IDENTIFICAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS
PRESENTES NA FRAÇÃO 0 DE ANTÍGENOS FRACIONADOS DE Paracoccidioides
brasiliensis
Viviane Cristina Fernandes
Universidade Federal de Minas GeraisInstituto de Ciências Biológicas
Departamento de Bioquímica e Imunologia
Laboratório de Imunologia Celular e Molecular
Orientador: Bernardo Sgarbi Reis
Co-orientador: Alfredo Miranda de Goes
A Paracoccidioidomicose
1908: Adolpho Lutz descrevia pela primeira vez no Brasil a paracoccidioidomicose em dois pacientes internados na Santa Casa de Misericórdia em São Paulo.
1971: A denominação paracoccidioidomicose foi consagrada após reunião de micólogos das Américas, em Medellin (Colômbia).
Adolpho Lutz (1855-1840)
Epidemiologia
América Latina:
~ 90 milhões de habitantes: 10 milhões com P.
brasiliensis Florestas Tropicais ou Subtropicais
Temperaturas médias entre 14-20°C
Precipitações pluviométricas entre 800 a 2.000 mm
Umidade relativamente alta
A doença é uma micose
sistêmica, prevalente na
América do Sul. O Brasil é
responsável por 80% dos
casos já reportados.
Distribuição regional heterogênea. Problema de saúde pública.
P. brasiliensis é um fungo assexuado, dimórfico, agente
etiológico da paracoccidioidomicose (PCM).
Habitat incerto: vida saprofítica em solo e detritos vegetais.
Paracoccidioides brasiliensis: o agente
etiológico
Patogenia
Inalação de Esporos (conídias)
Nos pulmões:
• transformação em leveduras e multiplicação
• alveolite com abundantes neutrófilos e, posteriormente, mononucleares e macrófagos, formando o complexo primário
• granuloma epitelióide
Focos latentes ou quiescentes
Involução espontânea do complexo primário
• Progressão das lesões primárias com sinais e
sintomas da doença
Forma Crônica da
PCM
Forma Aguda ou Subaguda da PCM
Idade
Sexo
Fatores genéticos
Diagnóstico da paracoccidioidomicose
Visualização direta do fungo em materiais patológicos.
Forma parasitária:
“roda de leme”
Diagnóstico sorológico ainda possui valor limitado.
Tratamento da paracoccidioidomicose
Principais drogas:
Anfotericina B,
Derivados de Imidazol,
Sulfonamidas.
Dúvida freqüente: quando intorromper o tratamento?
Projetos Desenvolvidos
Fracionamento do antígeno sintético do P. brasiliensis (PbAg)
Sete frações: 0, I, II, III, IV, V e VI
Fração 0 - Alta produção de IL-10
Fração II - Formação de granuloma e produção de TNF-a
As frações 0 e II possuem antígenos de superfície reconhecidos por anticorpos de coelhos imunizados com as respectivas frações
O fracionamento do antígeno bruto de P. brasiliensis se
mostrou eficiente em separar frações antigênicas menos
complexas
A fração 0 foi capaz de de controlar a infecção em PCM
experimental, impedindo a disseminação do fungo para o
baço e fígado
A fração II foi capaz de conferir proteção em
camundongos BALB/c infectados com P. brasiliensis
Projetos Desenvolvidos
Objetivo Geral
Purificar, identificar e caracterizar proteínas presentes na fração 0, obtidas a partir de antígenos fracionados de Paracoccidioides brasiliensis (PbAg) , importantes na proteção e no diagnóstico da paracoccidioidomicose.
Fracionar o antígeno bruto de P. brasiliensis a fim de obter a fração 0.
Objetivo Específico
Obtenção dos antígenos fracionados
7 dias a 35 ºC
rompimento mecânico com
pérolas de vidro (45 ciclos)
LEVEDURAS
ultracentrifugação 37.000 rpm 4 ºC 1:30 h
CEPA Pb 18
Extrato solúvel (PbAg) FPLC(sete frações)
ResultadoGráfico do FPLC
Den
sid
ade
ópti
ca (
280n
m)
Gra
die
nte
de
NaC
l [M
]
0
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
0
20
40
60
80
100
0(0)
6(I)
12(II)
20(III)
30(IV)
45(V)
70(VI)
100
% NaCl (Fração)
Objetivo Específico
Avaliar o perfil eletroforético das frações obtidas no fracionamento do antígeno bruto de P. brasiliensis
Resultado
Gel SDS-PAGE
66 -
45 -
29 -
14 -
kDa
FIIIF0 FI FII FIV FV FVI PbAgPM
Objetivo Específico
Refracionar as proteínas da fração 0 em coluna Mono-S acoplada ao sistema de FPLC.
Resultado
20
40
60
80
100
Picos do refracionamentoG
rad
ien
te d
e
0.20
0.40
0.80
1.00
0.60
0
01 02 03
Den
sid
ade
ópti
ca (
280n
m)
NaC
l[M
]
Gráfico do FPLC
Objetivo Específico
Avaliar o perfil eletroforético dos picos obtidos a partir do refracionamento da fração 0 do antígeno bruto de P. brasiliensis.
Resultado
Gel SDS-PAGE
66 -
29-
24-
18,4-
kDa
45-
F0 Pico 1 Pico 2 Pico 3PM
66 -
29-
24-
18,4-
kDa
45-
F0 Pico 1 Pico 2 Pico 3PM
Objetivo Específico
Identificar através de ensaios de Western-blot, bandas protéicas dos picos obtidos no refracionamento da F0 de PbAg, que são especificamente reconhecidos por soros de pacientes com PCM.
Resultado
Western-blot
F0Pico 1Pico 2 PM
38,5
18,1
kDa
201
125
81
F 0 Pico 1 Pico 2 PM
F0Pico 1Pico 2 PM
38,5
18,1
kDa
201
125
81
6,9
F0Pico 1Pico 2 PM
31,3
18,1
kDa
201
125
81
F0Pico 1Pico 2 PM
38,5
18,1
kDa
201
125
81
F 0 Pico 1 Pico 2 PM
F0Pico 1Pico 2 PM
38,5
18,1
kDa
201
125
81
6,9
31,3
18,1
kDa
201
125
81
43
Objetivos Específicos
Determinar a seqüência de aminoácidos da região aminoterminal das bandas protéicas mais reativas aos soros de pacientes com PCM, através de um seqüenciador de aminoácidos.
Analisar as seqüências obtidas, através da comparação com outras seqüências presentes no banco de dados - BLASTp.
Resultados
24.0 7/7
(100%)7/7
(100%)220 aa
Paracoccidioides brasiliensis
27 kDa antigen
ScoreIdentitySimilarity
LengthAnimalHomologya
27 kDa antigen [Paracoccidioides brasiliensis]
ARALSSDELKTVVSVLAQKLDSLNIDYAIMGGAATCLLSGDPNRRTEDVDLVIHVDHRKITADNLTTQLLKSFPSDFEGVSQFGHTIPAYKLRRPGGTVQLVVELEVFDYQSWPQRPQYDLQTATRTTLNINGQKVKLFSPEWILREKILSQYQRQGSRKEGTDIRDIISMIPLAVPGKPELNFNQSQELQTALANLVQKRPDLSSALKAKIKCSAVFHN
a: N-terminal sequence of PB29: A P L S I Y E L K T V V S
This peptide was compared to protein sequences deposited in non-redundant databases, using the Basic Local Alignment Search Tool program, BLASTp
38.4 12/12
(100%)12/12
(100%),416 aa
Paracoccidioides
brasiliensis
Immunodominant antigen Gp43
ScoreIdentitySimilarity
LengthAnimalHomologya
Immunodominant antigen Gp43 [Paracoccidioides brasiliensis]
MNFSSLNLALASCVLAWVCLASASSHVASHIVPRQAGSAIYGVNIGGWLLLEPWISPSVFEAGGSSSVDEYTLSKNLGRDAKRHLSKHWDTFITEDDFKNIAAAGLNHVRIPIGYWAVNPIEGEPYVQGQLDYLDKALVWAKNSNLRVVIDLHGVPGSQNFDNSGHRGAINWQKGDTIRQTLIAIHTLAIRYANRTDVVDSIELVNKPSIPGGVQVSLLKEYYEDGYHIVRDIDSTVGVSISDASLPPRTWNGFLAPKTYKNVYIDTYHNQVFDDIFRTFTIDQHVKLACSLPHGRLRGADKPLIVKEWSGAMTDCAMYLNGRGIGSRFDGSFPSGKPSGACGARSKGSSSELSAQQKKDTLLYIEAQLDAFEVGAGWYFWTWKTEGAPGWDMQDLLNQKLFPQPIWARKYGGCR
a: N-terminal sequence of PB43: AGSAIYGVNIGGAGSAIYGVNIGG
This peptide was compared to protein sequences deposited in non-redundant databases, using the Basic Local Alignment Search Tool program, BLASTp.
Resultados
Resultados
81 kDa antigen [Paracoccidioides brasiliensis]
Não foi encontrada nenhuma homologia significativa com outra proteína presente no banco de dados.
a: N-terminal sequence of PB81: EPPPPPPPPPPPPPPPPPPP
This peptide was compared to protein sequences deposited in non-redundant databases, using the Basic Local Alignment Search Tool program, BLASTp
Conclusões
As técnicas de fracionamento e refracionamento adotadas são eficientes e possuem grande reprodutibilidade;
O refracionamento levou a obtenção de três picos
distintos e dois deles apresentaram um perfil protéico diferenciado em gel de eletroforese SDS-PAGE 10%;
Três dessas bandas apresentaram um maior reconhecimento por soro de pacientes com PCM, todas pertencentes ao pico 2 do refracionamento;
Conclusões
O seqüenciamento das três bandas protéicas mais evidenciadas por soro de pacientes revelou que duas das três bandas já foram descritas para o mesmo microorganismo (gp43 e pb27);
A terceira banda, de 81 KDa, porém, parece ser uma proteína ainda não descrita e específica do fungo.
Perspectivas
Agradecimentos
À Deus;
Aos meus pais e ao meu irmão;
à Lili;
Ao Jamil e ao Marco Túlio;
Ao Alfredo
Ao Bernardo;
Aos demais colegas e amigos do Labs.