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DRIELEN DE OLIVEIRA MOREIRA
"MECANISMOS DE AÇÃO DA SURAMINA NA
CARDIOMIOPATIA DO CAMUNDONGO MDX"
Campinas, 2015
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iii
iv
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia
Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Moreira, Drielen de Oliveira, 1985-
M813m MorMecanismos de ação da suramina na cardiomiopatia do camundongo mdx /
Drielen de Oliveira Moreira. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
MorOrientador: Maria Julia Marques.
MorTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Mor1. Receptores purinergicos. 2. Cálcio. 3. Distrofia muscular de Duchenne. 4.
Coração. 5. Suramina. I. Marques, Maria Julia,1961-. II. Universidade Estadual de
Campinas. Instituto de Biologia. III. Título. Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Action mechanisms of suramin on cardiomyopathy in the mdx mice Palavras-chave em inglês: Receptors, Purinergic
Calcium Muscular dystrophy, Duchenne
Heart Suramin Área de concentração: Anatomia Titulação: Doutora em Biologia Celular e Estrutural Banca examinadora: Maria Julia Marques [Orientador]
Francis Lopes Pacagnelli Candida Luiza Tonizza de Carvalho
Robson Francisco de Carvalho
Marcelo Rodrigues da Cunha Data de defesa: 11-02-2015 Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural
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vi
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RESUMO
A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença muscular progressiva que causa
falência respiratória e cardíaca resultando em morte por volta da terceira década de vida. A
ausência da distrofina na DMD e no camundongo mdx, modelo experimental da doença,
leva a instabilidade do sarcolema e aumento do influxo de cálcio seguido de mionecrose e
fibrose. Receptores purinérgicos estão envolvidos na patogênese das distrofinopatias. A
ativação destes receptores por ATP deflagra vias de sinalização secundárias que promovem
a entrada de cálcio e ativam a formação de fibrose. No presente estudo, verificamos se a
suramina, droga anti-fibrótica e antagonista de receptores purinérgicos, modifica o cálcio e
proteínas a ele relacionadas, bem como afeta metaloproteinases e seus inibidores teciduais,
no coração e no músculo diafragma de camundongos mdx, na fase mais tardia da doença
(11 meses de idade). Análise de Western blotting revelou níveis elevados do receptor
purinérgico P2Y2 em ambos os músculos estudados. A terapia com suramina diminui o
nível deste receptor significativamente. Concomitantemente, observamos redução dos
níveis do canal de cálcio ativado por estiramento (TRPC1) e do cálcio total, o que no
músculo cardíaco pode explicar a redução da mionecrose (diminuição da creatina quinase
cardíaca no plasma e da troponina I no miocárdio). A atividade e o nível da
metaloproteinase-9 (MMP-9), principal envolvida na remodelação da matriz extracelular e
formação de fibrose, estavam elevados no coração distrófico em relação ao coração normal.
A suramina promoveu aumento adicional da atividade da MMP-9 e dos níveis do seu
inibidor tecidual, a TIMP-1. A suramina preveniu a redução da beta-distroglicana,
componente do complexo distrofina-proteínas que encontra-se reduzido no coração
distrófico. De maneira geral, a suramina promoveu efeitos semelhantes no diafragma
distrófico, no que se refere ao cálcio total, TRPC1, MMP-9 e TIMP-1. Estes dados sugerem
que, tanto no coração quanto no diafragma distróficos, o receptor purinérgico P2Y2
desempenha papel importante em vias de sinalização relacionadas ao cálcio (através do
TRPC1) e da modulação da matriz extracelular (através da MMP-9 e TIMP-1). A suramina,
por ser utilizada em outras doenças humanas, com doses e efeitos colaterais já estabelecidos
em humanos, tem potencial para a terapia da cardiomiopatia na DMD, merecendo atenção
em estudos clínicos desta doença.
Palavras-chaves: receptores purinérgicos, cálcio, Distrofia Muscular de Duchenne,
coração, suramina.
viii
ix
ABSTRACT
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive muscle-wasting disease that causes
respiratory and cardiac failure and results in death at about 30 years of age. The lack of
dystrophin in mdx mice, the experimental model of DMD, causes sarcolemmal breakdown
and increased calcium influx followed by myonecrosis and fibrosis. Purinergic receptors
are involved in the pathogenesis of dystrophinopathies. Activation of these receptors by
ATP triggers secondary signaling pathways that promote calcium entry and activates the
formation of fibrosis. In the present study, we investigated if suramin, an anti-fibrotic drug
and an antagonist of purinergic receptors, modifies total calcium and calcium related-
proteins and affects metalloproteinases and their tissue inhibitors in the heart and
diaphragm muscle of dystrophic mice, in the later stage of the disease (11 months of age).
Western blotting analysis indicated increased levels of P2Y2 purinergic receptor in the both
muscles studied, which were significantly decreased by suramin. Concomitantly, suramin
lead to a reduction in total calcium and in the levels of the stretch-activated calcium
channel TRPC1, which may explain the reduction of cardiac necrosis (decreases heart
creatine kinase in plasma and troponin I in the myocardium). The activity and level of
metalloproteinase-9 (MMP-9), the main involved in remodeling of the extracellular matrix
and formation of fibrosis, were elevated in the dystrophic heart compared to normal heart.
Suramin promoted further increase in MMP-9 activity and in the levels of MMP-9 inhibitor
TIMP-1. Suramin prevented the reduction of beta-dystroglycan, one of the main
components of the dystrophin-protein complex usually reduced in dystrophic heart. In
general, suramin promoted similar effects in the dystrophic diaphragm, with respect to total
calcium, TRPC1, MMP-9 and TIMP-1. These data suggest that P2Y2 purinergic receptor
plays an important role in signaling pathways involved in calcium regulation (via TRPC1)
and modulation of extracellular matrix (via MMP-9 and TIMP-1), in cardiac and
respiratory dystrophic muscles. Suramin may be a potential alternative to treat dystrophic
cardiomyopathy deserving attention in clinical trials.
Keywords: purinergic receptors, calcium, Duchenne muscular dystrophy, heart, suramin.
x
xi
SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................................................... vii
ABSTRACT ...................................................................................................................... ix
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... xxiii
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
1.1 Distrofia Muscular de Duchenne ............................................................................... 1
1.2 O camundongo mdx .................................................................................................... 4
1.3 Cálcio e a patogênese da DMD ................................................................................... 4
1.4 Cardiomiopatia na DMD e no camundongo mdx .................................................... 7
1.5 Receptores purinérgicos .............................................................................................. 9
1.6 Metaloproteinases de matriz e inibidores teciduais endógenos ............................ 13
1.7 Biomarcadores do dano cardíaco na DMD ............................................................. 15
1.7.1 Creatina quinase cardíaca e Troponina cardíaca .................................................. 15
1.8 Suramina .................................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS ................................................................................................................. 19
2.1 Objetivos gerais ......................................................................................................... 19
2.1.1 Objetivos específicos ................................................................................................ 19
3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 20
3.1 Animais ....................................................................................................................... 20
3.2 Protocolo experimental e tratamento com suramina ............................................. 20
3.3 Determinação da Creatina quinase cardíaca (CK-MB) ........................................ 21
3.4 Mensuração do cálcio total ....................................................................................... 22
3.5 Western blotting ........................................................................................................ 23
3.6 Zimografia ................................................................................................................. 24
3.6.1 Preparação do extrato total ..................................................................................... 25
3.6.2 Eletroforese .............................................................................................................. 25
3.7 Análise estatística ...................................................................................................... 26
4 RESULTADOS ............................................................................................................. 26
4.1 Quantificação dos níveis do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos ...................................................................................................... 26
xii
4.2 Quantificação do cálcio total e níveis de TRPC1 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos ...................................................................................................... 27
4.3 Quantificação dos níveis de CSQ-C e CSQ-E ......................................................... 29
4.4 Determinação da CK-MB e quantificação dos níveis de cTn-I ............................. 30
4.5 Quantificação dos níveis de b-distroglicana nos músculos cardíaco e diafragma
distróficos ......................................................................................................................... 32
4.6 Quantificação dos níveis de MMP-9 e TIMP-1 nos músculos cardíaco e diafragma
distróficos ......................................................................................................................... 33
4.7 Quantificação dos níveis de MMP-2 e TIMP-2 nos músculos cardíaco e diafragma
distróficos ................................................................................................................. ........ 35
4.8 Análise zimográfica da atividade das MMP-9 e MMP-2 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos ...................................................................................................... 37
4.9 Apresentação numérica dos resultados ................................................................... 40
4.9.1 Western blotting ....................................................................................................... 40
4.9.2 Cálcio total ............................................................................................................... 41
4.9.3 CK-MB ..................................................................................................................... 41
4.9.4 Zimografia ............................................................................................................... 42
5 DISCUSSÃO ................................................................................................................. 42
5.1 Suramina diminui os níveis do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos ...................................................................................................... 42
5.2 Suramina diminui o Ca2+
total e os níveis de TRPC1 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos ....................................................................................................... 45
5.3 Suramina não altera os níveis de CSQ-C e restaura os níveis de CSQ-E
............................................................................................................................................. 47
5.4 Suramina diminui a mionecrose no músculo cardíaco distrófico
............................................................................................................................................. 48
5.5 Suramina auxilia na manutenção da estrutura do complexo distrofina-
glicoproteínas no músculo cardíaco distrófico impedindo a redução dos níveis de
b_DG ................................................................................................................................. 49
xiii
5.6 Efeitos da suramina na atividade da MMP-9 e MMP-2 e níveis das MMP-9, MMP-
2, TIMP-1 e TIMP-2 nos músculos cardíaco e diafragma distróficos
............................................................................................................................................. 51
CONCLUSÃO ................................................................................................................. 54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 55
ANEXO ............................................................................................................................ 83
xiv
xv
DEDICO
AOS MEUS PAIS, GUILHERME E ELIANA
“Não existem palavras que expressem tamanho amor e gratidão que tenho por vocês. A
realização de mais essa etapa em minha vida, de mais uma conquista profissional só é
possível porque vocês estão todo tempo ao meu lado, me apoiando, me dando forças para
seguir em frente. Vocês são minha maior riqueza, os amo incondicionalmente e serei
eternamente grata por sonharem junto comigo e principalmente por me ajudarem a tornar
este sonho uma realidade”.
À MINHA IRMÃ, KERULINE
“Pela alegria plena, amor, cumplicidade, parceria, troca de experiências, apoio e amizade
sincera.”
AO MEU NAMORADO, CHARLES
“Encontrar um amor verdadeiro é raro no mundo de hoje... Encontrar um homem que a
ame, apoie, admire e acima de tudo respeite e entenda seus momentos de ausência é uma
benção de Deus. Obrigada por fazer parte da minha vida, por ser quem você é e por nunca
ter desistido de nós.
AO MEU CACHORRO, LUCKY
“Por me proporcionar deliciosos momentos de alegria e diversão. Por me receber sempre
com muita festa a cada volta para casa. Meu anjinho de quatro patas.”
xvi
xvii
Agradecimento especial
À Professora Dra. Maria Julia Marques por acreditar na realização de mais este trabalho,
pelo respeito, confiança, colaboração, amizade e incentivo. Pelos conhecimentos passados e
por ter me guiado na vida acadêmica, visando aprimoramento didático e científico.
xviii
xix
AGRADECIMENTOS
A Deus pela dádiva da vida, saúde e família que me concedeu. Por me proteger, abençoar e
me oferecer oportunidades para realização dos meus sonhos e objetivos. Por me amparar e
auxiliar na superação de obstáculos e dificuldades. Por me dar a força necessária para
seguir em frente mesmo quando houve a vontade de desistir.
A toda minha família pelo incentivo e apoio durante a realização deste trabalho.
Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural pelo
comprometimento e excelência na formação profissional de seus alunos.
Ao Prof. Dr. Humberto Santo Neto pela colaboração e pelas importantes considerações
para a realização deste trabalho.
Aos Professores do Departamento de Anatomia Prof. Dr. José Ângelo Camilli, Profa.
Dra. Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, Profa. Dra. Evanisi Teresa Palomari,
Prof. Dr. José Meciano, Prof. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira e Prof. Dr.
Marco Cesar Somazz pelos ensinamentos diários da vida acadêmica e pessoal.
Aos Professores Dr. Edson Pimentel, Dr. Marcondes Cavalcante Franca Júnior e Dra.
Elaine Minatel pelas importantes considerações no exame de qualificação.
À Profa. Dra. Elaine Minatel pela colaboração, parceria, amizade e ensinamentos durante
este trabalho e ao longo destes anos.
À Sra. Liliam Alves Senne Panagio pela atenção e auxílio durante todo o doutorado.
Aos funcionários do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Sr. Norivaldo
Celestino, Sr. Marco Aurélio Ribeiro de Paula, Sr. Paulo Afonso Bernardes, Sr. Paulo
Francisco dos Santos, Sr. Toni Donizeti dos Santos, Sra. Marlene Lima Francisco,
xx
Srta. Stella Maris Fick de Ferraz, Srta. Érika da Silva Campos pela contribuição
durante minha formação.
Ao Comitê de Ética em Experimental Animal (CEEA) no nome da Profa. Dra. Ana
Maria Aparecida Guaraldo e das funcionárias do Biotério Central da UNICAMP
(CEMIB) no nome de Érika T.P.S. Martins e Regina Maria P.S.M. Vinagre pelo
auxílio na aquisição e atenção ao cuidado dos animais de laboratório.
Aos amigos e colegas de laboratório Adriana Fogagnolo Maurício, Aline Macedo, Ana
Paula Tiemi Taniguti, Cintia Yuri Matsumura, Daniela Mizobuti, Fernanda dos
Santos Rapucci Moraes, Isabel Cristina Chagas Barbin, Ivan Pires, Juliana Pedrosa,
Juliano Alves Pereira, Luana Marcela N. da Silva, Luiz Henrique Rapucci Moraes,
Rafael Mancio, Samara Camaçari de Carvalho, Túlio Hermes e Viviane Perim pela
importante contribuição para a realização deste trabalho e pela amizade e convívio nestes
anos.
À todos os amigos e colegas que mesmo distantes nunca me abandonaram e sempre me
incentivaram e apoiaram a todo momento.
À FUNCAMP pelo auxílio financeiro concedido durante o Programa Estágio Docente
(PED).
À CAPES e a FAPESP (2012/03498-7) pela concessão de bolsa e financiamento do
projeto, o que tornou possível a execução e finalização deste trabalho.
xxi
“Se um dia tiver que escolher entre o mundo e o amor... Lembre-se:
Se escolher o mundo ficará sem o amor, mas se escolher o amor,
com ele conquistará o mundo.”
Albert Einsten
xxii
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADP – Adenosina difosfato
ATP – Adenosina trifosfato
b-DG – β distroglicana
Ca2+
– Cálcio
CaM - Calmodulina
CDG – Complexo distrofina-glicoproteínas
[Ca2+]i – Concentração de cálcio intracelular citoplasmática
CK – Creatina quinase
CK-MB – Creatina quinase cardíaca
CSQ – Calsequestrina
CSQ-E – Calsequestrina esquelética
CSQ-C – Calsequestrina cardíaca
cTGF – Fator de crescimento do tecido conjuntivo
cTn-I – Troponina cardíaca I
DMD – Distrofia Muscular de Duchenne
DHPRS – Canal voltage-dependente dihidropiridina
ECG – Eletrocardiograma
EGF – Fator de crescimento epidermal
EROs – Espécies reativas de oxigênio
FDA – Food and Drug Administration
FGF – Fator de crescimento fibroblástico
GAPDH – Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
ICP-EOS – Espectômetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente
(inductively coupled plasma optical emission spectrometry)
IL-6 – Interleucina 6
IL-1β – Interleucina 1β
Mdx – “x chromossome-linked muscular dystrophy”
MEC – Matriz extracelular
xxiv
MMPs – Metaloproteinases
MMP-2 – Metaloproteinase 2
MMP-9 – Metaloproteinase 9
Na+ - Sódio
PBS - Tampão fosfato salina (phosphate buffered saline)
PDGF – Fator de crescimento derivado de plaquetas
PKA – Proteína quinase A
PKC – Proteína quinase C
PKD – Proteína quinase D
RyRs – Receptor de rianodina
SAC - Canais ativados por estiramento (Stretch-activated channels)
Sal – Salina
SERCA – Bomba Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático
Ser 23 – resíduo de serina 23
Ser 24 – resíduo de serina 24
Sur – Suramina
TGF-β1 – fator de crescimento transformador beta-1
TIMPs – Inibidores teciduais endógenos de metaloproteinases
TIMP-1 – Inibidor tecidual endógeno 1
TIMP-2 – Inibidor tecidual endógeno 2
Tm – Tropomiosina
TnC – Troponina C
TnI – Troponina I
TnT – Troponina T
TRPC1 – Canal potencial receptor transiente, subfamília C, membro1
(transient receptor potential cation, subfamily C, member 1)
UDP – Uridina difosfato
U/L – Unidades internacionais
UTP – Uridina trifosfato
VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Distrofia Muscular de Duchenne
A distrofia muscular de Duchenne (DMD; Online Mendelian Inheritance in Man
[OMIM] referência 310200), descrita em 1861 por Gillaume Benjamin Amand Duchenne, é
uma doença recessiva ligada ao cromossomo X que afeta uma em cada 3500 crianças
nascidas vivas do sexo masculino (ENGEL et al., 1994).
Os primeiros sinais clínicos da DMD, geralmente observados por volta de 2-5 anos
de idade, são caracterizados por dificuldade para correr, subir e descer escadas,
instabilidade da marcha, pseudo-hipertrofia do tríceps sural e sinal positivo de Gowers, no
qual a criança por fraqueza dos músculos extensores de quadril e joelhos fixa cada
segmento dos membros em extensão, como se ascendesse sobre si mesma. Lordose,
escoliose, encurtamento do tendão de Aquiles e a fraqueza muscular progressiva levam ao
uso de cadeira de rodas em torno de 9-12 anos de idade. Em estágios posteriores, o
comprometimento da musculatura respiratória leva à diminuição da capacidade pulmonar e
complicações cardiorrespiratórias começam a aparecer levando o paciente a óbito por volta
de 30 anos de idade (ENGEL et al., 1994; BIGGAR, 2006, VERMA et al., 2010).
O comprometimento muscular na DMD é causado por mutação no gene da
distrofina, proteína do sarcolema que tem inúmeras associações com outras proteínas do
citoesqueleto, constituindo o complexo distrofina-glicoproteínas da membrana das fibras
musculares esqueléticas, cardíacas e lisas (CDG; BERNASCONI et al., 1995; Figura 1). O
CDG confere estabilidade ao sarcolema durante a contração e relaxamento da fibra
muscular (ENGEL et al., 1994), sendo constituído pelas distroglicanas, sintrofinas,
sarcoglicanas e distrobrevinas (para revisão ver RANDO, 2001; figura 1).
2
Figura 1: Organização molecular do complexo distrofina-glicoproteínas representando a α-
e β distroglicanas; α-, β-, γ-, δ - sarcoglicanas; α-, β1-sintrofinas; distrobrevina e a
distrofina. A distrofina exerce papel importante na estabilização do sarcolema conectando
actina citoesquelética à cadeia da laminina-2 localizada na lâmina basal via complexo de
glicoproteínas. Fonte: Laboratório de Biologia Estrutural da Junção Neuromuscular, 2011.
A ausência da distrofina leva a instabilidade do sarcolema e a redução dos níveis das
demais proteínas do CDG, interrompendo a ligação do citoesqueleto da fibra com a matriz
extracelular (ERVASTI, 1990). Ainda, na falta da distrofina ocorre entrada de grandes
quantidades de íons cálcio, levando à ativação de proteases, degeneração muscular,
subsequente invasão de células inflamatórias, culminando com a fibrose intersticial nos
músculos esqueléticos e cardíaco (BERTORINI et al., 1982; MARIOL e SÉGALAT, 2001;
WHITEHEAD et al., 2006) (Figura 2).
Os mecanismos responsáveis pelo aumento do cálcio (Ca2+
) na fibra distrófica ainda
não são completamente elucidados, mas canais de cálcio strech-activated (SACs) parecem
estar envolvidos (FRANCO-OBREGON Jr e LANSMAN, 1994; ALLEN et al., 2010;
MATSUMURA et al., 2011) assim como a presença de microrupturas do sarcolema
resultantes da força contrátil dos sarcômeros (GROUNDS et al., 2005; MARQUES et al.,
3
2008) e a ativação de proteases cálcio-dependentes, tornando as fibras musculares mais
susceptíveis a necrose (BATCHELOR e WINDER, 2006) (Figura 2).
Os SACs são canais mecanosensíveis permeáveis ao Ca2+
que aumentam a
concentração intracelular citoplasmática [Ca2+
]i (YEUNG et al., 2006), levando a ativação
exagerada de proteases endógenas, como a calpaína, resultando em necrose da fibra
muscular. Assim sendo, o cálcio desempenha papel central na patogênese da mionecrose na
DMD (MARIOL e SÉGALAT, 2001; GAILLY, 2002).
Figura 2: Representação esquemática da via através da qual a ausência da distrofina leva
ao influxo de cálcio, fibrose e consequente perda funcional. Ca2+
: cálcio; [Ca2+
]i:
concentração de cálcio intracelular; CDG: complexo distrofina-glicoproteínas; CK: creatina
quinase. Adaptado de KASPAR et al., 2010.
4
1.2 O camundongo mdx
O camundongo mdx foi descoberto em 1984 em uma colônia de camundongos
C57BL/10 ScSn, recebendo a denominação C57BL/10 mdx: “x chromossome-linked
muscular dystrophy”. Eles foram identificados por apresentarem níveis elevados das
enzimas creatina quinase e piruvatoquinase, decorrente da degeneração muscular
característica de distrofia muscular (BULFIELD et al., 1984).
A patologia muscular é pronunciada no mdx entre duas e oito semanas de idade, um
período caracterizado pela presença de focos de necrose, fibras recém-regeneradas com
núcleo central e altas concentrações plasmáticas da enzima creatina quinase. O ciclo de
degeneração-regeneração tem seu pico por volta da terceira ou quarta semana de vida do
animal (PARTRIDGE et al., 1989). Ao redor de 1-3 meses de vida, a necrose atinge seu
ápice e após o quarto mês a incidência de fibras necróticas é reduzida (TANABE et al.,
1986).
Camundongos idosos apresentam avançada fraqueza muscular nos membros
acompanhada por progressiva deterioração estrutural e funcional do músculo diafragma
(STEDMAN et al., 1991) e alterações degenerativas nas fibras musculares cardíacas, com
focos de fibrose presentes nos ventrículos, átrios, e no sistema de condução (HAINSEY et
al., 2002).
1.3 Cálcio e a patogênese da DMD
A manutenção da homeostase do Ca2+
é essencial para o crescimento e
funcionamento celular, particularmente nos músculos, onde grandes flutuações de Ca2+
são
necessárias para desencadear os ciclos de contração e relaxamento muscular
(BATCHELOR e WINDER, 2006).
A concentração de cálcio intracelular ([Ca2+
]i) é regulada pela interação de
múltiplos processos de influxo e efluxo (BOOTMAN et al., 2001). Assim sendo, as células
musculares usam altos níveis transientes de Ca2+
livre no citosol para a sinalização celular,
mantendo baixa a [Ca2+
]i (BOOTMAN et al., 2001; CONSTANTIN et al., 2006).
5
O gradiente de Ca2+
é mantido por canais presentes na membrana plasmática que
movem ativamente o Ca2+
para fora da célula. Ou ainda, este íon pode ser resgatado para o
retículo endoplasmático pela bomba Ca2+
-ATPase (ALBERTS et al., 2002).
O Ca2+
é mobilizado por canais voltagem-dependentes, os quais são acionados
mediante despolarização; canais de Ca2+
capacitativos, ativados pela diminuição dos
estoques intracelular e os canais de Ca2+
receptor-operados, que são ativados por
mensageiros bioquímicos. Os canais iônicos possuem ligação estrutural a proteínas ligadas
a membrana e contribuem para o trânsito anormal de Ca2+
em miócitos distróficos (FONG
et al., 1990; FRANCO-OBREGON Jr e LANSMAN, 1990; VANDEBROUCK et al.,
2002).
A entrada de Ca2+
, a partir da despolarização do sarcolema se faz através dos canais
voltagem-dependentes dihidropiridina (DHPRs) e tipo- L (L-type Ca2+
channel),
localizados nos túbulos transversos. O íon é primeiramente armazenado no retículo
sarcoplasmático e então liberado para o sarcoplasma através do receptor de rianodina
(RyRs) (BERCHTOLD et al.,2000).
O aumento da [Ca2+
]i leva a ativação de proteínas e consequente contração da fibra
muscular. O Ca2+
utilizado durante o processo de contração é bombeado via bomba Ca2+
-
ATPase da membrana plasmática para fora das fibras musculares ou retorna para o retículo
sarcoplasmático por ação da bomba Ca2+
-ATPase do Retículo Sarcoplasmático (SERCA),
impedindo dessa maneira o aumento da [Ca2+
]i e levando ao relaxamento (ROSSI e
DIRKSEN, 2006).
O Ca2+
bombeado para o retículo sarcoplasmático é sequestrado pela calsequestrina
(CSQ), principal proteína responsável pelo tamponamento deste íon com alta capacidade de
armazenamento. Além disto, a calsequestrina parece regular a liberação do cálcio para fora
do retículo sarcoplasmático através dos receptores rianodina (RyRs), permitindo níveis
normais de cálcio no citosol (YANO e ZARAIN-HERZBERG, 1994; OHKURA et al.,
1998; BEARD et al., 2002, ROSSI e DIRKSEN, 2006).
Outros canais podem estar envolvidos com o influxo de Ca2+
para o sarcoplasma,
por exemplo, os canais ativados por estiramento (SAC, stretch-activated channel; figura 3).
Aos canais SAC fazem parte a família de canais TRPC (transient receptor potential cation)
6
(MAROTO et al., 2005). Os canais TRPC são ativados por diferentes estímulos, como a
diminuição da reserva de cálcio ou influxo deste íon, permitindo o movimento de sódio
(Na+) e Ca
2+ através da membrana (ROWELL et al., 2010).
Figura 3: Organização molecular do complexo distrofina-glicoproteínas com representação
dos canais de cálcio ativados por estiramento (SAC, stretch-activated channel) e tipo- L (L-
type Ca2+
channel), através dos quais ocorre influxo de íon cálcio (Ca2+
). A conexão do
citoesqueleto intracelular com a matriz extracelular da fibra muscular é interrompida em
consequência a ausência da proteína distrofina. Fonte: Laboratório de Biologia Estrutural
da Junção Neuromuscular, 2011.
Compõe esta família sete canais, TRPC1-7, que contribuem com a excitabilidade e
não excitabilidade de células a entrada de cátions não-voltagem-dependentes
desempenhando funções fisiológicas ou com consequências patológicas (SABOURIN et
al., 2011).
Em músculos estriados esqueléticos, evidências indicam papel fundamental,
principalmente do TRPC1 na regulação do Ca2+
durante contrações repetidas, além de ser
considerado uma parte macromolecular do complexo que inclui a distrofina (SAUBORIN
et al., 2009; ZANOU et al., 2010). No sistema cardiovascular, o TRPC1 desempenha
função regulatória no controle do tônus vascular em resposta a constrição mediada por
endotelina 1 e potencializa a despolarização do músculo liso em resposta a uma sobrecarga
7
(INOUE et al., 2009). Adicionalmente, o TRPC1 apresenta um papel patológico no coração
ocasionando aumento do número de cardiomiócitos observado concomitantemente à
hipertrofia cardíaca em ratos e camundongos (OHBA et al., 2007; SETH et al, 2009;
MIJARES et al., 2014).
Na DMD e no camundongo mdx o influxo anormal de Ca2+ e alterações em sua
mobilização intracelular são fatores chave no processo de injúria levando a degeneração da
fibra muscular (TURNER et al., 1991; CONSTANTIN et al., 2006; WHITEHEAD et al.,
2006; KRUGUER et al., 2008).
O TRPC1, em fibras musculares distróficas, regula a entrada de Ca2+
(FRANCO-.
OBREGON JR e LANSMAN, 1994; GERVÁSIO et al., 2008), podendo ser ativado por
estiramento da membrana (MAROTO et al., 2005) levando a alteração na homeostase do
íon (VANDERBROUCK et al., 2002; WILLIAMS e ALEN, 2007) estando altamente
expresso nos músculos esquelético (VANDEBROUCK et al., 2002; MATSUMURA et al.,
2011) e cardíaco do mdx (WILLIAMS e ALLEN, 2007).
1.4 Cardiomiopatia na DMD e no camundongo mdx
O músculo cardíaco é comumente envolvido na DMD (ENGEL, 1994; ZHU et al.,
2002), sendo a cardiomiopatia a causa de morte em cerca de 20% dos pacientes
(WEHLING-HENRICKS et al., 2005).
Dentre as manifestações clínicas da doença cardíaca na DMD, têm-se descrito
taquicardia e arritmias ventriculares, insuficiência cardíaca congestiva e alterações
eletrocardiográficas (MANNING e CROPP, 1958). O eletrocardiograma (ECG) revela
ondas R de amplitudes anormalmente altas, intervalo PR diminuído, prolongamento do
intervalo QT, ondas R polifásicas, redução da razão R:S e contrações atriais e ventriculares
prematuras (SLUCKA, 1968; BIA et al., 1999; WEHLING-HENRICKS et al., 2005;
BRANCO et al., 2007; BOSTICK et al., 2008; BOSTICK et al., 2009; SPURNEY, 2011;
DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013).
A fibrose é o principal fator associado à cardiomiopatia (AU et al., 2011). A fibrose
é definida como acúmulo excessivo de matriz extracelular (MEC). A síntese da matriz é
8
estimulada por citocinas pró-fibróticas, como o fator de crescimento transformador beta-1
(TGF-β1) e o fator de crescimento de tecido conectivo (cTGF) (AU et al., 2011). A matriz
pode ser degradada por proteases zinco-dependentes, as chamadas metaloproteinases
(MMPs), cuja atividade enzimática pode ser controlada por inibidores teciduais endógenos
de metaloproteinases (TIMPs) (DAHIYA et al., 2011) (Figura 3).
Assim como na DMD, o camundongo mdx apresenta anormalidades no ECG (BIA
et al., 1999; CHU et al.; 2002; HAINSEY et al., 2002; QUINLAN et al., 2004; LOHAN et
al., 2005; DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013) e acúmulo progressivo de fibrose
cardíaca, sugerindo que a fibrose também é responsável por algumas características da
cardiomiopatia do mdx (HAINSEY et al., 2002; WEHLING-HENRICKS et al., 2005; DE
OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). Adicionalmente, a produção exacerbada de espécies
reativas de oxigênio (EROs) no camundongo mdx, desempenha papel central na disfunção
do fluxo de cálcio nos miócitos cardíacos (WILLIAMS e ALLEN , 2007; JUNG et al.,
2008). Níveis elevados de cálcio intracelular são resultantes do influxo por meio de canais
TRPC, os quais estão envolvidos na hipertrofia patológica e remodelação do músculo
cardíaco (MIJARES et al., 2014).
9
Figura 4: Representação esquemática da cardiomiopatia na DMD e no camundongo mdx.
Ca2+
: cálcio; [Ca2+
]i: concentração de cálcio intracelular; CDG: complexo distrofina-
glicoproteínas; CK-MB: creatina quinase cardíaca; cTn-I: troponina cardíaca I; ECG:
eletrocardiograma; MMPs: metaloproteinases de matriz e TIMPs: inibidores teciduais
endógenos de metaloproteinases. Adaptado de KASPAR et al., 2010.
1.5 Receptores purinérgicos
Nucleotídeos extracelulares são conhecidos por participarem da regulação de
diversas respostas fisiológicas no sistema cardiovascular como, por exemplo, a função
10
cardíaca e regulação do tônus vascular, através de receptores chamados de P2 (KUNAPULI
e DANIEL, 1998).
A primeira descrição da sinalização extracelular por purinas foi realizada por
DRURY e SZENT-GYÖRGYI (1929), e os receptores purinérgicos foram definidos em
1976 (BURNSTOCK, 1976). Estes receptores foram divididos em receptores P1 e
receptores P2 (BURNSTOCK, 1978, apud ABBRACCHIO et al., 2006). Mais tarde, os
receptores P2 foram subdivididos farmacologicamente em P2X (receptores de canais
iônicos dependentes de transmissor) e P2Y (receptores acoplados à proteína G)
(BURNSTOCK e KENNEDY, 1985; HOU et al., 1999; ABBRACCHIO et al., 2003).
A sinalização através de receptores purinérgicos ocorre em numerosos processos
biológicos, na maioria dos tecidos (BURNSTOCK et al., 2013), uma vez que adenosina
trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), uridina trifosfato (UTP) e uridina difosfato
(UDP), nucleotídeos da classe das purinas e pirimidinas além de funcionarem como uma
fonte de energia intracelular atuam como importantes sinalizadores moleculares
extracelulares (ERLINGE e BURNSTOCK, 2008). Tais nucleotídeos podem ser liberados
para o fluido extracelular em resposta a estímulos que incluem o estiramento mecânico,
estresse químico, ativação plaquetária, inflamação, proliferação e morte celular
(BURNSTOCK, 1997; IDZKO et al., 2007; ELLIOTT et al., 2009; COHEN et al., 2011).
Uma vez liberados, esses nucleotídeos ativam os receptores P2X e P2Y (ABBRACCHIO et
al., 2006; ZIZZO et al., 2012).
Sete subtipos de receptores purinérgicos P2X (P2X1-7) e oito subtipos de receptores
P2Y (P2Y1,2,4,6,11,12,13,14) foram identificados e reconhecidos (RAVELIC e BURNSTOCK,
1998; NORTH, 2002, BURNSTOCK, 2004). Os receptores P2X são ativados por ATP
enquanto os receptores P2Y têm preferência por nucleotídeos de adenina (ATP e ADP;
P2Y1, P2Y2, P2Y11, P2Y12 e P2Y14), nucleotídeos de uridina (P2Y2, P2Y4 e P2Y6) ou
nucleotídeos de açúcar (UDP- glucose e UDP-galactose; P2Y14) (ABBRACCHIO et al.,
2006).
No sistema musculoesquelético, estudos iniciais demonstraram que os nucleotídeos
extracelulares podem induzir o aumento de Ca2+
intracelular em células ósseas (YU e
FERRIER, 1993) e inibir a formação óssea (HOEBERTZ et al., 2002). O mesmo foi
11
encontrado em cultura de fibras musculares humanas (CSERI et al., 2002). Posteriormente
foi reconhecido que os nucleotídeos extracelulares desempenham papel fundamental na
modulação da diferenciação, sobrevivência e função das células ósseas (BURNSTOCK et
al., 2013). Durante o desenvolvimento, a expressão dos receptores P2X2 coincide com o
aparecimento e a formação das junções neuromusculares (RYTEN et al., 2001) e ambos
P2X e P2Y tem sido implicados do desenvolvimento do músculo esquelético (RYTEN et
al., 2001, CHEUNG et al., 2003, BURNSTOCK et al., 2013).
Análises imuno-histoquímicas de biópsias de músculo esquelético humano
revelaram a localização de receptores P2Y2 no endotélio de capilares e no endotélio de
microvasos do músculo liso. Além disso, os receptores P2X1 foram encontrados no
sarcolema (MORTENSEN et al., 2009). Dessa forma, tem sido sugerido que ambos
receptores, P2X e P2Y, podem ser alvos potenciais para a estimulação da regeneração do
músculo esquelético e da restauração funcional após lesão (WARREN et al., 2011).
No sistema cardiovascular, a sinalização purinérgica também exerce importante
papel (ERLINGE e BURNSTOCK, 2008). O ATP e seu produto de degradação, ADP,
exercem potentes e diversos efeitos como dilatação e vasoconstrição, angiogênese,
remodelação vascular, coagulação, agregação plaquetária, inflamação e inibição da
transmissão simpática (ERLINGE, 1998; WANG et al., 2002; ERLINGE e BURNSTOCK,
2008; ERLINGE, 2011; BURNSTOCK, 2013) bem como atuam na migração celular,
proliferação e morte celular durante a angiogênese, aterosclerose e restenose, seguidos de
angioplastia (RAVELIC e BURNSTOCK, 1991; BURNSTOCK, 2013).
No cardiomiócito, o ATP causa efeito inotrópico positivo, mas também efeito
cronotrópico positivo (PIROTTON et al., 1988, apud HOU et al., 1999) podendo também
atuar em sinergismo com agonistas β-adrenérgicos para aumentar a contratilidade dos
miócitos cardíacos (VASSORT, 2001). Além disso, o ATP extracelular pode ser liberado
no coração a partir de nervos simpáticos, plaquetas, células endoteliais e em caso de
hipóxia (FREDHOLM et al., 1982, HOU et al., 1999).
A sinalização purinérgica e seus receptores também têm sido relacionados ao
desenvolvimento do infarto do miocárdio, rejeição de xenotransplantes, remodelamento
cardíaco e fibrose (VASSORT, 2001; ERLINGE e BURNSTOCK, 2008; BRAUN et al.,
12
2010; LU e INSEL, 2014; BURNSTOCK e RAVELIC, 2014). Atribui-se ao receptor P2Y2
a resposta pró-fibrótica e o aumento de cálcio cardíaco, uma vez que a ativação do P2Y2
parece promover o aumento da expressão de TGF-β1 e interleucina-6 (IL-6), fatores
envolvidos na injúria cardíaca (BRAUN et al., 2010). Em casos de insuficiência cardíaca
congestiva em ratos, tem-se relatado além da alta- regulação do receptor P2Y2, também a
expressão do P2X1 (HOU et al., 1999; VASSORT, 2001; ERLINGE e BURNSTOCK,
2008). Adicionalmente, atribui-se ao receptor P2X7 a morte de cardiomiócitos
(COSENTINO et al., 2012).
Na DMD, a ausência da distrofina e a rápida mudança nas concentrações de Ca2+
e
permeabilidade da membrana levam a maior liberação de ATP e seus produtos ocasionando
alteração do perfil de sinalização dos receptores purinérgicos nos músculos distróficos,
como anormalidades na função do receptor P2X consequentemente contribuindo para a
patogênese da DMD (JIANG et al; 2005; YEUNG et al., 2006).
Atribui-se ao curso do processo de degeneração/regeneração em músculos
distróficos uma acentuada alta-regulação de diferentes receptores purinérgicos identificados
em análises de DNA, como por exemplo, o receptor purinérgico P2X4 (JIANG et al., 2005),
o qual foi demonstrado estar localizado nos macrófagos (YEUNG et al., 2004). Além deste,
os receptores P2X1 e P2X6, também altamente regulados, apresentam-se co-localizados em
pequenas fibras em regeneração com núcleo centralizado, caracterizando o papel dos
subtipos desses receptores P2X predominantemente no processo de regeneração muscular
(RYTEN et al., 2004; JIANG et al., 2005), embora o subtipo P2X1 esteja também expresso
em miócitos cardíacos e envolvido na patologia do músculo cardíaco (HOU et al., 1999).
Em relação aos receptores da família P2Y na cardiomiopatia na DMD e no
camundongo mdx, mais especificamente o receptor P2Y2 que participa da resposta pró-
fibrótica, os dados são bastante escassos. Desta forma, o estudo do envolvimento deste
receptor na cardiomiopatia do camundongo mdx pode contribuir para o estabelecimento de
novas terapias direcionadas a inibição da formação de fibrose.
13
1.6 Metaloproteinases de matriz e inibidores teciduais endógenos
Visto que a fibrose é a principal responsável pela perda funcional dos músculos
distróficos, é importante ressaltar os mecanismos envolvidos na sua formação, que
necessariamente envolvem a regulação da matriz extracelular pelas metaloproteinases e
seus inibidores endógenos.
As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco- e
cálcio-dependentes coletivamente capazes de degradar os componentes da MEC durante o
desenvolvimento embrionário, migração celular, morfogênese e remodelamento tecidual
(WOESSNER, 1991; CARMELI et al., 2004; ALI et al., 2011; VARGOVÁ et al., 2012).
As MMPs podem ser subdividas em cinco classes de acordo com sua estrutura
primária, a especificidade do seu substrato e a sua localização subcelular em: colagenases
(MMP-1, MMP-8 e MMP-13), gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estromelisinas (MMP-3,
MMP-10, MMP-11 e MMP-12), matrilisinas (MMP-7 e MMP-26), as do tipo membrana
(MT)-MMPs (MT1-MMP até MT26-MMP) e outras MMPs (HIDALGO e ECKHARDT,
2001; EGEBLAD e WERB, 2002; ALI et al., 2011; VARGOVÁ et al., 2012).
As MMPs desempenham papéis essenciais no funcionamento normal de diferentes
tecidos durante o crescimento, desenvolvimento e envelhecimento, estando envolvidas em
processos como o remodelamento ósseo, ovulação e funcionamento da glândula mamária e
do útero (WOESSNER, 1991; CARMELI et al., 2004). Também estão envolvidas em
muitos processos patológicos da MEC, incluindo a inflamação, invasão celular,
angiogênese, doença renal, progressão de tumores, metástases, morte celular, estando ainda
relacionadas à insuficiência cardíaca, doença coronária, hipertensão pulmonar, artrite,
osteogênese imperfeita, doença de Alzheimer entre outras (EGEBLAD e WERB, 2002;
CARMELI et al., 2004; DESCHAMPS e SPINALE, 2006; ALI et al., 2011; CASTRO et
al., 2011; CHELLADURAI et al., 2012; VARGOVÁ et al., 2012).
A expressão das MMPs pode ser induzida por citocinas pró-inflamatórias e pró-
fibróticas como o cTGF e o TGF-β1 bem como por oxidação da S-glutationa, por espécies
reativas de oxigênio, estímulo físico e receptores purinérgicos (NAGASE et al., 2006;
DESCHAMPS e SPINALE, 2006; GU e WILEY, 2006; CHEN et al., 2011; AU et al.,
2011).
14
A atividade das MMPs é regulada por dois tipos de inibidores endógenos: α2-
macroglobulina e inibidores teciduais endógenos de metaloproteinases (TIMPs) (NAGASE
et al., 2006; MOORE et al., 2012). A α2-macroglobulina é uma glicoproteína plasmática de
725 KDa consistindo de quatro subunidades idênticas de 180 kDa que inibe as
metaloproteinases em tecidos fluidos por aprisionamento da mesma no interior da
macroglobulina (STAMENKOVIC, 2003; NAGASE et al., 2006, VIAPPIANI et al., 2009).
As TIMPs são uma família de quatro membros, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4,
capazes de inibir a atividade das MMPs ligando-se a elas numa proporção estequiométrica
de 1:1 molar, bloqueando assim o acesso aos seus substratos extracelulares. Elas não
possuem especificidade para uma determinada MMP, embora haja alguma preferência da
TIMP-2 para a MMP-2 e da TIMP-1 para a MMP-9 (SCHULZ, 2007; VANHOUTE e
HEYMANS, 2010; CASTRO et al., 2011, GOMES et al., 2012). O balanço entre MMPs e
TIMPs tem papel importante na manutenção da integridade do tecido (PAGE-McCAW et
al., 2007) sendo seu desequilíbrio fator contribuinte para o remodelamento da matriz
extracelular (SCHULZ et al., 2007; AU et al., 2011).
Além da atividade inibitória das MMPs, tem-se descrito que as TIMPs atuam na
promoção do crescimento celular, possuem ação anti-apoptótica, antiangiogênica e
esteroidogênica (para revisão ver LAMBERT et al., 2004).
As MMPs têm papel importante na inflamação e fibrose dos músculos esqueléticos
presente na distrofia muscular na DMD e no camundongo mdx (BANI et al., 2008; LI et al.,
2009; DELFIN et al., 2012). A inibição genética ou farmacológica da MMP-2 e MMP-9 no
mdx melhora a capacidade regenerativa do músculo esquelético (LI et al., 2009;
MIYAZAKI et al., 2011). Em relação à patologia cardíaca, estudos em mdx idosos têm
demonstrado que níveis elevados de ambas as MMPs corroboram com o aumento do dano
cardíaco, resultando em dilatação ventricular e fibrose (AU et al., 2011; DAHIYA et al.,
2011). Além disso, relatos de que a MMP-2 degrada a troponina I dos cardiomiócitos
(WANG et al., 2002; BERGMAN et al., 2007) e que a MMP-9 exacerba a cardiomiopatia
no mdx por causar hipertrofia ventricular confirmam o envolvimento das MMPs no
desenvolvimento da disfunção cardíaca (DAHIYA et al., 2011, DELFIN et al., 2012).
15
1.7 Biomarcadores do dano cardíaco na DMD
O desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento da DMD
ressalta a importância da identificação/utilização de marcadores biológicos que podem ser
utilizados como parâmetros para avaliar a predisposição, a presença e a progressão da
doença ou o efeito de um tratamento.
A creatina quinase (CK) é o biomarcador sérico utilizado como primeiro sinal de
diagnóstico para a DMD, visto que altos níveis desta enzima refletem lesão e/ou doença
muscular (ENGEL et al., 1994; GASPER e GILCHRIST, 2005; ROUILLON et al., 2014;
AARTSMA-RUS et., 2014). O diagnóstico precoce e preciso também é essencial na
avaliação do comprometimento cardíaco. O aumento da CK-MB (CK-cardíaca), uma
izoforma da CK, tem sido utilizado no diagnóstico da injúria cardíaca. Adicionalmente, as
troponinas cardíacas (ADAMS et al., 1993; BRAUN et al., 1996; REAGAN, 2010) têm
sido propostas como biomarcadores altamente sensíveis e específicos na detecção de dano
miocárdico (HAMMERER-LERCHER et al., 2001, LANDESBERG et al., 2003;
REAGAN, 2010).
1.7.1 Creatina quinase cardíaca e troponina cardíaca
A creatina quinase (CK) é uma enzima que catalisa a transferência de um grupo
fosfato entre a creatina fosfato e a adenosina difosfato (ADP). Resulta desta reação a
creatina, que pode ser reaproveitada pela célula, e a adenosina trifosfato (ATP), que se
encontra disponível para reações dependentes de energia na célula. O cérebro, os músculos
liso, cardíaco e esquelético são as principais fontes teciduais de CK (KATIRJI, 2001).
Os tecidos contêm três isoformas de CK. Estas formas consistem em dímeros
compostos de subunidades M e B em combinação MM, MB e BB. A CK-MM é encontrada
em músculos esqueléticos e outros tecidos, a CK-BB é encontrada no cérebro, enquanto a
CK-MB encontra-se no músculo cardíaco (NANJI, 1983; WALLIMANN et al., 1992;
KEMP et al., 2004). Considera-se uma quarta isoforma, a CK-Mi que se acumula
principalmente em mitocôndrias (WALLIMANN et al., 1992; APPLE et al., 1999; KEMP
et al., 2004).
16
Na DMD, a concentração de CK está 50 a 100 vezes acima dos limites superiores
dos valores de referência (ENGEL et al., 1994). Em camundongos mdx, os níveis de CK
também se mostram elevados durante toda a vida do animal (BULFIELD et al., 1984;
YOSHIDA et al., 2006).
A CK-MB é um marcador cardíaco normalmente utilizado, porém encontrado em
pequena quantidade no músculo esquelético (KEMP et al., 2004; LEWANDROWSKI,
2014). Consequentemente, injúrias musculoesqueléticas podem contribuir para um aumento
na atividade absoluta da CK-MB no sangue (KEMP et al., 2004). Ainda assim, níveis
elevados de CK-MB também são observados em pacientes DMD (VAINZOF et al., 1985;
HAMMERER-LERCHER et al., 2001).
A fim de se evitar um falso positivo mediante elevações da CK-MB, a mensuração
das troponinas cardíacas tornou-se critério clínico na detecção de injúria do miocárdio
(McLAURIN et al., 1997), sendo consideradas marcadores cardíacos altamente sensíveis e
específicos (LANDESBERG et al., 2003).
As troponinas são proteínas envolvidas na regulação da contração dos músculos
esquelético e cardíaco. Suas isoformas, em ambos os tipos musculares (esquelético e
cardíaco) são estruturalmente diferenciadas e codificadas por genes distintos. Consistem em
três subunidades incluindo a troponina I (TnI), a qual inibe a interação actina-miosina com
o Ca2+
, a troponina C (TnC), subunidade de ligação ao Ca2+
e a troponina T (TnT), a qual
ancora as troponinas a tropomiosina (Tm) e que também contribui para a regulação da
ativação muscular (KOCIOL et al., 2010).
A TnI é codificada por três genes e é diferencialmente expressa em vários tipos de
tecidos. No entanto, a troponina cardíaca I (cTn-I) é exclusivamente expressa no coração e
é distinta das formas rápida e lenta do músculo esquelético (ADAMS et al., 1993; APPLE
et al., 1999; CLAUSE et al., 2012). A cTn-I (contendo 209 aminoácidos) possui uma
extensão de 31 resíduos não presentes em outras isoformas (WARD et al., 2002) e regula o
processo de contração e relaxamento do músculo cardíaco ligando o Ca2+
ao sítio de ligação
da TnC mediante reações de ponte cruzada com o filamento fino (LAYLAND et al., 2005).
17
A troponina I tem pelo menos seis sítios de fosforilação e pode ser fosforilada pelas
proteínas-quinases PKA, as várias isoformas da PKC, a PKD, a proteína-quinase G e a
quinase ativada p-21 (MURPHY 2004).
A fosforilação da cTn-I nos sítios dos resíduso de serina 23 e 24 (Ser23 e Ser24)
pela PKA leva a uma diminuição da sensibilidade do miofilamento ao Ca2+
, por meio de
uma alteração conformacional do complexo de troponinas. Tal mudança estrutural reduz a
afinidade do Ca2+
de se ligar a TnC (LAYLAND et al., 2005; WIJNKER et al., 2013).
Assim sendo, alterações no processo de fosforilação em locais específicos da cTn-I pode
desencadear falhas cardíacas (MURPHY, 2004).
1.8 Suramina
A suramina, droga aprovada pela Food and Drud Administration (FDA; CHESON
et al., 1987; REED et al., 1992; MIETZ et al., 1998), apresenta 1492,2 g/mol de peso
molecular e é composta por oito anéis benzeno, quatro grupos amida, um grupo uréia e seis
grupos sulfonados (Figura 4; BOSCH et al., 1997).
Figura 5: Estrutura molecular da suramina (Bosch et al., 1997).
A suramina foi inicialmente descrita em 1920 como uma droga para o tratamento de
indivíduos com tripanossomíase africana mostrando-se eficiente também contra alguns
tipos de tumores (McNALLY et al., 2000; BISAGGIO et al., 2006; KATHIR et al., 2006;
ARAGÃO et al., 2009), incluindo o câncer prostático metastático, o linfoma, o carcinoma
do córtex adrenal e o carcinoma renal metastático (YONEDA et al., 1995; ERGUVEN et
al., 2008).
18
A ação anti-tumoral da suramina se dá por sua ligação com receptores para fatores
de crescimento, tais como fator de crescimento epidermal (epidermal growth factor, EGF),
fator de crescimento derivado de plaquetas (platelet-derived growth factor, PDGF), fator de
crescimento fibroblástico (fibroblast growth factor, FGF), fator de crescimento endotelial
vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF) e fator de crescimento transformador
beta-1 (transforming growth factor beta-1, TGF-β1) (ZUMKELLER e SCHOFIELD,
1995).
A suramina foi também utilizada para impedir fibrose em músculos esqueléticos
normais após lesão. Seu uso em músculos esqueléticos lesados diminuiu a expressão do
TGF-β1 (STEIN et al., 1993; CHAN et al., 2005), promoveu regeneração muscular,
diminuiu a formação de fibrose e aumentou a força muscular após a lesão (NOZAKI et al.,
2008).
Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram que a suramina foi
capaz de proteger o músculo diafragma de camundongos mdx contra a mionecrose
(TANIGUTI et al., 2011), diminuir a fibrose e melhorar os níveis de beta-distroglicana, um
componente importante do complexo distrofina-glicoproteínas (TANIGUTI et al., 2012).
Mais recentemente, demonstramos efeitos positivos da droga na cardiomiopatia do mdx,
diminuindo a fibrose cardíaca e melhorando os parâmetros do eletrocardiograma, tais como
a razão R/S, o intervalo PR, a amplitude da onda Q e o índice de cardiomiopatia (DE
OLIVEIRA MOREIRA, et al., 2013).
A suramina tem sido utilizada como antagonista de alguns receptores purinérgicos
__P2X1, P2X2, P2X3, P2X5, P2Y1, P2Y2, P2Y11 e P2Y12 __ (BURNSTOCK, 2004) em
estudos de diversas patologias humanas (LI et al., 2011; NAKAMURA et al; 2011),
inclusive a DMD (IWATA et al; 2007). Efeitos benéficos decorrentes do tratamento com a
suramina no receptor P2Y2 têm sido relatados em outras patologias, como por exemplo, em
células tumorais de mama (LI et al., 2011), em células epiteliais do ducto pancreático
canceroso humano (CHOI et al., 2013) e em tumores hepáticos (XIE et al., 2014). Em
relação a patologias cardíacas, demonstrou-se eficácia da suramina como antagonista do
receptor P2Y2 na isquemia cardíaca (CONSENTINO et al., 2012).
19
Entretanto, não existem dados sobre os efeitos da inibição dos receptores
purinérgicos na cardiomiopatia na DMD e no camundongo mdx. Uma vez que a suramina
também é um inibidor destes receptores, consideramos que seria importante avaliar os
efeitos desta droga à luz da via de sinalização purinérgica. Isto permitirá uma nova
abordagem terapêutica para a cardiomiopatia distrófica. Adicionalmente, visto que a
suramina é utilizada para tratamento de outras patologias humanas, sendo conhecidas as
doses e efeitos colaterais em pacientes humanos, esta droga pode ser considerada para
estudos clínicos da DMD.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Considerando a ação antagonista da suramina em receptores purinérgicos,
objetivamos estudar a expressão do receptor P2Y2 na cardiomiopatia distrófica e na
distrofinopatia do músculo diafragma. Buscamos entender os mecanismos (ou as vias de
sinalização: regulação do cálcio e fibrose) que podem ser afetados por esta terapia.
2.1.1 Objetivos específicos
No músculo cardíaco distrófico, verificar a ação da suramina:
1- nos níveis dos receptores P2Y2;
2- no cálcio total, bem como nos níveis da calsequestrina cardíaca, envolvida com o
tamponamento do cálcio intracelular e no canal de cálcio TRPC1;
3- nos biomarcadores do dano cardíaco, quais sejam, a CK-MB e a cTn-I;
4- na proteção do sarcolema, quantificando os níveis da b-distroglicana;
5- no remodelamento da matriz extracelular, medindo os níveis e/ou a atividade das
metaloproteinases MMP-2 e MMP-9, bem como da TIMP-1 e TIMP-2.
20
No músculo diafragma distrófico, verificar a ação da suramina:
1- nos níveis dos receptores P2Y2;
2- no cálcio total, bem como nos níveis da calsequestrina esquelética, envolvida com o
tamponamento do cálcio intracelular e no canal de cálcio TRPC1;
3- na proteção do sarcolema, quantificando os níveis da b-distroglicana;
5- no remodelamento da matriz extracelular, medindo os níveis e/ou a atividade das
metaloproteinases MMP-2 e MMP-9, bem como das TIMP-1 e TIMP-2.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/10 (n=27) e camundongos da
linhagem mdx (n=54) com 8 meses de idade, machos e fêmeas, provenientes do Biotério
Central da UNICAMP (Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica – CEMIB)
com peso médio de 30g. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de
Biologia Estrutural e Funcional, em caixas plásticas com três camundongos sob condições
ambientais controladas (12 horas de ciclo claro/escuro) com ração e água ad libitum e
temperatura ambiente de 24ºC.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes para
experimentação animal de nossa Instituição, sob o protocolo da Comissão de Ética na
Experimentação Animal (CEEA-IB-UNICAMP) nº 2864-1.
3.2 Protocolo experimental e tratamento com suramina
Os animais foram divididos em três grupos experimentais: C57BL/10 tratados com
solução salina (n=27); camundongos mdx tratados com solução salina (mdx-sal; n=27) e
camundongos mdx tratados com 60mg/kg de suramina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)
diluída em solução salina (mdx-sur; n=27) (LOSSOS et al., 2000; TANIGUTI et al., 2011;
21
TANIGUTI et al., 2012; DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). A solução salina e a
suramina foram injetadas intraperitonealmente durante três meses, duas vezes por semana
(DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). Os camundongos tratados somente com solução
salina serviram de controle.
Após o último dia de tratamento, os animais foram eutanasiados com dose letal de
anestésico cloridrato de xilazina (6,8 mg/kg, 2% Virbaxyl, Virbac, São Paulo, Brasil) e
cloridrato de cetamina (130 mg/kg, Francotar, Virbac, São Paulo, Brasil). Os músculos
cardíaco e diafragma foram coletados e congelados de acordo com as técnicas descritas a
seguir.
No presente estudo, analisamos os efeitos da suramina também no músculo
diafragma de camundongos mdx, uma vez que este é o músculo mais acometido no modelo
experimental, apresentando fibrose semelhante à patologia no paciente DMD (STEDMAN
et., 1991; LOUBOUTIN et al., 1993). Ainda, drogas que melhoram a distrofia do músculo
esquelético podem ter efeitos contrários no coração (JORGENSEN et al., 2011) ou,
melhoram aspectos funcionais do músculo cardíaco não alterando a fibrose cardíaca, ou
mesmo não atuando na distrofia do diafragma (BISH et al., 2011).
Todas as análises descritas a seguir foram realizadas por um examinador às cegas.
3.3 Determinação de creatina quinase cardíaca (CK-MB)
Animais C57BL/10 (n=27), mdx-sal (n=27), mdx-sur (n=27) foram utilizados para
verificar o efeito da suramina nos níveis da enzima CK-MB. O sangue foi coletado por
punção cardíaca sob anestesia com cloridrato de cetamina (130 mg/Kg) e cloridrato de
xilazina (6,8 mg/Kg). Em seguida, o sangue foi centrifugado a 3000 RCF (Força centrífuga
relativa a aceleração da gravidade) à 4°C por 10 minutos. Utilizamos o kit CK-MB-Nac,
Bioliquid, Brasil para quantificação da CK-MB. As absorbâncias das amostras para CK-
MB foram lidas a 37°C utilizando-se espectrofotômetro (Thermo Electron Corporation
Genesys 20, Krackeler Scientific, Albany, New York, USA) com comprimento de onda de
340 nm e cubetas de quartzo de 1 cm de caminho óptico. Os valores foram expressos em
unidades internacionais (U/L).
22
3.4 Mensuração do cálcio total
Para observar os efeitos da suramina na quantidade de cálcio total das fibras dos
músculos cardíaco e diafragma realizamos a dosagem deste íon através de espectrometria
de plasma. Foram utilizados seis animais de cada grupo: C57BL/10, mdx-sal e mdx-sur.
Os músculos cardíaco e diafragma foram retirados, armazenados em tubo criogênico
(TPP, 1.2mL), pré-congelados em Nitrogênio líquido, mantidos a -80ºC em Biofreezer
(Bio-Freezer So Low. Environmental equipment Cincinatti, Ohio, EUA) e posteriormente
pesados em balança analítica. Para o preparo das amostras, utilizamos a técnica descrita por
YOSHIDA et al.; 2006. Os músculos foram colocados em balão volumétrico de 10 a 50 ml,
dependendo da massa do músculo, contendo 2% de seu volume de ácido nítrico p.a. a
100ºC até a digestão total dos músculos. O balão volumétrico foi completado com água
ultrapura e a amostra filtrada com algodão em um funil. A análise da amostra foi realizada
no espectrômetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (inductively
coupled plasma optical emission spectrometry, ICP_OES; Optimum 3000 Duo View.
Pekin-Elmer, Boston, MA, USA) localizado no Instituto de Química da Universidade
Estadual de Campinas. Esta técnica utiliza argônio de elevada pureza para geração do
plasma à alta temperatura (aproximadamente 6727 ºC) para produzir átomos excitados que
emitem radiação eletromagnética em comprimentos de onda entre 125 a 950 nm,
característicos de cada elemento químico. Após separação por sistemas ópticos das
radiações emitidas, detectores medem a intensidade da emissão. Para correlacionar a
intensidade da emissão à concentração do elemento na amostra utilizamos uma curva de
calibração de cálcio. Utilizamos como padrão uma solução de fosfato de cálcio nas
concentrações de 0,495 a 8,250 ppm.
3.5 Western blotting
Para a quantificação do P2Y2, TRPC1, calsequestrina esquelética (CSQ-E),
calsequestrina cardíaca (CSQ-C), cTn-I, e β-distroglicana (b-DG), MMP-2, MMP-9, TIMP-
1, TIMP-2 foram utilizados nove camundongos de cada grupo experimental. Os
camundongos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (130 mg/Kg) e cloridrato de
23
xilazina (6,8 mg/Kg) e perfundidos com PBS. Os músculos cardíaco e diafragma foram
retirados e homogeneizados em tampão para homogeneização (Tris-HCl 100 mM,
pirofosfato de sódio 100 mM, fluoreto de sódio 100 mM, 10 μg/ml aprotinin, PMSF 1 mM,
e Na3VO 0,25 mM) a 4ºC usando homogeneizador Polytron PTA 20S (Brinkmann
Instruments, Westbury, New York, EUA) operado em velocidade máxima por 30 segundos.
Os extratos foram centrifugados a 11000 rotações por minutos a 4ºC por 20 minutos e o
sobrenadante utilizado para análise por extrato total. A determinação da proteína foi
realizada pelo método de BRADFORD et al., 1976.
As amostras do extrato protéico foram tratadas com tampão Laemmli (azul de
bromofenol 0,04 mg/ml eTris-HCl 0,12 M, glicerol 20%, SDS 2% e ß-mercaptoetanol 0,28
M) e aquecidas por 5 minutos. Em seguida, 60 g de proteína foram aplicados em gel SDS
poliacrilamida 8-15% em aparelho para eletroforese (mini-Protean, Bio-Rad Laboratories,
Richmond, CA, EUA). A eletrotransferência do gel para a membrana de nitrocelulose foi
realizada em 90 minutos a 120 V em aparelho de transferência (mini-Protean, Bio-Rad
Laboratories, Richmond, CA, EUA). As membranas foram incubadas com solução basal
(Trisma base 10 mM, cloreto de sódio 150 mM e Tween-20 0,02%) contendo 3% de leite
desnatado, por 1 hora em temperatura ambiente para reduzir a ligação não específica de
proteínas. Posteriormente, foram incubadas com anticorpo primário diluído em 10 ml de
solução basal contendo 1% de leite desnatado a 4ºC, durante 12 horas. No dia seguinte, as
membranas foram lavadas por 30 minutos com solução basal e incubadas em 10 ml de
solução basal contendo 3% de leite desnatado e 2,5 l de anticorpo secundário conjugado a
peroxidase por duas horas em temperatura ambiente. Posteriormente, as membranas foram
lavadas por 30 minutos com solução basal.
Para detectar as bandas imunorreativas, as membranas foram expostas à solução de
quimioluminescência (Super Signal West Pico Chemiluminescente, Pierce) por 5 minutos e
a captura de fluorescência foi realizada utilizando-se o aparelho G-Box Chemi e o software
de aquisição de imagem GeneSnap (Syngene, Maryland-USA). As densidades das bandas
foram quantificadas pelo software de análise GeneTools (Syngene, Maryland- USA).
Após obtenção das bandas, as membranas foram lavadas com solução basal (3x10
minutos) e incubadas com 10mL de Stripping Buffer (10mM Tris-HCl pH 7.5;
24
Mercaptoethanol 0.1M; Uréia 8M) durante 1h, à 60°C. Em seguida, foi realizada uma
incubação em Tris-HCl 1M pH 7.5 por 30min para neutralizar o stripping. As membranas
foram lavadas com solução basal e processadas conforme descrito previamente para
marcação da proteína gliceraldeído 3-fosfato dehidrogenase (GAPDH). Esta é uma proteína
de controle interno, pois a quantidade desta proteína não se altera em diferentes condições
fisiológicas. As bandas marcadas com GAPDH foram utilizadas para normalização das
bandas.
Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: 1) P2Y2 (goat polyclonal; Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA); 2) TRPC1 (rabbit polyclonal; Alomone
Labs, Jerusalem, Israel); 3) calsequestrina cardíaca (rabbit polyclonal PA1-913, Affinity
BioReagents); 4) calsequestrina esquelética (mouse monoclonal VIIID12, Affinity
BioReagents, Golden, Colorado); 5) troponina cardíaca I (mouse monoclonal; Abcam,
Cambridge, MA, USA); 6) beta-distroglicana (mouse monoclonal; NCL-b-DG, Novocastra
Laboratories, Newcastle, UK); 7) MMP-2 (polyclonal goat, R&D Systems, USA); 8)
MMP-9 (polyclonal goat, R&D Systems, USA); 9) TIMP-1 (rat monoclonal; Abcam,
Cambridge, MA, USA); 10) TIMP-2 (mouse monoclonal; Millipore, USA); 11); GAPDH
(rabbit polyclonal; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA). Foi utilizado
o anticorpo secundário IgG mouse, rabbit, goat ou rat conjugado à peroxidadse
correspondente (H+L) (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).
3.6 Zimografia
Para verificar se o tratamento com suramina altera a atividade das MMPs foi
realizada a técnica de zimografia para análise da MMP-2 e MMP-9. Foram utilizados os
músculos cardíaco e diafragma de animais C57BL/10 (n=6), mdx-sal (n=6), mdx-sur (n=6).
25
3.6.1 Preparação do extrato total
Os músculos foram retirados como descrito previamente e homogeneizados em
tampão de extração (30mg de músculo/100μl de solução), contendo Tris-HCl 50mM pH7,4,
NaCl 0,2M, Triton X-100 0,1%, CaCl2 10mM e 0,1% de coquetel inibidor de protease
(P8849 – Sigma) utilizando um homegeneizador Polytron PTA 20S (PT 10/35; Brinkmann
Instruments) em três ciclos de 5s cada. O homogeneizado foi incubado por 2h a 4ºC, em
seguida, foi centrifugado a 4000rpm por 20min a 4ºC. O sobrenadante foi coletado e a
concentração de proteínas foi determinada pelo método de BRADFORD, 1976.
3.6.2 Eletroforese
Alíquotas (30μg de proteína) do extrato foram submetidas à eletroforese sob
condições não redutoras (100V, a 4ºC) em gel de poliacrilamida a 7,5% (tampão Tris-HCl
1,5 M pH 8,8, acrilamida 30 %, bis-acrilamida 0,8 %, Glicerol 50 %, SDS 10 %, persulfato
de amônio 10 % e tetrametilenodiamina) contendo 1% de gelatina (colágeno desnaturado).
Após a eletroforese, os géis foram lavados em Triton X-100 2,5% duas vezes por 20min.
Posteriormente, os géis foram incubados em tampão de incubação (Tris-HCl 50mM pH 7,4,
NaCl 0,1M, CaCl2 dihidratado 1M, NaNO3 0,02%) com 0,004% de inibidor de protease,
por 20-24h a 37ºC, sob agitação. Após a incubação, os géis foram corados com Comassie
Brilliant Blue 0,25% e descorados com solução de etanol 30% e ácido acético 10%. Áreas
de proteólise aparecem como bandas claras contra um fundo azul escuro.
As bandas obtidas foram digitalizadas utilizando-se o aparelho G-Box Chemi e o
software de aquisição de imagem GeneSnap (Syngene, Maryland-USA). A atividade
gelenolítica das bandas da MMP-2 e -9 foram analisadas obtendo-se a densidade óptica
integrada (IOD) das bandas utilizando-se o software de análise Image J 1.46r (Wayne
Rasband, National Institutes of Health-USA).
26
3.7 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. A comparação entre os
três grupos foi realizada por análise de variância (ANOVA; p≤0,05) seguida do pós-teste de
Bonferroni no programa estatístico BioEstat 5.0.
4 RESULTADOS
4.1 Quantificação dos níveis do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos
Verificamos a ação da suramina, considerada uma droga antagonista de receptores
purinérgicos P2, nos níveis do P2Y2, receptor envolvido na resposta pró-fibrótica, tanto no
músculo cardíaco quanto no diafragma.
Os níveis de P2Y2 estão 49% e 69% maiores no grupo mdx-sal quando comparados
ao grupo C57BL/10, respectivamente no músculo cardíaco e diafragma. A suramina
reduziu em 42% e 35% os níveis de P2Y2 no músculo cardíaco e diafragma,
respectivamente, quando comparados ao grupo mdx-sal (Figura 6).
27
Figura 6: Quantificação por Western blotting do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos
cardíaco e diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-
sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas do receptor P2Y2.
(B) Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de P2Y2
normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*)
Diferença significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni).
4.2 Quantificação do cálcio total e níveis de TRPC1 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos
Na Figura 7, observamos os resultados da dosagem de cálcio total no músculo
cardíaco e diafragma. O cálcio total no músculo cardíaco encontra-se 51% aumentado no
mdx-sal quando comparado ao C57BL/10. No diafragma, o cálcio total está 34% maior no
mdx em relação ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA).
A suramina reduziu em 39% e 30% a concentração de cálcio total no músculo
cardíaco e diafragma, respectivamente (Figura 7).
28
Figura 7: Quantificação do cálcio total nos músculos cardíaco e diafragma em animais
controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-
sur). Valores expressos como média ± desvio padrão. (*) Diferença significante quando
comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença
significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).
Quantos aos níveis de TRPC1, verificamos que estes encontram-se 25% e 45%
maiores no grupo mdx-sal quando comparados ao grupo C57BL/10, respectivamente no
músculo cardíaco e diafragma. A suramina reduziu em 23% e 41% os níveis de TRPC1 no
músculo cardíaco e diafragma, respectivamente, quando comparados ao grupo mdx-sal
(Figura 8).
29
Figura 8: Quantificação por Western blotting do TRPC1 nos músculos cardíaco e
diafragma de animais controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx
tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína TRPC1. (B)
Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de TRPC1
normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*)
Diferença significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni).
4.3 Quantificação dos níveis de CSQ-C e CSQ-E
Para verificar se o tratamento com suramina altera os níveis da calsequestrina
cardíaca (CSQ-C) e calsequestrina esquelética (CSQ-E), proteína envolvida no
tamponamento do cálcio, realizamos a técnica de Western blotting para estas proteínas. Os
resultados estão apresentados na Figura 9.
No músculo cardíaco não houve diferença significativa entre os grupos estudados.
No diafragma verificamos que os animais mdx-sal apresentam redução de 52% comparada
ao controle C57BL/10. O tratamento com suramina aumentou em 49% os níveis de CSQ-E
em relação grupo mdx-sal (Figura 9).
30
Figura 9: Quantificação por Western blotting da CSQ-C (Calsequestrina cardíaca) e CSQ-
E (Calsequestrina esquelética) nos músculos cardíaco e diafragma de animais controle
C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (A)
Bandas representativas da proteína CSQ-C e CSQ-E. (B) Bandas representativas do
controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de CSQ-C e CSQ-E normalizados pelo
GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*) Diferença
significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#)
Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni).
4.4 Determinação da CK-MB e quantificação dos níves de cTn-I
Para verificar se a suramina atua na proteção a mionecrose no músculo cardíaco
distrófico, realização a dosagem da CK-MB no plasma e a quantificação dos níveis de cTn-
I por Western blotting. Os resultados estão apresentados nas figuras 10 e 11.
A CK-MB encontra-se 68% maior nos animais distróficos quando comparados aos
animais controles (p≤0,05). A suramina reduziu em 66% os níveis plasmáticos de CK-MB
(p≤0,05) (Figura 10).
31
Figura 10: A) Níveis plasmáticos da enzima CK-MB (U/L) dos camundongos controle
C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur).
(*) Diferença significante quando comparada aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05,
ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparada aos
camundongos mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).
A quantidade de cTn-I está 69% maior no grupo mdx-sal comparado ao C57BL/10
(figura 10, p≤0,05, ANOVA). A suramina reduziu 67% os níveis de cTn-I em relação ao
grupo mdx-sal, levando a valores próximos aos observados no grupo C57BL/10 (Figura 11,
p≤0,05, ANOVA).
32
Figura 11: Quantificação por Western blotting da troponina cardíaca (cTn-I) nos grupos
controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-
sur). (A) Bandas representativas da proteína cTn-I. (B) Bandas representativas do controle
interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de troponina cardíaca normalizados pelo GAPDH,
expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*) Diferença significante quando
comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença
significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).
4.5 Quantificação dos níveis de b-distroglicana nos músculos cardíaco e diafragma
distróficos
Para verificar se o tratamento com suramina altera os níveis de b-distroglicana (b-
DG), proteína trans-sarcolemal que interage intracelularmente com a distrofina e com
proteínas sinalizadoras, realizamos a técnica de Western blotting para esta proteína. Os
resultados estão apresentados na Figura 12.
No coração, a b-DG estava 40% reduzida no grupo mdx-sal quando comparado ao
grupo C57BL/10. A suramina aumentou em 34% a b-DG no grupo mdx-sur em relação ao
mdx-sal. No diafragma, a b-DG estava reduzida em relação ao controle, porém não
33
encontramos diferença estatística. A suramina promoveu discreto aumento da b-DG, que
não foi diferente do mdx-sal (Figura 12).
Figura 12: Quantificação por Western blotting da b-DG (β-distroglicana) nos músculos
cardíaco e diafragma de animais controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e
mdx tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína b-DG. (B)
Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de b-DG
normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*)
Diferença significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni).
4.6 Quantificação dos níveis de MMP-9 e TIMP-1 nos músculos cardíaco e diafragma
distróficos
Para verificar se o tratamento com suramina auxilia na manutenção da integridade
do tecido muscular reduzindo o desequilíbrio entre a MMPs e a TIMPs, fator que contribui
34
para o remodelamento da MEC, realizamos a técnica de Western blotting para a
quantificação destas proteínas. Os resultados estão apresentados nas Figuras 13, 14.
A MMP-9 no músculo cardíaco encontra-se 37% aumentada no mdx-sal quando
comparada ao C57BL/10. No diafragma, a MMP-9 está 35% maior no mdx-sal em relação
ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA). O tratamento com suramina não alterou os níveis de
MMP-9 no músculo cardíaco, enquanto que no diafragma houve aumento de 23% (p≤0,05,
ANOVA; Figura 13).
Os níveis da TIMP-1 estão 53,4% e 57,7% maiores no grupo mdx-sal quando
comparados ao grupo C57BL/10, respectivamente no músculo cardíaco e diafragma. A
suramina aumentou em 52,6% e 62,5% os níveis de TIMP-1 no músculo cardíaco e
diafragma, respectivamente, quando comparados ao grupo mdx-sal (Figura 14).
Figura 13: Quantificação por Western blotting da MMP-9 nos músculos cardíaco e
diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx
tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína MMP-9. (B)
Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de MMP-9
normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*)
Diferença significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
35
Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni).
Figura 14: Quantificação por Western blotting da TIMP-1 nos músculos cardíaco e
diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx
tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína TIMP-1. (B)
Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de TIMP-1
normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*)
Diferença significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni).
4.7 Quantificação dos níveis de MMP-2 e TIMP-2 nos músculos cardíaco e diafragma
distróficos
Em relação aos níveis de MMP-2, no músculo cardíaco, observamos que os animais
mdx-sal apresentam níveis 40% maior quando comparados ao grupo C57BL/10. No
diafragma, a MMP-2 encontra-se 47% aumentada no mdx-sal quando comparada ao
36
C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA). O tratamento com suramina não alterou os níveis dessa
metaloproteinase em ambos os músculos estudados (p≤0,05, ANOVA; Figura 15).
Os níveis da TIMP-2 estão 50% e 60% maiores no grupo mdx-sal quando
comparados ao grupo C57BL/10, respectivamente no músculo cardíaco e diafragma. A
suramina aumentou em 30% e 57% os níveis de TIMP-2 no músculo cardíaco e diafragma,
respectivamente, quando comparados ao grupo mdx-sal (Figura 16).
Figura 15: Quantificação por Western blotting da MMP-2 nos músculos cardíaco e
diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx
tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína MMP-2. (B)
Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de MMP-2
normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*)
Diferença significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni).
37
Figura 16: Quantificação por Western blotting da TIMP-2 nos músculos cardíaco e
diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx
tratados com suramina (mdx-sur). (A) Bandas representativas da proteína TIMP-2. (B)
Bandas representativas do controle interno GAPDH. (C) Gráfico dos níveis de TIMP-2
normalizados pelo GAPDH, expressos em unidade arbitrária. Média ± desvio padrão. (*)
Diferença significante quando comparado ao C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni). (#) Diferença significante quando comparado ao mdx-sal (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni).
4.8 Análise zimográfica da atividade da MMP-9 e MMP-2 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos
A análise zimográfica do músculo cardíaco revelou que os animais mdx-sal
apresentam níveis elevados de MMP-9 (100kDa) e das três isoformas da MMP-2 (ativa
55kDa, pró 60kDa e pré 66kDa) quando comparados aos animais C57BL/10 (Figura 17). A
suramina aumentou significativamente a atividade da MMP-9 (p≤0,05) e não alterou a
MMP-2 (p≥0,05) (Figura 17).
38
Figura 17: A) Análise zimográfica das metaloproteinases 2 e 9 no músculo cardíaco de
camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com
suramina (mdx-sur). B) Atividade da MMP-9 (100kDa). C) Atividade de MMP-2 em suas
três isoformas: MMP-2 pré (66 kDa), MMP-2 pró (60 kDa) e MMP-2-ativa (55 kDa). (*)
Diferença significativa quando comparada aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni). (#) Diferença significativa quando comparada aos camundongos
mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).
No diafragma de animais mdx-sal ambas as metaloproteinases encontram-se com
atividade aumentada (p≤0,05) quando comparadas aos animais C57BL/10 (Figura 18). O
tratamento com suramina elevou significativamente a atividade de MMP-9 e reduziu a
atividade de MMP-2 (p≤0,05) (Figura 18).
39
Figura 18: A) Análise zimográfica das metaloproteinases 2 e 9 no músculo diafragma de
camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com
suramina (mdx-sur). B) Atividade da MMP-9 (100kDa). C) Atividade de MMP-2 em suas
três isoformas: MMP-2 pré (66 kDa), MMP-2 pró (60kDa) e MMP-2-ativa (55kDa). (*)
Diferença significativa quando comparada aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni). (#) Diferença significativa quando comparada aos camundongos
mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).
40
4.9 Apresentação numérica dos resultados
4.9.1 Western blotting
CORAÇÃO DIAFRAGMA
C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur
P2Y2 4,26±1,38 9,05±1,38* 5,23±1,23# 1,10±0,81 3,55±1,42* 2,30±0,99*#
TRPC1 2,07±0,54 2,77±0,46* 2,11±0,62# 1,23±0,23 2.26±0.27* 1,33±0,31#
CSQ-C 2,43±0,78 1,92±0,30 2,07±0,95
CSQ-E 1,02±0,20 0,49±0,17* 0,95±0,27#
cTn-I 3,94±0,66 12,71±2.59* 4,21±2.24#
b-DG 11±3,04 6.59±2,66* 9.91±3,38# 1,20±0,40 0,99±0,27 1,18±0,09
MMP-9 2,61±0,23 4,14±0,57* 4,16±0,92* 1,06±0,02 1,64±0,15* 2,14±0,44*#
TIMP-1 1,86±0,78 3,99±0,52* 8,43±3,58*# 1,10±0,20 2,60±0,96* 6,93±2,11*#
MMP-2 2,48±0,27 4,13±1,71* 4,81±1,62* 1,26±0,87 2,39±0,88* 2,50±0,89*
TIMP-2 3,76±1,08 7,23±1,34* 10,26±3,76*# 3,09±1,77 7,66±3,03* 17,75±3,83*#
Tabela 1: Dados números obtidos em análises de Western blotting do receptor purinérgico
P2Y2 (P2Y2), canal de cálcio do tipo SAC (strech activated channel – TRPC1),
calsequestrina cardíaca (CSQ-C) e calsequestrina esquelética (CSQ-E), troponina cardíaca
(cTn-I), beta-distroglicana (b-DG), metaloproteinases -2 e -9 (MMP-2, MMP-9) e
inibidores teciduais de metaloproteinases -1 e -2 (TIMP-1 e TIMP-2) nos músculos
cardíaco e diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-
sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (*) Diferença significativa quando comparada
aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença
significativa quando comparada aos camundongos mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni).
41
4.9.2 Cálcio total
C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur
CORAÇÃO 86,47±9,33 175,01±30,29* 106,99±15,39*#
DIAFRAGMA 137,87±26,78 208,90±49,44* 146±9,58*#
Tabela 2: Dados números obtidos na análise de determinação de cálcio total nos músculos
cardíaco e diafragma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-
sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (*) Diferença significativa quando comparada
aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença
significativa quando comparada aos camundongos mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni).
4.9.3 CK-MB
C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur
CK-MB 40,45±12,13 125,51±20,63* 42,60±19,67*#
Tabela 3: Dados números obtidos na análise de creatina quinase cardíaca (CK-MB) no
plasma de camundongos controle C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx
tratados com suramina (mdx-sur). (*) Diferença significativa quando comparada aos
camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni). (#) Diferença
significativa quando comparada aos camundongos mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste
Bonferroni).
42
4.9.4 Zimografia
CORAÇÃO DIAFRAGMA
C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur C57BL/10 Mdx-sal Mdx-sur
MMP-9 1,28±0,24 2,81±0,46* 7,25±1,80*# 0,73±0,21 3±0,71* 9,71±1,75*#
MMP-2
ativa
0,62±0,18 1,19±0,43* 1,42±0,73* 0,77±0,14 11,84±3,24* 5.57±1,78*#
MMP-2
pró
15,12±1,99 24,83±1,81* 24,53±7,26* 9,28±1,73 17,28±5.51* 9,37±2,79*#
MMP-2
pré
3,42±1,93 9,80±4,63* 10,85±6,49* 5,62±1,68 14,61±2,37* 11,08±2,40*#
Tabela 4: Dados números obtidos na análise zimográfica das metaloproteinases -2 e -9
(MMP-2 e MMP-9) nos músculos cardíaco e diafragma de camundongos controle
C57BL/10, mdx tratados com salina (mdx-sal) e mdx tratados com suramina (mdx-sur). (*)
Diferença significativa quando comparada aos camundongos C57BL/10 (p≤0,05, ANOVA,
pós-teste Bonferroni). (#) Diferença significativa quando comparada aos camundongos
mdx-sal (p≤0,05, ANOVA, pós-teste Bonferroni).
5 DISCUSSÃO
5.1 Suramina diminui os níveis do receptor purinérgico P2Y2 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos
No presente estudo, considerando o antagonismo da suramina a receptores
purinérgicos, e o envolvimento destes receptores em outras patologias cardíacas
(VASSORT, 2001; ERLINGE e BURNSTOCK, 2008; BRAUN et al., 2010; LU e INSEL,
2014; BURNSTOCK e RAVELIC, 2014) investigamos o envolvimento do receptor P2Y2
na cardiomiopatia de camundongos mdx. Este é o primeiro estudo que sugere o
envolvimento da sinalização purinérgica, especificamente do receptor P2Y2, na
43
cardiomiopatia distrófica. Análises por western blotting revelaram a presença do receptor
P2Y2 tanto no animal controle quanto no camundongo mdx do músculo cardíaco distrófico,
indicando envolvimento da sinalização purinérgica no sistema cardiovascular de animais
modelos da DMD. Dados obtidos no músculo diafragma de camundongos mdx também
revelaram envolvimento do receptor P2Y2 na distrofinopatia de músculos esqueléticos na
DMD.
Ao compararmos os níveis de P2Y2 do camundongo distrófico ao animal controle,
observamos elevados níveis do receptor tanto no músculo cardíaco quanto no diafragma de
animais de 11 meses de idade. Isso indica que, assim como os receptores P2X (IWATA et
al., 2007), o receptor P2Y também encontra-se em níveis elevados no animal distrófico. È
possível que estes receptores encontrem-se em níveis elevados devido a maior liberação de
ATP e UTP decorrente do estiramento mecânico e ou inflamação que ocorrem na DMD
devido à ausência da distrofina (ENGEL et al., 1994; IWATA et al., 2007).
Estudos com cultura de fibroblastos cardíacos indicam o receptor P2Y2 como
ativador de fibroblastos (BRAUN et al., 2010). De fato, em estudo prévio observamos que
o coração de animais distróficos apresentam maior área de fibrose em relação ao controle
de mesma idade (DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). Ainda, nossos dados revelam
níveis elevados de P2Y2 também no músculo diafragma distrófico. Acreditamos que, assim
como no músculo cardíaco, o receptor P2Y2 esteja implicado na resposta pró-fibrótica do
músculo diafragma, que em comparação ao animal controle apresenta extensa área de
fibrose (DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013).
O tratamento com suramina reduziu significativamente os níveis do receptor
purinérgico P2Y2 em ambos os músculos estudados. Possivelmente isso tenha ocorrido
devido a suramina atuar como um antagonista competitivo pelo mesmo sítio de ligação ao
receptor como previamente observado em cultura de células (CHARLTON et al., 1996),
impedindo assim a ligação de ATP e UTP ao receptor (Figura 19). Esses achados sugerem
o potencial efeito da suramina no controle da formação de fibrose nos músculos cardíaco e
esquelético através do receptor P2Y2.
44
Figura 19: Representação esquemática da fibra muscular cardíaca distrófica. O influxo de
cálcio (Ca2+
) por meio de canais do tipo SAC (strech activated channel) e tipo-L ocasionam
o aumento da concentração de cálcio intracelular Ca2+
i e ativa proteases cálcio-
dependentes levando a degradação de proteínas contráteis, aumento da creatina quinase
cardíaca (CK-MB) e troponina cardíaca (cTn-I) e consequente mionecrose. A ligação da
45
adenosina trifosfato (ATP) ao sítio de ligação do receptor purinérgico P2Y2, que por sua
vez está acoplado à proteína G, também ativa os canais do tipo SAC, contribuindo para o
influxo de cálcio. A suramina (sur) ao se ligar ao receptor P2Y2 impede que este atue sobre
os canais de cálcio. Dessa forma, a Ca2+
i,CK-MB e cTn-I diminuem e a fibra muscular é
protegida do processo de mionecrose.
5.2 Suramina diminui o cálcio total e os níveis de TRPC1 nos músculos cardíaco e
diafragma distróficos
No presente trabalho, realizamos a dosagem total do Ca2+
nos músculos cardíaco e
diafragma, através de espectrometria de plasma, tal como descrito em trabalhos anteriores
(YOSHIDA et al., 2006; MATSUMURA et al., 2011; PEREIRA et al., 2014). A
concentração de Ca2+
total nos músculos do grupo mdx está aumentada quando comparada
ao controle (GLESBY et al., 1988; DUNN e RADDA, 1991; REEVE et al., 1997;
YOSHIDA et al., 2006; MATSUMURA et al., 2011). Portadores da DMD também
apresentam níveis elevados de Ca2+
total (BERTORINI et al., 1982; JACKSON et al.,
1985).
Estudo anterior demonstrou que os níveis de Ca2+
total estão elevados nos músculo
cardíaco e diafragma de camundongos mdx em todas as idades e não se correlaciona com a
mionecrose (DUNN e RADDA, 1991). Entretanto, posteriormente, atribuiu-se a perda da
homeostase do cálcio em músculos esqueléticos de camundongos mdx à fase de
degeneração muscular, visto que mdx com 3 meses de idade, apresentavam redução do
conteúdo total de Ca2+
em comparação a camundongos mais jovens (REEVE et al., 1997).
De fato, o diafragma de camundongos mdx com 36 dias de vida, fase na qual este músculo
passa por um pico de degeneração, apresenta níveis elevados de Ca2+
total (MATSUMURA
et al., 2011; PEREIRA et al., 2014).
No presente estudo, realizado em fase mais tardia da distrofia no camundongo mdx,
na qual o animal encontra-se com 11 meses de idade, estando o diafragma com extensa área
de fibrose (aproximadamente 32% de área total do músculo) e o músculo cardíaco
apresentando comprometimento tais como alterações eletrocardiográficas e fibrose, (DE
46
OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013) também observamos níveis elevados de Ca2+
total
corroborando com os achados anteriores realizados em diferentes idades (DUNN e
RADDA, 1991). Nossos dados sugerem que as alterações na homeostase do Ca2+
persistem
nos estágios mais avançados da doença e não são apenas consequência secundária ao
processo de degeneração muscular.
O TRPC1 regula a entrada de Ca2+
(FRANCO-OBREGON JR E LANSMAN, 1994;
GERVÁSIO et al., 2008), pode ser ativado por estiramento da membrana (MAROTO et al.,
2005) e causar alteração na homeostase de Ca2+
(VANDERBROUCK et al., 2002;;
WILLIAMS e ALEN, 2007). Sua atividade pode ser regulada por diversas proteínas, dentre
elas as caveolinas (BRAZER et al., 2003). A caveolina-3, especificamente expressa em
músculos esqueléticos, cardíaco e lisos, está co-localizada com a distrofina (SONG et al.,
1996) e aumentada na DMD e no camundongo mdx (BONILLA et al., 1981; REPETTO et
al., 1999; GERVÁSIO et al., 2008).
No presente estudo encontramos níveis elevados de TRPC1 em ambos os músculos
cardíaco e diafragma ao compararmos mdx-sal e grupo controle. O músculo diafragma de
camundongos mdx-sal apresentou níveis maiores de TRPC1 (20%) em relação ao músculo
cardíaco. Possivelmente isso se deve ao fato do músculo diafragma no modelo
experimental ser o mais acometido, se assemelhando ao paciente DMD (STEDMAN et.,
1991; LOUBOUTIN et al., 1993).
O aumento dos níveis de TRPC1 em ambos os músculos estudados pode ser
decorrente de alterações na caveolina-3, consequentemente predispondo ao influxo de
cálcio e contribuindo para a patogênese nos músculos estudados. Adicionalmente, canais
TRPC1 também podem ser estimulados por EROs (ALLEN et al., 2010). Considerando que
fibras musculares distróficas são susceptíveis as EROs (RANDO et al.,1998), estas
promovem a abertura desses canais permitindo a entrada de Ca2+
(ALLEN et al., 2010).
A suramina reduziu significativamente os níveis de Ca2+
total e TRPC1 em ambos
os músculos estudados possivelmente por ação antagonista nos receptores purinérgicos
(IWATA et al., 2007; NAKAMURA et al., 2011). Estes receptores são ativados por ATP
(ERLINGE e BURNSTOCK 2008; BRAUN et al., 2010) e participam do processo de
regulação da homeostase do Ca2+
em praticamente todas as células (NORTH 2002).
47
Também tem sido demonstrado ativação de canais da família TRPC por ATP (ALVAREZ
et al., 2008), uma vez que esta promove aumentos transitórios na concentração de Ca2+
intracelular (NAKAMURA et al., 2011). Dessa maneira, alterações nas funções desses
receptores tem importante papel no influxo de íons Ca2+
em músculos de camundongos
distróficos e, portanto, podem ter implicações na patogênese da DMD (YEUNG et al.,
2006). Nossos achados revelaram redução significativa dos níveis do receptor P2Y2 em
ambos os músculos estudados. Este receptor, além de participar da resposta pró-fibrótica,
induz o aumento do cálcio, TGB-β1 e IL-6 (BRAUN et al., 2010) (Figura 19).
5.3 Suramina não altera os níveis de CSQ-C e restaura os níveis de CSQ-E
A calsequestrina é a principal proteína responsável pelo tamponamento do Ca2+
com
alta capacidade de armazenamento do íon no retículo sarcoplasmático. Distingue-se em
duas formas: a cardíaca e a esquelética. A forma cardíaca é expressa somente nos músculos
cardíacos e nos músculos esqueléticos de contração lenta (25% do total de calsequestrina) e
não é observada em fibras de contração rápida (ARAI et al., 1992; BIRALD et al.,1992;
DAMIANI e MARGRETH, 1994). A forma esquelética é expressa nas fibras esqueléticas
de contração rápida e de contração lenta e é ausente no coração.
No presente estudo, em animais idosos, não observamos alteração nos níveis de
calsequestrina cardíaca em relação ao grupo controle embora nossos dados tenham
apresentado uma tendência a redução no grupo distrófico. Em animais mdx jovens, a
calsequestrina cardíaca também não encontra-se reduzida no coração (MATSUMURA et
al., 2009; PERTILLE et al., 2010). Entretanto, apesar de não agir sobre a calsequestrina
cardíaca, proteína responsável pelo tamponamento do cálcio (YANO e ZARAIN-
HERZBERG, 1994), o tratamento com suramina atuou positivamente nos níveis de Ca2+
total e TRPC1 o que contribuiu para a diminuição da mionecrose e fibrose no músculo
cardíaco de camundongos mdx idosos após o tratamento (DE OLIVEIRA MOREIRA et al.,
2013).
No músculo diafragma observamos redução nos níveis de calsequestrina esquelética
entre o grupo mdx-sal e o controle. Dados contrastantes foram previamente observados em
48
estudos que obtiveram redução nas proteínas semelhantes à calsequestrina CLP-150, CLP-
170 e CLP-220 em mdx, mas não encontraram diferença na calsequestrina de músculos
normais e mdx (CULLIGAN et al., 2002). Outros estudos, em mdx jovens também
encontraram redução da calsequestrina esquelética (MATSUMURA et al., 2009;
PERTILLE et al., 2010; PEREIRA et al., 2012).
O tratamento com suramina reestabeleceu os níveis da calsequestrina esquelética,
concomitantemente reduziu os níveis de Ca2+
total e TRPC1. Essa combinação de efeitos da
suramina no músculo diafragma de animais distróficos sugere a capacidade da droga em
atuar, direta ou indiretamente, no tamponamento do cálcio, bem como em canais de Ca2+
proporcionando o reestabelecimento da homeostase do íon e desta forma diminuir a
mionecrose e fibrose como previamente observado (DE OLIVEIRA MOREIRA et al.,
2013).
5.4 Suramina diminui a mionecrose no músculo cardíaco distrófico
Todos os processos envolvidos no crescimento e metabolismo das células
necessitam de energia. A produção, transporte, conversão e utilização de energia das
células são processos fundamentais que acontecem por vias metabólicas que envolvem um
grande número de reações catalisadas por enzimas, como por exemplo, a creatina quinase
(WALLIMANN et al., 1992).
No presente trabalho, observamos altos índices de CK-MB indicativo de
mionecrose. Esses índices foram consideravelmente reduzidos (66%), se aproximando ao
grupo controle sugerindo diminuição da mionecrose nesses animais, de acordo com nossos
achados prévios de redução de fibras positivas ao azul de Evans no coração de
camundongos mdx tratados com suramina (DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013).
Adicionalmente, observamos altos níveis de cTn-I no grupo mdx-sal (69% maior em
relação ao grupo controle). A elevação dos níveis de cTn-I no grupo mdx-sal pode ser
decorrente da ação das espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs aumentam a
expressão da cTn-I em células cardíacas, como previamente observado em estudos da
cardiomiopatia em ratos diabéticos (KU et al., 2011) e estão envolvidas na cardiomiopatia
49
dilatada no camundongo mdx (WILLIAMS e ALLEN, 2007). Além disso, sabe-se que a
PKA, uma proteína-quinase que fosforila a cTn-I (MURPHY, 2004), promove a
fosforilação de diversas outras proteínas, inclusive as envolvidas com os canais de Ca2+
tipo-L e dos receptores de rianodina do retículo sarcoplasmático (LAYLAND et al., 2005).
Esses canais tem sua atividade alterada na distrofia e estão envolvidos no influxo de Ca2+
e
consequentemente com a mionecrose.
Estudos sugerem que a depleção genética da fosforilação por PKA em receptores de
rianodina atenuam a cardiomiopatia no camundongo mdx, uma vez que a PKA está
associada à alteração da homeostase do Ca2+
(SARMA et al., 2010). Possivelmente, a
redução dos níveis de cTn-I pela suramina esteja relacionada à capacidade da droga em
inibir seletivamente a fosforilação pela PKA, como previamente observado em estudo com
vírus da hepatite B in vitro (OKABE et al., 2006) e/ou por aumentar a abertura e/ou a
condutância dos receptores de rianodina (RyRs) cardíacos, provavelmente competindo com
a calmodulina (CaM) pelo mesmo sítio de ligação (O’NEILL et al., 2003; HILL et al.,
2004).
Dessa maneira, é possível atribuir a suramina a capacidade de reduzir a mionecrose
do músculo cardíaco distrófico, possivelmente por atuar positivamente sobre os níveis de
cálcio total e TRPC1, consequentemente em decorrência de sua ação antagonista a
receptores purinérgicos P2 (IWATA et al., 2007; NAKAMURA et al., 2011) (Figura 19).
5.5 Suramina auxilia na manutenção da estrutura do complexo distrofina-
glicoproteínas no músculo cardíaco impedindo a redução dos níveis de b-DG
Alterações na expressão de proteínas do CDG e instabilidade do sarcolema são
consequências da ausência da distrofina (DOWLING et al., 2003). No músculo cardíaco, a
ausência da distrofina é claramente associada a alterações necróticas, inflamação, aumento
do tecido adiposo, fibrose, taquicardia e deficiências das propriedades contráteis no mdx
(SAPP et al., 1996; BIA et al., 1999; CHU et al.; 2002; WEHLING-HENRICKS et al.,
2005). Em estudo prévio, constatamos áreas de inflamação e fibrose no músculo cardíaco
50
de camundongos mdx com 11 meses de idade e alterações eletrocardiográficas (DE
OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013).
Em pacientes DMD, os componentes do CDG estão diminuídos ou ausentes no
sarcolema quando comparados a músculos normais (ERVASTI et al., 1990), sugerindo que
a distrofina é essencial para a correta formação do CDG. Em analogia ao paciente DMD, o
camundongo mdx também apresenta diminuição das glicoproteínas associadas à distrofina
(LOHAN et al., 2005; LEWIS et al., 2010). Em contrapartida, estudo recente apontou que a
b-DG, a α-distroglicana e a γ-distroglicana, são expressas em níveis normais no coração do
mdx, uma vez que a utrofina, proteína homóloga a distrofina, é expressa no músculo
cardíaco e consequentemente contribui para a manutenção do CDG no coração distrófico
(SHARPE et al., 2013).
No presente estudo observamos redução de 40% dos níveis de b-DG no músculo
cardíaco no grupo mdx-sal em relação ao grupo controle em animais idosos. Redução
significativa também foi encontrada em estudos com animais jovens (MATSUMURA et
al., 2009). Os níveis de b-DG no músculo cardíaco foram aumentados após tratamento com
suramina, sugerindo seu papel na manutenção da estrutura do complexo distrofina-
glicoproteínas. A MMP-9, uma metaloproteinase de matriz, quebra a b-DG (YAMADA et
al., 2001; ZHONG et al., 2006; MICHALUK et al., 2007). Dessa maneira, redução da
atividade da MMP-9 poderia explicar em parte o aumento dos níveis da b-DG como
previamente observado no músculo diafragma de camundongos mdx de 7 meses tratados
com suramina (TANIGUTI et al., 2012). Entretanto, em animais mais idosos e tratamento
em longo prazo não observamos alteração dos níveis desta MMP, embora a sua atividade
tenha sido aumentada pela suramina. Isso sugere que há outros fatores contribuintes para o
aumento dos níveis da b-DG além da redução da MMP-9. Estudo recente, em carcinoma de
adenóide cístico salivar atribuiu-se o restabelecimento da b-DG à regulação das TIMPs
(HAO et al., 2013). No presente estudo, observamos que a suramina, concomitantemente ao
aumento da atividade da MMP-9, aumentou os níveis da TIMP-1, seu inibidor tecidual.
Uma vez que atribui-se ao balanço entre MMPs e TIMPs a manutenção da integridade da
MEC (PAGE-McCAW et al., 2007; SCHULZ et al., 2007; AU et al., 2011) é possível que
no coração de animais distróficos tratados com a suramina, o aumento das TIMPs além de
51
auxiliar no remodelamento fisiológico da MEC, atue de maneira a impedir a redução dos
níveis de b-DG.
No músculo diafragma, não observamos alterações significativas nos níveis de b-
DG com o tratamento. Em contrapartida, estudo anterior utilizando suramina em animais de
7 meses tratados durante 6 semanas, verificou o reestabelecimento dos níveis de b-DG
mediante tratamento com o antifibrótico, em conjunta redução da atividade da MMP-9
(TANIGUTI et al., 2012). Em nossos estudos, com animais idosos (11 meses) e tratamento
em longo prazo, observamos aumento da atividade e níveis da MMP-9 no diafragma. È
possível, que este aumento esteja relacionado ao aumento dos níveis de TGF-β1 observados
no músculo diafragma de animais distróficos com 11 meses de idade (DE OLIVEIRA
MOREIRA et al., 2013), uma vez que esta citocina pode induzir a expressão de MMPs
(NAGASE et al., 2006; CHEN et al., 2011; AU et al., 2011). Adicionalmente, sabe-se que a
suramina não altera a produção de TGF-β1 e sim bloqueia seus receptores (DIJKE e HILL,
2004). Concomitantemente, a TIMP-1, inibidor tecidual endógeno da MMP-9, teve seus
níveis aumentados pela suramina. Acreditamos que esse aumento, ocorrido em semelhante
proporção ao aumento da MMP-9, se deu na tentativa de manter o balanço que garante a
integridade do tecido, fazendo com que a MMP-9 não degrade a MEC, mesmo
encontrando-se em altos níveis.
5.6 Efeitos da suramina na atividade da MMP-9 e MMP-2 e níveis das MMP-9, MMP-
2, TIMP-1, TIMP-2 nos músculos cardíaco e diafragma distróficos
A atividade e expressão de várias MMPs estão desreguladas em músculos
distróficos de camundongos mdx (KUMAR et al., 2010; MIYASAKI et al., 2011). Nossos
estudos também apontam essa desregulação tanto no músculo cardíaco quanto no
diafragma quando comparamos camundongos mdx-sal e C57BL/10 para ambas MMP-9 e
MMP-2 corroborando com estudos prévios (VON MOERS et al., 2005; ZANOTTI et
al.,2007; LI et al., 2009; KUMAR et al., 2010; TANIGUTI et al., 2012).
O aumento da atividade e níveis das MMPs pode ser dependente da ativação de
receptores purinérgicos (GU e WILEY,2006), ou está relacionada com a presença de
52
citocinas pró-inflamatórias e pró-fibróticas como o cTGF e o TGF-β1 (NAGASE et al.,
2006; DESCHAMPS e SPINALE, 2006; CHEN et al., 2011; AU et al., 2011), ambos
encontrados em níveis elevados em músculos distróficos (GROUNDS et al., 2008;
TANIGUTI et al., 2011, DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013)
No presente estudo, o tratamento com suramina aumentou a atividade da MMP-9 e
não alterou seus níveis no músculo cardíaco embora previamente tenha reduzido a fibrose
cardíaca (DE OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). É provável que a redução da fibrose
cardíaca tenha ocorrido devido ao conjunto de ações da droga na proteção contra
mionecrose, reduzindo a CK-MB e níveis de cálcio total e TRPC1, bem como atuando na
redução dos níveis do receptor purinérgico P2Y2, diretamente envolvido na resposta pró-
fibrótica em fibroblastos cardíacos (BRAUN et al., 2010). Adicionalmente, a suramina
aumentou proporcionalmente a TIMP-1, inibidor tecidual endógeno da MMP-9.
Acreditamos que esse aumento tenha ocorrido com o objetivo de se manter o equilíbrio
entre a MMP-9 e TIMP-1, uma vez que o desequilíbrio entre MMPs e TIMPs contribui para
o remodelamento da MEC (PAGE-MCCAW et al., 2007; SCHULZ et al., 2007; AU et al.,
2011). Além disso, estudos com células C2C12 apontam que o aumento da expressão da
MMP-9 é favorável à migração celular miogênica (MORGAN et al., 2010).
Na DMD, o papel individual das MMPs parece ser dependente da fase de
progressão da doença (FINGLETON, 2008), se diferenciando entre os músculos
esqueléticos e também em relação à idade (BANI et al., 2008), sugerindo dessa maneira
que a inibição das MMPs pode apresentar consequências vantajosas e desvantajosas
(FINGLETON, 2008) uma vez que têm papel fundamental na MEC em ambos
remodelamento fisiológico e patológico (PAGE-McCAW et al., 2007; FINGLETON,
2008).
Estudo recente demonstrou que o tratamento de 6 semanas com suramina em
animais de 7 meses de idade diminui a atividade da MMP-9 (TANIGUTI et al., 2012). Em
contrapartida, observamos que em animais de 11 meses de idade e submetidos a tratamento
em longo prazo com a mesma droga, tanto a atividade quanto os níveis de MMP-9
encontram-se aumentados. De fato é possível que as MMPs se diferenciem em relação à
idade (BANI et al., 2008). A suramina, também no músculo diafragma, aumentou
53
proporcionalmente os níveis da TIMP-1 auxiliando o equilíbrio entre as MMPs e TIMPs,
provavelmente favorecendo o remodelamento fisiológico. Entretanto, há relatos de que a
inibição da MMP-9 melhora a patogênese do músculo esquelético e a regeneração em
camundongos mdx (LI et al., 2009). Em estudo anterior, demonstramos que a suramina
reduziu significativamente a mionecrose, inflamação e fibrose no músculo diafragma (DE
OLIVEIRA MOREIRA et al., 2013). A melhora na patologia do diafragma pode ser
decorrente além da ação antifibrótica da droga, à sua ação nos níveis e tamponamento de
cálcio e consequentemente na mionecrose. Além disso, a suramina reduziu
significativamente os níveis do P2Y2 também no músculo diafragma.
Semelhante a MMP-9, a MMP-2 também tem sido encontrada em altos níveis em
miofibras do modelo experimental da DMD (KHERIF et al., 1999; LI et al., 2009). A
MMP-2 é considerada regulador positivo do crescimento de fibras em regeneração no mdx
(MIYAZAKI et al., 2011). Nossos achados indicam que a suramina tem pouca ou nenhuma
ação sobre a MMP-2 e que as MMPs parecem agir diferentemente em ambos os músculos
estudados.
54
CONCLUSÃO
O presente trabalho sugere que o receptor purinérgico P2Y2 está envolvido na
cardiomiopatia distrófica de camundongos mdx.
O antagonismo ao receptor purinérgico P2Y2 desencadeou alterações importantes
nos níveis desse receptor, bem como na via de sinalização do cálcio (possivelmente
melhorando o tamponamento deste íon ao reduzir os níveis de Ca2+
total e componentes dos
canais do tipo SACs, como o TRPC1), na modulação da matriz extracelular (promovendo o
equilíbrio entre MMPs e TIMPs) e na manutenção da estrutura do complexo distrofina-
glicoproteínas no músculo cardíaco distrófico restaurando os níveis de beta-distroglicana.
Em relação a distrofinopatia do músculo diafragma, concluímos que também há
envolvimento do receptor P2Y2 e que a suramina parece atuar de forma semelhante quanto a
via de sinalização do cálcio e modulação da matriz extracelular.
Os resultados obtidos indicam que a suramina, ao reduzir os níveis de receptores
purinérgicos e por ser uma droga já utilizada em outras patologias humanas, com doses e
efeitos colaterais estabelecidos, apresenta potencial papel na terapia da cardiomiopatia na
DMD, merecendo atenção em estudos clínicos da doença. Ainda, é importante ressaltar que
o desenvolvimento de novos antagonistas de receptores purinérgicos é de relevância para
novas terapias da DMD.
55
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ANEXO – COMISSÃO DE ÉTICA: CERTIFICADO