSo-Bb61, imidacloprid, CNPSo-Bb61 +

de avaliação em laboratório. Médias

Figura 4. Mortalidade média (%) de

isolado de

imidacloprid, e testemunha aos 7 dias

seguidas de mesma letra nas barras de mesma cor, não diferem

significativamente entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).

si

Cerotom rc ta s t tam tos

99

Ta e mo édia do

ba mpati urant

bela 17. Mortalidade total

ssiana CNPSo-Bb61 em co

rtalidade confirmada (% m

bilidade com imidacloprid d

Mor

± DP) de Cerotoma arcuata em tratamentos com o isola

e 10 dias de avaliação em laboratório.

talidade total

Dias

de Beauveria

Tratamentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10CN

3,85

s

2PSo-Bb61

2,2 ±

n

2,2 ± 3,85

a

4,4±3,8

ns

4,4±

a

3,85

6,7±0,0

ns

6,7±0,0

a

11,1±3,8

a

13,3±0,0

a

20,0±6,7

a

4,4±10,2

a

Imi3,59

s

a

3dacloprid

9,2 ±

n

15,0±10,4

a

15,0±10,4

ns

15,0±10,4 15,0±10,4

ns

17,2±8,3

a

23,8±11,2

a

23,8±11,2

a

30,5±17,7

a

2,7±18,7

a

CNs

13,4

b

7PSo-Bb61 + imidacloprid

33,8 ± 22,7

n

54,4±17,1

a

54,4±17,1

ns

59,0± 63,5±8,6

ns

65,7±8,1

b

68,1±4,7

b

68,1±4,7

b

70,5±3,43

b

0,5±3,43

b

Tes2,88

s

7,7

a temunha

1,7 ±

n

3,1±2,7

a

3,1±2,7

ns

6,4± 6,4±7,7

ns

6,4±7,7

a

6,4±7,7

a

6,4±7,7

a

6,4±7,7

a

6,4±7,7

a

dadeMortali confirmada

Dias Tratamentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CN

± 0,0

ns

±3,8

ns

22,2±1

ns PSo-Bb61

0,0 0,0 ± 0,0

ns

2,2±3,8

ns

2,2 4,4±3,8

ns

4,4±3,8

ns

8,9±7,7

a

11,1±3,8

ab

17,8±10,2

a

3,9

Imi ± 0,0

ns

± 0,0

ns

13,3±1

ns dacloprid

0,0 0,0 ± 0,0

ns

0,0 ± 0,0

ns

0,0 0,0 ± 0,0

ns

0,0 ± 0,0

ns

4,4±7,7

a

4,4±7,7

ab

11,1±13,9

a

3,3

CN8±8,2

ns

8±7,4

ns

27,6±1

ns PSo-Bb61 + Imidacloprid

4, 9,2±4,4

ns

9,2±4,4

ns

13, 18,2±10,4

ns

20,5±13,4

ns

22,9±14,2

a

22,9±14,2

b

27,6±18,8

a

8,8

Tes ± 0,0

ns

± 0,0

ns

0,0 ±

ns temunha

0,0 0,0 ± 0,0

ns

0,0 ± 0,0

ns

0,0 0,0 ± 0,0

ns

0,0 ± 0,0

ns

0,0 ± 0,0

ns

0,0 ± 0,0

ns

0,0 ± 0,0

ns

0,0

Mé não d (p < 0

dias seguidas de mesma letra na coluna ns - não significativo

iferem entre si pelo teste de Tukey ,05)

100

4.3.4.2. Infecção de D. speciosa após aplicação de B. bassiana em mistura com inseticidas em casa de vegetação

com fipronil, causando 65 % de mortalidade

etos foram liberados

o interior das gaiolas que continham essas plantas. Dessa maneira, o contato do

seto com o fungo foi menor em casa de vegetação quando comparado com

laboratório. Assim é possível que a

Com base nos resultados de mortalidade total obtidos em casa de

vegetação (Tabela 18), pode-se observar que os maiores valores de mortalidade

de D. speciosa foram ocasionados pela aplicação do inseticida fipronil, tanto nos

ensaios onde os fungos foram aplicados em misturas com fipronil quanto nos

ensaios onde apenas o inseticida foi aplicado. Em todos os ensaios onde o

inseticida fipronil foi aplicado, a mortalidade de D. speciosa 10 dias após

aplicação, foi de 100%, e já no quarto dia após a aplicação somente com o

inseticida fipronil, a mortalidade chegou a 72 %. Esses resultados comprovam a

eficiência do inseticida fipronil no controle de D. speciosa, como já observado nos

três ensaios realizados em laboratório

10 dias após aplicação (Tabelas 11, 12 e 13). Ao contrário, pode-se observar que

os valores de mortalidade de D. speciosa em casa de vegetação, onde somente o

inseticida imidacloprid foi aplicado, foram superiores a 50 % somente 8 dias após

aplicação (Tabela 18).

A baixa mortalidade causada pelos isolados de Beauveria bassiana em

casa de vegetação, 32 % e 12 % respectivamente para os isolados CNPSo-Bb59

e CNPSo-Bb61, pode ter ocorrido devido a uma variedade de efeitos limitantes ao

desenvolvimento do fungo, entre os quais e mais provável a baixa umidade

relativa do ar. A umidade relativa dentro da casa de vegetação durante a

realização do ensaio foi de 54 %, e esta pode ter afetado a germinação dos

conídios.

O modo de aplicação também pode ter interferido nos resultados de

mortalidade causada pelos fungos. Em laboratório, os insetos receberam

aplicação tópica, enquanto que em casa de vegetação os tratamentos foram

pulverizados sobre vasos com plantas de soja e depois os ins

n

in

contato do inseto com o fungo em

101

taminação p fu e ca de ge

dade confirmada terem sido reduzidos,

laboratório, os maiores valores de

ade con ma o erv os m sa e ge ão ocorreram após

. Em laboratório,

dade confirmada nos tratamentos com

e 1 2 3 Esses resultados

co m çã do ins s m ng n tra mentos apenas com

rio a em as e ge ão. Esses resultados

ora r s s a r ados em laboratório e em casa de

ão v os alo s rta de do ins s nos tratamentos

nha, on as an n re er tr m o fu s e inseticidas.

dade na testemunha, é utilizar insetos

olvimento iol co lve et 19 b) or , o ins s utilizados em

l ra io m m as de getação foram

os em c d o ld m t sse inseto em

s io possuem hábitos subterrâneos, e a sua

de serem reproduzidas em condições

et al. 2000). Segundo Jackson (1986), o sucesso da criação de

sp. em laboratório não se deve

con

tarsal com os conídios depositados sobre a superfície das folhas.

Apesar de os valores de mortali

comparados com os resultados obtidos em

mortalid

aplicação do isolado CNPSo-Bb61 em mistura

na aplicação somente do inseticida fipronil

também observa-se índices de mortali

aplicação somente do inseticida fipronil (T

revelam

inseticidas, tanto em labor

também sugerem um possível efeito

favorecendo a infecção com o fungo.

F

vegetaç

testemu

Um dos aspectos que devem ser cons

patógenos, de modo a reduzir a mortali

sadios, criados em laboratório,

desenv

todos os ensaios, tanto em

coletad

laboratório. As larvas de

criação em laboratório é difícil porque

desenvolve nem sempre são passíveis

controladas (Ávila

Diabrotica

utilizados, mas sim à experiência de manipulação da criação.

elo ngo m sa ve tação tenha ocorrido através do contato

fir da bs ad e ca d ve taç

com o inseticida fipronil (16,5 %) e

(14,3 %) (Tabela 19)

ab

fu

las

os

1, 1

os

e 1

ta

).

nta

m o

ele

ina o s eto co

ató qu nto c

estressante causado pelo inseticida

a d ve taç

bse

ad

vado

v

no

re

ens

de

ios

mo

ealiz

lida s eto

de pl tas ão ceb am

iderados para bioensaios envolvendo

ata ent de ngo

eto

ve

de

com a mesma idade, peso e fase de

b ógi (A s al. 98 . P ém s

abo

à

tór

icu

co

de

o e

a

c

anu

a

nçãampo, evid dif a d e o

D. pec sa

as condições em que o inseto se

apenas aos equipamentos e materiais

102

Tabela 18. Mortalidade total (com e sem sinais do patógeno) (média % ± DP) de Diabrotica speciosa em tratamentos com

isolados de Beauveria bassiana em mistura com inseticidas durante 10 dias de avaliação em casa de vegetação.

Dias Após a Inoculação Tratamentos 1 2 3 4 7 8 9 10 5 6

CNPSo-Bb59 3,6 ± 7,14

ns

5,

n

8,

n

10,

a

13,

ns

9,

n

20

n

24

n

29

n

31

n

3 ± 10,71 s

9 ± 17,86 s

2 ± 17,19 b

7 ± 24,28

1 1 ± 34,96 s

,3 ± 34,37 s

,6 ± 36,53 s

,3 ± 32,91 s

,7 ± 31,30 s

CNPSo-Bb61 0,0 ± 0,00

ns

0

n

0

n

0,

a

0,

ns

0,

n

3

n

6

n

9

n

1

n

,0 ± 0,00 s

,0 ± 0,00 s

0 ± 0,00

0 ± 0,00

0 ± 0,00 s

,4 ± 3,99 s

,8 ± 7,97 s

,4 ± 6,61 s

2,0 ± 8,90 s

Imidacloprid 1,0 ± 2,08

n

2

n

8,

a

19

ns

3,

n

49

n

63

n

69

n

79

n

0,0 ± 0,00

ns s

,0 ± 2,28 s

7 ± 8,37 b

,1 ± 8,05

3 0 ± 17,91 s

,4 ± 14,55 s

,9 ± 12,18 s

,9 ± 15,59 s

,8 ± 11,88 s

Fipronil 0,0 ± 0,00

ns

1

n

4

n

71,

c

85

ns

95

n

10

n

10

n

10

n

1

n

1,2 ± 9,38

4

s

,9 ± 10,88 s

6 ± 10,78

,7 ± 9,72

,4 ± 4,27 s

0,0 ± 0,00 s

0,0 ± 0,00 s

0,0 ± 0,00 s

00,0 ± 0,00 s

CNPSo-Bb59 + imidacloprid 0,0 ± 0,00

ns

2

n

7

n

14

a

23,

ns

4,

n

41

n

55

n

62

n

69

n

,5 ± 3,19 s

,8 ± 6,61 s

,8 ± 8,90 b

0 ± 12,21

3 2 ± 16,33 s

,2 ± 19,23 s

,5 ± 17,08 s

,1 ± 14,99 s

,6 ± 11,73 s

CNPSo-Bb61 + imidacloprid 0,0 ± 0,00

ns

0

n

1

n

5,

a

13,

ns

6,

n

54

n

61

n

65

n

72

n

,0 ± 0,00 s

,2 ± 2,38 s

2 ± 1,35

7 ± 11,10

2 6 ± 14,33 s

,3 ± 12,77 s

,8 ± 14,31 s

,5 ± 12,46 s

,2 ± 14,95 s

CNPSo-Bb59 + fipronil 3,1 ± 4,11

ns

7

n

0

ns

9

bc

2

ns

7,

ns

9

n

98

n

9

n

0

n

,9 ± 9,23

2

s

,5 ± 23,71

3 ,5 ± 24,56

6 ,4 ± 21,05

8 8 ± 11,88

2,6 ± 8,58 s

,1 ± 2,14 s

9,1 ± 1,78

1

s

0,0 ± 0,00 s

CNPSo-Bb61 + fipronil 0,0 ± 0,00

ns

0

n

4

n

7

c

1

ns n

9

n

9

n

9

n n

,0 ± 0,00 s

2,6 ± 13,19

6

s

,5 ± 23,02

8 ,0 ± 12,91

94,7 ± 3,64 s

7,6 ± 2,83 s

7,6 ± 2,83 s

9,0 ± 2,00

1

s

00,0 ± 0,00 s

Testemunha 0,0 ± 0,00

ns

0,

n

2

n

3,

a

18,

ns

8,

n

19

n

20

n

23

n

27

n

00 ± 0,00 s

,8 ± 3,67 s

8 ± 4,36

1 ± 22,09

1 1 ± 22,09 s

,0 ± 21,98 s

,0 ± 22,03 s

,7 ± 21,27 s

,6 ± 17,54 s

Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem Os dados foram transformados para √x+0,5

entr pelo teste Tukey (p<0,05)

s: dados não significativos pelo teste de Kruskal-Wallis

e si de

n

103

) (m cios atam

isolados de Beauveria bassiana

Tabela 19. Mortalidade confirmada (com sinais do patógeno édia % ± DP) de Diabrotica spe

em mistura com inseticidas durante 10 dias de avaliação em casa de vegetação.

Dias Após a Inoculação

a em tr entos com

Tratamentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CNPSo-Bb59 0,0 ± 0,00

ns

4 1,8 ± 3,57

ns

1,8 ± 3,57

ns

1,8 ± 3,57

ns

3,6 ± 7,14

ns

3,6 ± 7,14

ns

3,6 ± 7,14

ns

3,6 ±

n

7,14 s

3,6 ± 7,1

ns

3,6 ± 7,14

ns

CNPSo-Bb61 0,0 ± 0,00

ns ns

4

n

0,0 ± 0,00

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

1,5 ±

n

2,94 s

1,5 ± 2,9

ns

1,5 ± 2,94

s

Imidacloprid 0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

1 2,1 ±

n

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

1,0 ± 1,92

ns

1,0 ±

n

1,92 s

2,1 ± 2,5

ns

2,51

s

Fipronil 0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

2, 0 14,3 ±

n

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

5 ± 5,00

ns

2,5 ± 5,00

ns

2,5 ± 5,00

ns

2,5 ±

n

5,00 s

2,5 ± 5,0

ns

3,93

s

CNPSo-Bb59 + imidacloprid 0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

1, 5 4,5 ±

n

0,0 ± 0,00

ns

1,6 ± 3,33

ns

6 ± 3,33

ns

1,6 ± 3,33

ns

1,6 ± 3,33

ns

3,3 ±

n

3,85 s

4,5 ± 3,1

ns

3,15

s

CNPSo-Bb61 + imidacloprid 0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

2, 2 7,5 ±

n

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

3 ± 2,85

ns

4,0 ± 2,99

ns

6,6 ± 4,92

ns

6,6 ±

n

4,92 s

6,6 ± 4,9

ns

6,09

s

CNPSo-Bb59 + fipronil 1,8 ± 2,14

ns

1,8 ± 2,14

ns

6, 54 9,2 ±

n

6,3 ± 10,23

ns

6,3 ± 10,23

ns

3 ± 10,23

ns

9,2 ± 0,54

ns

9,2 ± 10,54

ns

9,2 ±

n

0,54 s

9,2 ± 10,

ns

0,54

s

CNPSo-Bb61 + fipronil 0,0 ± 0,00

ns

5,5 ±11,11

ns

14, 20 16,5±

n

14,7 ± 17,03

ns

14,7 ±17,03

ns

7 ± 17,03

ns

16,5±15,20

ns

16,5 ±15,20

ns

16,5±

n

15,20 s

16,5 ±15,

ns

15,20

s

Testemunha 0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0, 0 0,0 ±

n

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ± 0,00

ns

0,0 ±

n

0,00 s

0,0 ± 0,0

ns

0,00

s ns: dados não significativos pelo teste de Kruskal-Wallis

104

4.3.5. Consumo foliar de D. speciosa em trifólios de soja tratados com fungos e inseticidas

Foi observado, durante os ensaios realizados em casa de vegetação, que

os insetos se alimentaram mais das plantas de soja pulverizadas com o inseticida

fipronil do que daquelas com o inseticida imidacloprid. (Fig. 6).

Analisando os resultados dos ensaios realizados em laboratório, o consumo

e D. speciosa após 24 horas de contato com os trifólios de soja pulverizados com

o inseticida fipronil em mistura com o fungo CNPSo-Bb61 foi maior (3,6 cm2 de

área foliar consumida) (p < 0,05) em comparação com os tratamentos com

aplicação do inseticida imidacloprid em misturas com os fungos CNPSo-Bb59 e

CNPSo-Bb61 (0,5 cm2 e 0,6 cm2 respectivamente) (Tabela 20). Após 48 horas de

contato com os trifólios, as maiores áreas consumidas ocorreram em trifólios de

soja tratados com fungos, com o inseticida fipronil em mistura com o isolado

CNPSo-Bb61 e na testemunha.

As maiores mortalidades dos insetos ocorreram quando esses se

soja pulverizados com o inseticida fipronil (100 %) e

d

alimentaram de trifólios de

com o isolado CNPSo-Bb59 em mistura com o inseticida fipronil (93 %) (Tabela

21). Nos tratamentos onde somente os isolados de fungos foram pulverizados

sobre os trifólios de soja, a mortalidade dos insetos foi 16,7 % (CNPSo-Bb59) e

6,7 % (CNPSo-Bb61).

105

a b

c d

Figura 5. Consumo foliar de adu

(cultivar Paraná) pulverizadas com

com plantas sem tra

mparadas com pla

; (d) fu

comparadas

imidacloprid co

com plantas sem tratamento

ltos de Diabrotica speciosa em plantas

: (a) fungos em mistura com o inseticid

tamento; (b) fungos em mistura com o in

ntas sem tratamento; (c) inseticidas com

ngos comparadas com plantas sem trat

de soja

a fipronil

seticida

paradas

amento.

106

Tabela 20. Área foliar de soja consumida por 5 adultos de Diabrotica speciosa

após períodos de 24 e 48 horas, sob condições controladas de 26 ± 1oC, 60 % UR

e fotofase de 14 horas.

Tratamentos Consumo após 24 horas média ± DP (cm2)

Consumo após 48 horas média ± DP (cm2)

CNPSo-Bb59 2,5 ± 1,65 ab 3,1 ± 2,22 abcd CNPSo-Bb61 3,3 ± 2,03 ab 5,2 ± 3,09 cd Regent 800 WG 1,6 ± 0,47 ab 0,3 ± 0,50 a Provado 200 SC 0,6 ± 0,36 ab 1,8 ± 0,75 abc CNPSo-Bb59 + Regent 800 WG 1,2 ± 1,11 ab 0,5 ± 0,88 ab CNPSo-Bb59 + Provado 200 SC 0,5 ± 0,55 a 1,0 ± 0,93 ab

3,6 ± 2,24 b 6,9 ± 3,85 d CNPSo-Bb61 + Provado 200 SC 0,6 ± 0,36 a 1,2 ± 1,15 abc Testemunha 3,

CNPSo-Bb61 + Regent 800 WG

2 ± 2,10 ab 4,5 ± 2,80 bcd Médias transformadas √x. Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo Teste de Tukey p<0,05.

Tabela 21. Mortalidade média (%) de D. speciosa alimentada com trifólios de soja

pulverizados com inseticidas e fungos, sob condições controladas de 26 ± 1oC, 60

% UR e fotofase de 14 horas.

Mortalidade total (média % ± DP) Tratamentos 3 D.A.P 7 D.A.P. CNPSo-Bb59 16,7 ± 15,05 a 66,7 ± 27,32 a CNPSo-Bb61 6,7 ± 10,33 a 70,0 ± 32,86 a Provado 200 SC 36,7 ± 23,38 a 76,7 ± 15,05 a Regent 800 WG 100,0 ± 0,00 b 100,0 ± 0,00 b CNPSo-Bb59 + Provado 200 SC 13,3 ± 32,66 a 64,0 ± 32,98 a CNPSo-Bb59 + Regent 800 WG 93,3 ± 16,33 b 96,7 ± 8,16 b CNPSo-Bb61 + Provado 200 SC 13,3 ± 10,33 a 83,3 ± 15,05 a CNPSo-Bb61 + Regent 800 WG 3,3 ± 8,16 a 70,0 ± 35,21 a Testemunha 13,3 ± 10,33 a 66,7 ± 20,65 a Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Kruskal-Wallis D.A.P. - dias após pulverização

Esses resultados confirmam que o inseticida fipronil possui maior eficiência

de controle a D. speciosa, como já observado nos bioensaios realizados em

laboratório e em casa de vegetação. Todavia, esse inseticida não protege a planta

do ataque dos insetos adultos, visto que, de alguma maneira, interferiu na

107

alimentação (Fig. 6a). No entanto, os resultados obtidos com o isolado CNPSo-

b59 em mistura com o inseticida fipronil revelam que esse tratamento não

inte

necessidade de que novos experimentos sejam realizados para avaliar o

consum

utilizando iscas tratadas com inseticidas em mistura com um atrativo alimentar à

base d

com o atrativo alimentar, seguida pelas iscas tratadas com o inseticida fipronil em

mis ra

somen

nos tri imidacloprid. Mesmo não tendo

cau d

Ja

Bemisia argentifolli Bellow & Perring (Homoptera: Aleyrodidae) em plantas que

fora

de con

relação àqueles onde foi aplicado o inseticida imidacloprid. Moino Jr. & Alves

(19 )

comportamento dos insetos. A alteração no comportamento de limpeza de

He o

insetic

perma

compo

que o

com os conídios do fungo, quando aplicado em tratamento foliar (Pianoski et al.

990, Hajek et al. 1987).

Moore et al. (1992) observaram que o gafanhoto Schistocerca gregaria

eixa de se alimentar 24 horas depois de ter sido inoculado com altas dosagens

e Metarhizium flavoviride. Porém, esse efeito não foi observado em D. speciosa

uando os insetos foram tratados com os fungos B. bassiana e M. anisopliae.

B

rferiu na alimentação dos insetos. Esses resultados deixam evidente a

o. Parimi et al. (2003) avaliaram o consumo de Diabrotica virgifera virgifera

e curcubitacina. A maior área consumida pelos insetos foi em iscas tratadas

tu com o atrativo químico. O autor não realizou tratamentos com aplicações

te do inseticida fipronil.

O resultado que merece ser destacado é reduzida alimentação dos insetos

fólios de soja pulverizados com o inseticida

sa o mortalidade elevada, impediu que os insetos se alimentassem.

mes & Elzen (2001) observaram que imidacloprid inibiu a alimentação de

m pulverizadas com o inseticida imidacloprid, pois observaram melhores níveis

trole do inseto em tratamentos com aplicação foliar de B. bassiana em

98 também observaram que imidacloprid pode provocar alterações no

ter termes tenuis (Hagen) (Isoptera: Rhinotermitidae), provocada pelo

ida imidacloprid permitiu que uma maior quantidade de conídios

necesse sobre a cutícula dos insetos. Se imidacloprid provoca alterações no

rtamento dos insetos, irá reduzir os níveis de infecção do patógeno, visto

inseto com baixa mobilidade e alimentação reduzida terá menos contato

1

d

d

q

108

4.4. Conclusões

- Os isolados de B. bassiana avaliados foram mais virulentos à D. speciosa

em comparação aos isolados de M. anisopliae;

- C. arcuata foi menos suscetível aos isolados de B. bassiana em

comparação com D. speciosa;

cloprid não causaram efeito fungitóxico aos

isolados de B. bassiana;

na CNPSo-Bb61 em mistura com o inseticida

imidacloprid causou efeito sinérgico na mortalidade de adultos de C.

a imidacloprid, tanto em aplicação tópica sobre

o inseto como em aplicação foliar;

é importante quando se trata de pragas de importância econômica.

Por outro lado, se imidacloprid inibiu a alimentação dos insetos, estes

- O alto valor da DL50 de B. bassiana revela a baixa suscetibilidade de D.

speciosa aos isolados avaliados;

- Os inseticidas fipronil e imida

- A aplicação de fungos e inseticidas não causou efeito sinérgico, nem aditivo

na mortalidade de adultos de D. speciosa;

- O isolado de Beauveria bassia

arcuata;

- O inseticida fipronil foi mais eficiente no controle de D. speciosa em

comparação com o inseticid

- O inseticida imidacloprid inibiu a alimentação de D. speciosa em plantas de

soja;

- A rápida mortalidade dos insetos ocasionada pela aplicação do inseticida

fipronil

deixam de causar danos à planta, e dessa maneira esse inseticida pode ser

considerado uma forma de se obter sucesso no controle de adultos de D.

speciosa.

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89-96.

Considerações finais

Através dos resultados obtidos podemos concluir que os indivíduos de

Diabrotica speciosa agrupam-se de acordo com a região geográfica onde se

encontram. Embora nos agrupamentos de uma determinada região ocorra a

presença de indivíduos de outras regiões, indicando migração deste inseto.

Os inimigos naturais com maior prevalência sobre este inseto foram os

protozoários do gênero Gregarina e as moscas parasitóides do gênero Celatoria.

Com relação à presença de fungos entomopatogênicos sobre as folhas de soja, as

maiores densidades de Beauveria sp. foram constatadas durante os meses de

fevereiro e março, correspondendo às maiores porcentagens de adultos de D.

speciosa com sinais de infecção causada por esse patógeno.

Avaliando a capacidade de controle dos fungos entomopatogênicos pode-

se concluir que os isolados de Beauveria bassiana foram mais virulentos à este

inseto em relação aos isolados de Metarhizium anisopliae avaliados.

Embora a associação de isolados de B. bassiana e os inseticidas fipronil e

imidacloprid não tenham causado efeito sinérgico nem aditivo na mortalidade do

inseto, esses inseticidas não causaram efeito fungitóxico aos isolados. Porém, o

inseticida fipronil foi mais eficiente no controle de D. speciosa em comparação

com o inseticida imidacloprid, tanto em aplicação tópica sobre o inseto como em

aplicação foliar. A rápida mortalidade dos insetos ocasionada pela aplicação do

inseticida fipronil é importante quando se trata de pragas de importância

econômica. Por outro lado, o inseticida imidacloprid provocou inibição da

alimentação dos insetos, portanto não causaram danos às plantas, dessa maneira

esse inseticida pode ser considerado de interesse na redução do dano causado

pelos adultos de D. speciosa.