ElyaraHelderWendy

Diferenciação/Desenvolvimento de Th2

Abordagens...

STAT3

STATs e Diferenciação

Diferenciação e epigenética

STATs X Células T CD4+

Cytokine, 47: 149-156, 2009.

JAK/STATs X Células T CD4+

Arch Immunol Ther Exp, 55: 231-245, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.

STATs X Células T CD4+

Curr Opin Immunol, 21(2): 161-166, 2009.

STAT3 - EstruturaApresenta 6 domínios conservados

Interação proteína-proteína

Interação com DNA

Interação com PY

Atividade transcriciona

l

Arch Immunol Ther Exp, 55: 231-245, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.

STAT3 - Função

Proc Natl Acad Sci USA 94: 3801-3804, 1997.

Importância de STAT3 → camundongos stat3-/- → morte durante o desenvolvimento embrionário

STAT3 - Função

Clin Cancer Res, 13::5665-5669, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.

Ativado por diversas citocinas e fatores de crescimento

STAT3 - Função↑ expressão de genes com funções inibitórias (IL-10, TGF-β);

↓ expressão de genes com funções pro-inflamatórias (IFNs, IL-12, TNF, MHCII, CD80/86)

Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.

STAT3 - Tumor

Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Curr Opin Immunol, 20(2): 228-233, 2008.

STAT3 – Células T

Int Immunol, 10: 1747-1751, 1998; J Immunol, 161: 4652-4660, 1998. .

STAT3 → papel crítico em vários tecidos

Células T CD4+ stat3-/-

Nenhum déficit evidente no desenvolvimento

Timo e compartimentos periféricos normais

Reduzida proliferação dependente de IL-6 e IL-2

STAT3 – Diferenciação de células Th17

Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009; Curr Opin Immunol, 21(2): 161-166, 2009..

STAT3 – Doenças inflamatórias crônicas

Nat Med, 13: 711-718, 2007.

Uveite → grupo de doenças inflamatórias intraocular → envolvimento das células Th17

Modelo em camundongo:Células T reativas – Th17Doença inibida com anti-IL-17CD4stat3-/- - resistentes a uveite

STAT3 – Doenças inflamatórias crônicas Inflamação intestinal crônica → envolvimento das células Th17 e STAT3

STAT3 – Th2

ObjetivoDemonstrar função de STAT3 no padrão de resposta Th17 (modelo de colite)

e na expansão homeostática de TCD4+ naïve nos órgãos linfóides

Estabelecimento de modelo de colite, através da transferência de células TCD4+ naïve, para avaliar papel

do STAT3

Rag2-/-

Controle: Stat3fl/fl

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

TCD4+

Baço e linfonodosTCD4+ naïve

CD25-CD45RBhighiv

4.105

STAT3 foi, portanto, crítico para o desenvolvimento de colite (órgão específico), bem como para respostas inflamatórias sistêmicas.

9 weeks

Estabelecimento de modelo de colite, através da transferência de células TCD4+ naïve, para avaliar papel

do STAT3

Papel de STAT3 no diferenciação deTh17: responsável pela produção de IL-17?

Rag2-/-

Controle: Stat3fl/fl

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

TCD4+

naïveCD25-

CD45RBhigh

9 semanas Lâmina PrópriaLinfonodos MesentéricosBaço

FACS TCD4+ IL17+

STAT3 é necessário para a produção de IL-17A, mas não para IFN-γ, em células TCD4+, utilizado modelo de colite.

Papel de STAT3 na conversão de células TCD4+ naïve para Treg em modelo de colite

Concentração homeostática de Treg nos doadores de TCD4+

STAT3 tem pouco efeito sobre a expressão de Foxp3 em células TCD4+, na ausência de inflamação.

Controle: Stat3fl/fl

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

Lâmina PrópriaLinfonodos MesentéricosBaço

FACS TCD4+ Foxp3+

Papel de STAT3 na conversão de células TCD4+ naïve para Treg em modelo de colite

Concentração de Treg em ambiente inflamatório

STAT3 inibi a conversão de TCD4+ naïve para Treg Foxp3+, em ambiente inflamatório.

9 semanas Lâmina PrópriaLinfonodos MesentéricosBaço

FACS TCD4+ Foxp3+

Rag2-/-

Controle: Stat3fl/fl

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

TCD4+

naïveCD25-

CD45RBhigh

Rag2-/-

TCD4+ naïve CD25-CD45RBhigh

(Stat3-/-)Cd4 Cre; Stat3fl/fl

IL-17A + Foxp3 + Score Clínico

STAT3 regula então quais genes envolvidos na diferenciação de padrão Th17?

Controle: Stat3fl/fl

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

TCD4+

Baço e linfonodosTCD4+ naïve

CD4+CD44-CD62L+

anti-CD3, anti-CD28IL-6, TGF-β,

anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ

72h

IL-6

1h

ChIP-Seqanti-pSTAT3

anti-H3K4Me

STAT3 liga-se a mais de 3000 genesLiga-se a muitos genes associados

a diferenciação de Th17

Regulação gênica

Szalkowski A M , Schmid C D Brief Bioinform 2010;bib.bbq068

STAT3 regula então quais genes envolvidos na diferenciação de padrão Th17?

Controle: Stat3fl/fl

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

TCD4+

Baço e linfonodosTCD4+ naïve

CD4+CD44-CD62L+

anti-CD3, anti-CD28IL-6 e/ou TGF-β,

anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ

72h

IL-6

1h

MicroarrayPCR em Tempo Real

STAT3 regula positivamente modificações epigenéticas nos genes em que é alvo, aumentando sua expressão e, portanto contribui para estabilidade

do padrão Th17.

Expressão gênica

9 semanas • Lâmina Própria• Linfonodos Mesentéricos• Baço

Apesar da ausência de inflamação corroborar com pequeno infiltrado de

células no recipiente Rag2-/-, porque as células TCD4+ Stat3-/- não se acumulam

num recipiente linfopênico?

Ainda no modelo de inflamação sistêmica através de colite ...

FACS TCD4+

Rag2-/-

Controle: Stat3fl/fl

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

TCD4+

naïveCD25-

CD45RBhigh

9 semanas TCD4+ CD45.1TCD4+ Cd4 Cre; Stat3 fl/fl

• Lâmina Própria• Linfonodos Mesentéricos• Baço

FACS

Portanto, STAT3 tem papel importante na expansão de células T, num ambiente inflamatório.

Criando-se um ambiente inflamatório junto com a transferência de células TCD4+ Stat3-/-, estas acumular-se-

iam nos órgãos linfóides?

E como seria a expansão das células TCD4+ na ausência de inflamação?

2 semanas •Linfonodos Mesentéricos• Baço

A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- em acumular-se indica que STAT3 tenha papel na expansão de células T, anterior ao

estabelecimento da inflamação.

FACS TCD4+

Rag2-/- (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

TCD4+

naïveCD25-

CD45RBhigh

Controle: CD45.1

Qual seria a importância de STAT3 na expansão homeostática de células T?

Rag2-/-

Controle: CD45.1

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

Medula óssea

8 semanas • Timo• Linfonodos Mesentéricos• Baço

FACS células T

Rag2-/-

Controle: CD45.1

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

MO1:1

8 sem • Timo • Linfonodos• Baço

Qual seria a importância de STAT3 na expansão homeostática de células T?

TCD4+ CD45.1TCD4+ Cd4 Cre; Stat3 fl/fl

FACS

Portanto, STAT3 tem papel essencial na proliferação celular de TCD4+ não somente em ambientes patológicos, mas também a partir de células tronco.

Modelo reconstituição competitiva