OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA EXTRAÍDA DE RESÍDUO ÓSSEO DE FRANGO.
F. L. CAVALCANTE1, P. B. V. PINHEIRO2, E. B. DUARTE3, J. P. O. LIMA2, M. S. FILHO3 e M. F. ROSA3
1 Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Química 2 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará
3 Embrapa Agroindústria Tropical E-mail para contato: [email protected]
RESUMO. As apatitas são objeto de grande número de pesquisas em função de sua elevada biocompatibilidade. Nesse contexto, o desenvolvimento de processos que possibilitem a obtenção de fosfatos de cálcio a partir de subprodutos de baixo custo e largamente disponíveis, são de fundamental importância. No presente trabalho, estudou-se a obtenção de hidroxiapatita (HA), a partir do resíduo ósseo de frango, visando sua utilização na formulação de bionanocompósitos. Os ossos passaram por um pré-tratamento, visando a remoção dos constituintes orgânicos a fim de se obter HÁ purificada. O material de partida foi caracterizado por Análise Elementar, Determinação do Teor de Lipídeos, Proteínas e cinzas. HA, por sua vez, foi caracterizada através de Análise Elementar, Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e Difratometria de Raios X (DRX) e Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS). Os teores de proteínas, lipídeos e cinzas foram respectivamente de 36,66%, 24,95% e 33,27%. O FTIR confirmou a presença de bandas referentes ao estiramento dos grupos PO4
3-, e estiramento O-H, bem como picos associados à presença de carbonato. O teor de carbonato obtido na HA foi de 5,0%, percentual normalmente relatado como indicativo de boa resistência mecânica e bioatividade.
Palavras-chave: bioapatita, biomateriais, ossos de frango, indústria avícola.
1. INTRODUÇÃO
A hidroxiapatita tem sido amplamente estudada nas últimas décadas em função de
suas propriedades físico-químicas adequadas a reparação do tecido ósseo. Sua
biocompatibilidade, resulta principalmente de sua similaridade química com a fase
inorgânica dos tecidos calcificados, o que lhe confere propriedades como osteocondução e
bioatividade, não produzindo reações imunológicas ou inflamatórias. Entre as formas de
obtenção da HÁ destacam-se o isolamento, sendo mais comumente extraída de ossos
animais; síntese a partir de reação com um precursor de Ca e íons fosfato; Síntese in situ
com o auxílio de moléculas de origem biológica e síntese utilizando biomembranas. O
isolamento de bioapatita a partir de osso xenógeno apresenta algumas vantagens em
relação aos demais, sendo a similaridade morfológica, estrutural e química com o osso
humano uma das mais citadas, também deve-se considerar o fato de que ossos xenógenos
são uma matéria prima barata e largamente disponível (ŠUPOVÁ, 2014).
O Brasil, no início deste ano, se consolidou como o 2º maior produtor de carne de
frango, ficando atrás apenas para os EUA, desfrutando em função disto, de alta
disponibilidade de resíduo ósseo da cadeia avícola de corte. Ossos e carcaças
desqualificadas apresentam-se como potenciais fontes de proteínas e minerais, sendo em
geral destinados a compor ingredientes de ração animal, no entanto, o desenvolvimento de
processos que viabilizem a utilização destes resíduos como matéria prima para a produção
de materiais de maior valor agregado fortalece a cadeia produtiva gerando emprego e
renda. Os ossos, de uma forma geral, são compostos basicamente de colágeno, apatita e
lipídeos, composição esta que varia segundo alguns fatores, tais como espécie e idade do
animal (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PROTEÍNA ANIMAL, 2015).
O termo “apatita” aplica-se a uma gama de compostos com uma fórmula geral de
A10(BO4)6Z2 (ou M5(XO4)3X), onde A é geralmente um cátion metálico divalente (Ca2+,
Sr2+, Ba2+, Pb2+ ou Cd2+), BO4 um ânion trivalente com B geralmente sendo um metal
(PO43-, AsO4
3- ou MnO43-) e X um ânion monovalente (F-, Cl-, OH- ou Br-). O nome
específico de cada apatita depende dos elementos ou radicais A, B e X. Nestes termos,
a hidroxiapatita estequiométrica é caracterizada por apresentar a estrutura cristalina de
apatita, onde A é cálcio (Ca2+), BO4 tem B como fósforo (PO43-) e X é o radical hidroxila
(OH-). A hidroxiapatita estequiométrica apresenta relação Ca/P molar de 1,67, relação
mássica Ca/P de 2,15 e sua fórmula química, Ca10(PO4)6(OH)2, possui 39,9% em peso
de Ca, 18,5 % de P e 3,38 % de OH (APARÍCIO E GINEBRA, 2015). No entanto, a
hidroxiapatita estequiométrica difere da biológica em relação à estequiometria,
composição e cristalinidade, e consequentemente nas propriedades físicas e
mecânicas. As apatitas biológicas são geralmente cálcio deficientes, sendo portanto,
não estequiométricas, geralmente menos cristalinas, por vezes carbonatadas e
consequentemente de maior solubilidade, já que a maior quantidade de carbonato
diminui o tamanho do cristal, aumentado a área superficial e assim a solubilidade
(IBUKI, 2014)
O presente trabalho teve como objetivo o isolamento de bioapatita proveniente de
resíduo ósseo de frango de corte utilizando o método hidrotérmico alcalino e sua posterior
caracterização quanto à morfologia e composição química.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Reagentes
Nas etapas de pré-tratamento foram utilizados hidróxido de sódio P.A. (Dinâmica,
com pureza >99,5%). Cloreto de Sódio P.A. (Dinâmica, com pureza >99,5%). Acetona
P.A. (Vetec Química Fina) e Éter diétilico P.A. (Vetec Química Fina).
2.2 Extração da bioapatita
Os ossos de frango foram obtidos em um abatedouro local e em seguida
separados manualmente dos resíduos de carne. Secos em estufa com circulação de ar
durante 24 h, em seguida congelados até o momento das análises. Os ossos
descongelados foram imersos em solução de NaCl 2% (m/v) na proporção de 1:10 de
massa de ossos para solução e autoclavados durante 30 min a 120 ºC, ao final do
processo, os ossos foram separados da solução por decantação e secos em estufa
com circulação de ar por 16 h. Em seguida, os ossos foram triturados em moinho
analítico e imersos em uma mistura de acetona:éter (3:2) na proporção de 1:2, de
massa de ossos para volume de solução. A mistura foi deixada em repouso durante 24
h, em seguida filtrada e os ossos levados a secagem em estufa com circulação de ar
durante 3h. Os ossos desengordurados foram triturados novamente e desproteinizados
em solução de NaOH 4% (m/v) nas proporções de 1:20 e 1:40 (m/v), ambas
proporções durante 24h, obtendo-se assim, as amotras 1 e 2 respectivamente. Ao final
do processo, o material inorgânico foi filtrado em papéis de filtro de 28 m e lavado até
pH neutro, seco novamente, e calcinado em mufla a 500 °C durante 18h. Ao final da
etapa de calcinação, as amostras foram resfriadas e em seguida lavadas com água
deionizada até pH neutro com uso de papel de filtro de 28m, por fim, secas em estufa
a 80ºC por 24h. Metodologia adaptada de Šupová et al. (2011).
2.3 Caracterizações
Os ossos in natura foram caracterizados por: análise de composição química
(proteínas, lipídeos e umidade e cinzas), enquanto a bioapatita obtida foi caracterizada
por MEV, EDS, FTIR, TGA e DRX. O teor de carbonato foi determinado segundo a
equação (A) (MURUGAN et al., 2003):
(A)
Onde:
CO32- %– teor de carbonato em percentagem de massa
– Transmitância no pico máximo da banda de carbonato localizada em
aproximadamente 1450cm-1
– Transmitância no pico máximo da banda de fosfato localizada em aproximadamente 569cm-1
A cristalinidade das amostras foi determinada a partir da equação (B), dada abaixo
para o cálculo do índice de cristalinidade.
(B)
IC – Índice de cristalinidade (%)
– Intensidade do vale entre os picos correspondentes aos planos (112) e (300)
– A intensidade do pico correspondente ao plano (300)
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Caracterização Físico-Química
O resíduo ósseo de frangos foi caracterizado segundo sua composição
percentual, os dados relativos a caracterização se encontram na Tabela 1.
Tabela 1 – Composição percentual dos ossos in natura
AMOSTRA PROTEÍNAS (%) LIPÍDEOS (%) CINZAS (%)
OSSOS IN NATURA 36,66 24,95 33,27
Os ossos de frango são constituídos basicamente por lipídeos, proteínas,
matéria inorgânica e umidade, sendo o colágeno a proteína mais abundante na
composição dos ossos e a hidroxiapatita o componente principal da fase ingorgânica,
representada pelo teor de cinzas. O valor de 33,27 % de cinzas está em concordância
com o reportado na literatura de 30 a 70% para a composição de tecidos calcificados
(ANGELO, 2008).
3.2 MEV/EDS
Através da microscopia eletrônica foi possível verificar a existência de possíveis
diferenças estruturais e superficiais promovidas pelo tratamento com NaOH. Nas
Figuras 1 e 2 – são mostradas as microscopias das Bioapatias 1 e 2. Em todas as
amostras dos pós de bioapatita foi possível observar a existência de partículas
submicrométricas, bem como, de partículas na escala nanométrica (menores que
100nm), muito embora, apresentem-se, em sua maioria, entre 100 e 1000 nm. As
partículas obtidas apresentaram-se na forma de grânulos esféricos. Šupová et al.
(2011), obteve, através de processo semelhante, partículas de bioapatita proveniente
de ossos de frango menores que 100 nm em forma de agulha. O tamanho dos cristais
está relacionado ao tempo e a temperatura na etapa de calcinação, onde um maior
tempo ou temperatura acarreta em aglomeração de cristais levando a obtenção de
cristais de maior tamanho. No entanto, a dependência do formato dos cristais com a
metodologia empregada no processo de purificação ainda não está claramente
estabelecida na literatura, Šupová et al. (2014).
Figura 1 – Micrografia (esquerda) e Gráfico de EDS (direita) Bioapatita 1
Figura 2– Micrografia (esquerda) e Gráfico de EDS (direita) Bioapatita 2
A análise de EDS foi realizada com o intuito de avaliar qualitativamente a razão
molar Ca/P das bioapatitas obtidas a partir das 4 condições estudadas, os valores
obtidos estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 – Relação molar Ca/P das bioapatitas 1 e 2.
Amostra Bioapatia 1 Bioapatia 2
Relação Ca/P 1,54 ± 0,06 1,70 ± 0,06
A bioapatita 1 apresentou razão molar Ca/P inferior ao esperado para
hidroxiapatita estequiométrica, de 1,67, este valor inferior se relaciona com a existência
de substituições do cálcio por cátions metálicos na estrutura cristalina da apatita,
característica comum às apatitas biológicas, por isso comumente denominadas cálcio
deficientes. Šupová et al., (2011), obtiveram bioapatita de ossos de frango a partir do
método hidrotérmico alcalino com razão Ca/P de 1,64. A existência de algumas
substituições na estrutura cristalina da bioapatita é tida como vantajosa em relação a
HA pura, ou estequiométrica, uma vez que o osso humano também apresenta várias
substituições em sua estrutura, muitas destas, mesmo a nível de traços executam
papel fundamental nas reações bioquímicas associadas com o metabolismo do osso
(ŠUPOVÁ et al., 2011). Já a bioapatita 2 apresentou valor maior que 1,67, indicando
composição estrutural rica em cálcio. Os espectros de EDS mostrados nas Figuras 1 e
2 apresentaram uma composição típica de apatitas biológicas, sendo majoritariamente
constituídas de Ca e P, e apresentando em sua composição outros cátions metálicos
comumente presentes em menor proporção.
3.3 FTIR
Através da análise de FTIR foram obtidos os espectros apresentados na Figura 3,
de onde foi possível observar as diferenças estruturais entre as amostras de bioapatita
em função do procedimento de desproteinização utilizado.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5004000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5004000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5004000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Comprimento de onda (cm-1)
Bioapatita 1
3570
630
1039870
557
1410
Ab
so
rbâ
ncia
(u
.a.)
1450 Bioapatita 2
Figura 3– Espectro de FTIR das bioapatitas 1 e 2.
Todas as amostras apresentaram-se livres de matéria orgânica, não sendo
possível a observação de bandas referentes aos demais constituintes do osso, o que
corrobora com os resultados apresentados por Armstrong e Singer (1965), em que se
constata a remoção completa dos constituintes orgânicos presentes no osso após
calcinação de 18h a uma temperatura de 700 ºC. A banda em 870 cm-1 referente a
presença de carbonato como substituição do tipo B (quando parte dos grupos PO43-
são substituídos por CO32-). A presença de substituições de carbonato na apatita está
diretamente relacionada ao aumento na solubilidade, sendo, portanto, mais facilmente
absorvível pelas células vivas em comparação com HA estequiométrica, o que pode
potencializar sua bioatividade (MERY et al., 1998). Os teores de carbonato
apresentados na Tabela 3 foram calculados a partir do espectro de FTIR segundo a
equação (A).
Tabela 3 - Teores de carbonato das bioapatitas 1 e 2 Amostra Bioapatita 1 Bioapatita 2
Teor de carbonato (%) 5,02 5,02
As apatitas biológicas apresentam uma série de substituintes que lhe conferem
melhores propriedades frente as aplicações biomédicas, um dos mais importantes é o
carbonato, estando presente na fase mineral do osso humano em uma concentração
de cerca de 5-8% (MERY et al.,1998). As bioapatitas extraídas do resíduo ósseo de
frango apresentaram teor de carbonato entre 3,58 e 5,02%, sendo valores superiores
ao valor de 3,11%, reportado na literatura para bioapatita extraída a partir de ossos de
fêmur de frango (ŠUPOVÁ et al., 2011), e ao de 4,4% obtido para bioapatita extraída a
partir de tíbia bovina, ambos com o uso do método hidrotérmico alcalino (MURUGAN et
al., 2003).
3.4 TGA
Utilizou-se a análise termogravimétrica para avaliar a estabilidade térmica dos pós
de bioapatita, bem como, para verificar a presença de impurezas orgânicas
remanescentes associadas a estrutura das bioapatitas. Através do curva de TGA
apresentada na Figura 4, foi possível acompanhar a porcentagem de perda de massa
das amostras (Bioapatita 1 e 2) com o aumento da temperatura, onde foi possível
observar uma perda de massa entre 0,9 e 1,1% até a temperatura de 400 °C. Entre 500
e 900 °C foi possível observar uma pequena diminuição na massa da amostra que pode
estar relacionada a decomposição do carbonato presente na amostra, que segundo
reportada na literatura, ocorre entre 500 e 890 °C em atmosfera de nitrogênio, Joschek
et al. (2000). As percentagens de perdas mássicas apresentadas ao final da corrida se
relacionaram hierarquicamente com os teores de carbonato calculados. Tal resultado
corrobora em relação a magnitude em que o carbonato se encontra presente nas
amostras analisadas.
0 200 400 600 8000 200 400 600 8000 200 400 600 8000 200 400 600 800
90
95
100
105
Bioapatita 2
Ma
ssa d
a a
mo
stra
(%
)
Temperatura da amostra (°C)
Bioapatita 1
Figura 4– Gráfico da análise termogravimétrica das Bioapatitas 1 e 2.
3.5 DRX
A Figura 5 – apresenta os difratogramas obtidos para as bioapatitas 1 e 2. Os
espectros apresentaram picos estreito e bem definidos, característica normalmente
atribuída a um alto índice de cristalinidade. Os picos apresentaram alto grau de
correlação com com os picos característicos de hidroxiapatita encontrados na base de
dados PDF-2 do Internacional Center for Diffraction Data (ICDD), tendo como padrão a
ficha 01-082-1943.
Figura 5– Difratograma das bioapatitas 1 e 2.
Os índices de cristalinidade das amostras estão dispostos na Tabela 3. Os
mesmos se mostraram altos, e podem estar relacionados com a temperatura e o tempo
utilizado na etapa de calcinação das amostras.
Tabela 4 – Índice de cristalinidade.
Amostra Bioapatia 1 Bioapatia 2
Índice de cristalinidade (%) 95,6898 85,8056
4. CONCLUSÕES
Foi possível obter Bioapatita a partir de resíduos ósseos da avicultura com
características desejáveis para utilização na formulação de biocompósitos a partir de
uma metodologia simples.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Embrapa Agroindústria Tropical pelo apoio financeiro e ao CNPq pela concessão da bolsa de pesquisa.
6. REFERÊNCIAS
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