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ÓLEOS E GORDURAS

XVICAPÍTULO

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

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XVIÓLEOS E GORDURAS

As determinações feitas na análise de óleos e gorduras são geralmente as dos chamados índices, que são expressões de suas propriedades físicas ou químicas dos mesmos e não as porcentagens dos seus constituintes. Assim, são determi-nados os índices de iodo, saponificação, peróxidos e as constantes físicas como

o ponto de fusão e o índice de refração. São estes índices que, juntamente com as reações características, servem para identificação e avaliação da maioria dos óleos e gorduras, sen-do o resultado da análise baseado neste conjunto de dados.

Os métodos de cromatografia em fase gasosa são, desde há muito tempo, aplicados para o conhecimento da composição dos ácidos graxos destes compostos.

325/IV Determinação da acidez

A determinação da acidez pode fornecer um dado importante na avaliação do es-tado de conservação do óleo. Um processo de decomposição, seja por hidrólise, oxidação ou fermentação, altera quase sempre a concentração dos íons hidrogênio. A decomposi-ção dos glicerídios é acelerada por aquecimento e pela luz, sendo a rancidez quase sempre acompanhada pela formação de ácidos graxos livres. Estes são freqüentemente expressos em termos de índice de acidez, podendo sê-lo também em mL de solução normal por cento ou em g do componente ácido principal, geralmente o ácido oléico. Os regula-mentos técnicos costumam adotar esta última forma de expressão da acidez. O índice de acidez é definido como o número de mg de hidróxido de potássio necessário para neu-tralizar um grama da amostra. O método é aplicável a óleos brutos e refinados, vegetais e animais, e gorduras animais. Os métodos que avaliam a acidez titulável resumem-se em titular, com soluções de álcali-padrão, a acidez do produto ou soluções aquosas/alcoólicas do produto, assim como os ácidos graxos obtidos dos lipídios.

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Material

Balança analítica, frasco Erlenmeyer de 125 mL, proveta de 50 mL e bureta de 10 mL.

Reagentes

Solução de éter-álcool (2:1) neutraSolução fenolftaleína Solução de hidróxido de sódio 0,1 M ou 0,01 M

Procedimento – As amostras devem estar bem homogêneas e completamente líquidas. Pese 2 g da amostra em frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 25 mL de solução de éter-álcool (2:1) neutra. Adicione duas gotas do indicador fenolftaleína. Titule com so-lução de hidróxido de sódio 0,1 M ou 0,01 M até o aparecimento da coloração rósea, a qual deverá persistir por 30 segundos.

Cálculos

v = nº de mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulaçãof = fator da solução de hidróxido de sódioP = nº de g da amostra

NotasPara converter o índice de acidez em solução molar, divida o resultado por 1,78. Para expressar o índice de acidez como acidez em ácido oléico, divida o resultado por 1,99. Para transformar a acidez em ácido oléico em acidez em solução normal, divida o resul-tado por 3,55.No caso de produtos com baixo teor de ácidos graxos, por exemplo, óleos e gorduras refinados, use solução de NaOH 0,01 M para a titulação.

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Referência bibliográfica

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1.: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 245-246.

326/IV Determinação do índice de peróxido

Este método determina todas as substâncias, em termos de miliequivalentes de peróxido por 1000 g de amostra, que oxidam o iodeto de potássio nas condições do teste. Estas substâncias são geralmente consideradas como peróxidos ou outros produtos simi-lares resultantes da oxidação da gordura. É aplicável a todos os óleos e gorduras normais, incluindo margarina e creme vegetal, porém é suceptível e portanto qualquer variação no procedimento do teste pode alterar o resultado da análise.

Material

Balança analítica, frasco Erlenmeyer de 125 ou 250 mL com tampa esmerilhada, proveta de 50 mL, pipeta graduada de 1 mL, bureta de 10 mL com sub-divisões de 0,05 mL.

Reagentes

Ácido acético ClorofórmioSolução de tiossulfato de sódio 0,1 N ou 0,01 NAmido solúvelIodeto de potássioSolução de ácido acético-clorofórmio (3:2) v/v

Solução saturada de iodeto de potássio – Pese 30 g de iodeto de potássio e adicione 21 mL de água. Conserve a solução em frasco âmbar e utilize no mesmo dia da sua preparação.

Solução de amido 1% m/v

Procedimentos

Óleos e gorduras normais – Pese (5 ± 0,05) g da amostra em um frasco Erlenmeyer de 250 mL (ou 125 mL) . Adicione 30 mL da solução ácido acético-clorofórmio 3:2 e agi-

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te até a dissolução da amostra. Adicione 0,5 mL da solução saturada de KI e deixe em repouso ao abrigo da luz por exatamente um minuto. Acrescente 30 mL de água e titule com solução de tiossulfato de sódio 0,1 N ou 0,01 N, com constante agitação. Continue a titulação até que a coloração amarela tenha quase desaparecida. Adicione 0,5 mL de solução de amido indicadora e continue a titulação até o completo desaparecimento da coloração azul. Prepare uma prova em branco, nas mesmas condições e titule.

Margarina e creme vegetal – Funda a amostra, com constante agitação, em placa aquece-dora ou em estufa a (60-70)°C. Evite aquecimento excessivo, particularmente prolongado à temperatura acima de 40ºC. Uma vez completamente fundida, remova a amostra da placa até que a camada aquosa se separe. Decante o óleo e filtre em papel Whatman nº 4 ou equivalente. A amostra deve estar clara e brilhante. Proceda a determinação conforme o descrito para óleos e gorduras normais.

Nota: se o volume gasto na titulação da amostra for menor que 0,5 mL, usando solução de tiossulfato de sódio 0,1 N, repita a determinação com solução 0,01 N. No caso do branco, o volume gasto não deve exceder a 0,1 mL da solução de tiossulfato de sódio 0,1 N.

Cálculo

A = nº de mL da solução de tiossulfato de sódio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulação da amostraB = nº de mL da solução de tiossulfato de sódio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulação do brancoN = normalidade da solução de tiossulfato de sódiof = fator da solução de tiossulfato de sódio.P = nº de g da amostra

Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS´ SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists` Society. 4th ed. Champaign, USA, AOCS, 1990. [AOCS Official method Cd 8-53].

327/IV Determinação do índice de refração

O índice de refração é característico para cada tipo de óleo, dentro de certos limites. Está relacionado com o grau de saturação das ligações, mas é afetado por outros fatores tais como: teor de ácidos graxos livres, oxidação e tratamento térmico. Este método é aplicável a todos os óleos normais e gorduras líquidas.

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Material

Refratômetro de Abbé equipado com escala-padrão e algodão.

Reagente

Éter de petróleo ou outro solvente.

Procedimento

Ajuste da aparelhagem – Ajuste previamente o refratômetro de Abbé com água. Faça cir-cular uma corrente de água a 40°C pelo aparelho. Deixe estabilizar a temperatura. Ajuste a 40°C para óleos e a 60°C para amostras com ponto de fusão mais alto. A temperatura do refratômetro deve ser controlada a ± 0,1°C e, para isto, é preferível usar banho de água controlado termostaticamente e com circulação de água. O instrumento é calibrado se-guindo as instruções do fabricante, com líquido de pureza e índice de refração conhecidos ou, em alguns casos, é satisfatório usar um prisma de vidro de índice de refração teórico de 1,333 à 20 °C. Se o refratômetro for equipado com um compensador, uma lâmpada elétrica como a de vapor de sódio, torna-se necessária.

Tratamento da amostra – Funda a amostra, caso não esteja líquida. Filtre para remover quaisquer impurezas e traços de umidade. A amostra deve estar completamente seca. Certifique-se que os prismas estejam limpos e completamente secos e então coloque no prisma inferior algumas gotas da amostra. Feche os prismas e trave firmemente. Deixe por 1 a 2 minutos até que a amostra atinja a temperatura do aparelho. Ajuste o instrumento e a luz para obter a leitura mais distinta possível e, então, determine o índice de refração. A leitura na escala dará diretamente o índice de refração absoluto a 40°C, com quatro casas decimais. Realize pelo menos três leituras e calcule a média. A variação das leituras deve ser igual a 0,0002. Limpe os prismas entre as leituras com algodão umedecido com solvente e deixe secar.

Cálculo para correção da temperatura

R’+ K (T’- T) = R

R = leitura à temperatura T (°C)R’= leitura à temperatura T’ (°C)T = temperatura padrão (°C)T’ = temperatura na qual a leitura de R’ foi feita (°C)K = 0,000365 para gorduras e 0,0003885 para óleos

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Referências bibliográficas

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Mé-todos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 247.

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1990. [A.O.C.S. Official method Cc 7-25].

328/IV Determinação do índice de saponificação

O índice de saponificação é a quantidade de álcali necessário para saponificar uma quantidade definida de amostra. Este método é aplicável a todos os óleos e gorduras e expressa o número de miligramas de hidróxido de potássio necessário para saponificar um grama de amostra.

Material

Frascos Erlenmeyer de 250 mL, condensador de água e banho-maria ou chapa aquecedo-ra com controle de temperatura.

Reagentes

Solução de ácido clorídrico 0,5 MHidróxido de potássio Solução de fenolftaleínaÁlcool Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 4% m/v

Procedimento – Funda a amostra, se não estiver completamente líquida. Filtre em papel de filtro para remover impurezas e traços de umidade. A amostra deve estar completa-mente seca. Pese uma quantidade de amostra, de tal modo que sua titulação corresponda de 45 a 55% da titulação do branco. Esta massa normalmente é de (4-5) g. Adicione 50 mL da solução alcoólica de KOH. Prepare um branco e proceda ao andamento analítico, simultaneamente com a amostra. Conecte o condensador e deixe ferver suavemente até a completa saponificação da amostra (aproximadamente uma hora, para amostras nor-mais). Após o resfriamento do frasco, lave a parte interna do condensador com um pouco de água. Desconecte do condensador, adicione 1 mL do indicador e titule com a solução

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de ácido clorídrico 0,5 M até o desaparecimento da cor rósea.Cálculo

A = volume gasto na titulação da amostraB = volume gasto na titulação do brancof = fator da solução de HCl 0,5 MP = nº de g da amostra

Nota: algumas amostras são mais difíceis de serem saponificadas, requerendo mais de 1 hora de saponificação.

Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA. A.O.C.S., 1990. [A.O.C.S. Official method Cd 3-25].

329/IV Determinação do índice de iodo pelo método de Wijs

O índice de iodo de um óleo ou gordura é a medida do seu grau de insaturação e é expresso em termos do número de centigramas de iodo absorvido por grama da amostra (% iodo absorvido). O método de Wijs é aplicável a todos os óleos e gorduras normais que não contenham ligações duplas conjugadas. Cada óleo possui um intervalo caracte-rístico do valor do índice de iodo. A fixação do iodo ou de outros halogênios se dá nas ligações etilênicas dos ácidos graxos.

Material

Balança analítica, agitador magnético, estufa, cronômetro, papel de filtro qualitativo, frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa esmerilhada, proveta de 50 mL, pipetas volu-métricas de 2, 5, 20 e 25 mL e bureta de 50 mL.

Reagentes

Ácido clorídricoIodoTetracloreto de carbono

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Tiossulfato de sódio (Na2S2O3.5H2O)Amido solúvelIodeto de potássio Solução de Wijs Solução de iodeto de potássio a 15% m/v Solução de indicador de amido a 1% m/v.Solução de tiossulfato de sódio a 0,1 M

Procedimento – Funda a amostra, caso não esteja no estado líquido (a temperatura da fusão não deverá exceder o ponto de fusão da amostra em 10oC). Filtre através de papel de filtro para remover algumas impurezas sólidas e traços de umidade. Pese aproximadamente 0,25 g em frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa e adicione 10 mL de tetracloreto de carbono. Transfira com auxílio de bureta, 25 mL de solução de Wijs no frasco Erlenmeyer que contém a amostra. Tampe e agite cuidadosamente com movimento de rotação, assegurando perfeita homogeneização. Deixe em repouso ao abrigo da luz e à temperatura ambiente, por 30 minutos. Adicione 10 mL da solução de iodeto de potássio a 15% e 100 mL de água recentemente fervida e fria. Titule com solução tiossulfato de sódio 0,1 M até o aparecimento de uma fraca coloração amarela. Adicione 1 a 2 mL de solução indicadora de amido 1% e continue a titulação até o completo desaparecimento da cor azul. Prepare uma determinação em branco e proceda da mesma maneira que a amostra.

Cálculo

M = molaridade da solução de Na2S2O3VB = mL gasto na titulação do brancoVA = mL gasto na titulação da amostraP = nº g da amostra

NotasQuando o índice de iodo for determinado em material contendo sistemas de duplas ligações conjugadas, o resultado não é uma medida do total de insaturação, mas um valor empírico indicativo da sua quantidade na molécula. Por ser de difícil preparação, recomenda-se a aquisição no comércio do reagente de Wijs. Armazene as soluções de Wijs em frasco âmbar, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz e da umidade.Devido à toxicidade, o tetracloreto de carbono está sendo substituído por ciclohexano.Se o óleo apresentar um índice de iodo superior a 100, como por exemplo, os óleos de ori-gem marinha, o tempo de reação com a solução de Wijs deverá ser maior que 30 minutos.

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Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 [A.O.C.S. Recommended Practice Cd 1 – 25].

330/IV Determinação do índice de iodo por cálculo

O índice de iodo determinado por cálculo aplica-se à análise de triglicerídios e de ácidos graxos livres e seus produtos hidrogenados. Este método determina o índice de iodo de óleos comestíveis diretamente da composição de ácidos graxos insaturados obti-dos a partir da análise por cromatografia em fase gasosa.

Procedimento – Determine a composição de ácidos graxos da amostra a ser analisada por cromatografia em fase gasosa (344/IV).

Cálculos

(% ácido palmitoléico x 0,950) + (% ácido oléico x 0,860) + (% ácido linoléico x 1,732) + (% ácido linolênico x 2,616) + (% ácido gadoléico x 0,785) + (% ácido erúcico x 0,723) = índice de iodo dos triglicerídios

(% ácido palmitoléico x 0,990) + (% ácido oléico x 0,8986) + (% ácido linoléico x 1,810) + ( % ácido linolênico x 2,735) + (ácido gadoléico x 0,8175) + (% ácido erúcico x 0,7497) = indice de iodo dos ácidos graxos livres

Nota: para óleos com conteúdo de matéria insaponificável superior a 0,5% (ex.: óleos de peixe), o resultado tende a ser inferior ao determinado pelo método de Wijs.

Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1995. [A.O.C.S. Recommended Practice Cd 1c-85].

331/IV Determinação do índice de Bellier

Na análise dos óleos, a determinação do índice de Bellier é utilizada para a identi-

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ficação do azeite de oliva.Material

Chapa aquecedora, termômetro com divisões de décimos de grau, pipetas de 2, 5 e 50 mL, frasco Erlenmeyer de 125 mL e refrigerante de refluxo.

Reagentes

Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 8% m/vÁcido acético (1+3)Álcool a 70% v/v

Procedimento – Transfira lentamente, com o auxílio de uma pipeta, 1 mL da amostra para um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 5 mL da solução alcoólica de hidróxido de potássio a 8%. Adapte ao frasco Erlenmeyer um refrigerante de refluxo. Aqueça em chapa aqquecedora por 10 minutos. Esfrie até (25-30)°C. Adicione 50 mL de álcool a 70%. Agite e adicione 1,5 mL de ácido acético (1+3). Agite e adapte ao frasco um termô-metro de 50oC, dividido em décimos de grau, de maneira que o bulbo do termômetro mergulhe no líquido. Se houver turvação, aqueça lentamente até cerca de 10oC acima do índice suposto. Resfrie o frasco, gradualmente e agitando sempre em um banho de água da seguinte maneira: mergulhe sucessivamente o frasco durante 10 segundos, retire e agite por 10 a 20 segundos. A temperatura deve baixar lentamente.Tome, como índice de Bellier, a temperatura na qual nota-se o início da turvação.

Referência bibliográfica

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mé-todos químicos e físicos para análise de alimentos, 3ª ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 255.

332/IV Determinação do ponto de fusão

Os óleos e gorduras naturais, de origem vegetal e animal, são misturas de glicerí-dios e de outras substâncias e consistem de inúmeros componentes. Estas substâncias não exibem um ponto de fusão definido e nem preciso. Portanto, o termo “ponto de fusão” não implica nas mesmas características das substâncias puras de natureza definitivamen-te cristalina. As gorduras passam por um estágio de amolecimento gradual antes de se tornarem completamente liquefeitas. O ponto de fusão deve ser definido por condições específicas do método pelo qual é determinado e, neste caso, é a temperatura na qual a amostra torna-se perfeitamente clara e líquida. O método do tubo capilar é aplicável para

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todas as gorduras animais e vegetais normais.Material

Aparelho para determinação do ponto de fusão, tubos de ponto de fusão, tubos capilares de vidro, termômetro com a especificação da A.O.C.S. : H 6-40 ou 7-45, béquer de 600 mL, papel de filtro e funil de vidro.

Procedimento – Funda a amostra e filtre em papel de filtro para remover qualquer im-pureza e resíduo final de mistura. A amostra deve estar absolutamente seca. Mergulhe completamente pelo menos 3 tubos capilares limpos na amostra liquefeita, de maneira que a gordura fique a uma altura de 10 mm. Funda o final do tubo (onde a amostra está localizada) numa chama pequena, mas não queime a gordura. Coloque os tubos num béquer e deixe em refrigerador entre (4 - 10)°C durante 16 horas. Remova os tubos do refrigerador e prenda-os com uma rolha de borracha ou de qualquer outra maneira ao ter-mômetro, de modo que as extremidades inferiores dos tubos de fusão estejam no fundo junto com o bulbo de mercúrio do termômetro. Mergulhe o termômetro num béquer de 600 mL, contendo água até a metade de seu volume. O fundo do termômetro deve estar imerso a 30 mm na água. Ajuste a temperatura inicial do banho de (8 - 10)°C abaixo do ponto de fusão da amostra no início do teste. Agite o banho de água com um pequeno fluxo de ar ou com outros métodos adequados e forneça calor de maneira que aumente a temperatura na faixa de 0,5°C por minuto. As gorduras passam normalmente por um estágio de opalescência antes da completa fusão. O aquecimento é contínuo até que os tubos estejam completamente claros. Observe a temperatura na qual cada tubo se torna claro e calcule a média de todos os tubos. Esta deve estar dentro de 0,5°C. Considere esta média como o ponto de fusão.

Nota: as amostras devem estar completamente liquefeitas quando os tubos forem coloca-dos no refrigerador. É uma boa prática passar o fundo dos tubos que contêm a amostra momentaneamente por uma chama, antes de serem levados ao refrigerador.

Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists’Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Cc 1-25].

333/IV Reação de Kreis

Chama-se rancidez a alteração no odor e sabor dos óleos e gorduras, provocada pela

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ação do ar (rancidez oxidativa) ou de microrganismos (rancidez cetônica). O método é válido para óleos normais e gorduras líquidas. A floroglucina reage em meio ácido com os triglicerídios oxidados, dando uma coloração rósea ou vermelha, cuja intensidade au-menta com a deterioração devido, provavelmente, à presença de aldeído malônico ou de aldeído epidrínico.

Material

Pipeta de 5 mL, provetas de 10 mL e proveta de 50 mL com boca esmerilhada.

Reagentes

Ácido clorídrico Solução de floroglucina em éter a 0,1% m/v

Procedimento –Transfira, com auxílio de uma pipeta, 5 mL de substância fundida para uma proveta de 50 mL com boca esmerilhada. Adicione 5 mL de ácido clorídrico e agite por 30 segundos. Adicione 5 mL de uma solução de floroglucina a 0,1% em éter. Agite novamente por 30 segundos e deixe em repouso por 10 minutos. Na presença de substân-cias rançosas, a camada inferior apresentará uma coloração rósea ou vermelha.

Nota: se a intensidade da coloração for fraca, compare a camada inferior com uma quan-tidade análoga de solução de permanganato de potássio a 0,0012% (transfira 3,8 mL de uma solução 0,01 M para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água). Se a intensidade for a mesma ou inferior, o resultado pode deixar de ser levado em consideração, caso os caracteres sensoriais do produto forem satisfatórios.

Referência bibliográfica

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 260. 334/IV Determinação da umidade e matéria volátil

A determinação da umidade e matéria volátil é um dos parâmetros legais para a avaliação da qualidade de óleos e gorduras, sendo realizada por aquecimento direto a 105°C.

Procedimento – Faça a determinação conforme método 012/IV alterando os intervalos

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de tempo de pesagem de três para uma hora, até peso constante.Referência bibliográfica

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p .22.

335/IV Determinação de impurezas insolúveis em éter

Este método, aplicável para todos os tipos de gorduras e óleos, determina sujidades e/ou outras substâncias estranhas insolúveis em éter de petróleo.

Material

Banho-maria, estufa, dessecador, proveta de 50 mL e cadinho de Gooch.

Reagente

Éter de petróleo

Procedimento – Use o resíduo resultante da determinação da umidade e matéria volátil. Adicione 50 mL de éter de petróleo no resíduo e aqueça em banho-maria para dissolver a gordura. Filtre em cadinho de Gooch com ajuda de vácuo. Lave com cinco porções de 10 mL de éter de petróleo a quente, permitindo que cada porção escoe primeiro para depois adicionar a outra porção. Lave completamente com éter de petróleo. Seque o cadinho e aqueça até peso constante em estufa a (101 ± 1)°C. Esfrie em dessecador até a temperatura ambiente e pese.

Cálculo

p = massa das impurezas insolúveis no éter de petróleoP = massa da amostra seca

Referências bibliográficas

AMERICAN OIL CHEMISTS` SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1996. [A.O.C.S. Official method Ca 3a-46].

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INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 262.

336/IV Determinação de resíduo por incineração (cinzas)

Este método determina o resíduo remanescente depois de incineração sob con-dições específicas de teste. Aplicável para gorduras animais e óleos vegetais e marinhos. Fundamenta-se na perda de peso que ocorre quando o produto é incinerado a 550°C, com destruição da matéria orgânica sem apreciável decomposição dos constituintes do resíduo mineral ou perda por volatilização.

Material

Cápsula de porcelana de 50 mL ou cápsula de platina de 100 mL, bico de Bünsen, tela de amianto, tripé, balança analítica, mufla, papel de filtro e dessecador.

Procedimento – Coloque o papel de filtro contendo os insolúveis totais em éter obtido conforme 335/IV em uma cápsula de porcelana de 50 mL ou cápsula de platina de 100 mL, previamente aquecida em mufla a 550°C por 1 hora, resfriada em dessecador até a temperatura ambiente e pesada. Carbonize em bico de Bünsen com chama baixa. Incine-re em mufla a 550°C. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante.

Nota: a combustão da amostra deve ser feita em capela, com exaustão forçada.

Cálculo

p = nº de g de resíduoP = nº g da amostra

Referências bibliográficas

AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists`Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S.

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1990. [A.O.C.S. Official method Ca 11-55]INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 263.

337/IV Determinação da densidade relativa

Este método determina a razão da massa da amostra em relação à da água por uni-dade de volume a 25°C e é aplicável a todos os óleos e gorduras líquidas.

Material

Picnômetro com junta esmerilhada de 50 mL, banho-maria mantido à temperatura de (25 ± 0,1)°C e termômetro com subdivisão de 0,1°C.

Procedimento – Funda a amostra, filtre com papel de filtro para remover as impurezas e traços de umidade. Aqueça à temperatura de (20-23)°C. Encha o recipiente do picnô-metro, adicionando a amostra cuidadosamente pelas paredes para prevenir a formação de bolhas de ar. Tampe e coloque em banho-maria na temperatura de (25 ± 0,1)°C. Con-serve o conjunto imerso na água e espere atingir a temperatura acima especificada por 30 minutos. Remova com cuidado o óleo que tenha escorrido pela lateral do recipiente. Retire do banho e seque, evitando o manuseio excessivo. Pese e calcule a densidade.

Cálculo

A = massa do recipiente contendo óleoB = massa do recipiente vazioC = massa da água à temperatura de 25ºC

Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS´ SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists` Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Cc 10a-25].

338/IV Teste do frio

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Este método mede a resistência da amostra à cristalização e é comumente usado também como índice de “winterização” e verificação da remoção da estearina no proces-so. É aplicável a todos os óleos vegetais normais, refinados e em gordura animal isenta de umidade.

Material

Banho-maria a 25°C, banho de gelo a 0°C, frasco especial para óleo de 115 mL, funil e papel de filtro.

Procedimento – Filtre uma quantidade suficiente da amostra (200-300) mL diretamente com papel de filtro. Aqueça a porção filtrada. Agite a amostra continuamente durante o aquecimento e remova do calor quando a temperatura atingir 130°C. Abasteça um frasco especial para óleo completamente até o gargalo com a amostra e tampe hermeticamente. Coloque o frasco num banho de água a 25°C e vede o banho com parafina. Mergulhe o frasco contendo a amostra em banho de gelo, de modo que o conjunto fique coberto com água e gelo. Reabasteça com gelo freqüentemente, se necessário, para manter o banho solidamente empacotado, caso contrário, a temperatura poderá subir acima de 0°C. É essencial que a temperatura do banho se mantenha a 0°C. Ao final de cinco horas e meia, remova o frasco do banho e examine rigorosamente os cristais de gordura ou turvação formada. Não confundir cristais com pequenas bolhas de ar. Para o teste ser positivo, a amostra precisa estar completamente clara, límpida e brilhante.

NotasA finalidade do tratamento a quente é remover traços de impurezas, umidade e destruir algum núcleo de cristais.

Recomenda-se utilizar um fundo preto iluminado para melhor visualização do resultado do teste, devendo a amostra ficar a uma distância de 2 metros.

Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended prac-ctices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Ce 11-53].

339/IV Determinação de matéria insaponificável

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Matéria insaponificável inclui aquelas substâncias que freqüentemente se encon-tram dissolvidas nas gorduras e óleos e que não podem ser saponificadas por tratamento usual com soda, mas são solúveis em solventes normais para gorduras e óleos. Incluem-se neste grupo de componentes, álcoois alifáticos de alto peso molecular, esteróis, pigmentos e hidrocarbonetos. O método é aplicável para gorduras e óleos animais e vegetais, não sendo adequado para gorduras e óleos contendo quantidade excessiva de matéria insapo-nificável, como os óleos marinhos. Este método também não é aplicável para alimentos com elevado teor de gordura.

Material

Extrator de gordura de capacidade de 200 mL com tampa de vidro, frascos Erlenmeyer ou Soxhlet de 100 a 200 mL, funil de separação de 500 mL, sifão de vidro e balança analítica.

Reagentes

Álcool a 95% v/vÁlcool a 10% v/vSolução de hidróxido de potássio a 50% m/vÉter de petróleoSolução de hidróxido de sódio 0,02 MSolução de fenolftaleína

Procedimento – Pese cerca de 5 g de amostra bem misturada em um frasco Erlenmeyer ou Soxhlet. Adicione 30 mL de álcool a 95% e 5 mL de KOH a 50%. Aqueça e deixe em refluxo por 1 hora ou até completa saponificação. Transfira para o funil de separação, ainda quente, usando um total de 40 mL de álcool 95%. Complete a transferência com água quente e depois fria até um volume total de 80 mL. Lave ainda o frasco com um volume de 5 mL de éter de petróleo e transfira para o funil. Esfrie até à temperatura ambiente e adicione 50 mL de éter de petróleo. Insira a tampa e agite vigorosamente por um minuto até o total clareamento das duas camadas. Use sifão de vidro para remover completamente a ca-mada superior sem incluir qualquer porção da camada inferior. Receba as frações de éter de petróleo em um funil de separação de 500 mL. Repita a extração pelo menos seis vezes, usando porções de 50 mL de éter de petróleo, agitando vigorosamente em cada extração. Lave os extratos combinados no funil de separação três vezes, usando 25 mL de álcool a 10%, agitando vigorosamente e retirando a camada alcoólica depois de cada extração. Evite remover qualquer parte da camada de éter de petróleo. Transfira o extrato de éter de petróleo para um béquer tarado e evapore até a secagem em banho de água. Depois de

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

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todo o solvente ter sido evaporado, complete a secagem em estufa a vácuo à temperatura de (75-80)ºC e pressão interna de 200 mm de Hg. Esfrie em dessecador e pese. Depois da pesagem, dissolva o resíduo em 50 mL de álcool a 95% a 50 ºC previamente neutra-lizado contendo fenolftaleína como indicador. Titule com NaOH 0,02 M até o ponto de viragem. Corrija a massa do resíduo para ácidos graxos livres contidos, usando a seguinte relação: 1 mL de 0,02 M de NaOH é equivalente a 0,0056 g de ácido oléico. Faça um branco sem a presença de óleo ou gordura e proceda da mesma maneira que a amostra.

Cálculo

A = massa do resíduo obtido após secagem a vácuoB = massa de ácido graxo determinado por titulaçãoC = massa do branco.P = nº de gramas da amostra

Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA,. A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Ca 6a-40].

340/IV Prova de Halphen-Gastaldi

Esta prova é considerada específica para a presença de estruturas ciclopropênicas contidas no ácido estercúlico ou ácidos de estruturas similares. Detecta, qualitativamente, a presença de óleo de semente de algodão em óleos e gorduras animais ou vegetais.

Material

Pipeta de 5 mL, tubo de ensaio, banho-maria e proveta de 10 mL.

Reagentes

Solução de enxofre em sulfeto de carbono a 1% m/vPiridina.

Procedimento – Transfira 5 mL da amostra para um tubo de ensaio. Adicione 5 mL de

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uma solução de enxofre em sulfeto de carbono a 1% e uma gota de piridina. Adapte ao tubo de ensaio um tubo de segurança. Mergulhe o tubo em banho-maria durante 15 minutos. Recolha o sulfeto de carbono destilado em um béquer com água. Na presença de óleo de semente de algodão, aparecerá uma coloração vermelha ou vermelho-cereja. A intensidade de cor depende da quantidade de óleo de semente de algodão presente.

Referência bibliográfica

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 264-265.

341/IV Prova de Holde

Este método detecta, qualitativamente, a presença de óleo de amendoim em óleos e gorduras animais ou vegetais.

Material

Pipetas de 1 e 5 mL, tubo de ensaio graduado e bico de Bünsen.

Reagentes

Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 3,3% (álcool a 90%) m/vÁlcool

Procedimento – Transfira 0,65 mL da amostra para um tubo de ensaio graduado. Adi-cione 5 mL de solução alcoólica de hidróxido de potássio a 3,3% (álcool a 90%). Aqueça até a ebulição e saponifique durante dois minutos. Esfrie e adicione uma quantidade de álcool a 90% equivalente ao evaporado. Coloque em banho a 18°C, por 10 minutos. Na presença de óleo de amendoim, aparecerá uma turvação ou um precipitado gelatinoso, dependendo da quantidade de óleo de amendoim presente.

Referência bibliográfica

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 265

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

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342/IV Prova de Villavecchia-Fabris

Este método detecta, qualitativamente, a presença de óleo de sésamo (gergelim) em óleos e gorduras animais ou vegetais.

Material

Pipetas de 1 e 5 mL, proveta de 10 mL e tubo de ensaio.

Reagentes

Solução alcoólica de furfural purificado a 1% (álcool a 95%) m/vÁcido clorídrico

Procedimento – Transfira 5 mL da amostra para um tubo de ensaio (se a amostra for muito espessa, adicione 5 mL de éter de petróleo). Adicione 0,2 mL da solução alcoólica de furfural a 1% (álcool a 95%) e 5 mL de ácido clorídrico. Agite o tubo durante 30 segundos. Deixe em repouso até separação das camadas. Na presença de óleo de sésamo (gergelim), a camada ácida apresentará uma coloração vermelha persistente.

Referência bibliográfica

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3 ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 265.

343/IV Determinação da extinção específica por absorção na região do ultravioleta.

Este método descreve o procedimento para o exame espectrofotométrico de azeite de oliva e outros óleos e gorduras na região do ultravioleta. A análise espectro-fotométrica na região do ultravioleta pode fornecer informações sobre a qualidade de um óleo, seu estado de conservação e alterações causadas pelo processamento. A absorção em 232 e 270 nm, comprimentos de onda especificados no método, é devida à presença de sistemas dienos e trienos conjugados, respectivamente. Estes compostos são formados por oxidação e/ou refino do óleo. Azeites de oliva virgem de boa qualidade e armazenados sob condições adequadas contêm poucos produtos de oxidação os quais absorvem próximo a 232 nm. Em alguns casos particulares, azeites de oliva virgem alterados podem exibir características espectrais próximas dos óleos refinados.

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Neste método, o óleo ou gordura em questão é dissolvido em solvente apropriado e a extinção da solução é determinada nos comprimentos de onda especificados, usando como referência o solvente puro. Estas absorções são expressas como extinções específicas

(a absorbância de uma solução a 1% do óleo no solvente especificado, numa espes-sura de 1 cm), convencionalmente indicadas por K.

Material

Espectrofotômetro UV/VIS com leituras individuais para cada comprimento de onda, cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm, balões volumétricos de 25 mL, colunas de vidro cromatográficas com comprimento de 450 mm, diâmetro interno de 35 mm, provida de tubo de descarga com 10 mm de diâmetro aproximadamente e mufla.

Reagentes

Ciclohexano ou isoctano, grau espectrofotométrico Alumina básicaHexano, grau cromatográficoAzeite de oliva virgemÓleo de amendoim refinado

Preparação da alumina – Coloque alumina, previamente dessecada em mufla a (380 - 400)oC por 3 horas, em um frasco hermeticamente fechado. Adicione água na proporção de 5 mL para 100 g de alumina. Feche o frasco de imediato e agite repetidamente. Deixe em repouso por pelo menos 12 horas antes de usar.

Verificação da atividade da alumina – Prepare a coluna cromatográfica com 30 g de alu-mina. Passe através da coluna uma mistura consistindo de 95% de azeite de oliva virgem (k < 0,18 a 268 nm) e 5% de óleo de amendoim refinado (k > 4 a 268 nm). Se após a pas-sagem através da coluna a mistura apresentar uma extinção específica maior que 0,11 a 268 nm, a alumina é aceitável. Caso contrário, o nível de hidratação deve ser aumentado.

Procedimento – A amostra a ser analisada deve estar perfeitamente homogênea e livre de impurezas. Óleos líquidos à temperatura ambiente devem ser filtrados através de papel de filtro à temperatura de aproximadamente 30°C. Gorduras sólidas devem ser homogenei-zadas e filtradas à temperatura não superior a 10°C acima do ponto de fusão. Pese aproxi-madamente 0,25 g da amostra em um balão volumétrico de 25 mL. Dissolva e complete o volume com ciclohexano ou isoctano e homogeneíze (solução A). A solução resultante

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

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deve ser perfeitamente límpida. Se ocorrer opalescência ou turbidez, filtre rapidamente através de papel de filtro. Transfira 5 mL desta solução e dilua a 25 mL com o ciclohexa-no ou isoctano em balão volumétrico (solução B). Encha uma cubeta com a solução A e meça a absorbância a 270 nm, usando o mesmo solvente como referência, em espectro-fotômetro previamente calibrado. Procedendo da mesma maneira, meça a absorbância da solução B a 232 nm. Os valores de absorbância obtidos devem estar compreendidos na faixa de 0,1 a 0,8. Quando o valor obtido da extinção específica a 270 nm for superior ao limite máximo legal estabelecido para a classificação do azeite, torna-se necessária a purificação por coluna cromatográfica com alumina ativada, como segue: transfira 30 g de alumina previamente ativada em suspensão com hexano para coluna cromatográfica. Remova o excesso de hexano deixando o nível do solvente a 1 cm da alumina. Dissolva 10 g de óleo em 100 mL de hexano homogeneizado e livre de impurezas, conforme já descrito neste procedimento e passe esta solução pela coluna. Colete o eluato e evapore todo o solvente sob vácuo e proceda como descrito anteriormente.

Cálculo

Kλ = extinção específica no comprimento de onda λAλ = absorbância medida no comprimento de onda λc =concentração da solução em g/100 mLl = caminho óptico da cubeta em cm

Nota: a análise espectrofotométrica do azeite de oliva inclui a determinação da variação da extinção específica:

ΔK = Extinção específica no comprimento de onda para a máxima absorção em torno de 270 nm

Referência bibliográfica

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists ’Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Ch 5-91].

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344/IV Análise por cromatografia em fase gasosa dos ésteres metílicos de ácidos graxos

A determinação da composição de ácidos graxos a partir da análise dos ésteres metílicos auxilia no estudo de fraudes e na avaliação do conteúdo nutricional de óleos e gorduras de origem vegetal ou animal. Por este método, os ésteres metílicos de ácidos graxos são separados, identificados e quantificados por cromatografia em fase gasosa. O método é aplicável para a determinação de ésteres metílicos de ácidos graxos contendo de 4 a 24 átomos de carbono, obtidos a partir de ácidos graxos de óleos e gorduras.

Material

Cromatógrafo a gás com sistema de injeção para coluna capilar (com capacidade de divi-são da amostra) e coluna empacotada (com o menor volume morto possível), forno com variação máxima de 1ºC para colunas empacotadas, 0,1ºC para colunas capilares e com temperatura programável (fundamental para análise de ésteres metílicos de ácidos graxos com menos de 16 átomos de carbono na molécula); detector de ionização de chama (DIC); seringa de 10 μL graduada em 0,1 μL e registrador ou integrador ou computa-dor.

Coluna empacotada

A coluna deve ser construída com um material inerte às substâncias que serão analisadas, isto é, vidro ou aço inox. Deve possuir comprimento de (1-3) m e diâmetro interno de (2-4) mm.

Suporte de empacotamento – São empregadas, normalmente, terras diatomáceas que sofreram lavagem ácida e silanização. O tamanho das partículas deve estar compreen-dido na faixa de (60-120) e (125-250) mesh, sendo que a variação entre elas não deve ser superior a 25 μm.

Fase estacionária – Pode ser empregado um líquido viscoso polar de poliésteres, isto é, polisuccinato de dietileno glicol (DEGS), polisuccinato de butanediol, poliadipato de etileno glicol. A fase estacionária deve corresponder de (5-20)% do empacotamento da coluna.

Condicionamento de uma coluna nova – Desconecte a coluna do lado do detector e gradativamente aqueça o forno a aproximadamente 10ºC acima da temperatura de ope-ração, sempre passando o gás de arraste. Mantenha esta temperatura, passando pela co-luna o gás de arraste com fluxo de (20 - 60) mL/min por aproximadamente 16 horas e por mais 2 horas a 20ºC acima da temperatura de operação. Cuidado para não exceder a

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

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temperatura máxima recomendada pelo fabricante.Coluna capilar

Tubo – O tubo da coluna é feito de material inerte, normalmente sílica fundida. O diâ-metro interno pode variar de (0,2-0,8) mm. A superfície interna do tubo sofre um trata-mento apropriado, antes de ser depositada a fase estacionária. O comprimento da coluna varia normalmente de (25 - 100) m.

Fase estacionária – As fases estacionárias são filmes de polietileno glicol, polisuccinato de buta-nediol, ciano propil siloxanos, entre outras. A espessura do filme pode variar de (0,1 - 0,25) μm.

Instalação e condicionamento da coluna – Tome os devidos cuidados na instalação das colunas nos fornos, ajustando as conecções para evitar vazamento dos gases ou quebra da coluna e reduzindo os espaços mortos. Condicione a coluna sempre passando o gás de arraste e programe o aquecimento da temperatura do forno a 3ºC/min a partir da tem-peratura ambiente até 10ºC abaixo da temperatura de decomposição da fase estacionária (verifique as recomendações do fabricante). Mantenha esta temperatura por 1 hora até estabilizar a linha de base.

Reagentes

Gás de arraste para DIC: hidrogênio (coluna capilar), nitrogênio, hélio ou argônio (pu-reza 99,999%).

Gases auxiliares para o DIC: nitrogênio, hidrogênio (pureza 99,999 %) e ar super seco (livre de hidrocarbonetos).

n-Hexano grau cromatográfico.

Padrões de referência: mistura de ésteres metílicos de ácidos graxos ou padrões individu-ais de ésteres metílicos (ampolas seladas com mg dos padrões) ou um óleo de composição conhecida, de preferência similar ao óleo ou gordura a ser analisado.

Soluções-padrão de referência – Dissolva o conteúdo da ampola (mg) dos padrões de referência em n-hexano e transfira para um balão volumétrico de 100 mL ou de outro volume apropriado. Complete o volume com o mesmo solvente. Procedimentos

Condições otimizadas de operação – Para coluna empacotada, considere as seguintes va-riáveis: tamanho e diâmetro interno da coluna, temperatura da coluna, fluxo do gás de arraste [proporção ideal: nitrogênio, hidrogênio e ar sintético 1:1:10 (exemplo: N2 (gás de arraste) 30 mL/min, H2 30 mL/min e ar sintético 300 mL/min)], resolução requerida,

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tamanho da amostra para análise. O tamanho da amostra escolhido deve situar-se dentro da faixa linear de resposta do detector.

Para coluna capilar considere as mesmas variáveis citadas para a coluna empacotada. A eficiência (número de pratos teóricos) obtida para cada componente separado por uma coluna capilar deve ser ao redor de 100000 ou no mínimo 3000 pratos por metro de coluna.Dependendo do tipo de amostra e da coluna disponível deve-se otimizar as condições de análise para se obter a melhor eficiência e resolução dos componentes. Para a análise de ésteres metílicos de ácidos graxos de óleos vegetais, recomenda-se, por exemplo,as condi-ções do método Method Ce 1h-05 ou a descrita abaixo: Coluna de fase estacionária ciano propil siloxona de 50 a 100 m, com 0,25 μm de espes-sura do filme e 0,25 mm de diâmetro interno.

Gás de arraste, hidrogênio, velocidade linear entre (15 - 25)mL/min, razão de divisão da amostra 1:50.Exemplo: coluna de 50 mTemperatura programada da coluna de 80 a 220ºC, sendo a velocidade de aquecimento de 5ºC por minuto. Mantenha a 220ºC por 10 minutos.Temperatura do injetor: 230ºCTemperatura do detector: 240ºC

Determinação da eficiência e resolução – Analise uma mistura de ésteres metílicos dos ácidos esteárico e oléico com proporções equivalentes dos dois compostos. Calcule o nú-mero de pratos teóricos n (eficiência) e a resolução pelas fórmulas:

dR1 = distância de retenção, medida em mm, do início da injeção ao máximo do pico do metil estearato.w1 e w2 = larguras dos picos do metil estearato e oleato, respectivamenteΔ = distância entre os máximos dos picos do metil estearato e metil oleato

As condições de análise que devem ser escolhidas são as que produzirem:n = 3000 pratos teóricos por metro de coluna (no mínimo) para o estearato de metilaR = 1,25 (no mínimo)

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

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Nota: deve-se trabalhar com temperatura do forno da coluna programável na análise de amostras contendo ácidos graxos com pesos moleculares muito diferentes. Diversos equi-pamentos possuem softwares que calculam os parâmetros de desempenho da coluna, auxiliando na seleção rápida da melhor condição de análise.

Determinação dos ésteres metílicos – Prepare a amostra como descrito em um dos pro-cedimentos a seguir: 054/IV, 055/IV ou 056/IV. Injete no cromatógrafo de 0,1 a 2 μL da solução de ésteres metílicos de ácidos graxos de padrões puros ou obtidas conforme descrito acima. Analise a mistura de padrões de referência de ésteres metílicos de ácidos graxos de composição conhecida nas mesmas condições empregadas na análise da amos-tra e determine o tempo de retenção (ou distância de retenção) para cada éster metílico. Construa o gráfico do logaritmo do tempo de retenção em função do número de átomos de carbono dos ácidos graxos. Em condições isotérmicas de análise, o gráfico para ésteres de séries homólogas e cadeia linear, deve ser uma reta. As retas são praticamente paralelas para diferentes séries homólogas. Empregando-se os gráficos obtidos como descrito acima, pode-se identificar um éster de ácido graxo de uma série homóloga por interpolação.

Na prática utiliza-se o cálculo de ECN, isto é, número equivalente de carbono, para iden-tificação de ácidos graxos de uma série homóloga.

Os valores de ECN são calculados a partir dos valores dos tempos de retenção dos com-postos.

Agi = ácido graxo a ser identificado n e n+i = número de átomos de carbono de padrões homólogos de cadeia reta, eluídos antes e depois do ácido graxo a ser identificado. t’Agi = tAgi - t0 t’Agi = tempo de retenção corrigidotAgi = tempo de retenção da substância a ser identificadat0 = tempo de retenção de uma substância não retida. (Ex: butano, pentano em colunas polares).t’Agn + t’Agn+i = tempos de retenção corrigidos de padrões homólogos de cadeia reta, eluídos antes e depois do ácido graxo a ser identificado.(“i”normalmente é igual a múltiplos de 2)

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Com determinada programação de temperatura (aumento linear de temperatura) a equa-ção é simplificada para:

Cálculos

Normalização

Exceto em casos excepcionais, assuma que todos os componentes da amostra estejam re-presentados no cromatograma. Desta forma a soma das áreas de todos os picos represen-tará 100% dos constituintes (eluição total). Se o equipamento incluir um computador ou integrador, utilize seus recursos para o cálculo. Caso contrário, determine a área de cada pico multiplicando a altura pela largura na meia altura. Quando necessário, considere as várias atenuações utilizadas durante o registro dos cromatogramas. De uma maneira geral, quando não estão presentes quantidades significativas de componentes com menos de 12 átomos de carbono, calcule a porcentagem de área do pico correspondente ao cons-tituinte, em relação à soma das áreas de todos os picos. O resultado será expresso como porcentagem de área do componente (éster metílico).

AAgi = área do pico correspondente ao componente “i”

Σ A = soma das áreas de todos os picos.

Normalização com fatores de correção

Os fatores de correção da resposta do detector são determinados quando estão presentes na amostra ácidos graxos com menos de 12 átomos de carbono e/ou ácidos graxos com grupos secundários ou, ainda, quando se utiliza um detector de condutividade térmica. Estes fatores devem ser usados para converter as porcentagens de área dos picos em por-centagem de massa dos componentes. Determine os fatores de correção com a ajuda de um cromatograma obtido da análise da mistura de padrões de ésteres metílicos, de com-posição conhecida, nas mesmas condições de análise da amostra.

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

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Para a mistura padrão:

MAgi = massa do componente “i” na mistura padrão.

ΣM = massa total dos vários componentes na mistura padrão

Do cromatograma da mistura padrão, calcule:

AAgi = área do pico correspondente ao componente “i”

Σ A = soma da área de todos os picos.

Geralmente os fatores de correção são calculados com relação ao KC16

(éster metílico do ácido palmítico). Assim os fatores relativos são:

Expresse o resultado em % de massa (m/m) do componente (éster metílico):

Pode ser feito o cálculo teórico dos fatores de correção do detector de ionização de chama (DIC):

Agi

Agi

Agi

Agi

Agi

Agi Agi

Agi Agi

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KAgi = fator de resposta para o ácido graxo “i”M Agi = massa molecular do éster metílico de ácido graxo “i”n Agi = número de átomos de carbono do éster metílico do ácidos graxo “i”A

c = massa atômica do carbono (12,01)

Pesos atômicos utilizados no cálculo:

Carbono = 12,01; Hidrogênio = 1,0079; Oxigênio = 15,994.

Fator relativo de resposta do DIC para cada componente com relação ao C16:0:

K’Ag i

= fator relativo de correção, para o ácido graxo “i”K

C16 = fator de resposta do DIC para o C16:0

KAgi = fator de resposta do DIC para o ácido graxo “i”

A determinação dos fatores de correção de resposta do DIC é especialmente importante para os ácidos graxos de baixo peso molecular (C4:0; C6:0), como por exemplo, para os derivados de gordura de leite e para os de alto peso molecular, como os de óleos de peixe, pois nestes casos os fatores relativos desviam de forma considerável da unidade.

Cálculo com padrão interno (PI)Empregue o método de padronização interna para determinar o valor absoluto de um ácido graxo na amostra ou na quantificação de ácidos graxos com baixo peso molecular (4 a 6 áto-mos de carbono) juntamente com ácidos graxos de alto peso molecular (16 a 24 átomos de carbono) na mesma amostra. Ésteres metílicos de ácidos graxos com número ímpar de carbo-nos são freqüentemente usados como padrão interno (Ex: C5:0; C11:0; C13:0; C19:0 ou C23:0).

Expresse o resultado em % de massa do componente (éster metílico):

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

C

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M = massa em miligramas da amostra

API = área do PIMPI = massa em miligramas do PIAAGi = área correspondente ao componente iKAgi = fator de correção da resposta do DIC para o ácido graxo i (relativo a KC16)KPI = fator de correção da resposta do DIC para o PI (relativo a KC16)

Nota: quando o resultado for expresso em gramas de ácidos graxos por 100 g de óleo, deve-se multiplicar pelo fator 0,956.

Referências bibliográficas

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 2-66: Preparation of methyl esters of long chain fatty acids).

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1-62: Fatty acid composition by gas chromatogra-phy).

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign , USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1d-91 Determination of fatty acids in edible oils and fats by capillary GLC).

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended prac-tices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign , USA: A.O.C.S., 1997 (A.O.C.S. Official Method Ce 1f-96 Determination of cis and trans fatty acids in hydrogenated and refined oils and fats by capillary GLC).

INTERNATIONAL STANDARD ORGANIZATION. IS0 5508: Animal and vegetable fats and oils – Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids. ISO 5508. 1990E

INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1 Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 266.

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345/IV Determinação de tocoferóis e tocotrienóis por cromatografia líquida de alta eficiência

Este método quantifica tocoferóis (alfa, beta, gama e delta) e tocotrienóis em óleos vegetais ou gorduras. Baseia-se na dissolução da amostra em solvente orgânico e injeção direta em cromatógrafo a líquido para a separação e quantificação dos tocoferóis e tocotrienóis.

Material

Sistema de cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) composto de: bomba de alta pressão, dispositivo para injeção da amostra, detector de fluorescência ajustado para os comprimentos de onda de 290 nm de excitação e 330 nm de emissão (na indispo-nibilidade de detector de fluorescência, utilize o de UV ajustado em 292 nm), coluna analítica de CLAE (250mm x 4mm) empacotada com micropartículas de sílica de 5 μm, pré-coluna de sílica; espectrofotômetro UV/VIS; rotavapor; balões volumétricos âmbar de 25, 50 e 100 mL; pipetas volumétricas de 10 mL e pipetas automáticas (20 a 200 μL e 200 a 1000 μL).

Reagentes

Padrões de α, β, γ, δ - tocoferóis de alta pureza (superior a 95%).Metanol.n-Hexano.Isopropanol

Fase móvel para CLAE – Hexano - isopropanol (99,5:0,5).

Nitrogênio seco

Nota: todos os solventes devem ser grau CLAE

Solução-padrão estoque de α-tocoferol – Pese cerca de 10 mg do padrão em um balão volumétrico âmbar 100 mL e complete o volume com n-hexano. Pipete 10 mL desta so-lução para um frasco âmbar e remova o solvente num rotavapor. A temperatura não deve exceder a 40oC. Retire o frasco e remova o solvente residual com nitrogênio. Adicione 10 mL de metanol, com pipeta volumétrica, e agite para dissolver o tocoferol. Meça a ab-sorbância desta solução a 292 nm e calcule a concentração (como μg/mL de α-tocoferol) dividindo-se o valor da absorbância lida por 0,0076.

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Soluções-padrão estoque de β, γ, δ-tocoferóis – Prepare a solução-estoque para cada um dos padrões de β, γ, δ-tocoferol e proceda como descrito para a solução-padrão de α-tocoferol. Meça a absorbância de cada uma das soluções nos comprimentos de onda indicados abaixo e utilize os respectivos fatores para o cálculo da concentração e pureza.

296 nm β-tocoferol = 0,0089298 nm γ-tocoferol = 0,0091298 nm δ-tocoferol = 0,0087

NotasOs fatores citados são derivados dos valores da absorção específica dos tocoferóis nos res-pectivos comprimentos de onda.Estoque as soluções-padrão em frasco de vidro âmbar, ao abrigo da luz e sob refrigeração pelo período de uma semana. Solução de trabalho de mistura de tocoferóis – Combine volumes apropriados das solu-ções-padrão estoque para obter soluções de trabalho com concentrações dos tocoferóis entre 1 e 5 μg/mL. Escolha no mínimo cinco pontos para a curva de calibração. Utilize n-hexano nas diluições.

Nota: Quando utilizar detector UV prepare uma solução mais concentrada dos padrões.

Procedimentos

Otimização dos parâmetros analíticos – Condicione a coluna, se necessário. Ajuste o flu-xo da fase móvel [n-hexano/isopropanol (99,5:0,5 v/v)] em 1 mL/min e deixe pelo menos 30 min. Injete cerca de 20 μL da mistura dos padrões de tocoferóis e, se necessário, ajuste a proporção de isopropanol da fase móvel e o fluxo. O fluxo da fase móvel adequado deve estar entre (0,7 - 1,5)mL/min. O tempo de retenção do α-tocoferol não deve ser menor que 5 minutos. O Fator de resolução (R) para o β e γ-tocoferol não deve ser menor que 1,0. Fator de resolução (R) é calculado por:

Rd1 = distância de retenção do γ-tocoferolRd2 = distância de retenção do β-tocoferolW1 = largura da base do pico do γ-tocoferolW2 = largura da base do pico do β-tocoferol

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Preparação da amostra – A amostra líquida de óleo deve ser homogeneizada (não filtre). Para amostra sólida, transfira uma certa quantidade representativa (não menos que 10% do peso total da amostra) para um béquer e homogeneíze cuidadosamente. Faça a fusão em um banho-maria onde a temperatura não exceda a 40oC. O preparo da amostra deve ser feito na ausência de luz. Pese com precisão, entre 0,2 e 0,5 g da amostra de óleo e transfira para um balão volumétrico de 25 mL com n-hexano. Agite para dissolver e com-plete o volume com o mesmo solvente. Quando utilizar um detector de fluorescência, podem ser necessárias algumas diluições para a obtenção de um cromatograma adequado. A amostra deve estar protegida da luz durante os procedimentos de preparo e deve ser analisada no mesmo dia.

Determinação de tocoferóis na amostra – Injete 20 μL da amostra e identifique os toco-feróis (e tocotrienóis) presentes por comparação com os tempos de retenção dos padrões. Registre as áreas dos picos dos tocoferóis e dos tocotrienóis. Faça duas determinações su-cessivas para cada tocoferol, usando alíquotas-teste preparadas recentemente. O resultado final deve ser a média de duas determinações obedecendo a exigência da repetitividade (vide resultados estatísticos do estudo colaborativo do método IUPAC 2432).

Curva de calibração – Injete cerca de 20 μL das soluções de mistura dos padrões de tocoferóis. Repita a injeção e verifique se os cromatogramas obtidos são reprodutíveis. Construa as curvas de calibração pelo método de padronização externa. Cálculos

A quantificação dos tocoferóis é feita por padronização externa. Os teores dos tocoferóis são calculados a partir de curvas de calibração construídas pelos softwares dos equipamen-tos ou em planilhas de cálculo (ex: excel). Para a construção da curva utilize no mínimo cinco pontos, isto é, no mínimo cinco níveis de concentração de cada padrão. As curvas obtidas relacionam a concentração dos padrões e a resposta do detector (área).

O teor de α-tocoferol presente em uma amostra, em μg/g, é dado por:

C = concentração do padrão de α-tocoferol (μg/mL)A = medida da área do pico obtido pelo padrão de α-tocoferola = medida do área do pico obtida pela amostra de α-tocoferolm = massa da amostraD = fator da diluição

Os teores de β, γ e δ-tocoferóis da amostra são calculados como o procedimento anterior usando os dados do cromatograma do correspondente padrão de tocoferol.

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Nota: os tocotrienóis contidos na amostra podem ser estimados usando os valores de C e A para o correspondente tocoferol. De acordo com a literatura a intensidade da fluo-rescência para os tocoferóis é a mesma do correspondente tocotrienol e a absorbância no UV é similar.

Referência bibliográfica

INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC 2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892,

346/IV Determinação de tocoferóis e tocotrienóis por cromatografia líquida de alta eficiência em produtos processados contendo ésteres de tocoferóis.

Produtos processados contendo ésteres de tocoferóis, como por exemplo, margari-nas, são saponificados e a matéria insaponificável obtida é dissolvida em solvente orgânico e injetada em cromatógrafo a líquido para a separação e quantificação dos tocoferóis e tocotrienóis.

Material

Balança analítica, banho-maria, rotavapor, balões âmbar de fundo chato de 50 e 100 mL com boca esmerilhada, funis de separação âmbar de 250 mL, filtros de vidro, provetas de 10 e 50 mL, papel de filtro e balão volumétrico de 50 mL.

Reagentes

Álcool aproximadamente 95% Ácool absoluto a 99%PirogalolSolução de KOH a 60% m/vÉter etílico livre de peróxidos (contendo 0,1% m/m de pirogalol)HCl 0,01 MSulfato de sódio anidro

Procedimento – Pese cerca de 2 g da amostra em balão de fundo chato âmbar de 100 mL. Adicione aproximadamente 8 mL de álcool 95%, para dissolver completamente a amostra. Agite levemente o frasco. Adicione 100 mg de pirogalol e agite para dissolver. Purifique com nitrogênio, adicione 4 mL de solução aquosa de KOH 60%. Passe nitrogênio e

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tampe o frasco. Coloque o frasco em um banho-maria à temperatura de 26°C e agite vigorosamente por 10 minutos. Todas as operações devem ser realizadas na ausência de luz direta (use frascos de vidro âmbar ou os envolvam com papel alumínio). Adicione 50 mL de água ao frasco e transfira o conteúdo quantitativamente para um funil de separa-ção de 250 mL. Lave o frasco com 50 mL de éter etílico livre de peróxidos e transfira as “lavagens” para o funil. Agite vigorosamente o funil de separação por 1 minuto, abrindo a tampa ocasionalmente para liberar a pressão formada. Deixe em repouso para que ocorra a separação das camadas. Retire a camada aquosa (camada inferior). Faça mais quatro extrações da camada aquosa com 30 mL de éter etílico isento de peróxidos e combine os extratos etéreos em outro funil de separação. Lave o extrato etéreo combinado com 50 mL de água (agitando cuidadosamente para evitar formação de emulsão) e a seguir com 30 mL de HCl 0,01 M. Separe as fases. Despreze a fase aquosa. Filtre a fração etérea passando por cerca de 3 g de Na2SO4 anidro, com a ajuda de um funil e papel de filtro. Colete o filtrado em balão de fundo chato âmbar para adaptar em um rotavapor. Remova o éter sob pressão reduzida, não excedendo a temperatura de 40°C. Se o resíduo líquido permanecer no frasco, adicione álcool absoluto 99% e evapore até à secura. Lave as pa-redes do frasco com n-hexano e transfira o conteúdo quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL. Complete o volume. Dilua adequadamente a amostra e proceda conforme 345/IV.

Referência bibliográfica

INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC 2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892, 1988.

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras

ColaboradoresEmy Takemoto, Mário Tavares, Miriam Solange Fernandes Caruso, Regina Sorrentino Minazzi Rodrigues e Sabria Aued Pimentel