MARILDA KEICO TACIRO
PROCESSO CONTÍNUO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS DE CADEIA MÉDIA (PHAMCL)
SOB LIMITAÇÃO MÚLTIPLA DE NUTRIENTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.
São Paulo 2008
PROCESSO CONTÍNUO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS DE CADEIA MÉDIA (PHAMCL) SOB LIMITAÇÃO MÚLTIPLA DE NUTRIENTES
MARILDA KEICO TACIRO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.
São Paulo 2008
MARILDA KEICO TACIRO
PROCESSO CONTÍNUO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS DE CADEIA MÉDIA (PHAMCL) SOB
LIMITAÇÃO MÚLTIPLA DE NUTRIENTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Orientador: Doutor José Geraldo da Cruz Pradella
São Paulo 2008
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
© reprodução total
Taciro, Marilda Keico. Processo contínuo de produção de polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHAMCL) sob limitação múltipla de nutrientes / Marilda Keico Taciro. -- São Paulo, 2008. Orientador: José Geraldo da Cruz Pradella. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia EP/IPT/ICB/Butantan. Área de concentração: Biotecnologia. Linha de pesquisa: Biopolímeros. Versão do título para o inglês: Medium-chain-length polyhydroxylkanoates production in chemostat culture under multiple nutrient limitation.
Descritores: 1. Polihidroxialcanoatos 2. Biopolímeros 3. Processo contínuo de produção 4. Polihidroxialcanoatos de cadeia média I. Pradella, José Geraldo da Cruz II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia. III. Título.
ICB/SBIB069/2008
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia Universidade de São Paulo, Instituto Butantan, Instituto de Pesquisas Tecnológicas ______________________________________________________________________________________________________________
Candidato(a): Marilda Keico Taciro.
Título da Tese: Processo contínuo de produção de polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHAMCL) sob limitação múltipla de nutrientes.
Orientador(a): José Geraldo da Cruz Pradella.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Aos meus filhos Júlia e Gabriel, Ao Newton por entender o significado
desse trabalho para mim
AGRADECIMENTOS
Ao Doutor José Geraldo da Cruz Pradella não só pela orientação desse trabalho, mas
pelos muitos outros ao longo de toda minha carreira profissional.
Ao Professor Doutor José Gregório Cabrera Gomez, sempre presente com sua visão
positiva e incentivando o trabalho. Agradeço pelas sugestões, ajuda e apoio ao longo de todo
o trabalho.
À Doutora Rosane Aparecida Muniz Piccoli, amiga de todas as horas, pela ajuda na
realização dos ensaios e, principalmente, fazer rodar e entender o “Metatool”. Amiga que
dividiu comigo as angústias de finalizar uma tese sendo mãe e em cima da hora.
À Professora Doutora Luiziana Ferreira da Silva pela incentivo, ajuda e apoio na
realização desse trabalho.
Aos amigos: Cezar Vanzin pelas amostras da meia noite na saída da faculdade; Rafael
Costa dos Santos Rocha, Sonia Regina da Silva Queiroz, Luana Rissi, sempre prontos a
ajudar; Johana Bocanegra, sempre disposta a passar a noite amostrando ensaio e fazendo
companhia; Rogério Gomes, pela ajuda no preparo do banco da linhagem e pela paciência em
explicar e estudar genética molecular comigo.
Aos Técnicos de Laboratório, Renato de Jesus Andrade, Aelson Luis dos Santos,
Sérgio Fernandes e Antônio Montemor pela ajuda nas análises, no preparo e condução dos
ensaios.
Em especial aos Técnicos de Laboratório Valter de Oliveira e Regis Norberto de
Carvalho, o primeiro sempre pronto a ajudar e o segundo, o meu “anjo do laboratório”,
quantas não foram as vezes em que tarde da noite ou mesmo nos fins de semana, a centrifuga
não funcionava ou a bomba de alimentação dava algum problema e ele estava por perto para
ajudar. Mais do que profissionais do Laboratório, grandes amigos!!
Vários foram os estagiários que ajudaram na realização desse trabalho, alguns só de
passagem, mas todas as contribuições sem exceção, muito importantes: Vanessa Baldacim,
Letícia Nivoloni, Natália Cavinato e Vinícius Villas Boas de Alencar.
As secretárias Maria das Graças F. de Oliveira e Nilza T. Dantas ela ajuda e apoio.
Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo que possibilitou a
realização desse trabalho e a todos que de alguma forma contribuíram para que esse trabalho
se concretizasse.
“ Sonho que se sonha junto é realidade”
(Raul Seixas)
RESUMO
TACIRO, M.K. Processo contínuo de produção de polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHAMCL) sob limitação múltipla de nutrientes. 2008. 273 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Programa Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/IBUTANTAN, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
A produção de polihidroxialcanoato de cadeia média por Pseudomonas putida IPT 046 em
cultivo contínuo sob limitação múltipla de nutrientes foi estudada, utilizando glicose e frutose
como fontes de carbono. O estudo da limitação em nitrogênio, limitação em fósforo e
limitação simultânea de nitrogênio e fósforo como forma de indução de acúmulo de
polihidroxialcanoato apontou que os maiores valores de acúmulo de polímero, cerca de 70%
da biomassa celular, foram alcançados quando fósforo foi o nutriente limitante. Quando a
limitação foi somente em nitrogênio, o máximo teor acumulado foi de 40% da biomassa
celular. A limitação simultânea de nitrogênio e fósforo, além do alto teor de polímero obtido
(68%) resultou em maior fator de conversão de fonte de carbono em polímero (YPHA/C de 0,19
g/g) quando comparado com a limitação em fósforo, 0,16 g/g, ou à limitação em nitrogênio,
0,10 g/g. A partir dos fatores de conversão de fonte de carbono e nutrientes em biomassa
residual foi possível delimitar as regiões de crescimento com múltipla limitação nas formas
estudadas. Os fatores de conversão de oxigênio em biomassa residual e os respectivos
coeficientes de manutenção obtidos para a condição de limitação em nitrogênio (Yxr/o = 0,96
g/g e mo =0,11g/gh), para limitação em fósforo (Yx/o = 1,39 g/g e mo = 0,13 g/gh) e para
limitação em nitrogênio e fósforo (Yx/o = 1,53 g/g e mo = 0,12 g/gh) indicaram que a
limitação simultânea em nitrogênio e fósforo implicou em menor consumo de oxigênio para
gerar células quando comparada com a condição de limitação somente em nitrogênio ou
fósforo e que o oxigênio utilizado para manutenção das células independeu do tipo de
limitação e dos valores das vazões específicas de alimentação empregadas, que variaram entre
0,04 e 0,50 h-1. O balanço de carbono mostrou que, independente do tipo de limitação, nas
condições de maior acúmulo de polímero a fração destinada a CO2 representou 60% do total
de carbono consumido. A fração de carbono destinada à biossíntese de polímero foi de 30%
na condição de limitação simultânea de nitrogênio e fósforo, 17,5% para limitação somente
em nitrogênio e de 21,5% para limitação em fósforo, correspondentemente, a fração de
carbono destinada a fazer células foi de 10%, 20,5% e 17,5%, respectivamente. Um modelo
metabólico foi proposto, ajustando aos dados experimentais na condição de limitação em
nitrogênio. Os fluxos metabólicos obtidos propõem que glicose ou frutose sejam consumidas
8
utilizando a via de Embden-Meyerhoff-Parnas, não ocorrendo fluxo entre 6-fosfogliconato e
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato. Piruvato, formado a partir de fosfoenolpiruvato, seja
descarboxilizado a acetil-CoA. Uma fração deste intermediário seja oxidado no Ciclo de
Krebs e outra direcionada para a biossíntese de polímero. A fração metabolizada no ciclo de
Krebs levaria à formação de NADPH pela ação da isocitrato desidrogenase com geração de
CO2. O modelo propõe ainda que NADPH e CO2 também devem ser gerados pelo desvio da
hexose monofosfato. As relações elementares geradas pelo modelo, também foram utilizadas
para analisar possíveis modificações na rede metabólica que pudessem resultar em aumento
da conversão de substrato em produto.
Palavras-chave: Polihidroxialcanoatos. Biopolímeros. Processo contínuo de produção.
Polihidroxialcanoatos de cadeia média.
ABSTRACT TACIRO, M.K. Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates production in chemostat culture under multiple nutrient limitation. 2008. 273 p. PhD thesis (Biotecnology) – Programa Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/IBUTANTAN, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Multiple nutrient limited growth of Pseudomonas putida IPT 046 was studied in a chemostat
culture from glucose and fructose as the carbon source. Nitrogen (N), phosphorus (P) and
both nitrogen and phosphorus (N and P) limitation was performed in order to accumulate
medium-chain-length polhydroxyalkanoate. P limitation resulted in higher content of polymer
accumulated (70%). N limited experiments achieved only 40% of cellular biomass in
polymer. N and P simultaneous limitation resulted in 68 % polymer content and best yields of
carbon into polymer (YPHA/C = 0,19 g/g) when compared with 0,16 g/g of P limitation and
0,10 g/g of N limitation. The border of the nutrient limitation zone was delimited from the
yields of carbon and nutrients into residual biomass and the extension of the nutrient limited
growth zone for the cultivation of Pseudomonas putida IPT 046 was established. The yields
of oxygen in residual biomass and the related maintenance coefficients for N limitation (Yxr/o
= 0,96 g/g e mo =0,11g/gh), P limitation (Yx/o = 1,39 g/g e mo = 0,13 g/gh) and N and P
limitation (Yx/o = 1,53 g/g e mo = 0,12 g/gh) indicate that N and P simultaneous limitation
result in less oxygen demand to synthesize cells and the oxygen demand for maintenance is
the same, independent of limitation strategy or dilution rate performed (0,04 to 0,50 h-1). In all
the limitation conditions tested, the carbon balance of the experiments showed that 60 % of
consumed carbon resulted in CO2 when polymer content was the highest. Polymer synthesis
took 17,5 % of consumed carbon in experiments limited in N, 21,5 % in P limited and 30 % in
N and P simultaneous limited. Cellular biosynthesis took 20,5 %, 17,5 % and 10% of carbon
consumed, respectively.
A metabolic pathway model was proposed and matched with N limited experimental data.
The resulting metabolic fluxes indicated that glucose and fructose should be metabolized by
Embden-Meyerhoff-Parnas pathway, without flux from 6-phosphogluconate to 2-keto-3-
deoxy-6-phosphogluconate. Pyruvate formed from phosphoenolpyruvate and decarboxylated
into acetyl-CoA. A fraction of this intermediary was oxidated on Krebs Cicle and another one
goes to polymer synthesis. Isocitrate desidrogenase action resulted in NADPH and CO2
released. Also NADPH and CO2 were produced by hexose monophosphate shunt. Elementary
mode analysis was used to verify the possible effects of biochemical network modifications
10
and also for design of further modifications that could improve the system’s conversion of
substrate into polymer.
Key Words: Polyhydroxyalkanoates. Biopolymer. Chemostat culture. Medium-chain-length
polyhydroxyalkanoates.
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1: Fórmula genérica de monômeros detectados em PHA................................ 19
Figura 3.2: Modelo metabólico genérico para a síntese de PHA (GOMEZ, 2000)........ 20
Figura 3.3: Esquema representativo das vias metabólicas que fornecem
intermediários para síntese de polihidroxialcanoatos de cadeia média (adaptado de
WITHOLT e KESSLER, 1999)..................................................................................... 22
Figura 3.4: Esquema representando os limites da região de crescimento com múltipla
limitação de nutrientes Adaptado de DURNER et al.,1998........................................... 24
Figura 4.1: Esquema de preparo de inóculo................................................................... 32
Figura 4.2: Esquema do biorreator operado de forma contínua..................................... 33
Figura 5.1: Valores de Ln (X/Xo) em função do tempo para o ensaio de
determinação de µmax pelo método dinâmico para P. putida IPT 046.........................
39
Figura 5.2: Valores de concentração de biomassa (X) obtidos nas diferentes vazões
específicas de alimentação (D): a) ensaios não limitados na fonte de carbono (MCLc
6, 8, 9, 10, 12 e 21); b) ensaios limitados na fonte de carbono (MCLc 5, 7e 11)........... 41
Figura 5.3: Fator de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (livre de
polímero) (Yxr/c) calculado nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos
ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e
limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e
limitados na fonte de C (ο)............................................................................................. 43
Figura 5.4: Fator de conversão de fósforo em biomassa residual (Yxr/p) calculado
nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em
nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N
e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο)......................... 44
Figura 5.5: Fator de conversão de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n) calculado
nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente
em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo
(N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο).................... 45
12
Figura 5.6: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C e N): relações
Co/No (g de C/g de N consumidos) para diferentes vazões específicas de
alimentação (D).............................................................................................................. 46
Figura 5.7: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C e P): relações
Co/Po (g de C/g de P consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação
(D)................................................................................................................................... 48
Figura 5.8: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C, N e P):
relações Co/No (g de C/g de N consumidos) para diferentes vazões específicas de
alimentação (D).............................................................................................................. 48
Figura 5.9: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C, N e P):
relações Co/Po (g de C/g de P consumidos) para diferentes vazões específicas de
alimentação (D).............................................................................................................. 49
Figura 5.10: Teor de polímero (PHA) obtido nas vazões específicas de alimentação
(D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em
fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte
de C................................................................................................................................. 50
Figura 5.11: Fator de conversão de fonte de carbono em polímero (YPHA/C) calculado
nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em
nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N
e Plim) e não limitados em fonte de C............................................................................ 53
Figura 5.12: Composição do polímero acumulado nas vazões específicas de
alimentação (D) testadas nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim),
somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não
limitados em fonte de C.................................................................................................. 54
Figura 5.13: Produtividade de PHA (Prod) calculada nas vazões específicas de
alimentação (D) testadas nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim),
somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não
limitados em fonte de C.................................................................................................. 55
Figura 5.14: Velocidades específicas de consumo de oxigênio (qO2) calculadas nas
vazões específicas de alimentação (D), obtidas nos ensaios limitados somente em
nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N
e Plim) e, não limitados em fonte de carbono................................................................ 57
Figura 5.15: Velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) [□ e ■] e coeficiente
respiratório (RQ) [○ e ●] calculados nas vazões específicas de alimentação (D),
obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo
(Plim), limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e, não limitados em fonte de
carbono............................................................................................................................ 58
Figura 5.16: Ensaio MCLc 18: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO)
e teor de polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F),
nitrogênio (N) e fósforo (P)............................................................................................ 60
Figura 5.17: Ensaio MCLc 19: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO)
e teor de polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F),
nitrogênio (N) e fósforo (P)............................................................................................ 62
Figura 5.18: velocidades de consumo de oxigênio (OUR) e de produção de CO2
(CER) do ensaio MCLc 19............................................................................................ 63
Figura 5.19: Ensaio MCLc 20: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO)
e teor de polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F),
nitrogênio (N) e fósforo (P)............................................................................................ 64
Figura 5.20: velocidades de consumo de oxigênio (OUR) e de produção de CO2
(CER) do ensaio MCLc 20............................................................................................. 65
Figura 5.21: Ensaio MCLc 22: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO)
e teor de polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F),
nitrogênio (N) e fósforo (P)............................................................................................ 67
Figura 5.22: velocidades de consumo de oxigênio (OUR) e de produção de CO2
(CER) do ensaio MCLc 22............................................................................................. 68
Figura 5.23: Esquema representativo do modelo (E1) utilizado para análise de fluxos
metabólicos no cultivo de P. putida IPT 046................................................................. 70
Figura 5.24: Fração de carbono destinado a fazer células (CEL), polímero (F4) e CO2
(F14) a partir de glicose e frutose consumidos nos ensaios limitados em fonte de
carbono........................................................................................................................... 73
Figura 5.25: Fração de carbono destinado a fazer células (CEL), polímero (F4) e CO2
(F14) a partir de glicose e frutose consumidos nos ensaios não limitados em fonte de
carbono........................................................................................................................... 74
Figura 5.26: Esquema representativo do modelo E2 proposto para análise de fluxos
no cultivo de P. putida IPT 046..................................................................................... 75
Figura 5.27: Esquema representativo do modelo E3 proposto para análise de fluxos
no cultivo de P. putida IPT 046..................................................................................... 77
Figura 5.28a: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma
de indução de acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 9 e 61.............................. 82
Figura 5.28b: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma
de indução de acúmulo de 40% PHA. Relação elementar 69........................................ 83
Figura 5.29a: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma
de indução de acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 29 e 59............................ 84
Figura 5.29b: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma
de indução de acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 15 e 75............................ 85
Figura 5.30a: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma
de indução de acúmulo de 70% PHA. Relações elementares 29 e 59............................ 86
Figura 5.30b: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma
de indução de acúmulo de 70% PHA. Relações elementares 15 e 75............................ 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Quadro resumo de resultados obtidos de produção de PHAMCL em
biorreator......................................................................................................................... 27
Tabela 4.1: Composição dos meios de alimentação dos ensaios em alta densidade
(quantidade dos reagentes em g/litro de meio alimentado)............................................. 35
Tabela 5.1: Condições dos ensaios realizados para estudar o efeito da limitação de
nutrientes na produção de PHAMCL................................................................................ 41
Tabela 5.2: Valores de concentração de biomassa (X), teor de polímero (PHA), fator
de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (Yxr/c), fator de conversão
de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n), fator de conversão de fósforo em
biomassa residual (Yxr/p), velocidade específica de consumo de oxigênio (qO2),
velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) para os ensaios preliminares em
alta densidade celular...................................................................................................... 68
Tabela 5.3: Correlações utilizadas no modelo E1 para análise de fluxo metabólico...... 71
Tabela 5.4: Relações elementares geradas pelo programa Metatool para a condição de
limitação em N, e os correspondentes valores de fator de conversão de fonte de
carbono em biomassa (Yx/c), fator de conversão de fonte de carbono em polímero
(YPHA/C), quantidade de oxigênio consumido por biomassa residual formada (1/YXr/O2),
quantidade de CO2 produzido por biomassa residual formada (1/YXr/CO2) e quantidade
de ATP formado por biomassa residual formada (YATP/Xr)............................................... 81
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................16
2 OBJETIVO ..........................................................................................................................18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...........................................................................................19
3.1 Polihidroxialcanoatos .......................................................................................................19
3.2 Metabolismo de PHAMCL .................................................................................................20
3.3 Produção de PHAMCL em biorreator ..............................................................................22
3.4 Engenharia metabólica na produção de PHAMCL .........................................................28
3.5 Aplicações para PHAMCL .................................................................................................29
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................31
4.1 Ensaios em biorreator ......................................................................................................31
4.2 Metodologias analíticas ....................................................................................................36
4.3 Avaliação de fluxos metabólicos na produção de PHAMCL...........................................38
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................39
5.1 Determinação de velocidade específica máxima crescimento (µmax) para a linhagem IPT 046....................................................................................................................39
5.2 Crescimento com limitação de nutrientes - ensaios contínuos em baixa densidade celular ......................................................................................................................................40
5.3 Ensaios preliminares em alta densidade para produção de PHAMCL..........................59
5.4 Avaliação de fluxos metabólicos na produção de PHAMCL...........................................69
6 CONCLUSÕES....................................................................................................................88
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................91
ANEXO....................................................................................................................................99
ANEXO A - Ensaios em baixa densidade – Dados experimentais ...................................100
ANEXO B - Ensaios preliminares em alta densidade – Dados experimentais................138
ANEXO C – METATOOL – Entradas e saídas.................................................................152
16
1 INTRODUÇÃO
Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres acumulados por diversas bactérias,
despertam grande interesse, pois apresentam propriedades termoplásticas, são biodegradáveis
e biocompatíveis e podem ser sintetizados a partir de matérias-primas renováveis.
O Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT) estuda a produção
de PHA desde 1992, explorando diversos aspectos para o seu desenvolvimento, tais como: o
isolamento e caracterização de bactérias produtoras de PHA, a compreensão do metabolismo
de síntese destes polímeros a partir de diferentes substratos, o melhoramento genético de
linhagens bacterianas, o estudo e desenvolvimento de processos de produção, extração e
purificação de PHA, além da modelagem matemática dos mesmos.
Em 1998, o Laboratório de Biotecnologia Industrial (LBI) do IPT em cooperação com
o Laboratório de Materiais Avançados da Universidade Estadual Norte Fluminense
(LAMAV-UENF) com apoio do PADCT (CNPq), realizou estudos para a produção em
batelada e batelada alimentada de polihidroxialcanoatos de cadeia média (PHAMCL) e seu uso
em aplicações médico-veterinárias. Foram selecionadas linhagens produtoras de PHAMCL a
partir de carboidratos (GOMEZ, 2000) e óleos vegetais (SILVA et al., 1999 e SILVA-
QUEIROZ, 2003) e estudada a produção destes materiais a partir de carboidratos (GOMEZ et
al., 2000, DINIZ et al., 2004) além da caracterização dos mesmos (SANCHEZ et al., 2003).
Dando continuidade ao trabalho iniciado em 1998 na área de biopolímeros
degradáveis de cadeia média, o LBI-IPT em cooperação com o LAMAV-UENF, aprovou
junto a FAPESP o projeto “Avaliação do metabolismo de síntese de PHAMCL e controle de
sua composição monomérica” e, o presente trabalho constitui parte desse projeto.
PHA contendo monômeros de cadeia média (PHAMCL) são elastômeros produzidos por
Pseudomonas sensu stricto e compreendem mais que 90% dos monômeros detectados como
constituintes de PHA. Essa grande diversidade de monômeros que podem ser incorporados e
o potencial para a produção de PHA sob medida para diferentes aplicações, permite
aplicações amplas que vão da área de embalagens e materiais descartáveis, dominado por
“comodities” petroquímicos, para os quais o preço de venda tem que ser competitivo, até a
área médico-farmacêutica e de cosméticos que envolvem produtos com alto valor agregado.
Nos trabalhos anteriores, diversos aspectos básicos da produção de PHAMCL foram
estudados, bem como o uso de técnicas avançadas como o melhoramento genético de
linhagens associado ao uso de estratégias/técnicas de engenharia bioquímica. O presente
trabalho envolve estudos em processo conduzido de modo contínuo, associado à análise de
17
fluxos metabólicos visando o controle da composição monomérica dos PHAMCL e fornecendo
subsídios para melhor conhecer o metabolismo de sua produção e assim direcionar tais fluxos
segundo critérios de interesse. A possibilidade de controle de concentrações reais dos
substratos fornecidos, o equilíbrio dinâmico presente quando se estabelecem estados
estacionários no cultivo contínuo, coloca essa ferramenta como a mais indicada para fornecer
dados para a análise de fluxos metabólicos. Assim sendo, os resultados deste trabalho
contribuirão para o melhor entendimento e otimização do processo de produção dos PHAMCL
a partir de carboidratos.
18
2 OBJETIVO
O presente trabalho teve como objetivos otimizar o teor de polímero acumulado por P.
putida IPT 046 e obter PHAMCL com diferentes composições monoméricas em biorreator.
Para atingir esses objetivos foram realizados estudos em biorreator operado de forma
contínua, empregando-se regimes de crescimento com limitação de nutrientes, buscando-se
otimizar o teor de polímero e variar a composição dos mesmos através da adição controlada
de carboidratos.
Tomando como base esquemas do metabolismo de produção de PHAMCL, fluxos
metabólicos sob diferentes condições de cultivo foram estabelecidos, procurando uma maior
compreensão do metabolismo de síntese destes polímeros e norteando novas estratégias de
cultivo para aumentar a eficiência e o teor acumulado de polímero.
19
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Polihidroxialcanoatos
Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres acumulados por diversas bactérias na
forma de grânulos intracelulares como reserva de carbono, energia e equivalentes redutores
(ANDERSON e DAWES, 1990). A estrutura básica destes polímeros está representada na
Figura 3.1.
Figura 3.1: Fórmula genérica de monômeros detectados em PHA
Cerca de 150 monômeros diferentes já foram identificados como constituintes de PHA
produzidos por bactérias a partir de diversas fontes de carbono (REHM e STEINBÜCHEL,
1999), variando-se n, bem como a estrutura do substituinte R (Figura 3.1). PHA são
classificados em dois grandes grupos segundo Steinbüchel e Valentin (1995): (i) PHASCL
(polihidroxialcanoatos de cadeia curta), compostos por HASCL (“HydroxyAcids of Short-
Chain-Length”), contendo monômeros com 3 a 5 átomos de carbono na cadeia principal e, (ii)
PHAMCL (polihidroxialcanoatos de cadeia média), formados por HAMCL (“HydroxyAcids of
Medium-Chain-Length”), contendo monômeros com 6 a 16 átomos de carbono na cadeia
principal.
A composição monomérica, a massa molecular e a distribuição de massas moleculares
do polímero são responsáveis pelas propriedades físicas e mecânicas destes materiais,
direcionando sua aplicação. Assim, um maior domínio sobre o processo de síntese permitirá
um melhor controle, seja da composição, seja das massas moleculares ou de sua distribuição,
resultando em polímeros feitos sob medida para diferentes aplicações. As propriedades de
PHA permitem a obtenção desde materiais rígidos, como o poli-3-hidroxibutirato (P3HB),
que é um PHASCL, a materiais flexíveis, como PHAMCL, que podem também se apresentar
como materiais viscosos e aderentes se contiverem uma grande fração de monômeros
insaturados (GOMEZ, 2000).
20
PHAMCL são produzidos por Pseudomonas sensu stricto e compreendem mais que
90% dos monômeros detectados como constituintes de PHA (SUDESH et al., 2000). Estes
polímeros são elastômeros com baixo grau de cristalinidade e baixas temperaturas de fusão,
apresentando propriedades distintas das dos PHA mais conhecidos (P3HB e seu copolímero
P3HB-co-3HV), que são termoplásticos com alto grau de cristalinidade, possibilitando
vislumbrar aplicações distintas para os mesmos. PHAMCL tem merecido destaque como um
polímero funcional dado sua versatilidade, facilitada pela incorporação de vários grupos
funcionais, incluindo grupos como alquil, fenil, fenoxi e alcanos (KIM, 2002).
3.2 Metabolismo de PHAMCL
A síntese de PHA depende do fornecimento de um substrato adequado que possa ser
convertido a um hidroxiacil-CoA através das vias metabólicas existentes na célula (Figura
3.2), bem como da presença de uma PHA sintase na bactéria, capaz de incorporar este
hidroxiacil-CoA ao poliéster em formação. Ambos os fatores podem impedir a combinação de
certos monômeros em uma mesma cadeia polimérica ou restringir a quantidade de um
determinado monômero incorporado ao PHA (GOMEZ, 2000).
Figura 3.2: Modelo metabólico genérico para a síntese de PHA (GOMEZ, 2000).
PHA sintases são as enzimas chaves no processo de síntese destes polímeros,
catalisando a ligação dos monômeros por transesterificação (WITHOLT e KESSLER, 1999),
estando agrupadas em três classes. PHA sintases da classe I estão presentes em várias
bactérias e possuem especificidade por HASCL, raramente incorporando HAMCL. PHA sintases
de classe II são encontradas exclusivamente em Pseudomonas e apresentam maior
21
especificidade por HAMCL, incorporando HASCL mais raramente. Enquanto PHA sintases de
classe I e II são constituídas de um único polipeptídeo, as da classe III são constituídas por
duas subunidades polipeptídicas com especificidade para HASCL.
Dentre os vários monômeros detectados em PHA, mais que 90% estão presentes
apenas em PHAMCL produzidos por Pseudomonas, devido à especificidade de suas PHA
sintases e à grande versatilidade metabólica deste gênero (ORNSTON, 1971; INOUYE,
1998).
A síntese de PHAMCL é dividida em dois grupos com base nos substratos fornecidos:
síntese a partir de substratos relacionados, na qual a composição do polímero produzido
reflete o substrato fornecido (hidrocarbonetos, álcoois, ácidos carboxílicos), permitindo a
incorporação dos mais diversos monômeros ao polímero e, síntese a partir de substratos não
relacionados, que pode ser observada em diversas Pseudomonas quando cultivadas em
presença de substratos que são metabolisados a acetil-CoA (glicose, frutose, gliconato,
acetato, glicerol), produzindo um polímero contendo 3-hidroxidecanoato (3HD) como
principal constituinte, além de outros constituintes secundários.
As vias metabólicas que fornecem os intermediários nos dois tipos de síntese de
PHAMCL são distintas como ilustra a Figura 3.3. A β-oxidação de ácidos graxos é a principal
via fornecedora para substratos relacionados e a biossíntese de ácidos graxos para os
substratos não relacionados (EGGINK et al., 1992; HUIJBERTS et al., 1992; HUIJBERTS et
al., 1994).
Segundo Gomez (2000), embora ensaios específicos realizados com inibidores da β-
oxidação ou da biossíntese de ácidos graxos por Huijberts et al. (1994) deixem claro o
envolvimento específico destas vias na síntese de PHAMCL, não pode ser descartada a
possibilidade de existirem várias vias fornecendo intermediários para a síntese de PHAMCL.
Huijberts et al. (1994) apresentam resultados que sugerem que a partir de hexanoato, os 3-
hidroxiacil-CoA são gerados por três rotas diferentes: (i) β-oxidação parcial do hexanoato,
gerando 3-hidroxihexanoil-CoA que corresponde a 72 % dos monômeros incorporados ao
PHA; (ii) a presença de constituintes insaturados indica que a biossíntese de ácidos graxos
também está operante (13% dos monômeros sintetizados) e (iii) síntese de 3-hidroxioctanoil-
CoA por elongação de 3-hidroxihexanoil-CoA com acetil-CoA.
22
Figura 3.3: Esquema representativo das vias metabólicas que fornecem intermediários para síntese de
polihidroxialcanoatos de cadeia média (adaptado de WITHOLT e KESSLER, 1999).
3.3 Produção de PHAMCL em biorreator
Duas são as estratégias utilizadas para a produção em biorreator de PHAMCL. Na mais
comumente empregada, o processo é operado de modo descontínuo-alimentado, aplicando-se
um desbalanceamento nutricional no meio de cultura para promover o acúmulo do polímero.
Após uma fase de crescimento celular em meio balanceado, impõe-se a limitação de um
nutriente imprescindível ao crescimento, que não seja a fonte de carbono (PEREIRA, 1996;
TACIRO et al., 1997; KIM et al., 1997; PICCOLI, 2000; LEE, 2002; KIM, 2002; ROCHA et
al., 2002; TACIRO et al., 2002; PEREIRA, 2003; DINIZ et al., 2004). A outra estratégia
consiste na operação do biorreator de modo contínuo, buscando modular a relação fonte de
carbono/nutriente e, em decorrência, o crescimento celular e acúmulo de polímero
(PREUSTING et al., 1993; HUIJBERT et al., 1996, DURNER et al., 2000).
Os trabalhos envolvendo regimes de crescimento com limitação dupla de nutrientes
descritos na literatura para acúmulo de PHAMCL se baseiam no fato de que o crescimento com
limitação múltipla de nutrientes pode ser utilizado para forçar as células a um estado
fisiológico particular e que tais condições podem resultar em aumentos de produtividade de
enzimas e metabólitos.
23
O procedimento consiste, basicamente, na condução de ensaios contínuos em
biorreator nos quais estados estacionários são estabelecidos para uma dada vazão específica
de alimentação (D) e a uma dada relação fonte de carbono/nutriente limitante (Co/Nxo). Os
resultados podem ser apresentados na forma de um ábaco onde se identificam três regiões
distintas (Figura 3.4): i) crescimento limitado na fonte de carbono e com o nutriente em
excesso; ii) condição de limitação do nutriente e fonte de carbono em excesso; iii) um regime
intermediário de crescimento em que carbono e o nutriente são supridos ao meio, porém não
são detectadas concentrações significativas da fonte de carbono e do nutriente limitante.
Essa sistemática de abordagem procura, principalmente, definir as interfaces entre
essas três regiões, procurando otimizar o suprimento de substratos e a formação de produto.
No caso da produção de PHA, o que tem se buscado é o cultivo celular na faixa de transição
entre a região de dupla limitação de nutriente e a de nutriente limitado e fonte de carbono em
excesso, pois essa região satisfaz duas condições importantes: baixas concentrações reais de
nutrientes inibitórios ou tóxicos que possam ser utilizados e otimização do suprimento de
substratos para se obter máximo teor de PHA com completa utilização da fonte de C.
Segundo Egli (1991) e Durner et al. (2000), o limite em torno da região onde ocorre
múltipla limitação pode ser estimado a partir de dados de fatores de conversão medidos em
condições de limitação única de um dos substratos. Egli e Quayle (1986) propuseram que para
dois nutrientes (carbono e nitrogênio) em cultivo contínuo pode-se estabelecer esta região a
partir das definições dos fatores de conversão:
Yx/c = X/(Co – C) (1)
Yx/n = X/(No – N) (2)
onde Co e No são as concentrações de carbono e nitrogênio no meio alimentado, C e N as
correspondentes concentrações residuais e Yx/c e Yx/n os fatores de conversão de
biomassa em carbono e nitrogênio, respectivamente.
De (1) e (2) temos:
X = (Co – C)* Yx/c = (No – N)* Yx/n (3)
Dado que C e N se aproximam de zero quando o crescimento é limitado em carbono e
nitrogênio, a equação (3) resulta em:
24
Figura 3.4: Esquema representando os limites da região de crescimento com múltipla limitação de
nutrientes. D corresponde à vazão específica de alimentação empregada e Co/Nxo a relação entre a massa de carbono e a do nutriente limitado no meio de alimentação, que corresponde aos valores consumidos na condição de crescimento limitado. Adaptado de DURNER et al. ,1998.
Co/No = Yx/n / Yx/c (4)
Assumindo como constantes os fatores de conversão sob crescimento limitado em um
único substrato, o limite em torno da região onde ocorre múltipla limitação pode ser estimado
a partir dos valores de fatores de conversão medidos em condições de crescimento limitado
em carbono e, de modo semelhante, para a condição de limitação em nitrogênio. Segundo Egli
(1991), o conceito de crescimento com dupla limitação carbono/nitrogênio pode ser estendido
a outros dois ou mesmo a múltiplas combinações de nutrientes.
Exemplos de crescimento com limitação simultânea de diferentes nutrientes têm sido
reportados na literatura: Cooney et al. (1976) para nitrogênio e fósforo, Hueting e Tempest
(1979) para carbono e nitrogênio e carbono e potássio, Egli (1982), Egli (1991), Durner
(1998) e Durner et al. (2000) para carbono e nitrogênio.
A manipulação da relação C/N do meio de alimentação para atingir estados de dupla
limitação, empregado no presente trabalho, foi também utilizada para produção de poli-3-
hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato, por Yan et al. (2005). Ralstonia eutropha ATCC 17669
foi cultivada em biorreator em processo descontínuo-alimentado utilizando como fonte de
carbono uma mistura de ácidos orgânicos (butírico, propiônico, acético e láctico) e sulfato de
amônio como fonte de N. Diferentes vazões de alimentação com diferentes relações C/N
25
foram experimentadas e as zonas de dupla limitação dos substratos determinadas. Foi possível
estabelecer qual a melhor relação das correntes de alimentação das fontes de C e N e observar
que até cerca de 50% do polímero formado se deu durante o período de dupla limitação.
A Tabela 3.1 resume os resultados mais significativos descritos na literatura de
produção de PHAMCL em biorreatores com diversas linhagens.
Considerando que a fonte de carbono utilizada na produção de PHA representa uma
importante parcela do item de custos do processo, vários são os trabalhos que empregam
substratos de baixo custo, tais como óleos vegetais ou mesmo ácidos graxos deles derivados
(EGGINK et al., 1995; CROMWICK et al., 1996; TAN et al., 1997; HAZER et al., 1998).
Segundo Gomez (2000), a produção de PHAMCL a partir de carboidratos seria outra alternativa
para redução dos custos, entretanto, tem sido pouco estudada e sem uma real avaliação do
potencial de produção industrial destes polímeros (HAYWOOD et al., 1990; TIMM e
STEINBÜCHEL, 1990). Kim et al. (1996) cultivaram P. putida BMO1 em glicose, atingindo
100 g/L de biomassa total, porém, com apenas 0,6 g/L de PHA em cultivo descontínuo
alimentado. Weusthuis et al. (1997) atribuem o descaso com a produção de PHAMCL a partir
de carboidratos à diferença nos valores máximos teóricos dos fatores de conversão destes
substratos em PHAMCL, quando comparados aos valores com ácidos carboxílicos. Entretanto,
do ponto de vista industrial, o fator importante que deve ser considerado é o impacto da fonte
de carbono no custo de produção. Gomez (2000) apresenta uma comparação dos custos
mínimos de fonte de carbono para produção de PHAMCL a partir de sacarose ou de óleo de
soja demonstrando valores semelhantes.
O IPT e a USP tem estudado a produção de PHAMCL utilizando tanto óleos de origem
vegetal como carboidratos. Gomez (2000) isolou várias linhagens bacterianas capazes de
acumular PHAMCL a partir de carboidratos e a linhagem P. putida IPT 046 foi selecionada por
apresentar a melhor eficiência na conversão de carboidratos nestes polímeros. Ensaios em
biorreator com essa linhagem e utilizando glicose e frutose, resultaram em um polímero
contendo monômeros de 3-hidroxihexanoato (3HHx), 3-hidroxioctanoato (3HO), 3-
hidroxidecanoato (3HD), 3-hidroxidodecanoato (3HDd) e cerca de 5% de monômeros
insaturados 3-hidroxi-5-cis-dodecenoato (3HDd∆5) e 3-hidroxi-7-cis-tetradecenoato
(3HTD∆7) (SANCHEZ et al., 2003). Diniz et al. (2004) estudaram a produção de PHAMCL
com P. putida IPT 046 cultivada em glicose e frutose como fontes de carbono. Foram testados
vários procedimentos descontínuos-alimentados para o crescimento microbiano, seguidos de
limitação por nitrogênio ou fósforo para indução da síntese do polímero. O melhor resultado
foi obtido através de um cultivo com alimentação a vazão constante da fonte de carbono até
26
crescimento de biomassa de cerca de 30 g/L, seguida de limitação da fonte de fósforo,
resultando em cerca de 50 g/L de biomassa com 63% de teor de polímero e produtividade de
cerca de 0,8 g/L.h.
Dentre vários isolados, Silva-Queiroz (2003) identificou 4 linhagens bacterianas
capazes de acumular PHAMCL utilizando diferentes óleos vegetais (soja, milho, canola, arroz,
girassol). A utilização de óleo de soja como fonte de carbono resultou num polímero
constituído de monômeros 3HHx, 3HO, 3HD, 3HDd e 3HTD (3-hidroxitetradecenoato) com
cerca de 30 a 40% de monômeros insaturados.
Além do cultivo em biorreator, operações para separação e purificação do polímero
intracelular também têm que ser consideradas para a produção industrial de PHAMCL. Os
procedimentos para separação e purificação são semelhantes em vários aspectos àqueles
originalmente desenvolvidos para P3HB ou P3HB-co-3HV. De Koning e Witholt (1997)
desenvolveram processo de solubilização de todos os constituintes celulares de P. oleovorans
e P. putida com a conseqüente liberação do PHAMCL produzido, obtendo-se um látex, ou seja,
grânulos de PHA suspensos em água em concentrações de aproximadamente 300 g/L. O látex
representa uma boa maneira de manipular industrialmente estes materiais, uma vez que o
produto puro apresenta-se aderente e pode demorar vários dias para cristalizar (DE KONING
et al., 1997a).
27
Tabela 3.1: Quadro resumo de resultados obtidos de produção de PHAMCL em biorreator.
Bactéria Fontes de C PHA X
(g/L)
PHA
(%)
P
(g/Lh)
Tipo de processo Referência
P. putida IPT046 glicose e frutose C8 a C12 (1) 51 63 0,8 descontínuo alimentado DINIZ et al., 2004
P. oleovorans ATCC29347
ac. Octanóico - 63
55
62
75
1
0,63
descontínuo alimentado KIM, 2002
P. putida ác. Oléico - 141 52 1,91 descontínuo alimentado LEE et al., 2000
P. oleovorans n-octano - 18 63 1,06 contínuo (2 estágios) JUNG et al., 2000
P. putida KT2442 ác. octanóico e ác. undecenóico
C6 a C11 (2) 30 33 0,20 descontínuo alimentado KELLERHALS et al., 1999
P. oleovorans n-octano - 12
18
30
63
0,74
1,1
contínuo
contínuo (2 estágios)
HAZENBERG e WITHOLT, 1977
P. putida glicose e octanoato - 54,8 66 0,92 descontínuo alimentado KIM et al., 1997
P. putida BM01 Glicose - 100 1 - descontínuo alimentado KIM et al., 1996
P. putida ác.oleico C6 a C16 (3) 30 35 0,67 contínuo HUIJBERTS et al., 1996
P. putida KT2442 ác.oleico C6 a C16 (3) 92 45 1,50 descontínuo alimentado HUIJBERTS et al., 1996
11,6 23 0,58 contínuo (2 estágios) PREUSTING et al., 1993 P. oleovorans n-octano C6 e C8
37,1 33 0,25 descontínuo-alimentado PREUSTING et al., 1993
(1) polímero com 5% de constituintes insaturados; (2) polímero com 43,5 mol% de constituintes insaturados, presença de constituintes impares (C7, C9 e C11); (3) somente constituintes pares.
28
3.4 Engenharia metabólica na produção de PHAMCL
A engenharia metabólica permite otimizar a produtividade e os fatores de conversão
de substrato aos produtos de interesse através da análise do fluxo metabólico (AFM) e se
preocupa em modelar os sistemas biológicos de uma forma mais estruturada, realizando
balanços de massa envolvendo metabólitos intracelulares para calcular os seus fluxos através
de toda a rede metabólica, nem sempre considerados na modelagem matemática convencional
(STEPHANOPOULOS et al., 1998).
Estes fluxos podem ser calculados através das medidas das velocidades específicas de
produção e consumo de metabólitos intracelulares, bem como de consumo de substratos e
formação de produtos medidos fora do envelope celular. Por meio de balanço de massa e
considerando a estequiometria das diversas reações metabólicas, é possível o estabelecimento
de um modelo estequiométrico de um processo biológico, utilizando-se ferramentas de
álgebra linear e otimização linear para resolução do modelo. Outra forma de abordagem inclui
o uso de isótopos marcados para determinar a partição dos fluxos pelas vias metabólicas,
permitindo elaborar um mapa metabólico com um diagrama das principais reações
bioquímicas envolvidas e a estimativa das velocidades de cada passo em estado estacionário
(GOMBERT e NIELSEN, 2000). Isto permite comparar os fluxos metabólicos estabelecidos
em diferentes situações de cultivo, fluxos para linhagens de células modificadas
geneticamente em diferentes pontos da via metabólica e identificar pontos chaves de
ramificação, para a proposição de vias metabólicas alternativas, para a estimativa de fluxos
extracelulares não considerados durante a elaboração do modelo e para o cálculo dos fatores
de conversão máximos teóricos a partir de um dado substrato (STEPHANOPOULOS et al.,
1998).
Recentemente, a AFM tem sido utilizada para estudar as vias de síntese de PHA em
diferentes microrganismos (LEAF e SRIENC, 1998; KATO et al., 1999), permitindo entender
melhor as vias metabólicas envolvidas e indicar pontos relevantes onde se poderia atuar para
maximizar o rendimento da produção do polímero (SHI et al., 1999; SRIENC, 2002; LEE,
2002; LANGE et al., 2002). A biossíntese de PHA oferece uma situação ideal para análise de
fluxos metabólicos, pois, em diversas situações, a análise é facilitada devido ao fluxo de
metabólitos desviados para o crescimento celular ser nulo, ou seja, todo o carbono é
direcionado para a síntese de PHA (BRÄMER et al., 2002).
29
3.5 Aplicações para PHAMCL
Considerando que as propriedades dos PHA variam com sua composição monomérica,
um aspecto a ser destacado sobre a produção de PHA é a grande diversidade de monômeros
que podem ser a eles incorporados e seu potencial para a produção sob medida para diferentes
aplicações. Embora diversos monômeros tenham sido detectados em PHA, na maioria dos
casos, sua incorporação só foi obtida utilizando substratos com estrutura estritamente
relacionada ao monômero produzido e as possibilidades de combinações ainda são bastante
restritas (STEINBÜCHEL e VALENTIN, 1995). Além disso, a pequena escala de produção
da maioria do PHAMCL dificulta sua caracterização completa e com isso o estabelecimento de
relações entre a composição monomérica e as propriedades do material obtido.
Embora ainda não disponíveis comercialmente, uma série de aplicações potenciais têm
sido desenvolvidas para PHAMCL. Por sua fácil manipulação na forma de látex, podem ser
utilizados como filmes de revestimentos de papel, papelão, etc. (DE KONING et al., 1997b).
Uma outra aplicação promissora para PHAMCL é como fonte para monômeros quirálicos
(WITHOLT e KESSLER, 1999). Babu et al. (1997) verificaram que formulações baseadas em
determinados PHA apresentam características específicas boas para adesivos sensíveis à
pressão. Van der Walle et al. (1999) cita a utilização de PHA produzidos por P. putida como
agentes ligantes em formulações de tintas, que permitiriam a substituição dos solventes
orgânicos por água, possibilitando o desenvolvimento de tintas não agressivas ao meio
ambiente. Por serem biocompatíveis, aplicações na área medica, também têm sido objeto de
estudos. PHAMCL têm sido avaliados para a produção de "scaffolds" (moldes que suportam e
dirigem o crescimento das células) em aplicações de engenharia de tecidos (WILLIAMS et
al., 1999). Diversas aplicações para PHA na área de aparatos médicos bioabsorvíveis vêm
sendo desenvolvidas pela Tepha, Inc. (http://www. tepha.com).
Vários são os trabalhos citados por Kim et al. (2007) para modificação de
propriedades de PHAMCL visando aplicações na área médica. Estudos que envolvem blendas
com outros materiais (MALLARDÉ et al., 1998; RENARD et al., 2004; KIM et al., 2005),
“crosslinking” (ligações cruzadas) de PHAMCL insaturados empregando luz ultravioleta (KIM
et al, 2001), raios γ (ASBY et al., 1998; DUFRESNE et al., 2001) ou peróxidos (GAGNON et
al., 1994), ou mesmo a utilização de tratamentos térmicos juntamente com ultravioleta e
peróxidos (HAZER et al.,2001; CHUNG, 2005). Substituições químicas nas cadeias laterais
em PHAMCL insaturados introduzindo grupos funcionais tais como epóxi (BEAR et al., 2001),
30
hidroxila (LEE et al., 2000; EROGLU et al., 2005) ou grupos clorados (ARKIN et al., 2000)
também são citados.
Dentro desse panorama mundial apresentado, esse trabalho se insere neste cenário que
ainda carece de estudos e metodologias que otimizem condições para obter PHAMCL com
diferentes composições monoméricas para testar e ampliar suas aplicações.
31
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Ensaios em biorreator
Microrganismo: a linhagem Pseudomonas putida IPT 046 foi a utilizada em todos os
ensaios.
Preparo de inóculo: o inóculo foi preparado a partir de colônias isoladas de cultura
mantida em freezer a –70ºC. A Figura 4.1 apresenta um esquema do preparo de inóculo.
As composições dos meios de cultura utilizados nessa etapa estão descritos a seguir.
O Meio Caldo Nutriente (CN) continha a seguinte composição por litro:
[1] peptona ......................... 5,0 g [2] extrato de carne ............ 3,0 g
O meio de Agar Nutriente (AN) continha a mesma composição do meio CN, porém,
acrescido de 20 g de ágar bacteriológico por litro de meio de cultura.
O Meio Mineral-inóculo (MM) continha a seguinte composição por litro:
[1] (NH4)2SO4...................... 3,0 g [2] Na2HPO4........................3,5 g
[3] KH2PO4 ........................1,5 g [4] MgSO4.7H2O ................1,0 ml [5] CaCl2.2H2O ...................1,0 ml [6] Citr. Fe NH4....................1,0 ml [7] Elementos traços.............1,0 ml [8] Glicose............................10,0 g
Soluções estoque contendo MgSO4.7H2O (20%), CaCl2.2H2O (1%) e Citrato Fe NH4 (6%),
porcentagens expressas em massa por volume, eram mantidas em geladeira para o preparo
desse meio (MM), sendo a solução de citrato férrico amoniacal armazenada em frasco escuro.
A solução de elementos traços era composta por: 0,30 g/L de H3BO3, 0,20 g/L de
CoCl2.6H2O, 0,10 g/L de ZnSO4.7H2O, 0,03 g/L de MnCl2.4H2O, 0,03 g/L de
NaMoO4.2H2O, 0.02 g/L de NiCl2.6H2O e 0,01 g/L de CuSO4.5H2O e também mantida em
geladeira.
Os ensaios realizados foram divididos em dois grupos: os realizados a baixa densidade
celular (concentração de biomassa celular menor que 6 g/L) e os em alta densidade celular
(concentração de biomassa celular acima de 15 g/L).
32
Figura 4.1: Esquema de preparo de inóculo.
Todos os ensaios em biorreator foram realizados com pH e temperatura controlados a
7,0 e 30oC, respectivamente. O controle do pH era feito com NaOH e H2SO4 0,5 N nos
ensaios a baixa densidade celular e, 1,0 N nos ensaios em alta densidade celular, sendo o
consumo acompanhado com o auxílio de balança. Os ensaios iniciais foram realizados em
biorreator New Brunswick Scientific modelo Microferm com dorna de 3 litros (1,75 L) e
posteriormente em biorreator B. Braun modelo Biostat B (1,5 L) com dorna de 2 litros.
Ensaios preliminares visando obter maiores valores de produtividade (alta densidade) foram
realizados no biorreator B. Braun modelo Biostat B (2,4 L) com uma dorna de 4 litros. Os
biorreatores foram acoplados a um analisador Hartmann & Braun modelo Uras de CO2 e O2
para realização de balanço gasoso. Para a alimentação e retirada de meio de cultura do
biorreator utilizaram-se bombas peristálticas (Masterflex, modelo 7523-35). A figura 4.2
ilustra a montagem dos ensaios em biorreator operado de forma contínua.
33
Figura 4.2: Biorreator operado de forma contínua.
Os cultivos a baixa densidade celular tinham início com uma batelada em meio com
composição descrito a seguir (Meio Mineral – batelada) e após cerca de 5 horas da batelada
inicial, iniciava-se o cultivo contínuo através do acionamento das bombas peristálticas.
O Meio Mineral- batelada continha a composição descrita abaixo (por litro).
[1] (NH4)2SO4...................... 1,570 g [2] KH2PO4 ........................0,209 g [3] MgSO4.7H2O ................0,195 g [4] CaCl2.2H2O ..................0,001 g [5] Citr. Fe NH4................. 0,003 g [6] Elementos traços........... ....2,0 ml [7] NaCl..................................1,0 g [8] Glicose..............................5,25 g Frutose..............................5,25 g
A solução de elementos traços era a mesma empregada no preparo do meio de inóculo (MM)
e foi a utilizada em todos os meios minerais nos ensaios realizados.
O meio alimentado nesses ensaios (Meio Mineral–contínuo) possuía a composição
básica (por litro) descrita abaixo, estimada para cerca de 1,8 g/L de biomassa celular livre de
polímero, variando-se apenas a concentração da fonte de carbono:
34
[1] (NH4)2SO4.......................1,570 g [2] KH2PO4 ......................0,209 g [3] MgSO4.7H2O..................0,168 g [4] CaCl2.2H2O....................0,001 g [5] Citr. Fe NH4...................0,003 g [6] Elementos traços....................2 ml [7] NaCl........................................1 g
Para aplicação do método dinâmico de determinação de velocidade específica de
crescimento, segundo Pirt (1975), foi utilizado o seguinte meio de cultura (composição por
litro):
[1] (NH4)2SO4.......................2,762 g [2] KH2PO4 ......................0,368 g [3] MgSO4.7H2O.................0,295 g [4] CaCl2.2H2O....................0,002 g [5] Citr. Fe NH4...................0,006 g [6] Elementos traços...................2 ml [7] NaCl.......................................1 g [8] Glicose..................................20 g Frutose..................................20 g
Nos ensaios com excesso de fonte de carbono, os meios foram preparados com cerca
de 12,5 g/L de glicose e 12,5 g/L de frutose, tendo os outros componentes a composição
descrita para o Meio Mineral – contínuo. Ensaios limitados em fonte de carbono foram
preparados com cerca de 2,5 g/L de glicose e 2,5 g/L de frutose. Nos ensaios limitados em
fósforo, a concentração da fonte de nitrogênio (NH4)2SO4 foi aumentada de 1,57 g/L para 4,71
g/L e nos ensaios limitados em nitrogênio, à concentração da fonte de fósforo (KH2PO4) que
inicialmente era de 0,209 g/L foi aumentada para 0,45 g/L e, num segundo ensaio, para 0,90
g/L. A composição da solução de elementos traços do Meio mineral – contínuo e do meio
utilizado para determinação da velocidade específica de crescimento foi a mesma do preparo
de inóculo.
Nos ensaios em alta densidade celular o meio Meio Mineral - batelada continha a
composição descrita a seguir (por litro):
[1] (NH4)2SO4.....................11,630 g [2] KH2PO4 .........................1,550 g [3] MgSO4.7H2O .................1,240 g [4] CaCl2.2H2O ...................0,0073 g [5] Citr. Fe NH4...................0,0237 g [6] Elementos traços........... ....2,0 ml [7] NaCl...................................1,0 g [8] Glicose..............................22,23 g Frutose..............................22,23 g
35
Os cultivos em alta densidade celular tinham início com uma batelada em meio com a
composição descrita acima (Meio Mineral – batelada) e, iniciava-se o cultivo contínuo quando
as concentrações de glicose e frutose atingiam valores próximos de zero, através do
acionamento das bombas peristálticas.
A Tabela 4.1 apresenta a composição dos meios alimentados nos ensaios de alta
densidade.
Tabela 4.1: Composição dos meios de alimentação dos ensaios em alta densidade (quantidade dos reagentes em g/litro de meio alimentado).
Ensaio MCLc 17 MCLc 18 MCLc 19 MCLc 20 MCLc 22
Glicose 102 75 54 68 198 258
Frutose 102 75 54 68 198 258
(NH4)2SO4 26,164 26,164 12,129 25,48 24,81 33,35 24,67
KH2PO4 3,487 3,487 1,395 2,48 3,29 4,44 2,30 2,08
MgSO4.7H2O 2,794 2,794 1,118 1,49 2,65
CaCl2.2H2O 0,017 0,017 0,007 0,009 0,016
Citr. Fe NH4 0,053 0,053 0,021 0,028 0,051
Elementos Traços(1) 6 6 2 4 4
NaCl 3 3 1 1,33 1,33
(1) Mililitros por litro de meio alimentado.
Em todos os ensaios as vazões de alimentação eram verificadas periodicamente e
amostragens foram realizadas para a análise de: biomassa celular, teor e composição de PHA,
concentração das fontes de carbono, fósforo, nitrogênio e ácidos, segundo as metodologias
descritas a seguir. O controle de possíveis contaminações ao longo dos ensaios também foi
realizado através de observação microscópica de lâminas coradas (coloração de Gram) e
estrias em placas com meio de Ágar Nutriente.
36
4.2 Metodologias analíticas
Massa seca celular: a biomassa celular foi determinada por gravimetria após
centrifugação de volume conhecido da cultura, filtração em membrana de poro 0,45 µm
(Millipore) e secagem em estufa a 105oC por 5 horas.
A biomassa celular também foi estimada por determinação da absorbância a 625 nm,
após centrifugação da amostra, descarte do sobrenadante e suspensão em solução salina (8,5%
NaCl). Solução salina foi utilizada como branco e as amostras foram diluídas com a mesma
solução quando necessário.
Concentração de nitrogênio amoniacal: A concentração de nitrogênio amoniacal foi
determinada em potenciômetro (Procyon - mod SA720) com eletrodo específico para
detecção de amônia (Orion - mod. 95-12) após alcalinização da amostra (pH > 9) com NaOH
10 M. Soluções de (NH4)2SO4 contendo cerca de 10, 25, 50, 100, 250 e 500 ppm de
nitrogênio foram utilizadas para obtenção de curva de calibração.
Concentração dos ácidos acético, propiônico, pirúvico e fórmico A concentração dos
ácidos foi determinada por cromatografia de fase líquida (HPLC). Um volume de 20 µL de
amostra, adequadamente diluída para uma concentração entre 0,1 e 4,0 g/L, filtrada em
membrana de poro 0,45 µm (Millipore), foi injetado em cromatógrafo (Waters) equipado com
uma coluna para determinação de ácidos (Shodex KC 811). Os ácidos foram detectados
através de índice de refração diferencial (Waters 410 differential refractometer). Soluções
contendo cerca de 0,1 a 4,0 g/L de cada um dos ácidos analisados foram utilizadas para
obtenção de uma curva de calibração. As condições de operação do aparelho foram as
seguintes: temperatura de coluna de 55 oC, e como fase móvel uma solução aquosa de H3PO4
0,1% com vazão de 1,0 mL/min.
Concentração de carboidratos: As concentrações de glicose e frutose foram
determinadas por cromatografia de fase líquida (HPLC). Um volume de 10 µL de amostra,
adequadamente diluída para uma concentração entre 0,1 e 3,5 g/L, foi filtrada em membrana
de poro 0,45 µm (Millipore) e injetada em cromatógrafo (Waters) equipado com coluna para
determinação de açúcares (Shodex SC 1011). Os carboidratos foram detectados por índice de
refração diferencial (Waters 410 differential refractometer). A calibração do aparelho foi
realizada utilizando soluções contendo aproximadamente 0,1 a 3,5 g/L de cada um dos
açúcares. As condições de operação do aparelho foram as seguintes: temperatura de coluna de
72 oC e como fase móvel uma solução aquosa de EDTACa(Na)2 0,5 M com vazão de 0,6
mL/min.
37
Teor e composição de PHA: a quantidade e composição de PHA foram determinadas
por cromatografia de fase gasosa, segundo metodologia descrita por Gomez (2000). A
quantidade e composição de PHA foram determinadas através de cromatografia de fase
gasosa de propil-ésteres (RIIS e MAI, 1988). Entre 10 e 15 mg de células liofilizadas foram
transferidas para tubos, aos quais foram adicionados 2 mL de uma solução de ácido clorídrico
em propanol (1:4 v/v), 2 mL de 1,2-dicloroetano e 100 µL de uma solução de ácido benzóico
(40 g/L) em propanol. Os tubos foram fechados fortemente, agitados e submetidos a
propanólise por 3 horas a 100 oC, com agitação após os primeiros 30 minutos de propanólise.
Após resfriamento, foram adicionados aos tubos 4 mL de água destilada, agitando-os
vigorosamente por 30 segundos. Após separação, a fase aquosa (superior) foi descartada e a
fase orgânica (inferior) utilizada para análise. Um volume de 1 µL da fase orgânica foi
analisado após fracionamento da amostra ("split" 1:20) em cromatógrafo gasoso HP6890
Series GC System equipado com um coluna HP-5 (5% fenil-metil-siloxane, comprimento 30
m, diâmetro 0,25 mm, espessura do filme 0,25 µm). A análise foi realizada nas seguintes
condições: hélio como gás de arraste (0,8 mL/min), temperatura do injetor de 250 oC,
temperatura do detector de 300 oC, sistema de detecção FID (ionização de chama) e a seguinte
programação de temperatura: 100 oC por 1 minuto, elevação da temperatura até 185 oC a 8 oC/min e 185 oC por 15 minutos.
Ácido benzóico foi utilizado como padrão interno. Polímeros produzidos por P. oleovorans
ou P. putida a partir de diferentes fontes de carbono foram utilizados como padrões para a
geração das curvas de calibração. O PHA total foi calculado somando-se as quantidades dos
constituintes 3-hidroxihexanoato (3HHx), 3-hidroxioctanoato (3HO), 3-hidroxidecanoato
(3HD) e 3-hidroxidodecanoato (3HDd).
Concentração de fósforo: a concentração de fósforo foi determinada por colorimetria
pelo método do ácido ascórbico, descrita por Franson (1985). Uma solução de reativo era
preparada a partir da mistura das soluções: ácido sulfúrico (5N), tartarato de antimônio e
potássio (2,713g/L), molibdato de amônio (40g/L) e ácido ascórbico (0,1 M) na proporção em
volume de 10:1:3:6, respectivamente. No preparo da curva padrão partiu-se de uma solução
de K2HPO4 (219,5 mg/L). A leitura de absorbância era realizada a 880 nm, misturando-se:
200 µl de amostra ou padrão ou água (branco), 4,9 ml de água deionizada, 800 µl de reativo,
após 10 minutos de incubação e num intervalo de tempo de no máximo 30 minutos.
38
4.3 Avaliação de fluxos metabólicos na produção de PHAMCL
A análise de fluxos metabólicos (AFM) foi baseada no procedimento proposto por
Stephanopoulos et al. (1998). Ao longo de todos os ensaios foram retiradas amostras
periódicas e analisadas as concentrações de biomassa total, PHA, fontes de carbonos
fornecidos e ácidos orgânicos excretados (ácidos acético, pirúvico, fórmico e propiônico),
bem como o teor de O2 e CO2 nos gases de saída. A partir desses dados, calcularam-se as
velocidades específicas de cada um dos substratos consumidos e produtos formados bem
como os fatores de conversão dos substratos aos monômeros. Para a efetivação da AFM,
propuseram-se modelos de metabolismo, avaliando-se os fluxos dos metabólitos intracelulares
através da realização do balanço de massa em estado estacionário, utilizando-se das medidas
de velocidades específicas e da estequiometria dos modelos de metabolismo propostos.
No caso do modelo E3 utilizou-se o programa Metatool (FEIFFER et al., 2000 de
acesso livre na internet: http://pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/networks/metatool/
metatool.html) para simulação do modelo. O programa analisa e constrói vias metabólicas a
partir de dados bioquímicos e/ou seqüências genômicas. A metodologia adotada para o
desenvolvimento desse programa é baseada no conceito de modos elementares de fluxos. A
obtenção desses modos elementares de fluxos permite testar se conjuntos de enzimas formam
uma via metabólica consistente, compreendendo, principalmente, o direcionamento das
reações, a irreversibilidade. A partir da análise de um conjunto de vias metabólicas, o
programa gera regiões admissíveis de distribuição de fluxo em estado estacionário,
fornecendo as possíveis vias metabólicas juntamente com os respectivos fluxos das enzimas
responsáveis pelas reações. Um resumo da forma como funciona o programa se encontra no
Anexo C junto com os programas de entrada e saída utilizados nesse trabalho.
39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Determinação de velocidade específica máxima crescimento (µmax) para a linhagem
IPT 046
A determinação da velocidade específica de crescimento máxima (µmax) da linhagem
IPT 046 foi realizada empregando o Método dinâmico. Para esse experimento, utilizou-se
meio mineral descrito no item Material e Métodos.
Diniz et al. (2004) obtiveram valores de µmax de 0,65 h-1 para essa mesma linhagem.
Assim, com base nesses autores, a vazão específica de alimentação utilizada foi de 0,95 h-1.
Inicialmente, a vazão específica de alimentação foi mantida constante por 4 estados
estacionários em 0,4 h-1, atingindo uma concentração de biomassa de 2,97g/L. O valor de D
foi então alterado para 0,95 h-1, realizando-se amostragem a cada hora. A Figura 5.1 abaixo,
ilustra os resultados obtidos nesse ensaio, que corresponde as amostras realizadas entre as 70
e 78h do ensaio MCLc 04 (ANEXO A).
A equação da reta resultante obtida foi Ln (X/Xo) = – 0,321T – 0,038 e o valor de
µmax calculado de 0,63 h-1, valor praticamente igual ao obtido por Diniz et al. (2004) no
cultivo em batelada, que foi de 0,65 h-1.
Os ensaios conduzidos de forma contínua foram então planejados, considerando o
valor obtido de µmax, a vazões de alimentação menores e não muito próximas a esse valor
(µmax) para que os estados estacionários fossem atingidos e, não ocorresse desestabilização
do sistema (“lavagem”).
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
00 2 4 6 8
Tempo (h)
Ln(X
/Xo)
Figura 5.1: Valores de Ln (X/Xo) em função do tempo para o ensaio de determinação de µmax pelo método dinâmico para P. putida IPT 046.
40
5.2 Crescimento com limitação de nutrientes - ensaios contínuos em baixa densidade
celular
Aspectos econômicos da produção de PHAMCL foram avaliados por Hazenberg e
Witholt (1997) e De Koning et al. (1997a). Segundo De Koning et al. (1997a), os fatores mais
importantes que compõem o custo de produção de PHA são: o retorno do capital investido na
planta de produção, os substratos utilizados para se obter o produto, especialmente a fonte de
carbono, e a etapa de separação e purificação. Enquanto a produtividade do processo tem
grande influência no capital investido na planta, o fator de conversão de substrato em produto
impacta no valor a ser gasto com insumos para produção e, as operações unitárias utilizadas
sobre a separação e purificação do PHA. Já o teor de polímero acumulado pela biomassa
influenciará em todos os três fatores citados, assim, a busca por altos teores de PHAMCL é de
vital importância para a definição do seu processo de produção.
No planejamento desse conjunto de ensaios foi considerada a necessidade de otimizar
o suprimento de substratos e a formação de produto, que no caso da produção de PHA,
significa cultivo celular na faixa de transição entre a região de dupla limitação de substratos
(por exemplo, fontes de carbono e nitrogênio) e a de nutriente limitante (por exemplo, fonte
de nitrogênio) e fonte de carbono em excesso. Também foi admitido que o conceito de
crescimento com limitação simultânea de carbono e nitrogênio pode ser estendido a outros
dois ou mesmo a múltiplas combinações de substratos, bem como que o limite em torno da
região de múltipla limitação pode ser estimado a partir de dados de fatores de conversão
medidos em condições de limitação única de um dos substratos.
A Tabela 5.1 resume o conjunto de ensaios realizados para se estudar o efeito das
limitações carbono/nitrogênio e carbono/fósforo na produção de PHAMCL e estimar os limites
em torno da região em que ocorrem essas limitações.
Cabe lembrar que cada condição testada equivale a um meio de cultura com uma
relação carbono/nutriente e cerca de cinco vazões de alimentação, cada uma mantida por um
tempo equivalente a cerca de 4 tempos de residência no estado estacionário. Os valores de
vazão específica de alimentação (D) testados variaram entre 0,04 e 0,50 h-1.
A Figura 5.2 ilustra os resultados de concentração de biomassa (X) obtidos nos
ensaios. Verifica-se que os valores de X são crescentes para valores decrescentes de D nos
ensaios com excesso de fonte de carbono (MCLc 6, 8, 9, 10, 12 e 21, Figura 5.2 a), já nos
ensaios limitados também na fonte de carbono (MCLc 5, 7 e 11, Figura 5.2 b), os valores de
X variaram pouco com D, ficando em torno de 2 g/L.
41
Tabela 5.1: Condições dos ensaios realizados para estudar o efeito da limitação de nutrientes na produção de PHAMCL.
Condição testada Ensaio Fonte de carbono Fonte de nitrogênio Fonte de fósforo
MCLc 9 e 8* Excesso Limitado Limitado
MCLc 10 e 8* Excesso Limitado Excesso
MCLc 6, 12 e 21 Excesso Excesso Limitado
MCLc 5 Limitado Limitado Limitado
MCLc 11 Limitado Limitado Excesso
MCLc 7 Limitado Excesso Limitado
* Foram detectadas quantidades significativas de P no meio de cultivo para alguns valores de D do ensaio MCLc 8, por esse motivo ele aparece em duas condições testadas.
(a)
0
1
2
3
4
5
6
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60D (h-1)
X (g
/L)
MCLc 06
MCLc 08
MCLc 09
MCLc 10
MCLc 12 e 21
(b)
0
1
2
3
4
5
6
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60
D (h-1)
X (g
/L)
MCLc 05
MCLc 07
MCLc 11
Figura 5.2: Valores de concentração de biomassa (X) obtidos nas diferentes vazões específicas de alimentação (D): a) ensaios não limitados na fonte de carbono (MCLc 6, 8, 9, 10, 12 e 21); b) ensaios limitados na fonte de carbono (MCLc 5, 7 e 11).
42
Ensaios anteriores realizados em batelada e batelada alimentada mostraram que quase
não ocorre acúmulo de polímero para crescimento exponencial em meio não limitado em
nutrientes com essa linhagem (Diniz et al., 2004). Assim, para valores mais próximos da
velocidade específica máxima de crescimento dessa linhagem, menores valores de PHA eram
esperados como ocorrido. O baixo teor de polímero ou mesmo a não detecção do mesmo, na
condição de limitação da fonte de carbono também eram esperados, dado que o polímero
constitui material de reserva de fonte de carbono para o microrganismo, sendo acumulado
quando em excesso de fonte de carbono (ANDERSON e DAWES, 1990).
Quanto aos fatores de conversão, o que se observou é que variam com D e, nos ensaios
em que a fonte de carbono não foi limitante, o fator de conversão de fonte de carbono em
biomassa residual (livre de polímero) (Yxr/c) aumenta com o aumento da velocidade de
crescimento da biomassa, atingindo valores máximos da ordem de 0,4 – 0,5 g/g, como mostra
a Figura 5.3 quando praticamente não se observa acúmulo de polímero. O valor de 0,4 g/g é
citado no trabalho de Diniz et al. (2004) para essa mesma linhagem em condições de
crescimento celular, sem acúmulo de polímero e com a mesma fonte de carbono. Já nos
ensaios limitados em fonte de carbono, não foi possível estabelecer uma relação direta desse
parâmetro com D.
A limitação ou não na fonte de carbono resultou em comportamentos semelhantes de
valores de Yxr/p (Figura 5.4), valores praticamente constantes para toda a faixa de Ds
ensaiadas, valores na faixa de 30 – 40 g/g na condição de limitação em P, 20 – 25 g/g na
condição de limitação em N e 35 – 50 g/g para N e P limitados, sendo que nessa última
condição para limitação de fonte de C, os valores parecem ser um pouco inferiores aos com
excesso de fonte de carbono.
Quanto a Yxr/n (Figura 5.5), este variou pouco para os valores de D testados,
independente da limitação ou não da fonte de C. Os valores obtidos para a condição de
limitação em nitrogênio mostram-se um pouco superiores aos das duas outras condições
ilustradas nessa figura, porém são valores próximos aos citados para essa linhagem por Diniz
et al. (2004) e para A. eutrophus utilizando a mesma fonte de carbono na produção de PHA
(PICOLLI, 1995).
43
Nlim
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
Yxr/c
(g/g
)
Plim
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
Yxr/c
(g/g
)
N e Plim
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
Yxr/c
(g/g
)
Figura 5.3: Fator de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (Yxr/c) calculado nas
vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο).
44
Nlim
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
Yxr/p
(g/g
)
Plim
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
Yxr/p
(g/g
)
N e Plim
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
Yxr/p
(g/g
)
Figura 5.4: Fator de conversão de fósforo em biomassa residual (Yxr/p) calculado nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο).
45
Nlim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
Yxr/n
(g/g
)
Plim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
Yxr/n
(g/g
)
N e Plim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
Yxr/n
g/g
)
Figura 5.5: Fator de conversão de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n) calculado nas vazões
específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C (•) e limitados na fonte de C (ο).
46
A partir dos valores de Co/No e Co/Po calculados segundo Egli e Quayle (1986), construiram-
se as Figuras 5.6, 5.7, 5.8 e 5.9. As Figuras representam uma estimativa dos limites da região
de múltipla limitação de nutrientes buscada, isto é, a fronteira entre a região limitada em
nutriente e fonte de carbono (região inferior) e a região limitada em nutriente e não limitada
em fonte de carbono (região superior). Para a construção desses gráficos (Figura 5.6 a 5.9)
considerou-se que concentrações de nitrogênio residuais menores que 200 mg/L, fósforo
residual menores que 20 mg/L e fonte de carbono residual (glicose + frutose) menores que 2
g/L eram limitantes (MARANGONI et al., 2002; DINIZ et al., 2004).
Nlim
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0Co/No (gC/gN)
D (h
-1)
MCLc10MCLc11MCLc 8
Limitação em N e não limitação em C
Limitação em C e não limitação em N
Figura 5.6: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C e N): relações Co/No (g de
C/g de N consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação (D).
Os resultados obtidos ilustrados nas Figuras 5.6 a 5.9, indicam que o limite superior da
região de múltipla limitação é função da velocidade de crescimento do microrganismo, sendo
os valores de Co/No e Co/Po crescentes com a diminuição de D. Já para o limite inferior,
Co/No e Co/Po variam muito pouco com D.
Para a condição de limitação somente em N (Figura 5.6), obteve-se uma região de
crescimento com múltipla limitação com Co/No variando num intervalo entre 9,5 e 27,8
gC/gN para D variando de 0,05 a 0,45 h-1. Durner et al. (2000) obtiveram uma região de
crecimento com múltipla limitação bastante semelhante para cultivo contínuo limitado em N
47
de P. oleovorans, um intervalo entre 7 e 28 gC/gN para D variando de 0,05 a 0,40 h-1, embora
utilizando uma fonte de carbono distinta. Egli (1991) cita valores de 6 a 24 gC/gN para D
variando de 0,9 a 0,02 h-1 para cultivo de Klebisiella pneumoniae em quimiostato empregando
glicerol como fonte de carbono. Durner et al. (2001) relacionam o fenômeno de crescimento
em limitação múltipla de nutrientes a habilidade do microrganismo em ajustar sua
composição celular a disponibilidade desses nutrientes. Segundo esses autores, quanto maior a
flexibilidade do microrganismo mais extenso é o regime de crescimento com limitação
múltipla em cultivo contínuo.
Na Figura 5.7, sob condição de limitação em P, os valores de Co/Po variaram no
intervalo aproximado de 30 a 160 gC/gP para D entre 0,05 a 0,49 h-1 na região de crescimento
com múltipla limitação.
Quando a limitação foi simultaneamente em N e P, a região de crescimento com
múltipla limitação foi observada para D variando entre 0,05 e 0,49 h-1 para Co/No no
intervalo aproximado de 7,5 e 26 gC/gN (Figura 5.8) e Co/Po entre 31 e 131 gC/gP (Figura
5.9). Se compararmos a extensão da faixa de limitação múltipla das figuras 5.6 e 5.8 e, 5.7 e
5.9, o que se observa é uma diminuição dessa extensão quando a limitação é conjunta em N e
P, em ambos os casos. Se considerarmos a afirmação de Durner et al. (2001) com relação à
extensão do regime de crescimento com múltipla limitação, essa diferença pode ser atribuída
ao fato de que para um mesmo microrganismo, a habilidade em ajustar a composição celular à
limitação de um nutriente deve ser mais simples do que para dois nutrientes.
A necessidade de se otimizar o suprimento de substratos e a formação de produto, que
no caso da produção de PHA significa cultivo celular na faixa de transição entre a região de
dupla limitação de substratos (por exemplo, fontes de C e N) e a de nutriente limitante (por
exemplo fonte de N) e não limitado na fonte de C, faz com que a atenção maior seja
dispensada para essa região desses gráficos. Assim, foram construídas as Figuras 5.10 a 5.13
que representam o teor de PHA acumulado, o fator de conversão da fonte de C em polímero, a
composição do mesmo e a produtividade nas vazões de alimentação testadas para os ensaios
limitados em N, limitados em P e limitados em N e P.
48
Plim
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0 40 80 120 160 200Co/Po (gC/gP)
D (h
-1)
MCLc 6 e 6bMCLc 12MCLc 7MCLc 21
Limitação em P e não limitação em C
Limitação em C e não limitação em P
Figura 5.7: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C e P): relações Co/Po (g de C/g
de P consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação (D).
N e Plim
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0Co/No (gC/gN)
D (h
-1)
MCL5MCL9MCL8
Limitação em N e P e não limitação em CLimitação
em C e não limitação em N e P
Figura 5.8: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C, N e P): relações Co/No (g de C/g de N consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação (D).
49
N e Plim
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0 40 80 120 160 200Co/Po (gC/gP)
D (h
-1)
MCLc 5
MCLc 9
MCLc 8
Limitação em C e não limitação em N e P
Limitação em N e P e não limitação em C
Figura 5.9: Estimativa da região de múltipla limitação de nutrientes (C, N e P): relações Co/Po (g de
C/g de P consumidos) para diferentes vazões específicas de alimentação (D).
A Figura 5.10 mostra valores de PHA para as diferentes condições de limitação e o
que se observa é que maiores valores de polímero são acumulados quando P é o
nutriente limitante (valores máximos próximos a 70% de polímero). Quando a limitação é
somente na fonte de N, o máximo valor de teor de PHA obtido é de somente 40% da biomassa
celular. Entretanto, a limitação em ambos os substratos (N e P), além do alto teor de
polímero (68%) resulta em melhores fatores de conversão de fonte de carbono em polímero,
valores de YPHA/C de 0,19 g/g quando comparado com 0,16 g/g para limitação só em P e 0,10
g/g para limitação só em N (Figura 5.11).
Segundo Aguena (2007) existe um regulon (PHO), cuja principal característica é sua
indução exclusivamente na carência de P inorgânico, ou seja, sob limitação de fosfato a célula
muda o padrão de expressão gênica.
Assim, uma explicação para um maior acúmulo de PHA sob limitação de P poderia
estar relacionado com a indução da expressão de genes importantes ao acúmulo de PHA e que
fazem parte do regulon PHO. Resultado semelhante foi observado por Elbahloul e
Steinbüchel (2006) com relação ao acúmulo de cianoficina em Acinetobacter sp. Em
linhagem recombinante de Acinetobacter superexpressando o gene phoB (ativador do regulon
PHO) foi observado um maior acúmulo de cianoficina mesmo em condições não limitantes de
fosfato.
50
Nlim
0
20
40
60
80
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
PHA
(%)
Plim
0
20
40
60
80
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
PHA
(%)
N e Plim
0
20
40
60
80
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
PHA
(%)
Figura 5.10: Teor de polímero (PHA) obtido nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos
ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim), não limitados em fonte de C.
51
A Figura 5.12 mostra a composição do polímero acumulado para os diferentes valores
de D testados, correspondentes à Figura 5.10. Observa-se que, independente do tipo de
limitação, a predominância é do monômero de 3-hidroxidecanoato (C10) cuja fração molar
fica na faixa de 70% a 80%. Os monômeros 3-hexanoato (C6), 3-hidroxioctanoato (C8) e o 3-
hidroxidodecanoato (C12) também estão presentes no polímero e, na condição de maior
acúmulo, a composição é praticamente a mesma para as 3 condições testadas, cerca de: 3%
mol de C6, 20% mol de C8, e 5% mol de C12.
A composição de um polímero produzido pela mesma linhagem utilizada neste
trabalho em regime descontínuo-alimentado, limitado em N a partir de glicose e frutose é
descrita por Sánchez et al. (2004). O polímero obtido nesse trabalho também tem como
monômero predominante C10 porém, em porcentagens um pouco menores (60 - 70% mol), 20
- 25% mol de C8 e 6% mol de monômeros insaturados.
A Figura 5.13 mostra os valores de produtividade para as diferentes condições de
limitação e os maiores valores obtidos são da ordem de 0,16 – 0,18 gPHA/L.h, obtidos para D
= 0,05 h-1, nas condições de limitação somente em P e em N e P simultaneamente. Na
condição de limitação em N os valores máximos foram da ordem de 0,08 gPHA/L.h. Esses
valores são inferiores ao citado para essa mesma linhagem em cultivo descontínuo-alimentado
à alta densidade celular por Diniz et al. (2004) que foi de 0,8 g/Lh. Cabe lembrar, entretanto,
que o conjunto de ensaios realizados tinha como objetivo principal, otimizar o suprimento de
substratos e a formação de produto e foram realizados a baixas densidades celulares.
A partir dos dados coletados ao longo dos ensaios da composição em O2 e CO2 do gás
de saída do biorreator, foi possível calcular as velocidades de consumo de O2 e produção de
CO2. Para cada D testado, um valor médio foi calculado tomando os pontos do estado
estacionário estabelecido.
Pirt (1985) cita que a velocidade específica de consumo de oxigênio (qO2) pode ser
equacionada segundo a relação (equação 5) a seguir, que relaciona o fator de conversão de
oxigênio em células (Yx/o), a quantidade de oxigênio gasto pelas células para manutenção das
mesmas (mo), a velocidade específica de crescimento celular (µ) e a concentração da
biomassa celular (x).
qO2 = mo + (1/Yx/o) µx (5)
52
Partindo da definição de velocidade de consumo de oxigênio e considerando que em
cultivos contínuos a velocidade específica de crescimento celular é dada pela vazão específica
de alimentação, tem-se que a velocidade específica de consumo de oxigênio (qO2) é
proporcional a D (equação 6), possibilitando o cálculo de Yx/o através do coeficiente angular
( = 1/Yx/o) e do coeficiente de manutenção (mo) respectivo, pelo coeficiente linear da reta
obtida.
qO2 = mo + (1/Yx/o) D (6)
Os valores de qO2 obtidos nos ensaios foram plotados em função de D e um ajuste
linear possibilitou o cálculo do fator de conversão de oxigênio em células (Yx/o) e o
coeficiente de manutenção (mo) respectivo para as condições de limitação em N, P e N e P
simultâneos, como mostra a Figura 5.14. Para essas condições foi possível o cálculo da
velocidade específica de consumo de oxigênio nos diferentes valores de D e os valores de
Yxr/o e mo. No ajuste linear para condição de Nlim, não foi considerado o ponto
correspondente a D = 0,45 h-1.
Para a condição de limitação em N, obteve-se Yxr/o = 0,96 g/g (0,031 g/mmol), para
limitação em P Yx/o = 1,39 g/g (0,045 g/mmol) e para limitação em N e P o valor de Yx/o =
1,53 g/g (0,049 g/mmol). O valor de mo obtido foi praticamente o mesmo para as três
condições: 3,45mmol/gh para a primeira condição, 4,09 mmol/gh na segunda e 3,72 mmol/gh
na terceira, ou seja, 0,11-0,13 g/gh, indicando que a limitação simultânea em N e P implica
em menor consumo de oxigênio para gerar células quando comparada com a condição de
limitação somente em N ou P e, que o oxigênio gasto para manutenção das células independe
do tipo de limitação e da vazão específica de alimentação empregada no caso dessa linhagem.
Diniz et al. (2004) cita valores de Yx/o de 0,0264 – 0,0510 g/mmol para a mesma
linhagem (P. putida IPT 046) cultivada em batelada utilizando glicose e frutose como fontes
de carbono, a diferentes concentrações de nitrogênio (400 – 3500 mg/L), corroborando os
valores obtidos, porém valores de mo não são citados.
Valores semelhantes de Yx/o são citados por Batista Neto (2004) para ensaios
operados de forma contínua para produção de ácido clavulânico por Streptomyces
clavuligerus ATCC 27064 (1,02 – 2,08 g/g variando com as condições do cultivo), porém os
valores de mo obtidos foram bem menores, variando entre 0,0343 e 0,0018 g/gh.
53
Nlim
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
YPH
A/C
(g/g
)
Plim
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
YPH
A/C
(g/g
)
N e Plim
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
YPH
A/C
g/g
%)
Figura 5.11: Fator de conversão de fonte de carbono em polímero (YPHA/C) calculado nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não limitados em fonte de C.
54
Nlim
0
20
40
60
80
100
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
% m
ol
C6 C8 C10 C12
Plim
0
20
40
60
80
100
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
% m
ol
C6 C8 C10 C12
N e Plim
0
20
40
60
80
100
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
% m
ol
C6 C8 C10 C12
Figura 5.12: Composição do polímero acumulado nas vazões específicas de alimentação (D) testadas
nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não limitados em fonte de C.
55
Nlim
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
Prod
(g/lh
)
Plim
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
Prod
(g/lh
)
N e Plim
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
Prod
(g/lh
)
Figura 5.13: Produtividade de PHA (Prod) calculada nas vazões específicas de alimentação (D) testadas nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e não limitados em fonte de C.
56
Valores da mesma ordem de grandeza de Yx/o e mo são apresentados por Taciro
(1992) para cultivo em batelada de Azospirilum brasilense sp 245 utilizando frutose como
fonte de carbono: Yx/o de 0,07 – 0,09 g/mmol e mo de 1,32 – 2,10 mmol/gh.
A Figura 5.15 ilustra os valores de velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) e
o coeficiente respiratório (RQ), dados pela relação qCO2/qO2, correspondentes aos da Figura
5.14.
Se considerarmos que nos ensaios temos 2 fenômenos ocorrendo simultaneamente,
crescimento celular e acúmulo de polímero e, que o crescimento celular implica em maior
produção de CO2 do que o acúmulo de polímero, pois demanda maior energia e, portanto,
uma maior quantidade da fonte de carbono deve ser oxidada para suprir essa necessidade, o
comportamento de qCO2 e RQ (Figura 5.15) pode ser melhor compreendido quando observado
em conjunto com a Figura 5.10.
De modo geral, os valores de qCO2 foram crescentes com D, coerentes com o fato de
que o crescimento celular deve prevalecer sobre o acúmulo de polímero com o aumento de D,
sendo que na condição de limitação em N esse fato ocorreu de forma mais pronunciada até o
ponto de D = 0,33 h-1, ficando então constante. Se observarmos a Figura 5.10, para D ≥ 0,33
h-1, praticamente não se observa acúmulo de polímero, ou seja o fenômeno que predomina é o
crescimento celular, justificando o “patamar” existente. Quanto aos valores de RQ, o acúmulo
significativo de polímero (~40%) se observa para D = 0,05 h-1 cujo valor de RQ é maior. Já a
semelhança do restante dos valores pode ser atribuída ao baixo teor de polímero acumulado
nessa condição.
Na condição de limitação em P, o aumento de qCO2 com D não é tão pronunciado mas
na condição em que praticamente não se observa acúmulo de polímero (D = 0,49 h-1) atinge
valores da ordem de 16 mmol/g.h, valor este semelhante aos obtidos na condição de limitação
em N com baixo acúmulo de polímero. Para valores de D onde menores quantidades de
polímero foram acumuladas, os valores de RQ também estão próximos de 1, atingindo valores
maiores para Ds de 0,05 e 0,11 h-1 quando maiores quantidades de polímero foram
acumuladas (68 e 39 %).
Na condição de N e P limitados, os valores de RQ também ficaram próximos de 1,
porém observa-se um comportamento decrescente com o aumento de D (Figura 5.15),
coerente com o teor decrescente de polímero acumulado com D (Figura 5.10).
57
Nlim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
q (m
mol
/gh)
qO2 = 32,46 D +3,45 r = 0,97
Yx/o = 0,96g/gmo = 0,11g/gh
Plim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
q (m
mol
/gh)
qO2 = 23,12D + 4,09 r = 0,96
Yx/o = 1,39g/gmo = 0,13g/gh
N e Plim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
q(m
mol
/g.h
)
qO2 = 20,27 D +3,72 r = 0,98
Yx/o = 1,53g/gmo = 0,12g/gh
Figura 5.14: Velocidades específicas de consumo de oxigênio (qO2) calculadas nas vazões específicas de alimentação (D), obtidas nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim) e limitados em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e, não limitados em fonte de carbono.
58
Nlim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
q (m
mol
/g.h
)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
RQ
Plim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
D (h-1)
q (m
mol
/g.h
)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
RQ
N e Plim
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50D (h-1)
q(m
mol
/gh)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
RQ
Figura 5.15: Velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) [□ e ■] e coeficiente respiratório (RQ) [○ e ●] calculados nas vazões específicas de alimentação (D), obtidos nos ensaios limitados somente em nitrogênio (Nlim), somente em fósforo (Plim), limitado em nitrogênio e fósforo (N e Plim) e, não limitados em fonte de carbono.
59
5.3 Ensaios preliminares em alta densidade para produção de PHAMCL
Foram realizados cinco experimentos (MCLc 17, 18, 19, 20 e 22) com valores de D
em torno 0,05 h-1, buscando obter acúmulo de polímero em alta densidade celular. As
planilhas contendo os dados dos ensaios encontram-se no Anexo B.
O ensaio MCLc 17 teve sua composição de meio definido a partir do ensaio limitado
em P e N e não limitado em fonte de C em baixa densidade. A quantidade de fonte de C foi
calculada considerando as relações C/N e C/P obtidas para a condição de D = 0,05 h-1, onde
ocorreu maior acúmulo de polímero (C/N = 22 gC/gN e C/P = 112 gC/gP). Os outros
componentes do meio alimentado (Tabela 4.1 – Seção 4 - Material e Métodos) foram
multiplicados por 16,7 vezes. O ensaio iniciou com uma batelada com duração de 11h. A
vazão específica de alimentação empregada foi de 0,05 h-1 e o biorreator apresentava 10 g/L
de concentração de biomassa, concentração de glicose zero, porém ainda existia cerca de 10
g/L de frutose quando iniciada a alimentação. Após 26 horas de alimentação a concentração
de glicose atingiu 90,8 g/L, a de frutose 102,0 g/L e a concentração de biomassa começou a
cair lavando o sistema. A concentração de biomassa inferior a estimada e a frutose presentes
no biorreator, quando do início da alimentação do meio, resultaram em concentrações
crescentes de fonte de C, atingindo valores muito altos e inibindo o crescimento da biomassa
celular, desestabilizando o sistema.
O ensaio seguinte (MCLc 18) representado nas Figuras 5.16 a e b teve suas
concentrações de glicose e frutose no meio alimentado definido a partir do ensaio MCLc 17 e
as concentrações dos sais mantidas. Esse ensaio teve início com uma batelada com duração de
16h, atingiu X = 16,2 g/L com concentrações de fonte de C próximas de zero (G = 0,0 g/L e F
= 0,22 g/L). Na primeira tentativa de estabelecer um estado estacionário (D = 0,049 h-1), o
consumo de frutose foi menor que o esperado. A vazão de alimentação foi então diminuída
para 0,035 h-1, porém, tanto a glicose quanto a frutose acumularam, atingindo cerca de 64 g/l
de cada fonte de C após 173,5 h de ensaio, com presença de ácidos fórmico, acético e pirúvico
significativas (ácidos fórmico e acético ≥ 1 g/L e ácido propiônico ~ 0,7 g/L), lavando o
sistema. A alimentação foi então interrompida e um cultivo em batelada realizado até que as
concentrações de glicose e frutose se aproximassem de zero.
Um novo meio contendo menos fonte de carbono foi então alimentado (G = 52,72
g/L, F = 53,56 g/L) e um estado estacionário foi então estabelecido, com concentração de
biomassa média de 32,8 g/L, porém com cerca de 900 mg/L de nitrogênio e cerca de 10 g/L
de fonte de carbono residual As amostragens foram realizadas por cerca de 3,9 tempos de
60
residência no estado estacionário. Nesse ensaio não foi possível realizar a dosagem de fósforo,
pois o sobrenadante das amostras após centrifugação se mostrou bastante turvo,
provavelmente, devido a lise de células, interferindo na análise que é colorimétrica. A
presença de espuma no biorreator também foi observada, além do aspecto gelatinoso no
sobrenadante das amostras. O teor de polímero não passou de 15% da biomassa celular.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
0 50 100 150 200 250 300 350Tempo(h)
X (g
/L),
DO
0
15
30
45
60
75
PHA
(%)
X DOPHA
(a)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 50 100 150 200 250 300 350Tempo (h)
G, F
(g/L
)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000N
e P
(mg/
L)
GFN P
(b)
Figura 5.16: Ensaio MCLc 18: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO) e teor de polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F), nitrogênio (N) e fósforo (P).
61
O ensaio seguinte (MCLc 19) foi calculado para se obter uma concentração de
biomassa residual (Xr) de 18 g/L a partir do valor de Yx/n dos ensaios realizados em baixa
densidade. A concentração de fonte de C considerou a relação C/N = 26 gC/gN. A
composição do meio preparado foi a apresentada na Tabela 4.1 – Seção 4 - Material e
Métodos. A Figura 5.17 a e b ilustram os resultados desse ensaio.Uma batelada inicial com
duração de 19,5 h resultou em 15,5 g/L de biomassa celular, 0,24 g/L de glicose e consumo
total de frutose. Na primeira vazão específica de alimentação testada (0,05 h-1) foram
observadas concentrações crescentes das fontes de C e, D foi então diminuído para 0,04 h-1
(0,035 h-1). Observou-se um estado estacionário, amostrado por 3,4 tempos de residência,
porém ainda com altas concentrações de fonte de C (28,7 g/L de glicose e 48,5 g/L de
frutose), nitrogênio em concentrações muito baixas (6 mg/L) e fósforo em cerca de 22 mg/L.
Não foi observado concentrações significativas dos ácidos dosados (ácidos fórmico,
propiônico, acético e pirúvico). A concentração de biomassa obtida foi de cerca de 18 g/L e o
teor de polímero acumulado foi de 13%. Nesse ensaio a composição do gás de saída do
biorreator foi acompanhada e no estado estacionário obteve-se OUR = 43,8 mmol/L.h e CER
= 53,9 mmol/L.h ( Figura 5.18). Os valores calculados de qO2 e qCO2 foram 2,79 mmol/g.h e
3,44 mmol/g.h, respectivamente, sendo esses valores inferiores aos observados nos ensaios de
baixa densidade em qualquer das condições ensaiadas (Figuras 5.15 e 5.14).
O ensaio MCLc 20 teve sua forma de preparo modificada. Os componentes do meio
de cultura foram preparados e esterilizados num balão em separado das fontes de carbono.
Um terceira bomba peristáltica foi introduzida para a alimentação da glicose e frutose, além
de uma quarta bomba com água, de forma a compensar uma possível diminuição da vazão de
açúcar e, mesmo assim, manter a vazão específica de alimentação constante. A composição
dos meios alimentados está apresentada na Tabela 4.1– Seção 4 - Materiais e Métodos.
A batelada inicial teve a duração de 17,5 horas, obtendo ao seu final X = 19,5 g/L, G
= 0,00 g/L e F = 3,01 g/L. O primeiro valor de D (0,045 h-1) foi ensaiado por cerca de 77 h e
correspondeu a vazão de 29,8 ml/h da solução contendo as fontes de C (Bc) e 96,6 ml/h da
solução contendo os outros constituintes do meio de cultura (Bs). Nas primeiras 10 h de
alimentação alguns ajustes foram feitos na vazão de alimentação contendo glicose e frutose na
tentativa de adequar o fornecimento da fonte de carbono ao seu consumo (Tabela B.3 - Anexo
B) e em seguida as alimentações permaneceram constantes. O que se observou foram
concentrações de biomassa em cerca de 20 g/L, P entre 13 a 30 mg/L, traços de N (4 e 31
mg/L) e uma tendência de aumento de concentração de glicose e diminuição de frutose
(Figura 5.19 a e b). O teor de polímero permaneceu em cerca de 11 % da biomassa e dos
62
ácidos acompanhados, verificou-se a presença de ácido propiônico em concentrações
chegando a 1,30 g/L. O valores de Bc foi então diminuído para 28,5 ml/h e consequentemente
D para 0,044 h-1, o que resultou numa diminuição das concentrações de fonte de C, porém
pouco alterou a concentração de biomassa que continuou em cerca de 20-21 g/L.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
0 25 50 75 100 125 150 175 200Tempo(h)
X (g
/L),
DO
0
15
30
45
60
75
PHA
(%)
XDOPHA
(a)
0,0
15,0
30,0
45,0
60,0
0 25 50 75 100 125 150 175 200Tempo (h)
G, F
(g/L
)
0
500
1000
1500
2000
N e
P (m
g/L)
GFNP
(b)
Figura 5.17: Ensaio MCLc 19: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO) e teor de
polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F), nitrogênio (N) e fósforo (P).
63
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200Tempo (h)
OUR (mmol/L.h)CER (mmol/L.h)
Figura 5.18: velocidades de consumo de oxigênio (OUR) e de produção de CO2 (CER) do ensaio
MCLc 19.
Um novo lote de meio foi então preparado, considerando Yx/n = 5,6 g/g, D =
0,045 h-1, Xr = 16,5 g/L, Fs = 0,096 ml/h e volume de meio no reator de 2,84 L. O biorreator
foi então alimentado com D = 0,046 h-1 com o novo meio (Bs = 96,6 ml/h e Bc = 28,5 ml/h).
Ajustes nos valores de Bs e Bc foram realizados com o intuíto de adequar o consumo de fonte
de C com a oferta e entre 190,8 e 226h de ensaio a concentração de glicose ficou em zero,
porém cerca de 22 g/L de frutose permaneceram, além de cerca de 27 mg/L de P. Dos ácidos
dosados, a presença do ácido propiônico em cerca de 1g/L foi observada.
Um terceiro lote de meio foi então preparado fornecendo mais fonte de N e P que no
lote anterior porém, com menor quantidade de P com relação a N. Esperava-se que o consumo
desse N a mais resultasse na diminuição da concentração de frutose no reator e que todo o P
no meio fosse consumido induzindo o acúmulo de polímero. A concentração de frutose
diminuiu de cerca de 22 g/L para 16 – 17 g/L mas o P não. A concentração de biomassa que
era de cerca de 20 g/L aumentou para cerca de 22 g/L, quase sem polímero ( < 10%). O ácido
propiônico continuou presente em cerca de 1,5 g/L e ácido fórmico em cerca de 0,7 g/L.
A Figura 5.20 ilustra os valores de OUR e CER obtidos nesse ensaio. Analisando o
conjunto dos valores apresentados podemos separá-lo segundo as alimentações empregadas
(linhas tracejadas da Figura 5.20). Apesar do não estabelecimento de estados estacionários, se
considerarmos os valores obtidos de respiração no intervalo de 50 – 144h para a primeira
alimentação, 150 – 226h para a segunda e 228 – 310h para a terceira, observamos valores
crescentes de OUR e CER. Valores da ordem de 45, 52 e 65 mmol/L.h de OUR e 56, 63 e 74
64
mmol/L.h de CER para os intervalos, respectivamente. Se considerarmos ainda, os valores de
concentração de biomassa e PHA nesses intervalos, os valores de qO2 e qCO2 calculados foram:
2,5, 2,8 e 3,2 mmol/g.h de qO2 e 3,2, 3,3 e 3,6 mmol/g.h de qCO2, respectivamente. Valores
estes crescentes, porém inferiores aos menores valores obtidos em baixa densidade que foram
de cerca de 5 mmol/L.h para qO2 e de 7,5 mmol/L.h para qCO2.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
0 50 100 150 200 250 300 350Tempo (h)
X (g
/L),
DO
0
15
30
45
60
75
PHA
(%)
X DOPHA
(a)
0,0
15,0
30,0
45,0
60,0
0 50 100 150 200 250 300 350Tempo (h)
G, F
(g/L
)
0
500
1000
1500
2000N
e P
(mg/
L)
GFN P
(b)
Figura 5.19: Ensaio MCLc 20: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO) e teor de
polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F), nitrogênio (N) e fósforo (P).
65
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200 250 300Tempo (h)
OUR (mmol/L.h)CER (mmol/L.h)
Figura 5.20: velocidades de consumo de oxigênio (OUR) e de produção de CO2 (CER) do ensaio
MCLc 20.
O ensaio MCLc 22 manteve a forma de alimentação do ensaio MCLc 20: alimentações
em separado, uma com glicose e frutose, outra com o restante dos componentes do meio e a
possibilidade de adicionar água para compensar uma possível diminuição da vazão de açúcar
e, mesmo assim, manter a vazão específica de alimentação constante. A composição dos
meios alimentados está apresentada na Tabela 4.1 – Seção 4 - Materiais e Métodos.
A batelada inicial teve a duração de 19,5 horas, obtendo ao seu final X = 16,5 g/L, G
= 0,25 g/L e F = 0,46 g/L.
Duas composições de meio de cultura (Tabela 4.1 – Seção 4 - Materiais e Métodos)
foram experimentadas nesse ensaio. Uma composição base foi fixada e duas concentrações
(2,30 g/L e 2,08 g/L) de KH2PO4 foram utilizadas, buscando limitar em P o cultivo. A Tabela
B.4 - Anexo B apresenta os valores dos parâmetros medidos ao longo do ensaio.
O primeiro valor de D ensaiado foi 0,054 h-1. Correspondia à vazão de 30,9 ml/h da
solução contendo as fontes de C (Bc) e 90,5 ml/h da solução contendo os outros constituintes
do meio de cultura (Bs) em um volume de meio no biorreator de 2,24 L. Do mesmo modo
que no ensaio MCLc 20, ajustes foram feitos na vazão de alimentação contendo glicose e
frutose na tentativa de adequar o fornecimento da fonte de carbono ao seu consumo. Os
valores de Bc e Bs foram mantidos entre as amostras 10 e 14 (cerca de 24h) e, dada a
tendência de aumento da fonte de C, Bc foi diminuído para 28,1 ml/h. A concentração de
fonte de C continuou aumentando e Bc foi novamente alterado (25 ml/h) e água alimentada
(5,7 ml/h) para manter D em 0,054 h-1. A glicose residual foi consumida mas cerca de 33 g de
frutose permaneceram. A bomba de água foi então desligada para que D diminuísse (0,052h-1)
66
e o tempo de residência fosse aumentado permitindo um maior consumo de fonte de C. Essa
modificação resultou num estado estacionário com X = 22,2 g/L, G = 2,52 g/L, F = 30,78 g/L,
N = 19 mg/L, p = 16 mg/L e PHA = 13,6 %, ou seja, ocorreu diminuição da frutose porém foi
compensada pelo surgimento de glicose. Os valores de OUR e CER medidos foram de 56,1
mmol/L.h e 64,4 mmol/L.h, respectivamente. Os valores de qO2 e qCO2 calculados (2,93
mmol/g.h e 3,36 mmol/g.h, respectivamente) foram próximos aos obtidos no ensaio MCLc 20
entre 50 e 144 h. Não foi observado concentrações significativas dos ácidos analisados.
Uma outra condição foi experimentada, alterou-se o volume de meio no biorreator
com o objetivo de aumentar D, mantendo a mesma relação entre fonte de C e os outros
nutrientes e assim obter dados comparativos com o estado estacionário obtido com essa
relação de nutrientes. O volume foi alterado para 2,37 L resultando num D = 0,049 h-1. A
concentração de biomassa caiu para cerca de 15 g/L e as concentrações de fonte de C
começaram a aumentar . A alimentação foi desligada e uma batelada realizada buscando
diminuir as concentrações de fonte de C e retomar o experimento.
Um novo lote de meio de cultura foi preparado mantendo as mesmas concentrações de
nutrientes com exceção da fonte de P, que foi diminuída.
O ensaio contínuo foi retomado na amostra 34 (240,5 h de ensaio). O valor de D
inicial foi de 0,052 h-1, Bc = 99,8 ml/h e Bs = 23,3 ml/h. Os resultados indicavam uma
diminuição de P no biorreator, glicose zerada, porém frutose continuava presente com cerca
de 18 g/L. Tentativas para que não sobrasse P no meio foram feitas (226,0 e 241,3 h do
ensaio) e um problema no controle de pH acabou desestabilizando o sistema. Nova batelada
foi realizada e o ensaio retomado na amostra 45 ( 412,5 h de ensaio) com concentrações de
fonte de C baixas (G = 1,14 g/L e F = 3,01 g/L), X = 18,5 g/L, N = 194 mg/L e P = 18 mg/L.
Acatando uma sugestão da banca de qualificação desse trabalho, ao fato de que não se
observava acúmulo significativo de polímero nas tentativas de alta densidade realizadas, o
experimento foi direcionado procurando aumentar D e realizando isso de forma gradual.
Valores de D de 0,052 h-1, 0,055 h-1 e 0,074 h-1 foram testados.
O que se observou foram valores crescentes de concentração de fonte de C e uma
tendência a diminuição da concentração de biomassa e polímero. Na condição de D = 0,074
h-1, o aparecimento de aglomerados foi observado com 3h de mudança das vazões para essa
condição, em 24 horas nessa condição o ensaio ficou totalmente floculado, impossibilitando
uma amostragem homogênea, com aumento das concentrações de fonte de C, N e P, e
diminuição do consumo de oxigênio (Figuras 5.21 b e 5.22).
67
Não foram observadas concentrações significativas dos ácidos dosados nesse ensaio,
com exceção das amostras 34 e 56, os valores máximos não ultrapassaram 0,30 g/L.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Tempo (h)
X (g
/L),
DO
0
15
30
45
60
75
PHA
(%)
XDOPHA
(a)
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Tempo (h)
G,F
(g/L
)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
N e
P (m
g/L)
GFNP
(b)
Figura 5.21: Ensaio MCLc 22: (a) concentrações de biomassa (X), absorbância (DO) e teor de
polímero (PHA); (b) concentrações residuais de glicose (G), frutose (F), nitrogênio (N) e fósforo (P).
68
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Tempo (h)
OUR (mmol/L.h)CER (mmol/L.h)
Figura 5.22: velocidades de consumo de oxigênio (OUR) e de produção de CO2 (CER) do ensaio
MCLc 22.
A partir dos estados estacionários obtidos nos ensaios preliminares em alta densidade
foi construída a Tabela 5.2.
Tabela 5.2: Valores de concentração de biomassa (X), teor de polímero (PHA), fator de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (Yxr/c), fator de conversão de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n), fator de conversão de fósforo em biomassa residual (Yxr/p), velocidade específica de consumo de oxigênio (qO2), velocidade específica de produção de CO2 (qCO2) para os ensaios preliminares em alta densidade celular.
Ensaio X
(g/L)
PHA
(%)
Yxr/c
(g/g)
Yxr/n
(g/g)
Yxr/p
(g/g)
MCLc 18 32,80 15,1 0,29 6,89 -
MCLc 19 18,02 12,8 0,23 7,58 36,8
MCLc 22 22,2 13,6 0,18 5,03 33,8
Ao comparar os valores dos fatores de conversão obtidos nos estados estacionários dos
ensaios MCLc 19 e 22 (Tabela 5.2) aos obtidos para limitação em N e P em baixa densidade
celular (Yxr/c = 0,11 g/g, Yxr/p = 43 g/g e Yxr/n = 7 g/g), com exceção do valor de Yxr/n do
ensaio MCLc 18, fica evidente a diferença entre os mesmos, indicando que para
concentrações de biomassa celular cerca de 10 vezes superiores ou mais, as correlações C/N
e C/P obtidas em baixa densidade celular para acúmulo de PHA não são aplicáveis.
No estado estacionário do ensaio MCLc 18 não ocorreu limitação em N (900 mg/L
presentes) e não foi realizada a determinação de P. Assim mesmo, supondo que tenha
ocorrido limitação em P, os valores dos fatores de conversão calculados (Tabela 5.2) também
69
são distintos quando comparados aos obtidos para limitação em P em baixa densidade (Yxr/c
= 0,08 g/g e Yxr/n = 5 g/g).
5.4 Avaliação de fluxos metabólicos na produção de PHAMCL
Procurando uma maior compreensão do metabolismo de síntese destes polímeros
buscou-se analisar os fluxos metabólicos envolvidos nas diferentes condições de cultivo
testadas. A análise partiu dos valores obtidos de fonte de carbono consumida (glicose e
frutose), biomassa celular, polímero produzido, O2 consumido e CO2 produzido nos ensaios.
Inicialmente, um modelo simplificado E1 foi proposto (Figura 5.23), procurando-se
fechar o balanço de carbono a partir das velocidades específicas dos parâmetros medidos.
Apesar da análise ainda considerar o microrganismo (P. putida IPT 046) como uma “caixa
preta”, as reações envolvidas nas possíveis vias metabólicas foram consideradas: vias de
Entner-Doudoroff (ED) e das Pentoses, o Ciclo de Krebs (CK) e a obtenção de NADPH via
isocitrato desidrogenase, além da via de biossíntese de ácidos graxos.
Segundo Gomez (2000), para que o metabolismo possa fluir sem problemas é
necessário um balanço adequado que permita que as moléculas geradas pelas vias catabólicas
sejam utilizadas nas vias anabólicas e, de forma similar, coenzimas fosforiladas ou reduzidas
durante o catabolismo sejam regeneradas durante o anabolismo. Assim, além do balanço de
carbono considerou-se também o balanço de coenzimas no estudo em questão.
Na proposição do modelo E1 considerou-se as seguintes hipóteses: i) a partir da fonte
de carbono fornecida (glicose e frutose) há formação somente de células, PHA e CO2; ii) o
crescimento celular ocorre com um valor de Yxr/c determinado e supre não só carbono mas
coenzimas reduzidas e energia também; iii) a estimativa de CO2 e O2 proveniente/consumido
do processo de síntese de biomassa celular sem polímero (Xr) pode ser feita utilizando as
relações obtidas em ensaios nos quais não se observa acúmulo de polímero. As correlações
estabelecidas para o modelo E1 estão apresentadas na Tabela 5.3.
70
NADH
GLICOSE FRUTOSE
F7 NADP+ F8 NADPH
CO2 CEL CélulasF1 NAD+
F6 F2 CO2 O2
Acetil-CoA F9 NADH F11 NAD+
F3 H2O
O2
F5F10 FADH2 F12 FAD
F4H2O
Biossíntese de Ác. Graxos O2 F13 H2O
F14 CO2
C D E F3HHx 3HO 3HD 3HdD RQ F15
TCA
Figura 5.23: Esquema representativo do modelo (E1) utilizado para análise de fluxos metabólicos no cultivo de P. putida IPT 046.
O modelo E1 foi então simulado a partir das velocidades específicas (mmol/gcel.h) de
consumo de glicose, frutose, formação de polímero e assumindo valores fixos de Yxr/c (0,40
e 0,45 g/g) para estimar o fluxo de carbono para síntese de Xr (CEL). Diniz et al. (2004)
apresentam valores de Yxr/c nessa faixa para o crescimento dessa mesma linhagem. A análise
dos resultados indicaram que assumir um valor único de Yxr/c, assim como estimar CO2 e O2
proveniente/consumido do processo de síntese de biomassa celular livre de polímero (O2CEL e
CO2CEL) a partir dos valores obtidos nos ensaios nos quais não se observava acúmulo de
polímero, eram hipóteses que deveriam ser descartadas pois resultavam em valores muito
discrepantes dos medidos de velocidade de consumo de oxigênio (qO2) e produção de gás
carbônico (qCO2), além de não possibilitar o balanço de coenzimas.
Partiu-se então para verificar se com os valores de velocidade específica de consumo
das fontes de carbono, de produção de polímero medida, qO2 e qCO2 medidos na condição
ensaiada era possível fechar o balanço de carbono. O fluxo de carbono para fazer células
(CEL) e a quantidade de CO2 resultante desse fato, foi calculado a partir dos valores de
velocidades conhecidos, procurando satisfazer o balanço de coenzimas como propunha o
modelo E1. Das 35 condições testadas, somente 3 não fecharam o balanço com relação a
parcela de CO2CEL, no ensaio MCLc5 (limitado em C e N e P simultâneo) a vazão específica
de 0,50 h-1 e no ensaio MCLc7 (limitado em C e P) as vazões específicas de 0,05 e 0,45 h-1.
A Figura 5.24 e 5.25 foram construídas a partir dos valores calculados dos fluxos
obtidos, expressos em mmol C/g.h. Procurando visualizar melhor qual parcela de carbono
71
consumida foi destinada a fazer células (CEL), a polímero (F4) e a CO2 (F14), esses valores
foram representados como uma fração do fluxo de glicose somado ao de frutose.
Tabela 5.3: Correlações utilizadas no modelo E1 para análise de fluxo metabólico.
Nos ensaios limitados na fonte de carbono (Figura 5.24), observa-se que na menor
vazão específica testada (D = 0,05 h-1), independente do tipo de limitação imposta, metade do
carbono vai para síntese de biomassa celular e a outra metade para CO2. Exceto pelo ponto
correspondente a vazão específica de 0,11 h-1 na condição de limitação em N e P
simultaneamente, o comportamento é semelhante para os três tipos de limitação: a fração de
carbono destinada a fazer células aumenta com D até atingir valores pouco superiores a
0,6 (60 % do C consumido) e como praticamente não se observa formação de polímero, a
fração de C para CO2 (F14) apresenta comportamento inverso, aproximando de valores
ligeiramente inferiores a 40% do C consumido. Também nos ensaios não limitados na fonte
de C (Figura 5.25), observa-se uma tendência de crescimento da fração de C para fazer células
com D, atingindo valores semelhantes (próximos a 60 %) para valores de D acima de 0,2 h-1,
com valores muito baixos para C direcionado para formação de polímero. Já para os valores
de D menores (≤ 0,2 h-1), independente do tipo de limitação, a fração de C destinada a CO2
aumenta atingindo cerca de 60% para as menores vazões testadas (0,05-0,06 h-1). A fração de
C destinada a fazer polímero aumenta com a diminuição de D, atingindo para D igual a 0,06
h-1 cerca de 30% na condição de N e P lim e 17,5% para N lim e, para D igual a 0,05 h-1 o
72
valor de 21,5% para P lim, correspondentemente, a fração de C destinada a fazer células foi
de 10%, 20,5% e 17,5%, respectivamente.
Na busca por um melhor entendimento dos fluxos e vias metabólicas envolvidas no
cultivo de P. putida IPT 046, um segundo modelo (E2) mais detalhado foi proposto. Foram
consideradas as vias de Entner-Doudoroff (ED), Pentoses e o Ciclo de Krebs, seguindo
metodologia descrita por Cocaign (1992) e empregada por Piccoli (1995) para Alcaligenes
eutrophus. O modelo considera a quantidade necessária dos principais precursores para a
formação de 1 grama de biomassa celular, baseado nos dados citados por Neidhardt et al.
(1990) para Escherichia coli.
A utilização da via de Entner-Doudoroff no metabolismo de Pseudomonas foi
amplamente estudada por Lessie e Phibbs (1984), Phibbs (1988) e descrita por Conway
(1992). Segundo esse último autor, existem grandes evidências que a via de ED é operada de
forma cíclica, envolvendo reciclagem de fosfatotrioses por enzimas gliconeogênicas, o
gliceraldeído-3-fosfato formado pela ação da enzima 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato
aldolase é aparentemente reciclado a 6-fosfogliconato por enzimas gliconeogênicas.
Temple et al. (1998) descrevem que P. aeruginosa metaboliza açúcares com três e seis
carbonos pela via de ED de forma cíclica preferencialmente à via de Embden-Meyerhoff-
Parnas (EMP), assim, gliceraldeído-3-fosfato é preferencialmente reciclado ao invés de
continuar até piruvato pelas reações subseqüentes da via EMP. Succinato e outros
intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos são utilizados antes da glicose e esse
microrganismo não possui a via oxidativa de hexose monofosfato. Apesar de possuir 1-
fosfofrutoquinase indutiva compatível com o catabolismo de frutose pela via EMP, muitas
espécies de Pseudomonas utilizam ED como rota principal no catabolismo de frutose.
73
N lim
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
D (h-1)
F4
F14
CEL
P lim
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
D (h-1)
F4
F14
CEL
N e P lim
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
D (h-1)
F4
F14
CEL
Figura 5.24: Fração de carbono destinado a fazer células (CEL), polímero (F4) e CO2 (F14) a partir de glicose e frutose consumidos nos ensaios limitados em fonte de carbono.
74
N lim
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
D (h-1)
F4
F14
CEL
P lim
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
D (h-1)
F4
F14
CEL
N e P lim
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
D (h-1)
F4
F14
CEL
Figura 5.25: Fração de carbono destinado a fazer células (CEL), polímero (F4) e CO2 (F14) a partir
de glicose e frutose consumidos nos ensaios não limitados em fonte de carbono.
75
O modelo E2 foi então proposto, considerando a via de ED operando de forma cíclica
e gliceraldeído-3-fosfato preferencialmente reciclado ao invés de continuar até piruvato pelas
reações subsequentes da via EMP, além da ausência da via oxidativa de hexose monofosfato.
A figura 5.26 ilustra esse modelo proposto. A simulação desse modelo (E2) resultou em
valores distintos dos medidos experimentalmente de qO2 e qCO2.
Figura 5.26: Esquema representativo do modelo E2 proposto para análise de fluxos no cultivo de P.
putida IPT 046.
Modificações nesse modelo (E2) foram realizadas considerando o Ciclo do Glioxilato
e a via oxidativa de hexoses monofosfato, dado que as afirmações de Temple et al. (1998)
eram para P. aeruginosa, e a linhagem empregada nos ensaios é uma P. putida. A
AcCoA
PIR
Cit
Isocit
KG2
SucCoA
Suc
Mal
Fum
OAA
NADP+
NADPH
CoASH
NAD+
NADH
ADP +Pi
ATP
FAD
FADH2
CoASH
NAD+
NADH
CO2
CO2
CO2
NAD+
NADH
CoASH
NADP+
NADPH
CO2
ATP
CO2
ADP +Pi
3HHx
3HO
3HD
3HDd
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
PEPATP
ADP +Pi
PG3
PG2
ADP +Pi
ATP
BPG13NAD+
NADH
G3PKDPG2
GLICOSE
G6P
GL6P
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
NADP+
NADPH
PG6
FRUTOSE
F6P
E4P
S7P
X5P
Rb5P
F16P
G3P
LEGENDA
G6P glicose-6-fosfato
F6P frutose-6-fosfato
F16P frutose-1-6-difosfato
GL6P glicono-g-lactona-3-fosfato
PG6 6-fosfogliconato
KDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconato
G3P gliceraldeído-3-fosfato
E4P eritrose-4-fosfato
S7P sedoheptolose-7-fosfato
Rb5P ribose-5-fosfato
X5P xilulose-5-fosfato
BPG13 1,3-bifosfoglicerato
PG3 3-fosfoglicerato
PG2 2-fosfoglicerato
PEP fosfoenolpiruvato
PIR piruvato
AcCoA acetil-CoA
Cit citrato
Isocit isocitrato
KG2 a-cetoglutarato
SucCoA succinil-CoA
Suc succinato
Fum fumarato
Mal malato
OAA oxaloacetato
3HHx 3-hidroxihexanoato
3HO 3-hidroxioctanoato
3HD 3-hidroxidecanoato
3HDd 3-hidroxidodecenoato
76
possibilidade de que as quantidades de precursores necessários para a formação de biomassa
celular era a mesma de E. coli foi mantida, resultando em um novo modelo (E3).
A versão 4.9.3 double do programa Metatool foi utilizado para simular o modelo
proposto (E3) ilustrado na Figura 5.27. O Anexo C mostra arquivos de entrada e de saída para
as simulações realizadas.
Foram simuladas as 3 condições de acúmulo de PHA estudadas: limitação em N,
limitação em P e limitação em N e P simultâneas, todas na condição de maior acúmulo de
polímero observado (menores Ds testados). Para cada condição, um conjunto de relações
elementares foi gerado e dentre essas, as que resultavam em acúmulo de polímero com um
balanço energético favorável (formação de ATP) foram selecionadas e calculados os fatores
de conversão Yx/c e YPHA/C, além do consumo de oxigênio por biomassa formada (1/Yxr/o) e a
quantidade de CO2 produzido por biomassa formada (1/Yxr/co2). As tabelas C.1, C.3 e C.4 do
ANEXO C apresentam os valores desses parâmetros calculados que foram comparados com
os obtidos a partir dos respectivos ensaios.
Para a condição de limitação em N, os valores obtidos experimentalmente (Tabela
5.3) foram semelhantes, com exceção do valor de 1/YX/O2 que foi de 0,10 molO2/gcel e o
menor valor correspondente obtido foi de 0,13 molO2/gcel. A partir da relação
correspondente, foi gerada a Figura 5.28a (relação elementar 9 e 61) e Figura 5.28b (relação
elementar 69) que apresentam os fluxos na rede metabólica que melhor representariam os
dados experimentais obtidos.
Uma vez que glicose-6-fosfato (G6P) pode ser isomerizada em frutose-6-fosfato
(F6P), do ponto de vista do modelo metabólico relações elementares idênticas são geradas
considerando o consumo de frutose ou glicose. Essas mesmas relações elementares também
poderiam ser aplicadas considerando o consumo de glicose e frutose em diferentes
proporções.
Na Figura 5.28a e b o modelo propõe que glicose ou frutose devem ser consumidas
utilizando a via EMP ao invés de ED, não ocorrendo fluxo entre 6-fosfogliconato e 2-ceto-3-
desoxi-6-fosfogliconato (ED4 = 0) e nem de 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato para piruvato
(ED5 = 0), sendo o piruvato formado a partir de fosfoenolpiruvato (ED10). Acetil-CoA é
então produzido a partir do piruvato e parte dele é metabolizado no Ciclo de Krebs e a outra é
direcionada para a biossíntese de polímero. A parte que é metabolizada no ciclo de Krebs
também leva a formação de NADPH pela ação da isocitrato desidrogenase e gera CO2. A via
do glioxilato não é utilizada para repor intermediários do ciclo de Krebs. O modelo propõe
ainda que a via oxidativa de hexose monofosfato (VP5) ocorra para gerar NADPH e CO2 .
77
Figura 5.27: Esquema representativo do modelo E3 proposto para análise de fluxos no cultivo de P. putida IPT 046.
O próximo passo foi selecionar as relações elementares que permitiriam obter valores
de Yx/c e YPHA/C maiores que aqueles obtidos experimentalmente (0,24g/g e 0,10 g/g,
respectivamente). Ou seja, de que forma os fluxos metabólicos deveriam ser alterados para
AcCoA
PIR
Cit
Isocit
KG2
SucCoA
Suc
Mal
Fum
OAA
GLXAcCoA
NADP+
NADPH
CoASH
NAD+
NADH
ADP +Pi
ATP
FAD
FADH2
CoASH
NAD+
NADH
CO2
CO2
CO2CoASH
NAD+
NADH
CoASH
CO2
ATP
CO2
ADP +Pi
3HHx
3HO
3HD
3HDd
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
PEP
ATP
ADP +Pi
PG3
PG2
ADP +Pi
ATP
BPG13NAD+
NADH
G3PKDPG2
GLICOSE
G6P
GL6P
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
NAD+
NADH
PG6
FRUTOSE
F6P
E4P
S7PX5PRb5P
F16P
ADP +PiATP
DHP
Rbl5PCO2
NADP+
NADPH
LEGENDA
G6P glicose-6-fosfato
F6P frutose-6-fosfato
F16P frutose-1-6-difosfato
GL6P glicono-g-lactona-3-fosfato
PG6 6-fosfogliconato
KDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconato
G3P gliceraldeído-3-fosfato
E4P eritrose-4-fosfato
S7P sedoheptolose-7-fosfato
Rb5P ribose-5-fosfato
Rbl5P ribulose-5-fosfato
X5P xilulose-5-fosfato
DHP dihidroxiacetona
BPG13 1,3-bifosfoglicerato
PG3 3-fosfoglicerato
PG2 2-fosfoglicerato
PEP fosfoenolpiruvato
PIR piruvato
AcCoA acetil-CoA
Cit citrato
Isocit isocitrato
KG2 a-cetoglutarato
SucCoA succinil-CoA
Suc succinato
Fum fumarato
Mal malato
OAA oxaloacetato
GLX glioxilato
3HHx 3-hidroxihexanoato
3HO 3-hidroxioctanoato
3HD 3-hidroxidecanoato
3HDd 3-hidroxidodecenoato
78
resultar em um melhor desempenho do processo (maiores fatores de conversão de fonte de C
em células e polímero). O maior valor obtido para Yx/c foi de 0,50 g/g e YPHA/C = 0,20 g/g
(relação elementar 29 ou 59 e 15 ou 75) e os fluxos na rede metabólica para atingir esses
fatores de conversão estão representados na Figura 5.29 a e b.
O modelo propõe que a partir de frutose ou glicose a Via de ED seja utilizada de
forma cíclica, ocorrendo a formação de piruvato a partir de 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato e
não de fosfoenolpiruvato (ED10 = 0), gliceraldeído-3-fosfato seja transformado em
fosfoenolpiruvato somente para suprir precursores utilizados para fazer célula (Xr). A via
oxidativa de hexose monofosfato (VP5) continuaria ocorrendo gerando NADPH e CO2,
porém com fluxo bastante reduzido. Apenas algumas reações do ciclo de Krebs estariam
ocorrendo e somente para suprir intermediários metabólicos necessários à síntese de biomassa
residual (Xr). A reposição de oxaloacetato ocorreria via piruvato carboxilase. Assim, os
fatores de conversão seriam aumentados, pois NADPH seria gerado essencialmente na via de
ED evitando as descarboxilações (que resultam em perda de C) que ocorrem na via das
hexoses monofosfato e no ciclo de Krebs. Um outro aspecto importante a ser analisado é se a
quantidade de ATP gerado seria suficiente para satisfazer as necessidades de manutenção das
células na reação elementar proposta que garantiria maior rendimento. Segundo Russel e
Cook (1995), a demanda de energia para manutenção corresponde à quantidade de ATP
necessária para suprir as demandas energéticas de funções não diretamente relacionadas ao
crescimento. A Tabela 5.4 apresenta os valores de ATP gerados por biomassa residual
formada (YATP/Xr) e que deveria satisfazer as necessidades energéticas de manutenção para as
condições estudadas. Considerando o valor de 0,045 mmolATP/mg de células, citado por
Russel e Cook (1995), para Sreptococcus bovis em cultivo contínuo como um valor de
referência, a quantidade de ATP obtida na relação elementar que se ajusta aos dados
experimentais é cerca de 20 vezes a necessária. Por outro lado, quando se analisa as relações
elementares que permitem um melhor desempenho do processo para um acúmulo de 40% de
polímero, teríamos um valor de 0,033 – 0,036 molATP/gcel. Esse valor é ligeiramente inferior
ao estimado como necessário sugerindo que essa relação elementar possa não acontecer
biologicamente.
A análise acima foi realizada para o teor de acúmulo obtido experimentalmente (PHA
= 40%), o próximo passo consistiu em analisar as relações elementares geradas para um
acúmulo de polímero de 70%, ou seja, semelhante aos valores obtidos nas outras condições de
limitação estudadas. O conjunto gerado das relações elementares está representado no Anexo
C e os valores dos parâmetros calculados na Tabela C.2 do mesmo anexo. Escolhendo a
79
melhor condição de conversão de fonte de C em biomassa celular e PHA (Yx/c = 0,42 g/g e
YPHA/C = 0,29 g/g), o mesmo conjunto de vias metabólicas, que resultaram no melhor
desempenho para um acúmulo de PHA de 40%, seria utilizado pela bactéria. Esse fato
evidencia que no caso dessa bactéria (P. putida IPT 046) a melhor condição para produzir
PHA implicaria em gerar NADPH, que é consumido para fazer polímero, utilizando a Via
ED de forma cíclica e direcionando o fluxo de gliceraldeído-3-fosfato para a formação de
fosfoenolpiruvato somente para suprir precursores para síntese de biomassa residual (Xr),
uma vez que a produção de NADPH pelo Ciclo de Krebs ou pela via das hexoses monofosfato
implicariam em perdas da fonte de C na forma de CO2.
A quantidade de ATP gerados nessas relações elementares estão apresentadas na
Tabela 5.4. O valor obtido foi de 0,033 – 0,034 molATP/gcel, portanto teríamos um balanço
energético desfavorável também nesse caso, lembrando que o valor utilizado como referência
foi levantado para um microrganismo diferente do utilizado nos experimentos.
Tanto para a condição de limitação em P como em P e N (Tabela 5.4), os valores
obtidos da simulação (Tabelas C.3 e C.4 – ANEXO C) não foram os esperados, ou seja, o
modelo proposto não se ajusta. Nos dois casos, quando os valores de Yx/c e YPHA/C são
semelhantes aos experimentais, os de 1/Yxr/o e 1/Yxr/co2 diferem.
No caso da limitação somente em P, a não adequação do modelo fica evidenciada pelo
fato de que nenhum dos valores calculados de 1/Yxr/o e 1/Yxr/co2 sequer se assemelham aos
obtidos experimentalmente (Tabela C.3 – ANEXO C).
Considerando o modelo metabólico testado (E3), a não adequação do mesmo nos
casos de limitação em P e em N e P, talvez possa ser atribuída a composição da biomassa
celular que foi assumida como igual a de E. coli citada por Neidhardt et al. (1990). Fonseca
(2007) apresenta composições celulares de K. marxianus para diferentes formas de cultivo,
mostrando que a sua composição em proteína, carboidratos, RNA e DNA variam
significativamente dependendo do D utilizado. Valores de proteína variando entre 36 a 72%
(p/p), carboidratos de 26,5 a 51,1 % (p/p), ou sejam, valores 2 vezes maiores dependendo da
condição experimentada. Se considerarmos ainda que nos dois casos de não ajuste de
modelo, P foi o ou um dos elementos limitantes e que isso também deve resultar em
composição de biomassa celular distinta, essa hipótese parece mais razoável ainda. Uma outra
consideração que pode ser realizada, e vai nessa mesma direção, diz respeito ao nível de
oxidação da biomassa. Se observarmos os valores de Yx/o obtidos (Figura 5.14) e as frações
de carbono consumido que resultou em CO2 (Figura 5.25) é possível relacionar com a
composição da biomassa produzida. Nas três condições avaliadas foram observadas as
80
mesmas quantidades de CO2 gerado a partir da fonte de carbono consumida (60%). Um maior
consumo de oxigênio para uma determinada quantidade de biomassa produzida, implica em
mais coenzimas sendo reduzidas, ou seja, uma maior oxidação dos componentes da biomassa.
Assim, podemos afirmar que o nível de oxidação da biomassa não foi o mesmo nas situações
avaliadas, sendo mais próximos no caso da limitação em P e em N e P (valores de Yx/o mais
parecidos), porém diferente do caso de limitação em N, sugerindo diferenças na composição
da biomassa nesses casos.
81
Tabela 5.4: Relações elementares geradas pelo programa Metatool para a condição de limitação em N, e os correspondentes valores de fator de conversão de
fonte de carbono em biomassa (Yx/c), fator de conversão de fonte de carbono em polímero (YPHA/C), quantidade de oxigênio consumido por biomassa residual formada (1/YXr/O2), quantidade de CO2 produzido por biomassa residual formada (1/YXr/CO2) e quantidade de ATP formado por biomassa residual formada (YATP/Xr).
Relações Elementares D (h-1)
YX/C (g/g)
YPHA/C (g/g)
1/YXr/O2 (mol O2/gcel)
1/YXr/CO2 (mol CO2/gcel)
YATP/Xr (molATP/g cel)
Limitação N (PHA = 40% )
Experimental
9 e 61: 9.30 F(G) + 210.20 ADP + 64.46 O = 210.20 ATP + 35.79 CO2 + 64.46 H2O + 1 XT
69: 1 G + 19.75 F + 469,04 ADP + 143,84 O = 469,04 ATP + 79,85 CO2 + 143,84 H2O + 2,23 XT
29 e 89: 4.54 F(G) + 8.91 ADP + 7.32 O = 8.91 ATP + 7.22 CO2 + 7.32 H2O + 1 XT
15 e 75: 4.52 F(G) + 8.16 ADP + 7.120 O = 8.16 ATP + 7.15 CO2 + 7.20 H2O + 1 XT
Limitação N (PHA = 70% )
15 e 75: 3,10 F(G) + 8,05 ADP + 5,46 O = 8,05 ATP + 6,08 CO2 + 5,46 H2O + 1 XT
29 e 89: 3,10 F(G) + 8,27 ADP + 5,50 O = 8.27 ATP + 6,10 CO2 + 5,50 H2O + 1 XT
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05 0,05
0,24
0,24
0,24
0,50
0,50
0,42 0,42
0,095
0,098
0,098
0,20
0,20
0,29 0,29
0,098
0,131
0,131
0,015
0,015
0,039 0,039
0,146
0,146
0,146
0,029
0,029
0,087 0,087
-
0,856
0,856
0,036
0,033
0,033 0,034
Limitação P
Experimental
0,06
0,21
0,129
0,095
0,199
-
Limitação P e N
Experimental
0,05
0,06
0,27
0,35
0,19
0,20
0,097
0,092
0,153
0,127
-
-
82
Figura 5.28a: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma de indução de
acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 9 e 61.
PEP fosfoenolpiruvatoPIR piruvatoAcCoA acetil-CoACit citratoIsocit isocitratoKG2 α-cetoglutaratoSucCoA succinil-CoASuc succinatoFum fumaratoMal malatoOAA oxaloacetatoGLX glioxilato3HHx 3-hidroxihexanoato3HO 3-hidroxioctanoato3HD 3-hidroxidecanoato3HDd 3-hidroxidodecenoato
LEGENDA
G6P glicose-6-fosfato F6P frutose-6-fosfatoF16P frutose-1-6-difosfatoGL6P glicono-g-lactona-3-fosfatoPG6 6-fosfogliconatoKDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconatoG3P gliceraldeído-3-fosfatoE4P eritrose-4-fosfatoS7P sedoheptolose-7-fosfatoRb5P ribose-5-fosfatoRbl5P ribulose-5-fosfatoX5P xilulose-5-fosfatoDHP dihidroxiacetonaBPG13 1,3-bifosfogliceratoPG3 3-fosfogliceratoPG2 2-fosfoglicerato
AcCoA
PIR
Cit
Isocit
KG2
SucCoA
Suc
Mal
Fum
OAA
GLX
AcCoA
NADP+
NADPH
CoASH
NAD+
NADH
ADP +Pi
ATP
FAD
FADH2
CoASH
NAD+
NADH
CO2
CO2
CO2CoASH
NAD+
NADH
CoASH
CO2
ATP
CO2
ADP +Pi
3HHx
3HO
3HD
3HDd
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
PEP
ATP
ADP +Pi
PG3
PG2
ADP +Pi
ATP
BPG13NAD+
NADH
G3PKDPG2
GLICOSE
G6P
GL6P
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
NAD+
NADH
PG6
FRUTOSE
F6P
E4PS7PX5P
Rb5P
F16P
ADP +PiATP
DHP
Rbl5PCO2
NADP+
NADPH
P3HHx = 0,244
P3HO = 1,792
P3HD = 5,701
P3HDd = 0,407
PHAMCL = 0,081PHA
Xr
XTBIOTOT = 8,14E-03
BIOMASSA = 2,00E-03
VP14 = 3,650
AD1 = 5,735
ED10 = 141,005
ED11 = 129,601
CGLX1 = 0,000
CK1 = 83,253 CK2 =
83,253
CK5 = 81,094
CK4 = 81,094
CK3 = 83,253
CK6 = 81,094
CK7 = 81,094
CK8 = 81,094
CGLX2 = 0,000
AD2 = 0,000
ED9 = 142,044
ED8 = 142,044
ED7 = 145,038
ED6 = 145,038ED5 = 0,000
ED4 = 0,000
ED3 = 3,240
ED2 = 3,240
ED1 = 0,000 VP2 = 75,718
VP13 = -72,648
VP12 = -72,648
VP11 = -72,648
VP8 =0,722
VP9 = 0,72
VP10 = 0,000
VP5 = 3,240
VP7 = 0722
VP6 = 2,517
FADH2
FAD
OXFAD = 81,094
OXNAD = 443,925
NADH
NAD
H2O
O2
H2O
O2
CO2
291,453
83
Figura 5.28b: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma de indução
de acúmulo de 40% PHA. Relação elementar 69.
AcCoA
PIR
Cit
Isocit
KG2
SucCoA
Suc
Mal
Fum
OAA
GLX
AcCoA
NADP+
NADPH
CoASH
NAD+
NADH
ADP +Pi
ATP
FAD
FADH2
CoASH
NAD+
NADH
CO2
CO2
CO2CoASH
NAD+
NADH
CoASH
CO2
ATP
CO2
ADP +Pi
3HHx
3HO
3HD
3HDd
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
PEP
ATP
ADP +Pi
PG3
PG2
ADP +Pi
ATP
BPG13NAD+
NADH
G3PKDPG2
GLICOSE
G6P
GL6P
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
NAD+
NADH
PG6
FRUTOSE
F6P
E4PS7PX5P
Rb5P
F16P
ADP +PiATP
DHP
Rbl5PCO2
NADP+
NADPH
P3HHx = 0,070
P3HO = 0,516
P3HD = 1,641
P3HDd = 0,117
PHAMCL = 0,023PHA
Xr
XTBIOTOT = 2,34E-03
BIOMASSA = 5,76E-04
VP14 = 0,000
AD1 = 1,651
ED10 = 40,589
ED11 = 37,306
CGLX1 = 0,000
CK1 = 23,965
CK2 = 23,965
CK5 = 23,343
CK4 = 23,343
CK3 = 23,965
CK6 = 23,343
CK7 = 23,343
CK8 = 23,343
CGLX2 = 0,000
AD2 = 0,000
ED9 = 40,888
ED8 = 40,888
ED7 = 41,750
ED6 = 41,750ED5 = 0,000
ED4 = 0,000
ED3 = 0,933
ED2 = 0,933
ED1 = 1,051 VP2 = 20,745
VP13 = -20,912
VP12 = -20,912
VP11 = -20,912
VP8 = 0,208
VP9 = 0,21
VP10 = 0,000
VP5 = 0,933
VP7 = 0,208
VP6 = 0,725
FADH2
FAD
OXFAD = 23,343
OXNAD = 127,786
NADH
NAD
H2O
O2
H2O
O2
CO2
83,896
PEP fosfoenolpiruvatoPIR piruvatoAcCoA acetil-CoACit citratoIsocit isocitratoKG2 α-cetoglutaratoSucCoA succinil-CoASuc succinatoFum fumaratoMal malatoOAA oxaloacetatoGLX glioxilato3HHx 3-hidroxihexanoato3HO 3-hidroxioctanoato3HD 3-hidroxidecanoato3HDd 3-hidroxidodecenoato
LEGENDA
G6P glicose-6-fosfato F6P frutose-6-fosfatoF16P frutose-1-6-difosfatoGL6P glicono-g-lactona-3-fosfatoPG6 6-fosfogliconatoKDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconatoG3P gliceraldeído-3-fosfatoE4P eritrose-4-fosfatoS7P sedoheptolose-7-fosfatoRb5P ribose-5-fosfatoRbl5P ribulose-5-fosfatoX5P xilulose-5-fosfatoDHP dihidroxiacetonaBPG13 1,3-bifosfogliceratoPG3 3-fosfogliceratoPG2 2-fosfoglicerato
84
Figura 5.29a: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma de indução de
acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 29 e 59.
AcCoA
PIR
Cit
Isocit
KG2
SucCoA
Suc
Mal
Fum
OAA
GLX
AcCoA
NADP+
NADPH
CoASH
NAD+
NADH
ADP +Pi
ATP
FAD
FADH2
CoASH
NAD+
NADH
CO2
CO2
CO2CoASH
NAD+
NADH
CoASH
CO2
ATP
CO2
ADP +Pi
3HHx
3HO
3HD
3HDd
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
PEP
ATP
ADP +Pi
PG3
PG2
ADP +Pi
ATP
BPG13NAD+
NADH
G3PKDPG2
GLICOSE
G6P
GL6P
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
NAD+
NADH
PG6
FRUTOSE
F6P
E4PS7PX5P
Rb5P
F16P
ADP +PiATP
DHP
Rbl5PCO2
NADP+
NADPH
P3HHx = 0,066
P3HO = 0,049
P3HD = 0,154
P3HDd = 0,011
PHAMCL = 2,20E-3PHA
Xr
XTBIOTOT = 2,20E-04
BIOMASSA = 5,42E-05
VP14 = 2,008
AD1 = 0,155
ED10 = 0,000
ED11 = 1,313
CGLX1 = 0,000
CK1 = 0,585
CK2 = 0,585
CK5 = 0,000
CK4 = 0,000
CK3 = 0,585
CK6 = 0,000
CK7 = 0,000
CK8 = 0,000
CGLX2 = 0,000
AD2 = 0,000
ED9 = 0,028
ED8 = 0,028
ED7 = 0,109
ED6 = 0,109ED5 = 1,622
ED4 = 1,622
ED3 = 1,997
ED2 = 1,997
ED1 = 0,000 VP2 = 1,000
VP13 = 0,801
VP12 = 0,801
VP11 = 0,801
VP8 = 0,115
VP9 = 0,115
VP10 = 0,096
VP5 = 0,375
VP7 = 0,211
VP6 = 0,164
FADH2
FAD
OXFAD = 0,000
OXNAD = 1,615
NADH
NAD
H2O
O2
H2O
O2
CO2
2,118
PEP fosfoenolpiruvatoPIR piruvatoAcCoA acetil-CoACit citratoIsocit isocitratoKG2 α-cetoglutaratoSucCoA succinil-CoASuc succinatoFum fumaratoMal malatoOAA oxaloacetatoGLX glioxilato3HHx 3-hidroxihexanoato3HO 3-hidroxioctanoato3HD 3-hidroxidecanoato3HDd 3-hidroxidodecenoato
LEGENDA
G6P glicose-6-fosfato F6P frutose-6-fosfatoF16P frutose-1-6-difosfatoGL6P glicono-g-lactona-3-fosfatoPG6 6-fosfogliconatoKDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconatoG3P gliceraldeído-3-fosfatoE4P eritrose-4-fosfatoS7P sedoheptolose-7-fosfatoRb5P ribose-5-fosfatoRbl5P ribulose-5-fosfatoX5P xilulose-5-fosfatoDHP dihidroxiacetonaBPG13 1,3-bifosfogliceratoPG3 3-fosfogliceratoPG2 2-fosfoglicerato
85
Figura 5.29b: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma de indução
de acúmulo de 40% PHA. Relações elementares 15 e 75.
AcCoA
PIR
Cit
Isocit
KG2
SucCoA
Suc
Mal
Fum
OAA
GLX
AcCoA
NADP+
NADPH
CoASH
NAD+
NADH
ADP +Pi
ATP
FAD
FADH2
CoASH
NAD+
NADH
CO2
CO2
CO2CoASH
NAD+
NADH
CoASH
CO2
ATP
CO2
ADP +Pi
3HHx
3HO
3HD
3HDd
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
PEP
ATP
ADP +Pi
PG3
PG2
ADP +Pi
ATP
BPG13NAD+
NADH
G3PKDPG2
GLICOSE
G6P
GL6P
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
NAD+
NADH
PG6
FRUTOSE
F6P
E4PS7PX5P
Rb5P
F16P
ADP +PiATP
DHP
Rbl5PCO2
NADP+
NADPH
P3HHx = 0,007
P3HO = 0,049
P3HD = 0,155
P3HDd = 0,011
PHAMCL = 0,002PHA
Xr
XTBIOTOT = 2,21E-04
BIOMASSA = 5,43E-05
VP14 = 2,026
AD1 = 0,184
ED10 = 0,000
ED11 = 1,316
CGLX1 = 0,000
CK1 = 0,059
CK2 = 0,059
CK5 = 0,000
CK4 = 0,000
CK3 = 0,059
CK6 = 0,000
CK7 = 0,000
CK8 = 0,000
CGLX2 = 0,000
AD2 = 0,028
ED9 = 0,000
ED8 = 0,000
ED7 = 0,081
ED6 = 0,081ED5 = 1,654
ED4 = 1,654
ED3 = 2,015
ED2 = 2,015
ED1 = 0,000 VP2 = 1,000
VP13 = 0,829
VP12 = 0,829
VP11 = 0,829
VP8 = 0,111
VP9 = 0,111
VP10 = 0,091
VP5 = 0,361
VP7 = 0,202
VP6 = 0,159
FADH2
FAD
OXFAD = 0,000
OXNAD = 1,590
NADH
NAD
H2O
O2
H2O
O2
CO2
1,581
PEP fosfoenolpiruvatoPIR piruvatoAcCoA acetil-CoACit citratoIsocit isocitratoKG2 α-cetoglutaratoSucCoA succinil-CoASuc succinatoFum fumaratoMal malatoOAA oxaloacetatoGLX glioxilato3HHx 3-hidroxihexanoato3HO 3-hidroxioctanoato3HD 3-hidroxidecanoato3HDd 3-hidroxidodecenoato
LEGENDA
G6P glicose-6-fosfato F6P frutose-6-fosfatoF16P frutose-1-6-difosfatoGL6P glicono-g-lactona-3-fosfatoPG6 6-fosfogliconatoKDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconatoG3P gliceraldeído-3-fosfatoE4P eritrose-4-fosfatoS7P sedoheptolose-7-fosfatoRb5P ribose-5-fosfatoRbl5P ribulose-5-fosfatoX5P xilulose-5-fosfatoDHP dihidroxiacetonaBPG13 1,3-bifosfogliceratoPG3 3-fosfogliceratoPG2 2-fosfoglicerato
86
Figura 5.30a: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma de indução de
acúmulo de 70% PHA. Relações elementares 29 e 59.
AcCoA
PIR
Cit
Isocit
KG2
SucCoA
Suc
Mal
Fum
OAA
GLX
AcCoA
NADP+
NADPH
CoASH
NAD+
NADH
ADP +Pi
ATP
FAD
FADH2
CoASH
NAD+
NADH
CO2
CO2
CO2CoASH
NAD+
NADH
CoASH
CO2
ATP
CO2
ADP +Pi
3HHx
3HO
3HD
3HDd
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
PEP
ATP
ADP +Pi
PG3
PG2
ADP +Pi
ATP
BPG13NAD+
NADH
G3PKDPG2
GLICOSE
G6P
GL6P
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
NAD+
NADH
PG6
FRUTOSE
F6P
E4PS7PX5P
Rb5P
F16P
ADP +PiATP
DHP
Rbl5PCO2
NADP+
NADPH
P3HHx = 0,010
P3HO = 0,071
P3HD = 0,226
P3HDd = 0,016
PHAMCL = 0,003PHA
Xr
XTBIOTOT = 3,22E-04
BIOMASSA = 2,26E-05
VP14 = 2,147
AD1 = 0,077
ED10 = 0,000
ED11 = 1,647
CGLX1 = 0,000
CK1 = 0,024
CK2 = 0,024
CK5 = 0,000
CK4 = 0,000
CK3 = 0,024
CK6 = 0,000
CK7 = 0,000
CK8 = 0,000
CGLX2 = 0,000
AD2 = 0,012
ED9 = 0,000
ED8 = 0,000
ED7 = 0,034
ED6 = 0,034ED5 = 1,788
ED4 = 1,788
ED3 = 2,142
ED2 = 2,142
ED1 = 0,000 VP2 = 1,000
VP13 = 0,929
VP12 = 0,929
VP11 = 0,929
VP8 = 0,114
VP9 = 0,114
VP10 = 0,106
VP5 = 0,354
VP7 = 0,220
VP6 = 0,134
FADH2
FAD
OXFAD = 0,000
OXNAD = 1,761
NADH
NAD
H2O
O2
H2O
O2
CO2
1,961
PEP fosfoenolpiruvatoPIR piruvatoAcCoA acetil-CoACit citratoIsocit isocitratoKG2 α-cetoglutaratoSucCoA succinil-CoASuc succinatoFum fumaratoMal malatoOAA oxaloacetatoGLX glioxilato3HHx 3-hidroxihexanoato3HO 3-hidroxioctanoato3HD 3-hidroxidecanoato3HDd 3-hidroxidodecenoato
LEGENDA
G6P glicose-6-fosfato F6P frutose-6-fosfatoF16P frutose-1-6-difosfatoGL6P glicono-g-lactona-3-fosfatoPG6 6-fosfogliconatoKDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconatoG3P gliceraldeído-3-fosfatoE4P eritrose-4-fosfatoS7P sedoheptolose-7-fosfatoRb5P ribose-5-fosfatoRbl5P ribulose-5-fosfatoX5P xilulose-5-fosfatoDHP dihidroxiacetonaBPG13 1,3-bifosfogliceratoPG3 3-fosfogliceratoPG2 2-fosfoglicerato
87
Figura 5.30b: Fluxos na rede metabólica propostos para limitação em N como forma de indução
de acúmulo de 70% PHA. Relações elementares 15 e 75.
AcCoA
PIR
Cit
Isocit
KG2
SucCoA
Suc
Mal
Fum
OAA
GLX
AcCoA
NADP+
NADPH
CoASH
NAD+
NADH
ADP +Pi
ATP
FAD
FADH2
CoASH
NAD+
NADH
CO2
CO2
CO2CoASH
NAD+
NADH
CoASH
CO2
ATP
CO2
ADP +Pi
3HHx
3HO
3HD
3HDd
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
NADP+
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
PEP
ATP
ADP +Pi
PG3
PG2
ADP +Pi
ATP
BPG13NAD+
NADH
G3PKDPG2
GLICOSE
G6P
GL6P
ATP
ADP +Pi
ATP
ADP +Pi
NAD+
NADH
PG6
FRUTOSE
F6P
E4PS7PX5P
Rb5P
F16P
ADP +PiATP
DHP
Rbl5PCO2
NADP+
NADPH
P3HHx = 0,010
P3HO = 0,071
P3HD = 0,226
P3HDd = 0,016
PHAMCL = 0,003PHA
Xr
XTBIOTOT = 3,22E-04
BIOMASSA = 2,26E-05
VP14 = 2,139
AD1 = 0,065
ED10 = 0,000
ED11 = 1,646
CGLX1 = 0,000
CK1 = 0,024
CK2 = 0,024
CK5 = 0,000
CK4 = 0,000
CK3 = 0,024
CK6 = 0,000
CK7 = 0,000
CK8 = 0,000
CGLX2 = 0,000
AD2 = 0,000
ED9 = 0,012
ED8 = 0,012
ED7 = 0,046
ED6 = 0,046ED5 = 1,774
ED4 = 1,774
ED3 = 2,134
ED2 = 2,134
ED1 = 0,000 VP2 = 1,000
VP13 = 0,917
VP12 = 0,917
VP11 = 0,917
VP8 = 0,116
VP9 = 0,116
VP10 = 0,108
VP5 = 0,360
VP7 = 0,224
VP6 = 0,136
FADH2
FAD
OXFAD = 0,000
OXNAD = 1,771
NADH
NAD
H2O
O2
H2O
O2
CO2
1,965
PEP fosfoenolpiruvatoPIR piruvatoAcCoA acetil-CoACit citratoIsocit isocitratoKG2 α-cetoglutaratoSucCoA succinil-CoASuc succinatoFum fumaratoMal malatoOAA oxaloacetatoGLX glioxilato3HHx 3-hidroxihexanoato3HO 3-hidroxioctanoato3HD 3-hidroxidecanoato3HDd 3-hidroxidodecenoato
LEGENDA
G6P glicose-6-fosfato F6P frutose-6-fosfatoF16P frutose-1-6-difosfatoGL6P glicono-g-lactona-3-fosfatoPG6 6-fosfogliconatoKDPG2 2-ceto-desoxi-6-fosfogliconatoG3P gliceraldeído-3-fosfatoE4P eritrose-4-fosfatoS7P sedoheptolose-7-fosfatoRb5P ribose-5-fosfatoRbl5P ribulose-5-fosfatoX5P xilulose-5-fosfatoDHP dihidroxiacetonaBPG13 1,3-bifosfogliceratoPG3 3-fosfogliceratoPG2 2-fosfoglicerato
88
6 CONCLUSÕES
As conclusões do trabalho são as seguintes:
1. nas condições ensaiadas com excesso de fonte de carbono, os valores de
concentração de biomassa (X) foram crescentes para valores decrescentes da
vazão específica de alimentação (D), já nas condições ensaiadas com limitação de
fonte de carbono, os valores de X variaram muito pouco com D, resultando em
valores semelhantes;
2. o fator de conversão de fonte de carbono em biomassa residual (Yxr/c) aumenta
com D, atingindo valores máximos de 0,4 – 0,5 g/g, quando a fonte de carbono
não é limitante. Nos ensaios limitados em fonte de carbono, não foi possível
estabelecer uma relação direta desse parâmetro com D;
3. a limitação ou não em fonte de carbono resultou em comportamento semelhante
dos valores do fator de conversão de fósforo em biomassa residual (Yxr/p).
Valores praticamente constantes para toda a faixa de Ds ensaiadas, valores na
faixa de 30 – 40 g/g na condição de limitação em P, 20 – 25 g/g na condição de
limitação em N e 35 – 50 g/g para limitação em N e P simultânea;
4. o fator de conversão de nitrogênio em biomassa residual (Yxr/n) variou pouco
para os valores de D testados, independente da limitação ou não da fonte de C.
Valores de 10 g/g para limitação em N, 8 g/g para limitação em P e 9g/g para
limitação em N e P. Na condição de limitação em P e N e P simultânea, Yxr/n foi
menor ( 5 g/g e 7 g/g, respectivamente) para o D em que ocorreu maior acúmulo
de polímero;
5. a partir dos fatores de conversão de fonte de carbono e nutrientes em biomassa
residual foi possível delimitar as regiões de crescimento com múltipla limitação
nas formas estudadas;
6. o limite superior da região de múltipla limitação é função da velocidade de
crescimento do microrganismo, sendo os valores de Co/No e Co/Po crescentes
com a diminuição de D. Já para o limite inferior, Co/No e Co/Po variam muito
pouco com D;
7. maiores valores de polímero são acumulados quando P é o nutriente limitante
(70%). Quando a limitação é somente na fonte de N, o máximo valor de teor de
PHA obtido é de somente 40% da biomassa celular. A limitação em ambos os
89
substratos (N e P), além do alto teor de polímero (68%) resulta em melhores
fatores de conversão de fonte de carbono em polímero, valores de YPHA/C de 0,19
g/g quando comparado com 0,16 g/g para limitação só em P e 0,10 g/g para
limitação só em N;
8. independente do tipo de limitação, a predominância na composição do polímero é
do monômero de 3-hidroxidecanoato (C10) cuja fração molar fica na faixa de
70% a 80%. Os monômeros 3-hexanoato (C6), 3-hidroxioctanoato (C8) e o 3-
hidroxidodecanoato (C12) também estão presentes no polímero e, na condição de
maior acúmulo, a composição é praticamente a mesma para as 3 condições
testadas, cerca de: 3 % mol de C6, 20 % mol de C8, e 5 % mol de C12.
9. os maiores valores de produtividade obtidos são da ordem de 0,16 – 0,18
gPHA/L.h, obtidos para D = 0,05 h-1, nas condições de limitação somente em P e
em N e P simultaneamente. Na condição de limitação em N os valores máximos
foram da ordem de 0,08 gPHA/L.h;
10. os fatores de conversão de oxigênio em biomassa residual e os respectivos
coeficientes de manutenção obtidos para a condição de limitação em nitrogênio
(Yxr/o = 0,96 g/g e mo =0,11g/gh), para limitação em fósforo (Yx/o = 1,39 g/g e
mo = 0,13 g/gh) e para limitação em nitrogênio e fósforo (Yx/o = 1,53 g/g e mo =
0,12 g/gh) indicaram que a limitação simultânea em nitrogênio e fósforo implicou
em menor consumo de oxigênio para gerar células quando comparada com a
condição de limitação em N ou P e que o oxigênio utilizado para manutenção das
células independe do tipo de limitação e dos valores das vazões específicas de
alimentação empregadas (entre 0,04 e 0,50 h-1);
11. os valores de qCO2 foram crescentes com D, coerentes com o fato de que o
crescimento celular deve prevalecer sobre o acúmulo de polímero com o aumento
de D;
12. os ensaios preliminares em alta densidade resultaram em estados estacionários
com valores de concentração de biomassa de até 32,80 g/L ( D = 0,045 h-1), porém
com teores de polímero da ordem de 15 % da biomassa celular;
13. os valores de Yxr/p e Yxrc para os ensaios preliminares em alta densidade foram
diferentes dos obtidos em baixa densidade celular indicando que as relações C/N e
C/P devam ser diferentes para atingir um maior acúmulo de polímero em alta
densidade celular;
90
14. o modelo metabólico (E3) proposto ajustou aos dados experimentais na condição
de limitação em nitrogênio. Os fluxos metabólicos obtidos propõem que glicose
ou frutose sejam consumidas utilizando a via de Embden-Meyerhoff-Parnas, não
ocorrendo fluxo entre 6-fosfogliconato e 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogliconato. O
modelo propõe ainda que NADPH e CO2 são gerados pelo desvio da hexose
monofosfato;
15. as relações elementares geradas pelo modelo (E3), foram utilizadas para analisar
possíveis modificações na rede metabólica que pudessem resultar em aumento da
conversão de substrato em produto. Os fluxos resultantes indicaram que a melhor
condição para produzir PHA implica em gerar NADPH, que é consumido para
fazer polímero, utilizando a Via de Entner-Doudoroff de forma cíclica e
direcionando o fluxo de gliceraldeído-3-fosfato para a formação de
fosfoenolpiruvato somente para suprir precursores para síntese de biomassa
residual (Xr), uma vez que a produção de NADPH pelo Ciclo de Krebs ou pela
via das hexoses monofosfato implicam em perdas da fonte de C na forma de CO2;
16. a partir dos valores de Yx/o e das frações de carbono que resultaram em CO2
pode-se afirmar que o nível de oxidação da biomassa não foi o mesmo nas
situações de limitação avaliadas, sugerindo diferenças na composição celular
nesses casos;
17. a não adequação do modelo E3 nos casos de limitação em P e em N e P, foi
atribuída a composição da biomassa celular, assumida como igual a de E. coli no
modelo.
91
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ANEXOS