SÁVIA PERINA PORTILHO FALCI
ÓLEO DE MELALEUCA SP. COMO
AGENTE ANTIMICROBIANO EM
FERIDAS CONTAMINADAS POR
STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM
RATAS
Trabalho Final do Mestrado Profissional,
apresentado à Universidade do Vale do
Sapucaí, para obtenção do título de Mestre
em Ciências Aplicadas à Saúde.
POUSO ALEGRE – MG
2015
ii
SÁVIA PERINA PORTILHO FALCI
ÓLEO DE MELALEUCA SP. COMO
AGENTE ANTIMICROBIANO EM
FERIDAS CONTAMINADAS POR
STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM
RATAS
Trabalho Final do Mestrado Profissional,
apresentado à Universidade do Vale do
Sapucaí, para obtenção do título de Mestre
em Ciências Aplicadas à Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Manoel Araújo Teixeira
Coorientadora: Prof.ª Dr. ª Beatriz Bertolaccini Martinez
POUSO ALEGRE – MG
2015
iii
UNIVERSIDADE DO VALE DO SAPUCAÍ
MESTRADO PROFISSIONAL EM
CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE
COORDENADOR: Prof. Dr. Taylor Brandão Schnaider
Linha de Atuação Científico-Tecnológica: Fitoterapia
iv
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu pai Benedito (in memorian) e minha mãe Helena por sua
capacidade de acreditar e de investir em mim, à minha irmã Rúbia, aos meus familiares e
amigos pelas alegrias, tristezas e dores compartilhadas no processo de obtenção deste título
tão almejado.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr MANOEL ARAÚJO TEIXEIRA, professor orientador do programa de
pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da Universidade do Vale do Sapucaí
(UNIVÁS), orientador deste trabalho, pelo direcionamento, orientações, correções, sugestões
e por sua incansável paciência no decorrer de todo o processo e principalmente por me ensinar
a ser pesquisadora.
À Prof.a Dr.a BEATRIZ BERTOLACCINI MARTINEZ, professora orientadora do
programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS, pela coorientação
deste trabalho, pelas correções e sugestões.
À Prof.a Dr.a DANIELA FRANCISCATO VEIGA, professora orientadora do
programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS pelas orientações e
sugestões, a minha admiração por tanta dedicação e competência.
Aos Professores LYDIA MASAKO FERREIRA, ANDY PETROIANI, DIBA
MARIA SEBBA TOSTA DE SOUZA, JOSÉ DIAS SILVA NETO, GERALDO MAGELA
SALOMÉ, JOEL VEIGA FILHO, MARIA JOSÉ AZEVEDO DE B. ROCHA, TAYLOR
BRANDÃO SCHNAIDER, ANA BEATRIZ ALKMIM TEIXEIRA LOYOLA e ADRIANA
RODRIGUES DOS ANJOS MENDONÇA por todos os ensinamentos, orientações e
sugestões tão importantes para realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr NEIL FERREIRA NOVO e à Prof.a Dr.ª YARA JULIANO, professores
de bioestatística do programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS,
pela orientação e condução da análise estatística dos resultados deste trabalho.
À ILZAMARA MOREIRA SANTOS, VÂNIA DE FÁTIMA BARBOSA e
ELIZAMA SIQUEIRA BITTENCOURT, acadêmicas do curso de Enfermagem, LUIZ
ANDRE DE OLIVEIRA COSTA e TIAGO JARDIM DE OLIVEIRA, acadêmicos do curso
de Biologia pelo auxílio durante todo o decorrer da pesquisa, no preparo da anestesia dos
ratos, no processo de confecção, limpeza e curativo das feridas e na realização das culturas no
Laboratório de Cirurgia Experimental da UNIVÁS.
vi
A PABLO FERREIRA DAS CHAGAS, acadêmico do curso de Biologia da UNIVÁS
por sua ajuda na realização dos testes in vitro no laboratório de microbiologia da UNIVÁS.
A WELLINGTON DELFINO, coordenador do Comitê de Ética no Uso de Animais-
CEUA e veterinário do biotério por seu auxílio nos processos de anestesia, confecção das
feridas, coleta do material biológico e eutanásia dos animais no final do experimento.
A IVAN LÚCIO DE MELO funcionário do Laboratório de Cirurgia Experimental, por
suas sugestões que foram de muita ajuda para que todo o experimento decorresse da melhor
forma e por dispor recursos da estrutura laboratorial da UNIVÁS.
A LUIZ FRANCISLEY DE PAIVA, funcionário do Laboratório de Pesquisas básicas
da UNIVÁS por sua importante ajuda no preparo dos meios de cultura, na realização das
diluições das amostras dos lavados das feridas dos ratos e na realização das culturas.
A JOSÉ DONIZETI DOS REIS, funcionário do Laboratório de Botânica da UNIVÁS
por sua indispensável ajuda na obtenção do óleo de Melaleuca sp.
À amiga SAMANTA BORGES PEREIRA por toda ajuda e incentivo no início deste
projeto e aos meus amigos pela paciência na “fase mestrado”.
Aos amigos e patrões Dr. ANISIO EUSTÁQUIO DOS ANJOS SILVA e Dr.ª LUZIA
HELENA ALMEIDA DOS ANJOS proprietários do Méthodos Laboratório de análises
clínicas de Pouso Alegre por todo o apoio e ajuda financeira na realização deste sonho.
vii
O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo.
Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas
admiráveis.
José de Alencar
viii
SUMÁRIO
1 - CONTEXTO ....................................................................................................................................1
2 - OBJETIVO .......................................................................................................................................6
3 - MÉTODOS .......................................................................................................................................7
3.1 - EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE MELALEUCA SP. ............................................7
3.2 - AVALIAÇÃO DA CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO MELALEUCA SP. .............8
3.3 - ISOLAMENTO E TESTES COM STAPHYLOCOCCUS AUREUS ....................................8
3.3.1 - AMOSTRAS BACTERIANAS ...................................................................................... 8
3.3.2 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) .............. 9
3.3.3 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM) ..... 10
3.4 - INFECÇÃO ESTAFILOCÓCICA EM ANIMAIS ............................................................... 10
3.4.1 - ANIMAIS ...................................................................................................................... 11
3.4.2 - CONFECÇÃO DAS FERIDAS .................................................................................... 11
3.4.3 - INFECÇÃO POR S. AUREUS NOS RATOS ............................................................... 12
3.4.4 - LIMPEZA DAS FERIDAS E APLICAÇÃO DO PRINCÍPIO ATIVO ....................... 13
3.4.5 - QUANTIFICAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS NAS LESÕES PELO
MÉTODO DA IRRIGAÇÃO-ASPIRAÇÃO ........................................................................... 14
3.5 - ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................................... 18
4 - RESULTADOS/PRODUTO ........................................................................................................19
4.1 - IDENTIFICAÇÃO CROMATOGRÁFICA DOS COMPONENTES DO ÓLEO DA
MELALEUCA SP. ............................................................................................................................... 19
4.2 - ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) E
CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM) ............................................................. 21
4.3 - TRATAMENTO DAS INFECÇÕES ESTAFILOCÓCICAS EM RATOS ...................... 22
5 - APLICABILIDADE ......................................................................................................................30
6 - CONCLUSÕES .............................................................................................................................36
7 – IMPACTO SOCIAL .....................................................................................................................37
8 - REFERÊNCIAS .............................................................................................................................38
9 - NORMAS ADOTADAS ..............................................................................................................44
10 - APÊNDICES ................................................................................................................................45
Apêndice: Contagem de UFC nas diluições 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 em cada
grupo, no decorrer do tratamento. .....................................................................................................45
11 - ANEXOS ......................................................................................................................................49
ix
ANEXO I - Microscopia óptica – microorganismos do gênero Staphylococcus: cocos Gram-
positivos únicos, aos pares ou agrupados. ........................................................................................49
ANEXO II – Cultura de Staphylococcus aureus .......................................................................... 540
ANEXO III – Padrão de sensibilidade e resistência aos antibióticos de bactéria isolada de
lesão de pé pelo aparelho MicroScan® auto SCAN-4 System da SIEMENS. ........................ 561
ANEXO IV – Padrão de sensibilidade e resistência aos antibióticos de bactérias isoladas de
lesão de joelho pelo aparelho MicroScan® auto SCAN-4 System da SIEMENS ...................................52
ANEXO V – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVÁS ................................. 543
ANEXO VI –Informativo sobre o filme de cobertura da ferida ................................................. 544
ANEXO VII – Meios de cultivo de microrganismos ................................................................. 546
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Hidrodestilação - aparelho do tipo Clevenger - Departamento de botânica –
UNIVÁS .................................................................................................................................................7
FIGURA 2: Ensaio para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e
Concentração Bactericida Mínima (CBM) ......................................................................................10
FIGURA 3: Ato cirúrgico para produção das feridas: a) Área epilada. b) Demarcação sob
pressão com o punch. c) Incisão da pele. d) Ferida cutânea expondo a fáscia muscular ...........12
FIGURA 4: Infecção da ferida: a) Inoculação de 0,5 mL de uma suspensão bacteriana de 1,5
x 108 UFC/mL de S. aureus. b) Fixação de filme adesivo protetor ..............................................13
FIGURA 5: Aplicação do tratamento com o auxílio do “prompt” de dispensação de 1 mL ...14
FIGURA 6: Coleta do material da ferida pelo método irrigação e aspiração. a) Obtenção do
lavado da ferida. b) Acondicionamento do lavado em tubo de ensaio estéril ............................14
FIGURA 7: Exemplo do processo de diluição seriada .................................................................16
FIGURA 8: Ágar sal manitol ..........................................................................................................16
FIGURA 9: Cultura e contagem de UFC. a) Inoculação do material para o meio de ágar sal
manitol. b) bactérias com aspecto de colônias características típicas do crescimento de
Staphylococcus aureus c) Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ..................17
FIGURA 10: CIM para Bac 1 (lesão pé) : Tubo 7 – 0,1% Tubo 8 – 0,05% Tubo 9 –
0,025% ............................................................................................................................................... 171
FIGURA 11: CIM para Bac 2(lesão joelho) e Bac 3(ATCC® 25923™): Tubo 6 - 0,2%
Tubo 7 – 0,1% Tubo 8 – 0,05% Tubo 9 – 0,025% .................................................................... 212
FIGURA 12: Contagem de UFC na diluição 10 -1 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5 , 8, 12 e 15 de tratamento ................................................................................................................45
FIGURA 13: Contagem de UFC na diluição 10 -2 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento .................................................................................................................45
FIGURA 14: Contagem de UFC na diluição 10 -3 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento ................................................................................................................ 46
FIGURA 15: Contagem de UFC na diluição 10 -4 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento ................................................................................................................ 46
FIGURA 16: Contagem de UFC na diluição 10 -5 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1
5, 8, 12 e 15 de tratamento .................................................................................................................47
FIGURA 17: Contagem de UFC na diluição 10 -6 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento .................................................................................................................47
xi
FIGURA 18: Contagem de UFC na diluição 10 -7 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento .................................................................................................................48
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Analitos identificados no óleo de Melaleuca sp. ....................................................20
TABELA 2 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus nos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10 -1 no decorrer dos 15 dias de tratamento. .....................................................24
TABELA 3 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10 -2 no decorrer dos 15 dias de tratamento. .....................................................24
TABELA 4 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10 -3 no decorrer dos 15 dias de tratamento. .....................................................25
TABELA 5 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10 -4 no decorrer dos 15 dias de tratamento. .....................................................25
TABELA 6 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10 -5 no decorrer dos 15 dias de tratamento. .....................................................25
TABELA 7 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10 -6 no decorrer dos 15 dias de tratamento. .....................................................26
TABELA 8 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10 -7 no decorrer dos 15 dias de tratamento. .....................................................26
TABELA 9 - Teste de Friedman - Diminuição do número de UFC no decorrer do tratamento
dentro do mesmo grupo. .....................................................................................................................27
TABELA 10 - Teste de Kruskal Wallis - Diminuição do número de UFC no decorrer do tratamento
entre os 4 grupos estudados. ...................................................................................................................28
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
% por cento – uma parte em cem partes
& substitui a conjunção aditiva “e”
® marca registrada
° graus
°C graus Celsius
µL microlitro
ad libitum à vontade
ATCC American Type Culture Collection
CBM Concentração Bactericida Mínima
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
cm centímetro
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
et al e colaboradores
IRAS Infecções Relacionadas à Assistência em Saúde,
IV infusão venosa
Kg quilograma
M. alt Melaleuca alternifolia
M. sp Melaleuca sp.
mg miligrama
mL mililitro
MRSA Staphylococcus aureus meticilina – resistentes
OE óleo essencial
OMS Organização Mundial de Saúde
psi medida de pressão
S. aureus Staphylococcus aureus
Tea tree árvore do chá
TTO óleo da árvore do chá
UFC unidades formadoras de colônias
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
xiv
RESUMO
Objetivo: Avaliar, o efeito inibitório do óleo da planta Melaleuca sp. no crescimento de
isolados de Staphylococcus aureus, provenientes de feridas de membros inferiores resistentes
a diferentes antibióticos. Métodos: A extração do óleo foi por hidrodestilação por arraste de
vapor. Após a obtenção do óleo da planta Melaleuca sp., testes in vitro determinaram a
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) desse
óleo em relação a três cepas de S. aureus. O trabalho in vivo foi realizado com a inoculação da
bactéria S. aureus (isolado de lesão de membro inferior) na concentração de 1,5 x 108
UFC/mL, em 40 ratos fêmeas, que foram subdivididos em quatro grupos de dez indivíduos a
saber: ratos fêmeas tratadas com gel de carbopol; com tetraciclina; com óleo de Melaleuca
alternifólia e com óleo de Melaleuca sp. Resultados: A planta mostrou uma maior
quantidade de eucaliptol e terpenos. A CIM foi de 0,2% e a CBM foi de 0,4%. O melhor
tratamento in vivo foi com o antibiótico tetraciclina que diferenciou estatisticamente dos
demais tratamentos. Os óleos foram melhores que o tratamento controle, mas não obtiveram a
descolonização das feridas. Conclusão: In vitro o óleo de Melaleuca sp. cultivado no Brasil
apresentou um bom potencial bactericida; In vivo a capacidade antimicrobiana foi diminuída
mas com comportamento igual ao da Melaleuca alternifólia; A tetraciclina apresentou
melhores resultados neste estudo e é o tratamento mais adequado para esse tipo de ferida.
Palavras chaves: 1.Fitoterapia; 2.Óleo de Melaleuca; 3.Bactericidas; 4.Staphylococcus
aureus; 5. In vitro; 6. Feridas abertas.
xv
ABSTRACT
Objective: To evaluate the inhibitory effect of the plant Melaleuca sp. oil on the grouth of
Staphylococcus aureus from wounds of the lower limbs are resistant to various antibiotics.
Methods: The extraction of oil was carried out by hydrodistilation by drag ateam. After
obtaining the Melaleuca sp. plant oil, in vitro tests determined the minimum inhibitory
concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of this oil for three
strains of S. aureus. The in vivo study was inoculation of S. aureus bactéria (isolated lower
extremity injury) at a concentration of 1.5 x 108 CFU/mL in 40 rats, which were divided into
four groups of ten subjects namely: rats treated with tetracycline; Melaleuca alternifolia with
oil, oil of Melaleuca sp. and carbopol gel. Results: The plant showed a higher amount of
terpenes and eucalyptol. The MIC was 0,2% and MBC 0,4%. The best treatment in vivo was
with the antibiotic tetracycline statistically different from the other treatments. The oils were
better than control, but did not achieve the decolonization on the wounds. Conclusion: In
vitro oil Melaleuca spp. cultivated in Brazil has a good bactericidal potential; In vivo
antimicrobial capacity was diminished but with behavior equal to the Melaleuca alternifolia;
Tetracycline showed better results in this study and is the most appropriate treatment for this
type of wound. Keywords: 1.Phytotherapy; 2.Tea Tree Oil; 3.Bactericidal; 4. Staphylococcus
aureus; 5. In vitro; 6. Open wounds
1
1 - CONTEXTO
A infecção das feridas é uma das maiores preocupações dos profissionais que
lidam diretamente com essa temática pelos custos gerados decorrentes do processo infeccioso
(BOWLER et al., 2001). A presença de microrganismos infecciosos é uma das principais
causas do insucesso em processos de cicatrização de feridas (TAZIMA et al., 2008). Deve-se
considerar que toda ferida está colonizada, já que as bactérias existentes na pele podem
colonizar a lesão, mas isso não significa que esteja infectada (PRISTO, 2013).
RODEHEAVER (1997) recomendou para a limpeza da ferida infectada,
contaminada ou com área de necrose, o uso de irrigação da superfície da ferida para remoção
de restos avasculares e de bactérias, e ainda que a pressão do fluido de irrigação seria o fator
determinante para o sucesso da descontaminação.
Para resolver uma ferida é indicado tratar a infecção local com desbridamento
amplo, remoção de corpos estranhos e de tecido desvitalizado, acompanhado de limpeza,
curativos e o uso de antibióticos sistêmicos se necessário (PAGGIARO et al., 2010).
As infecções de feridas estão associadas a diversos fatores incluindo aos
procedimentos cirúrgicos e a queimaduras e têm, frequentemente, como agente etiológico os
Staphylococcus aureus, seguidos pelos Estafilococos coagulase negativa, Enterococcus sp. e
Escherichia coli (BORGES et al., 2008).
Microrganismos do gênero Staphylococcus são cocos Gram positivos, imóveis,
não formadores de esporos, que dão origem a células arredondadas com cerca de um mícron
de diâmetro. Quando observados em microscopia óptica, aparecem geralmente como células
únicas, aos pares ou agrupadas, com aparência de cacho de uvas (Anexo 1). A maioria das
espécies são aeróbicas ou anaeróbicas facultativas, com multiplicação rápida na maioria dos
meios de cultura a 37º C. As colônias de Staphylococcus aureus em meio sólido têm formas
arredondadas e aparência rugosa elevada e brilhante, com coloração amarelo-ouro. (Anexo 2)
(BROOKS et al., 2009; LEVINSON, 2010).
O gênero Staphylococcus faz parte da microbiota humana e pode provocar
doenças que vão desde uma infecção simples, como espinhas e furúnculos, até as mais graves,
como pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico, septicemia, entre
outras (DUARTE e SÁ, 2011). Normalmente, o controle dessa bactéria é realizado com
antibióticos, mas devido à sua capacidade de adaptação e resistência, tornou-se uma das
espécies de maior importância no quadro das infecções hospitalares (DUARTE e SÁ, 2011).
2
As fossas nasais, garganta, intestinos e pele são as regiões do corpo que possuem o maior
índice de colonização (PALOS et al., 2009).
Em um estudo sobre a prevalência e os fatores associados à colonização de feridas
em pacientes internados no interior do nordeste do Brasil, encontrou-se uma proporção
elevada de feridas colonizadas por S. aureus e S. aureus meticilina-resistentes (MRSA). Nesse
trabalho ficou evidenciado que a colonização nasal por S. aureus pode ser uma fonte para a
colonização das feridas, ilustrando a importância de prevenir a contaminação cruzada em
ambientes hospitalares, principalmente entre os idosos (ALMEIDA et al., 2014). LAVERY et
al. (2014), em um estudo para determinar os fatores de risco para infecções do pé diabético
por MRSA, encontraram uma prevalência de 42,1% de S. aureus, e 70% desses isolados
foram resistentes à meticilina. No geral, a prevalência de MRSA em infecções do pé diabético
foi de 29,8%. Três fatores de risco foram evidenciados na pesquisa desses autores, a presença
de organismos multirresistentes, a história de uma infecção do pé diabético por MRSA e uma
cultura de MRSA nasal positivo. Em outro estudo ZALAVRAS et al. (2009) estudaram 26
pacientes com infecção após o tratamento operatório de fraturas de tornozelo, sendo que o
S. aureus foi identificado em 17 pacientes (65%) e oxacilina resistente em seis (23%).
Bactérias patogênicas S. aureus são responsáveis por uma mortalidade superior às
verificadas pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), tuberculose e hepatite viral
juntas, nos Estados Unidos (BOUCHER e COREY, 2008). É comum encontrar esse
microrganismo associado às infecções em feridas, a procedimentos cirúrgicos e a
queimaduras (BORGES et al., 2008). Também está relacionado, frequentemente, na
ocorrência das infecções relacionadas à assistência em saúde (IRAS), devido a sua alta
patogenicidade e à grande prevalência nas instituições de saúde.
Estima-se que cerca de 30% da população geral dos Estados Unidos seja
colonizada por S. aureus e 1,5% por MRSA (SIGEL et al., 2007; TENOVER, 2006;
ELSTON e BARLOW, 2009). No Brasil, não há dados sistematizados que apontem as taxas
de colonização por MRSA na população em geral, sendo que alguns estudos realizados em
populações específicas, por exemplo, em pacientes atendidos em Ambulatórios de
Dermatologia, apontam a prevalência de S. aureus, variando entre 15,5% e 68,79%
(WALTER et al., 2003 e DRYDEN et al., 2004).
O uso indiscriminado de antibióticos contra infecções estafilocócicas foi uma
prática utilizada em todo mundo, que proporcionou o aumento de isolados de MRSA, ou de
outro perfil de resistência antimicrobiana (CRUVINEL et al., 2011).
3
As terapias orais utilizadas no tratamento de MRSA incluem a tetraciclina e a
rifampicina (em terapia de combinação), bem como a clindamicina, a linezolida e o
trimetoprim-sulfametoxazol (TMP-SMX, embora o seu uso seja restrito em alguns países). As
tetraciclinas que atuam por inibição da síntese proteica bacteriana têm boa biodisponibilidade
e são de fácil penetração nos tecidos, fazendo dessa classe de drogas (que inclui a doxiciclina
de espectro estendido e a minociclina) uma opção para o tratamento ambulatorial de infecções
por MRSA (RUHE e MENON, 2007).
Essa classe de antibióticos possui atividade bacteriostática contra ampla variedade
de bactérias gram-positivas bem como gram-negativas aeróbias e anaeróbias. Mostra-se
intrinsicamente mais ativo contra os microrganismos gram-positivos do que contra os gram-
negativos. As tetraciclinas inibem a síntese bacteriana das proteínas por meio de sua ligação
ao ribossomo 30S da bactéria, impedindo o acesso do aminoacil-tRNA ao local aceptor no
complexo mRNA-ribossomo (BRUNTON et al., 2010).
A resistência é disseminada e, com frequência, induzível. Os três principais
mecanismos de resistência são: diminuição do acúmulo de tetraciclina (redução do influxo do
antibiótico ou aquisição de uma via de efluxo dependente de energia), produção de uma
proteína ribossômica que desloca a tetraciclina de seu alvo proporcionando uma “proteção”
que também pode ocorrer por mutação e inativação enzimática das tetraciclinas. (BRUNTON
et al., 2010).
O uso dos óleos essenciais como agentes medicinais é conhecido desde a remota
antiguidade. Registros de seis mil anos atrás relatam que os egípcios realizavam práticas
religiosas associadas à cura de males, às unções da realeza e à busca de bem-estar físico, por
meio dos aromas obtidos de folhas, de flores, de sementes e de outras partes específicas de
certos vegetais (TYRREL, 1990). Já sabiam há mais de 4.000 anos das propriedades do ópio
(Papaver somniferum) como sedativo e calmante, da hortelã pimenta (Mentha piperita) como
digestivo e da cila (Drimia urticaria) como estimulante cardíaco; sabiam também, como
preparar diuréticos, vermífugos, purgantes e antissépticos a partir das plantas (BHATTARAM
et al., 2002).
Estima-se que, entre 70 e 90% da população, em alguns países como França, Itália
e Alemanha, recorrem ao conhecimento popular, sob a forma de “medicina complementar”,
“alternativa” ou “não convencional”. Isso também é observado em países em
desenvolvimento, sob outra concepção, uma vez que, o acesso aos medicamentos ocorre de
forma precária, e a medicina popular, muitas vezes, é a principal fonte de prevenção, de
tratamento e de manutenção da saúde de grande parte da população nesses países (PROBST,
2012).
4
No trabalho de YUNES et al. (2001) foi descrito a necessidade do
desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e de fitofármacos no Brasil. Os autores
apontaram algumas vantagens que justificam o uso de fitoterápicos, como os efeitos
sinérgicos, a associação de mecanismos por compostos agindo em alvos moleculares
diferentes bem como menores riscos de efeitos colaterais e de custos em pesquisas.
O mercado global de medicamentos em 2011 (sintéticos e naturais) alcançou a
cifra de U$ 800 bilhões, variando esse valor de acordo com as condições econômicas e sociais
de cada região do mundo, enquanto o mercado para os fitoterápicos atingiu o patamar de
U$ 26 bilhões, com uma desigualdade regional semelhante. Na Europa, encontra-se o maior
mercado, sendo que cerca de 50% desse encontra-se na Alemanha. A América Latina com
sete países com uma imensa biodiversidade participou apenas com 5% desse total. Nesse
mesmo período, o mercado de fitoterápicos movimentou cerca de R$ 1,1 bilhão no Brasil,
quando foram comercializados 43 milhões de unidades desse tipo de medicamento,
representando um aumento de 13% em relação ao ano anterior (ALVES, 2013).
As pesquisas sobre a ação dos óleos essenciais de algumas plantas têm ficado
mais populares, porque muitas drogas sintéticas são relacionadas a efeitos colaterais
desagradáveis, como a nefrotoxicidade e a otoxicidade (LANG e BUCHBAUER, 2012).
Dentre os fitoterápicos estudados, a árvore do chá (Melaleuca alternifólia Cheel) é uma das
mais importantes, pois já demostrou ação contra MRSA (CARSON et al., 1995),
Streptococcus (CARSON et al., 1996) Staphylococcus coagulase negativa e coliformes
(HAMMER et al., 1996). Essa planta pertence à família Myrtaceae, que é composta por
vários genêros e cerca de 3500 espécies distribuídas por todo o mundo, preferencialmente, nas
zonas tropicais e subtropicais da América e da Austrália. Estão amplamente distribuidas pelas
florestas brasileiras e muitas de suas espécies são cultivadas por conta de seus frutos
comestíveis, com finalidade ornamental, como fonte de madeira, ou ainda como fonte de
essências de valor comercial. A maior aplicação biológica dos óleos essenciais é sua ação
como agente antimicrobiano, representando uma extensão do próprio papel que exercem nas
plantas protegendo-as da ação de bactérias e de fungos fitopatogênicos. Os quatro genêros
mais importantes desta família são: Eucalyptus, Melaleuca, Eugenia e Psidium (SIANI et al.,
2000).
A Melaleuca alternifolia é internacionalmente conhecida como “tea tree” ou
árvore do chá. Originária da Austrália, possui um grande valor econômico devido à presença
de óleo essencial armazenado em seus tecidos foliares. O óleo essencial é utilizado
principalmente na produção de cosméticos, de germicidas e de agentes antissépticos. Eles são
também utilizados no tratamento de várias doenças (FARAG et al., 2004).
5
A Austrália foi o país pioneiro a trabalhar com óleo desse gênero (CARSON et
al., 2006). No entanto, existem várias plantas espalhadas pelo mundo, como as espécies de
Melaleuca armillaris, M. acuminata e M. Stypheloiodes, cultivadas na Tunisia (AMRI et al.,
2012). No Egito, FARAG et al. (2004) isolaram óleos das espécies M. ericifolia, M.
leucadendron, M. armillaris e M. styphelioides. Foram descritas também a M. leucadendron
na Malásia e no Vietinã (BRINKMAN e XUAN, 1991) e nos EUA a M. Quinquenervia
(PORAZINSKA, 2007).
No Brasil, SILVA et al. (2010) trabalharam com as espécies de M. hypericifolia e
M. thymifolia na Universidade Federal de Viçosa. E no sul de Minas Gerais, PEREIRA e
TEIXEIRA (2012) trabalharam com o óleo de Melaleuca sp., cultivado como planta
ornamental, na cidade de Pouso Alegre e conseguiram a inibição da bactéria S. aureus in vitro
e de outros patógenos. Essa pesquisa abriu possibilidades para que o óleo produzido por essa
planta possa ser estudado, idenficando propriedades iguais ou similares às da M. alternifolia.
6
2 - OBJETIVO
Avaliar o efeito inibitório do óleo da planta Melaleuca sp. no crescimento de
Staphylococcus aureus, proveniente de feridas de membros inferiores resistentes a
antibióticos.
7
3 - MÉTODOS
3.1 - EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE MELALEUCA SP.
O óleo da folha da planta foi extraído por meio da hidrodestilação, utilizando o
equipamento do tipo Clevenger (Hermex Glasware – Brasil). Foram colocados 400 gramas de
folhas de Melaleuca sp. em um balão com 300 mL de água. Esse balão foi colocado sobre
uma manta aquecedora que aqueceu a mistura até à ebulição, liberando o vapor que arrasta
com ele o óleo da Melaleuca sp. O vapor passando pelo condensador foi resfriado e voltou
novamente à fase líquida. No balão de recolhimento, os líquidos que não eram solúveis entre
si separam-se (Figura 1). Depois de retirado, o óleo da Melaleuca sp. foi acondicionado em
frasco escuro e mantido em geladeira a uma temperatura de 5o C até o momento do envio da
amostra para análise dos constituintes químicos.
FIGURA 1: Hidrodestilação - aparelho do tipo Clevenger - Departamento de botânica –
UNIVÁS.
Fonte: Falci, S.P.P.
8
3.2 - AVALIAÇÃO DA CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO MELALEUCA SP.
A amostra do óleo foi enviada para o laboratório do Instituto de Química da
Universidade de Campinas (UNICAMP). A identificação das propriedades químicas foi
realizada por cromatografia gasosa, em cromatógrafo a gás (modelo 7890, Agilent, EUA) com
espectrofotômetro de massa tipo quadrupolo linear (modelo 5975, Agilent, EUA). A
identificação dos compostos do óleo foi realizada com base nos dados de espectro de massas
NIST11 (fabricado nos EUA) e no programa Automated Mass Spectral Deconvolution Mass e
Identification System (AMDIS – fabricado nos EUA). A concentração dos compostos foi
expressa em porcentagem de área normalizada dos picos. O índice adotado de qualidade foi
acima de 70%.
3.3 - ISOLAMENTO E TESTES COM STAPHYLOCOCCUS AUREUS
3.3.1 - AMOSTRAS BACTERIANAS
Foram avaliados dois isolados de S. aureus provenientes de feridas de membros
inferiores de pacientes, sexo feminino e com idades de 36 e 57 anos e uma cepa controle de
Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 25923™). O isolado proveniente de lesão do
pé demostrou resistência aos antibióticos Amoxilina/Ácido Clavulânico,
Ampicilina/Sulbactam, Ceftriaxona, Eritromicina, Oxacilina, Penicilina e Tetraciclina. Para o
antibiótico Clindamicina a resistência foi intermediária (Anexo 3). O isolado de lesão de
joelho foi resistente aos antibióticos Amoxilina/Ácido Clavulânico, Ampicilina/Sulbactam,
Ceftriaxona, Ciprofloxacin, Clindamicina, Eritromicina, Levofloxacina, Moxifloxacina,
Oxacilina, Penicilina e Synercid (Anexo 4).
A identificação dos microrganismos e o teste de suscetibilidade aos
antimicrobianos foram realizados por automação no aparelho MicroScan® auto SCAN-4
System da SIEMENS (Alemanha) com a utilização do painel Pos Combo Type 41
(Alemanha).
Após identificação, os isolados foram preservados em meio líquido Trypticase
Soy Agar (TSA - Himedia®), e a semeadura foi realizada em diversos tubos inclinados como
culturas estoque, a partir das quais foram reativados e inoculados para determinação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM).
9
3.3.2 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM )
A partir das culturas estoques, os estafilococos foram transferidos para o meio
Tioglicolato (Himedia®), incubado a 37°C por 24 horas e em seguida semeados em meio ágar
sal manitol e novamente, incubados a 37°C por 24 horas. A concentração para a inoculação de
cada espécie de S. aureus foi de 1x106 UFC (Unidades Formadoras de Colônias) /mL e obtida
utilizando-se um swab esterilizado que foi tocado na superfície de 4 a 5 colônias grandes
isoladas na placa de ágar sal manitol e emulsionados em 3 mL de água para inóculo (água
desionizada autoclavada). A turvação final foi equivalente à de um padrão de turvação 0,5 da
escala de McFarland. Turvação essa confirmada através da utilização do medidor de turvação
MicroScan® com um intervalo de 0,08 ± 0,02. (Manual de procedimento para painéis de
Gram-Positivos Desidratados- MicroScan®– SIEMENS).
Na determinação da CIM foram utilizados 14 tubos de ensaio com 5 mL de caldo
Tioglicolato (Himedia®) para cada uma das cepas utilizadas. Em 12 tubos foram acrescidas
concentrações progressivas do óleo extraído, sendo o 12o tubo usado como controle, ou seja,
com a menor concentração do óleo, mas sem inóculo. O 13o tubo foi usado como controle
positivo de crescimento, isto é, sem o óleo, porém com o inóculo, e o 14o usado como
controle negativo, sem o óleo e sem o inóculo, apenas o meio de cultura. As concentrações
utilizadas foram 8; 4; 2; 1; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 e 0,00625%. O ensaio foi
realizado com três repetições para cada tubo. Após a adição do óleo, os 11 primeiros tubos e o
13º tubo (controle positivo) receberam 250 µL de um mesmo inóculo contendo 1x106
UFC/mL. Todos os tubos foram acondicionados em incubadora a 37°C de temperatura,
durante 18 horas. Decorrido esse período, os tubos foram examinados visualmente para
comprovar a presença de turvação. O primeiro tubo no qual não se observou turvação foi
considerado como contendo a CIM (Figura 2).
A CIM foi estabelecida para a bactéria isolada da lesão do pé, para a lesão do
joelho e para a cepa de Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 25923™), que é uma
cepa americana padronizada (Figura 2).
10
FIGURA 2: Ensaio para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM). Fonte: Falci, S.P.P.
3.3.3 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CB M)
Nos tubos que não se mostraram turvos, foram retiradas alíquotas de 100 µL, que
foram depositadas em placas de Petri contendo ágar sal-manitol (Difco Co), espalhadas com o
auxílio da alça de Drigalski e encubadas invertidas a 37º por 18 horas. A primeira
concentração que não permitiu o crescimento de nenhuma colônia sobre a superfície do ágar
foi considerada como a CBM, ou seja, a concentração capaz de matar todos os
microrganismos.
3.4 - INFECÇÃO ESTAFILOCÓCICA EM ANIMAIS
O experimento foi realizado no laboratório de Cirurgia Experimental, para os
procedimentos com os ratos, e no Laboratório de Microbiologia, para os procedimentos de
cultura microbianas e contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), da Faculdade de
Ciências da Saúde Dr. José Antônio Garcia Coutinho da Universidade do Vale do Sapucaí
(UNIVÁS), em Pouso Alegre, Minas Gerais.
11
Desenho da pesquisa:
Tratou-se de estudo experimental com ratos, primário, intervencional,
prospectivo, analítico e controlado. Os princípios éticos para o uso de animais de laboratório
foram seguidos conforme preconiza o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animal (CEUA) da
Universidade do Vale do Sapucaí (UNIVÁS), sob o protocolo 187/13 (Anexo 5).
3.4.1 - ANIMAIS
A amostra foi constituída por 40 ratos (Rattus Norvegicus albinus) da linhagem
Wister, fêmeas, com 3 a 4 meses de vida, com massa corpórea de aproximadamente 300 g,
proveniente do biotério da Universidade do Vale do Sapucaí, MG, Brasil (UNIVÁS).
Os animais ficaram dez dias em adaptação, alojados e mantidos no biotério em
caixas moradias individuais de polipropileno (Caixa GK 115 – Beira Mar), com dimensão de
49x34x16 centímetros (cm), identificadas com números de 1 a 40. A iluminação foi
controlada com ciclo claro/escuro de doze horas. Os animais receberam ração padronizada
(ração extrusada presence da marca Evitalis) e água ad libitum. A higienização das gaiolas foi
realizada duas vezes por semana, com troca das maravalhas.
3.4.2 - CONFECÇÃO DAS FERIDAS
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia geral, por meio
de administração intramuscular de 0,1 mL de cloridrato de quetamina (Dopalen, Agribrands),
associado a 0,05 mL de cloridrato de xylazina (Rompun, Bayer), para cada 100 gramas de
peso do animal.
Com o animal anestesiado, por meio de um molde de papelão e com uma caneta
dermográfica, demarcou-se no dorso uma área quadrangular de 5 cm no eixo longitudinal por
5 cm no eixo transversal, iniciada a partir da margem inferior das escápulas. Essa área foi
epilada manualmente.
Antes da incisão, o local da ferida foi estabelecido como uma área circular de 2,5
cm de diâmetro, no plano transverso, com seu centro na linha mediana dorsal seguindo em
sentido caudal, iniciando-se a 1 cm da margem inferior das escápulas.
Na mesa cirúrgica, a região demarcada em cada rato foi limpa com solução salina
a 0,9%, e a antissepsia realizada com álcool 70% (Figura 3A). Com um “punch” de aço
12
inoxidável de 2,5 cm de diâmetro e extremidade cortante em bisel fez-se pressão contra a pele
o que produziu um corte circular superficial (Figura 3B). Com bisturi e tesoura íris foram
completadas a incisão e a ressecção da pele e do panículo carnoso até a fáscia muscular
superficial (Figura 3C), produzindo a ferida conforme técnica preconizada por OLIVEIRA et
al., 2000 com adaptação de ATZINGEN et al.(2013) (Figura 3D).
FIGURA 3: Ato cirúrgico para produção das feridas: A) Área epilada. B) Demarcação sob pressão com o punch. C) Incisão da pele. D) Ferida cutânea expondo a fáscia muscular. Fonte: Falci, S.P.P.
3.4.3 - INFECÇÃO POR S. AUREUS NOS RATOS
A seguir ao procedimento cirúrgico, cada animal recebeu sobre a ferida 0,5 mL de
uma suspensão bacteriana de 1,0 x 106 UFC/mL de S. aureus (turbidez de 0,5 na escala de Mc
Farland). Nesse experimento utilizou-se o S. aureus isolado da lesão do joelho por apresentar
resistência a um número maior de antibióticos que as outras duas cepas utilizadas nos testes
de CIM e CBM (Figura 4A).
A B
C D
13
Esse procedimento foi efetuado em todos os animais, sendo esse dia considerado
como dia zero da infecção. Em seguida, a ferida foi coberta com filme transparente adesivo
(Smith & Nephew® Inglaterra, modelo OpSite Flexigrid) com dimensão de 2,5x3,0cm (Anexo
VI). Para a fixação do filme transparente, a película que protege a parte adesiva foi removida,
sendo o filme aderido à área ao redor da ferida e, em seguida, foi removida a camada externa,
ficando, apenas a camada do meio, fina e flexível aderida ao dorso do animal (Figura 4B).
Depois o animal foi recolocado na gaiola.
FIGURA 4: Infecção da ferida: A) Inoculação de 0,5 mL de uma suspensão bacteriana de 1,0 x 106 UFC/mL de S. aureus. B) Fixação de filme adesivo protetor. Fonte: Falci, S.P.P.
Após dois dias da infecção foi realizada a separação dos animais em quatro grupos
distintos a saber:
a) grupo controle (n=10) – o tratamento das feridas dos ratos foi realizado com 1 mL de gel
de carbopol;
b) grupo tetraciclina (n=10) – as feridas deste grupo de ratos receberam 1 mL de tetraciclina
a 1% em gel de carbopol, obtido em farmácia de manipulação;
c) grupo Melaleuca alternifolia (n=10) – neste grupo foi aplicado 1 mL de óleo de Melaleuca
alternifolia a 1% em gel de carbopol, obtido em farmácia de manipulação;
d) grupo Melaleuca sp. (n=10) – as feridas dos ratos receberam 1 mL do óleo de Melaleuca
sp. (extraído no laboratório de botânica da UNIVÁS) a 1% em gel de carbopol que foi
preparado em farmácia de manipulação.
3.4.4 - LIMPEZA DAS FERIDAS E APLICAÇÃO DO PRINCÍPIO ATIVO
Diariamente, sempre antecedendo à aplicação do tratamento, foi realizado o
desbridramento da ferida quando necessário, com o auxílio de pinça e gaze embebida em soro
A B
14
fisiológico 0,9% esterilizado por meio de um procedimento rápido, invadindo minimamente
os tecidos vivos. Em seguida foi realizada a limpeza da ferida com 5 mL de soro fisiológico a
0,9%.
Para os tratamentos realizados a partir do estabelecimento da infecção foi usado
um “prompt” com capacidade de dispensação de 1 mL da substância utilizada em cada grupo,
de forma a preencher toda a superfície da lesão e desta forma padronizar a quantidade de
tratamento aplicada nos quatro grupos (Figura 5). Esses tratamentos foram realizados durante
um período de 15 dias.
Após a limpeza e o tratamento, as feridas permaneceram cobertas por filme
transparente adesivo durante todo o experimento. A analgesia dos animais durante o
experimento foi feita com Cetoprofeno (3 dias) e Dipirona gotas (12 dias), diluídos na água
que os ratos beberam, na quantidade de 5 mg/Kg e 15 mg/kg, respectivamente.
FIGURA 5: Aplicação do tratamento com o auxílio do “prompt” de dispensação de 1 mL. Fonte: Falci, S.P.P.
3.4.5 - QUANTIFICAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS NAS LESÕE S PELO MÉTODO DA IRRIGAÇÃO-ASPIRAÇÃO
A coleta do lavado da ferida para quantificação das UFC foi realizada nos 1º, 5º,
8º, 12º e 15º dias, contados depois do processo de infecção. A cada avaliação foram
depositados sobre a ferida, com o auxílio de uma seringa com capacidade de dez mL acoplada
a uma agulha estéril de calibre 25x7, 5 mL de soro fisiológico a 0,9%, esterilizado. A solução
do soro fisiológico lavou todo o leito da lesão. Com uma seringa de 3 mL, foi expirado
exatamente 2 mL dessa solução do soro com os microrganismos existentes na lesão e
15
transferidos para um tubo de ensaio esterilizado. Este foi vedado com tampa de rosca e
imediatamente encaminhado ao laboratório de microbiologia.
Para possibilitar a coleta do lavado das lesões, evitando a perda dessa solução com
as bactérias, foi utilizado um suporte confeccionado a partir do corte do embolo de seringa de
20 mL e afixado manualmente ao redor da lesão pelo pesquisador. Esse suporte e a seringa de
3 mL foram trocados a cada nova coleta em cada rato (Figura 6A e 6B).
FIGURA 6: Coleta do material da ferida pelo método irrigação e aspiração. A) Obtenção do lavado da ferida. B) Acondicionamento do lavado em tubo de ensaio estéril. Fonte: Falci, S.P.P.
A alíquota de 1 mL da mistura do soro com os microrganismos foi retirada da
amostra e submetida à técnica de diluição seriada. Com uma pipeta automática esterilizada
repassou-se 1,0 mL do lavado da ferida para outro tubo de ensaio com 9,0 mL de solução
esterilizada de cloreto de sódio a 0,9%, obtendo a diluição 10-1. Esse procedimento foi
repetido até a diluição 10-7 (Figura 7). Após a diluição foi transferido 100µL de cada uma das
sete diluições, começando da mais diluída para a menos diluída, para a superfície do meio
ágar sal manitol, seletivo para bactérias do gênero Staphylococcus (Figura 8). Para cada
diluição, foram realizados três plaqueamentos.
A B
16
FIGURA 7: Exemplo do processo de diluição seriada. Fonte: https://bacilosnasopa.wordpress.com/tag/tecnica-de-diluicao-seriada/
FIGURA 8: Ágar sal manitol. Fonte: Falci, S.P.P.
O inóculo foi espalhado com o auxílio da alça de Drigalsky sobre a superfície do
ágar sal manitol (Figura 9A). As placas foram incubadas invertidas, a uma temperatura de
37ºC, por 24h, quando então foi feita a contagem de bactérias com aspecto de colônias
características típicas do crescimento de S. aureus (colônias com halo amarelo ao redor,
resultado da fermentação do manitol (Figura 9B) com o auxílio do contador de colônias
17
mecânico CP 602 (Phoenix) (Figura 9C). A quantificação de UFC indicou quantas bactérias
havia, por mililitros, na suspensão original da ferida.
No décimo sétimo dia do experimento, o animal foi submetido à anestesia geral e
em seguida realizada a retirada do material biológico para futuros estudos. A eutanásia foi
realizada com cloreto de potássio 19% via intracardíaca.
FIGURA 9: Cultura e contagem de UFC. A) Inoculação do material para o meio de ágar sal manitol. B) Bactérias com aspecto de colônias características típicas do crescimento de S. aureus C) Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC). Fonte: Falci, S.P.P.
A B
C
18
3.5 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram processados pelo software Statistical Package for the Social
Sciences (SPSS), versão 18. Por meio do teste de Kruskal Wallis, foi avaliada entre os grupos
a diferença quantitativa do número de UFC nos 5 dias de coleta do lavado das feridas e nas 7
diluições no decorrer dos 15 dias de tratamento. Foi avaliada também dentro de cada grupo a
variação de crescimento de UFC nos 5 dias de coleta do lavado das feridas no decorrer do
tratamento e nas 7 diluições, pelo teste de Friedman.
O nível de rejeição da hipótese de nulidade foi fixado em 5%, considerando-se
significantes os valores de p menores ou iguais a 0,05.
19
4 - RESULTADOS/PRODUTO
4.1 - IDENTIFICAÇÃO CROMATOGRÁFICA DOS COMPONENTES DO ÓLE O
DA MELALEUCA SP.
No óleo de Melaleuca sp. foram detectados 27 picos, dos quais 21 são
apresentados na Tabela 1. Os seis picos não identificados podem estar relacionados a novas
estruturas que não foram reconhecidas pela biblioteca de dados do programa ou podem ser
picos que não se separaram uns dos outros durante a cromatografia. Houve uma pequena
prevalência de monoterpenos (57,2%) em relação à presença de sesquiterpenos (42,8%). Os
principais monoterpenos foram o eucaliptol ou 1,8 cineol com 70,08%, seguidos de terpineol
com 8,95% e limonemos com 8,25%. Dos sesquiterpenos encontrados, o mais abundante foi o
globulol, seguido de octahidro tetrametil ciclopropazuleno com 0,62% e 0,50%. Todos os
constituintes identificados no óleo estão dispostos na Tabela 1.
20
TABELA 1 – Analitos identificados no óleo de Melaleuca sp.
Pico tR Nome do Composto % A Qualidade
1 8,88 Trimetil Biciclico Hepteno 3,39 97
2 10,20 Dimetil Metileno Biciclico Heptano 1,09 97
3 10,67 Mirceno 1,99 AMDIS
4 11,04 Metileno Metiletenil Cicloexano 0,15 76
5 11,44 Metil Metiletilideno Cicloexano 0,20 95
6 11,69 Tetrametl Benzeno 0,13 81
7 11,82 Limoneno 8,25 99
8 11,89 Eucaliptol 70,08 99
9 12,76 Terpineno 0,64 94
10 13,67 Isopropilideno Metil Biciclico Hexano 0,13 89
11 16,03 Terpineol (isômero) 0,22 AMDIS
12 16,33 Terpineol (isômero) 0,84 93
13 16,72 Terpineol (isômero) 7,89 87
14 22,76 Não determinado 0,15 -
15 23,02 Não determinado 0,13 -
16 23,51 Decahidro Trimetil Metileno
Ciclopropazuleno
0,50 95
17 24,06 Aloaromadendreno 0,27 99
18 24,91 Octahidro Tetrametil Ciclopropazuleno 0,62 96
19 25,56 Hexahidro Dimetil Metil Etil Naftaleno 0,43 90
20 26,45 Não determinado 0,12 -
21 26,65 Não determinado 0,21 -
22 27,03 Globulol 0,82 98
23 27,23 Octahidro Dimetil Metil Etenil Azuleno 0,45 87
24 27,26 Não determinado 0,34 -
25 27,45 Eudesmol 0,29 AMDIS
26 27,92 Não determinado 0,32 -
27 28,03 Hexahidro Dimmetil Metiletil Naftaleno 0,23 87
Pico: Número do pico pela ordem de eluição da coluna tR = Tempo de retenção do composto na coluna em minutos Nome do composto: Nome mais comum do composto identificado. %A = Porcentagem de área normalizada a qual indica a distribuição relativa dos compostos na amostra. Qualidade: é o índice de pesquisa na base de dados que reflete a similaridade do espectro de massas obtido com os registrados nas bibliotecas utilizadas. Foram adotados índices de qualidade > 70. Fonte: Falci, S.P.P.
21
4.2 - ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) E
CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)
A partir de inóculos padronizados de cada amostra bacteriana testada foram
obtidos os resultados de CIM e CBM para o óleo de Melaleuca sp. cultivado no Brasil.
Houve crescimento bacteriano em todos os tubos com meio de cultura sem adição
do óleo teste. A CIM do óleo de Melaleuca sp. mostrou diferentes resultados para as bactérias
testadas, sendo que, os S. aureus, proveniente da lesão do pé e a cepa controle, ATCC®
25923™ foram mais resistentes ao óleo testado, quando comparados ao S. aureus proveniente
da lesão do joelho. O óleo da Melaleuca sp. apresentou CIM de 0,1% para o isolado de S.
aureus proveniente da lesão no pé e para a cepa controle ATCC® 25923™. Para o isolado da
lesão no joelho, a CIM foi de 0,2%
A CBM do óleo de Melaleuca sp. foi a mesma para todas as bactérias testadas, e a
ausência de crescimento se deu a partir do tubo 5 a 0,4%. Portanto, os resultados obtidos para
CIM e CBM foram respectivamente 0,1% e 0,4% para o isolado de S. aureus proveniente da
lesão no pé (Figura 10) e de 0,2% e 0,4% para o isolado da lesão no joelho. Para a cepa
ATCC® 25923™, a CIM e a CBM foram respectivamente 0,2% e 0,4% (Figura 11).
FIGURA 10: CIM para Bac 1 (lesão pé): Tubo 7 - 0,1%; Tubo 8 - 0,05%; Tubo 9 - 0,025%. Fonte: Falci, S.P.P.
7 8
9
22
FIGURA 11: CIM para Bac 2 (lesão joelho) e Bac 3 (ATCC® 25923™): Tubo 6 - 0,2; Tubo 7 - 0,1%; Tubo 8 - 0,05%; Tubo 9 - 0,025%. Fonte: Falci, S.P.P.
4.3 - TRATAMENTO DAS INFECÇÕES ESTAFILOCÓCICAS EM RATOS
Na diluição 10-1 houve um aumento no número de UFC/mL do grupo controle
entre a primeira (dia 1) e a segunda (dia 5) leituras de avaliação do experimento (Tabela 2).
Quando esse resultado foi analisado, o aumento no número de bactérias S. aureus não foi
significativo. A partir de então, houve uma inversão desse resultado, e nas demais passaram a
ser observadas reduções no número de UFCs das leituras do oitavo dia (197,9), do décimo
segundo (37,3) e do décimo quinto dia (11,9), conforme descrito na Tabela 2.
Reduções estatísticamente significantes foram encontradas na comparação das
primeiras leituras (dias 1 e 5) com as duas últimas (dias 12 e 15). Outra diferença estatística
significativa encontrada foi na comparação do número de bactérias obtidas na terceira leitura
(dia 8) em relação ao número de bactérias obtidas na última leitura (dia 15). Esses dados estão
disponíveis na Tabela 9. Portanto, neste trabalho, o comportamento do tratamento controle
mostrou que o simples fato de se lavar uma ferida contribuiu para a redução do número de S.
aureus que estavam presentes na infecção inicial.
No segundo dia de coleta (dia 5) e na diluição de 10-1 houve uma diminuição
significativa no número de UFC no grupo tratado com a tetraciclina em relação ao controle e
ao tratamento com Melaleuca alternifolia (Tabela 10). A tetraciclina não se diferenciou da
Melaleuca sp., mas foi mais eficiente na redução do número de microrganismos (Tabela 2).
6 7 8 9
23
Quando se analisa a diferença do crescimento dos microrganismos dentro do mesmo grupo, os
resultados mostraram que o número contado na primeira leitura (dia 1) em relação à terceira, à
quarta e à quinta leituras (dias 8, 12 e 15) foi significativo (Tabela 9). Também foi observada
uma diferença significativa entre o número de S. aureus encontrados na segunda leitura (dia
5) e na última (dia 15), conforme Tabela 9.
Quando se observam os tratamentos da Melaleuca alternifolia na diluição de 10-1,
em relação ao controle não houve diferença estatística entre eles, e nessa primeira avaliação
de resultados coube a ela o pior desempenho entre os tratamentos aplicados no combate ao
S. aureus (Tabela 2). O tratamento com o óleo de Melaleuca alternifólia não diminuiu
significativamente o número de S. aureus da primeira leitura (um dia) em comparação ao
número desses microrganismos da segunda leitura (cinco dias). A diminuição se tornou
significativa quando se comparou essas primeiras leituras com as duas últimas (doze e quinze
dias), conforme Tabela 9. Quando se comparou a terceira leitura (oito dias) com a última
(quinze dias), também houve diferença significativa (Tabela 9).
Avaliando ainda os resultados da diluição 10-1, a Melaleuca sp. reduziu bastante o
número de microrganismos em relação ao controle, mas não foi tão eficiente como a
tetraciclina e nem tão ineficaz como foi a Melaleuca alternifolia, nos primeiros cinco dias de
observação dos dados (Tabela 2). No tratamento com o óleo da planta Melaleuca sp. foi
observada uma redução significativa de propágulos de S. aureus entre a primeira leitura (dia
1) quando comparada à quarta e à quinta leituras (dias 12 e 15). Também foi observada uma
diferença significativa entre o número de S. aureus encontrados na segunda leitura (cinco
dias) e na terceira leitura (oito dias) em relação à quinta leitura (15 dias), conforme descrito na
Tabela 9.
A partir do oitavo dia de observação, a tetraciclina continua sendo o melhor
tratamento de combate à bactéria S. aureus, diferenciando estatisticamente de todos os outros
tratamentos (Tabela 10). O controle continua também com um número de microrganismos
maior que os demais tratamentos (Tabela 2). No entanto, quando se comparam os tratamentos
da Melaleuca alternifolia e Melaleuca sp., observa-se uma redução não significativa (Tabela
2) do número de bactérias controladas pelo tratamento com o óleo de M. alternifolia.
No décimo quinto dia, o melhor resultado observado continuou sendo para o
tratamento com tetraciclina que diferenciou estatisticamente do controle e da Melaleuca sp.
(Tabela 10), mas não diferenciou do tratamento com o óleo da Melaleuca alternifolia.
24
TABELA 2 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus nos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10-1 no decorrer dos 15 dias de tratamento.
Grupos dia 1 dia 5 dia 8 dia 12 dia 15
Controle 279,7 334,2 197,9 37,3 11,9
Tetra 339,7 30,5 13 9,2 1,1
M. alt 368,5 283,6 133,6 28,6 8,9
M. sp. 361,6 195,8 160,2 61 15,8
Nas diluições 10-2 e 10-3 os resultados foram exatamente iguais aos observados na
diluição 10-1, exceto quando foram observados os tratamentos com Melaleuca sp. e M.
alternifolia. Na diluição 10-2 o tratamento com o óleo de Melaleuca alternifolia foi melhor
que o da Melaleuca sp., fato inversamente observado na diluição 10-1 (Tabela 3).
TABELA 3 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10-2 no decorrer dos 15 dias de tratamento.
Grupos dia 1 dia 5 dia 8 dia 12 dia 15
Controle 209,4 184,2 30,2 3 0,7
Tetra 241,8 3,3 1,4 0,3 0
M. alt 185,5 51,9 9,6 2,8 0,3
M. sp. 122,9 100 25,5 4,2 1,2
Na diluição 10-3 foram analisados os dados até à quarta leitura (dia 12), pois na
última leitura não houve crescimento de microrganismos que permitisse uma comparação
entre os tratamentos (Tabela 4).
25
TABELA 4 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10-3 no decorrer dos 15 dias de tratamento.
Grupos dia 1 dia 5 dia 8 dia 12 dia 15
Controle 50,7 19,9 4,5 0,3 0,1
Tetra 40,3 0,1 0 0 0
M. alt 29,3 5,9 0,8 0,2 0
M. sp. 22,2 14,5 0,3 0,1 0
Nas diluições 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 não houve crescimento de microrganismos
suficiente para uma análise estatística, conforme mostram as Tabelas 5, 6, 7 e 8.
TABELA 5 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10 -4 no decorrer dos 15 dias de tratamento.
Grupos dia 1 dia 5 dia 8 dia 12 dia 15
Controle 8,7 2,1 0,3 0 0
Tetra 3,1 0 0 0 0
M. alt 41,7 0,3 0 0 0
M. sp. 7,6 1,3 0 0 0
TABELA 6 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10-5 no decorrer dos 15 dias de tratamento.
Grupos dia 1 dia 5 dia 8 dia 12 dia 15
Controle 0,8 0 0 0 0
Tetra 1,2 0 0 0 0
M. alt 2,4 0 0 0 0
M. sp. 0,1 0 0 0 0
26
TABELA 7 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10-6 no decorrer dos 15 dias de tratamento.
Grupos dia 1 dia 5 dia 8 dia 12 dia 15
Controle 0,6 0 0 0 0
Tetra 0,2 0 0 0 0
M. alt 0,8 0 0 0 0
M. sp 0 0 0 0 0
TABELA 8 - Média da contagem de UFC de Staphylococcus aureus dos 10 ratos de cada
grupo na diluição 10-7 no decorrer dos 15 dias de tratamento.
Grupos dia 1 dia 5 dia 8 dia 12 dia 15
Controle 0,3 0 0 0 0
Tetra 0,5 0 0 0 0
M. alt 0,4 0 0 0 0
M. sp 0 0 0 0 0
27
TABELA 9 – Teste de Friedman - Diminuição do número de UFC no decorrer do tratamento
dentro do mesmo grupo.
(1º DIA X 5º DIA X 8º DIA X 12º DIA X 15º DIA)
CONTROLE TETRACICLINA MELALEUCA ALTERNIFOLIA MELALEUCA SP
DILUIÇÃO 10 -1
( p < 0,0001)
1º e 5º DIAS > 12º e
15º DIAS
8º DIA > 15º DIA
( p < 0,0001 )
1º DIA > 8º, 12º e 15º
DIAS
5º DIA > 15º DIA
( p < 0,0001 )
1º e 5º DIAS > 12º e 15º DIAS
8º DIA > 15º DIA
( p < 0,0001 )
1º DIA > 12º e 15º
DIAS
5º e 8º DIAS > 15º
DIA
DILUIÇÃO 10-2
( p < 0,0001)
1º DIA > 15º DIA
5º DIA > 12º e 15º
DIAS
( p < 0,0001 )
1º DIA > 8º, 12º e 15º
DIAS
5º DIA > 15º DIA
( p < 0,0001 )
1º DIA > 8º, 12º e 15º DIAS
5º DIA > 12º e 15º DIAS
( p < 0,0001 )
1º e 5º DIAS > 12º e
15º DIAS
DILUIÇÃO 10-3
( p = 0,0047 )
5º DIA > 15º DIA
( p = 0,0005 )
1º DIA > 5º, 8º, 12º e
15º DIAS
( p < 0,0001 )
1º DIA > 8º, 12º e 15º DIAS
( p = 0,0004 )
1º DIA > 8º, 12º e 15º
DIAS
DILUIÇÃO 10-4 ( p = 0,0668 )
( p = 0,1257 )
( p = 0,0418 )
( p = 0,0563 )
DILUIÇÃO 10-5
( p = 0,5249 )
( p = 0,2873 )
( p = 0,7725 )
( p = 0,9953 )
DILUIÇÃO 10-6
( p = 0,7725 )
( p = 0,9384 )
( p = 0,9384 )
( p = 1,0000 )
DILUIÇÃO 10-7
( p = 0,9384 )
( p = 0,7725 )
( p = 0,9953 )
( p = 1,0000 )
28
TABELA 10 - Teste de Kruskal Wallis - Diminuição do número de UFC no decorrer do
tratamento entre os 4 grupos estudados.
CONTROLE X TETRACICLINA X MELALEUCA ALTERNIFÓLIA X MELALEUCA SP
DIA 1 DIA 5 DIA 8 DIA 12 DIA 15
DILUIÇÃO 10 -1
( p = 4757 )
( p < 0,0001 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
* TETRACICLINA
< MELAL.
ALTERNIFOLIA
( p = 0,0002 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
* TETRACICLINA
< MELAL.
ALTERNIFOLIA
* TETRACICLINA
< MELAL. SP
( p = 0,0071 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
* TETRACICLINA
< MELAL.
ALTERNIFOLIA
* TETRACICLINA
< MELAL. SP
( p = 0,0027 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
* TETRACICLINA
< MELAL. SP.
DILUIÇÃO 10 -2
( p = 0,8838 )
( p = < 0,0001 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
* TETRACICLINA
< MELAL.
ALTERNIFOLIA
* TETRACICLINA
< MELAL. SP
( p = 0,0013 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
* TETRACICLINA
< MELAL.
ALTERNIFOLIA
* TETRACICLINA
< MELAL. SP
( p = 0,0146 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
( p = 0,4600 )
DILUIÇÃO 10 -3
( p = 0,9480 )
( p = 0,0014 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
( p = 0,0298 )
* TETRACICLINA
< CONTROLE
( p = 0,7271 )
( p = 0,9744 )
DILUIÇÃO 10 -4
( p = 0,8395 )
( p = 0,2549 )
( p = 0,9744 )
( p = 1,0000 )
( p = 1,0000 )
DILUIÇÃO 10 -5
( p = 0.3894 )
( p = 1,0000 )
( p = 1,0000 )
( p = 1,0000 )
( p = 1,0000 )
DILUIÇÃO 10 -6
( p = 0,7016 )
( p = 1,0000 )
( p = 1,0000 )
( p = 1,0000 )
( p = 1,0000 )
DILUIÇÃO 10-7 ( p = 0,7129 ) ( p = 1,0000 ) ( p = 1,0000 ) ( p = 1,0000 ) ( p = 1,0000 )
29
A técnica de irrigação-aspiração demonstrou ser eficiente. Em trabalhos
realizados por essa técnica é necessário fazer diluições apenas entre 10-1 e 10-3, quando se
tratar de estudos referentes à quantificação de S. aureus em feridas de ratos.
30
5 - APLICABILIDADE
CARSON et al. (2006) descreveram que o óleo isolado da árvore do chá (M.
alternifolia) é formada de hidrocarbonetos de terpeno, principalmente de monoterpenos e
sesquiterpenos e outros alcoóis associados. O mesmo foi observado no presente estudo, com
porcentagens bem similares. No entanto, quando se compararam os compostos das duas
plantas, Melaleuca sp. e M. alternifolia, perceberam-se diferenças na constituição dos óleos,
como a prevalência do eucaliptol (1,8 cineol) na amostra brasileira em relação ao terpinen-4-
ol, principal constituínte descrito para amostras australianas (CARSON et al., 2006).
Uma das dificuldades de se estabelecer a fitoterapia como prática médica é a falta
de padronização dos constituintes químicos das plantas. Isso tem sido relatado com frequência
nas literaturas, e outros autores descreveram que o óleo de Melaleuca alternifolia e outras
espécies sofrem variações na sua constituição, quando se trata das mesmas variedades ou
quimiotipos ou mesmo de lote para lote. (CARSON et al., 2006 e QUINTÃO, 2013).
O óleo extraído da Melaleuca sp. é rico em eucalitol (1,8 cineol), e somente nos
últimos anos, as pesquisas mostraram existir uma ação antimicrobiana atribuída a essa
molécula, que age como um facilitador da permeabilidade da membrana em microrganismos
como S. aureus (CARSON et al., 2006). O eucaliptol encontrado na amostra brasileira abre a
possibilidade para que trabalhos posteriores busquem o entendimento da ação dessa
substância em bactérias patogênicas, principalmente as do gênero S. aureus, pois in vitro sua
ação foi tão eficaz quanto à dos óleos cultivados na Austrália, que possuem o terpinen-4-ol
como principal agente antimicrobiano.
A Standards Association of Australian (1985), por meio da AS 2782, e a
International Standards Organization (1996), por meio da ISO 4730 preconizaram que, para
que o óleo da árvore do chá (TTO) seja comercializado deverá seguir alguns parâmetros de
qualidade, nos quais foi estabelecido que, a quantidade de 1.8- cineol (eucaliptol) deve ser
abaixo de 15% e a de terpinen-4-ol, acima de 30% para que, se tenha eficácia mínima como
antisséptico. Neste trabalho, a amostra de óleo da planta Melaleuca sp. não atingiu a
qualidade pré-estabelecida pelo comitê australiano e pelo comitê internacional. Outros
trabalhos de pesquisa precisam ser feitos com essa planta, sobretudo no aspecto agronômico,
para que possam ser estabelecidas as condições ideais de cultivo, de clima, de horário de
coleta, entre outros fatores, que poderão colaborar para a produção de algumas moléculas
antimicrobianas como o terpinen-4-ol, que não foi encontrada na amostra de óleo da planta
brasileira. Todavia, o padrão internacional para produção e para comercialização do óleo de
TTO não especifica quais espécies do gênero Melaleuca devem ser utilizadas. Das literaturas
31
consultadas, a grande maioria das amostras cromatográficas referem-se ao óleo de Melaleuca
alternifolia (CARSON et al., 2006).
Outras espécies como a Melaleuca hyperycifolia e a M. thymifolia são cultivadas
no Brasil e produziram em torno de 88% e 7,7%, respectivamente, de 1,8-cineol. As espécies
da famíla Myrtaceae, também cultivadas em solo brasileiro, são produtoras dessa molécula
como, por exemplo, as espécies de Callistemon viminalis, C. polandii e Kunzea ericoides que
produziram, respectivamente, em torno de 65%, 77% e 16,4% (SILVA et al., 2010). A
espécie mais famosa de Myrtaceae e produtora de eucaliptol é a Eucalyptus globulus, na qual
se tem relatos que a extração dessa molécula chega a uma concentração média de 80% (VITTI
e BRITO, 2003).
O 1,8-cineol (eucaliptol) é usado na medicina tradicional na Alemanha e está
registrado como produto há muitos anos, que é consumido em cápsulas para o tratamento de
bronquite aguda e crônica, sinusite e infecções respiratórias (JUERGENS et al., 2003). Outros
trabalhos mostram aplicações dessa molécula para aumentar a penetração de drogas
percutâneas, como descongestionante nasal, antitosse, na aromaterapia e na odontologia
(KALRA. et al., 2011, OLIVEIRA et al., 2011)
O terpineol é uma molécula que possui atividade antimicrobiana. Pesquisas que se
dedicaram ao estudo do óleo da planta de Melaleuca alternifolia descreveram essa
característica, principalmente, quando estudaram o terpineol separadamente
(LOUGHLIN et al., 2008). Ela possui ampla aplicação industrial, a começar pela perfumaria,
(ABURJAI e NATSHEH, 2003 e BICAS et al., 2011), como constituinte de perfumes e
cosméticos na indústria de produtos de limpeza e como repelente de insetos (LIU et al.,
2013), desinfetante (YANG et al, 2004), aromatizante (BICAS et al., 2011), na indústria
farmacêutica, como antifúngico e antisséptico (HAMMER et al., 2004) e na indústria de
processamento de minerais como agentes de flotação (BASAROVÁ, 2005).
O limonemo é vastamente encontrado nas plantas cítricas, apesar de já ser decrito
em mais de 300 plantas. Essa molécula é utilizada como solvente para resinas, síntese de
outros compostos químicos, aplicações em borracha, tintas, agente dispersante para óleo, além
da utilização na síntese química do mentol (MARÓSTICA JUNIOR e PASTORE, 2007). É
também considerado como percursor de terpineol (YUASA, 2006).
SILVA et al. (2010) trabalharam com a composição de M. linariifolia , planta cultivada
também no estado de Minas Gerais, na cidade de Viçosa (550 km de distãncia da coleta
realizada neste trabalho), na qual encontraram uma alta concentração de methyleugenol e
traços de E-methylisoeugenol. O limoneme foi o único composto comum nas duas
32
cromatografias, mas na análise realizada na cidade de Viçosa a quantidade foi quatro vezes
menor do que a encontrada na espécie Melaleuca sp., em Pouso Alegre.
Dados relacionados à CIM e à CBM foram igualmente obtidos por COX et al.
(2000) quando trabalharam com a árvore do chá para controlar Escherichia coli (AG 100) e S.
aureus (NCTC 8325). A CIM obtida por esses autores para o isolado de S.aureus (ATCC®
25923), patógeno oral, foi de 0,1% e a CBM 0,4%. Outros trabalhos mostraram que óleos
ricos em monoterpenos e sesquiterpenos possuem características bactericidas e
bacteriostáticas (MAYAUD et al., 2008 e HAMMER et al., 2011) O óleo da Melaleuca sp.
controlou as cepas bacterianas de maneira eficaz e numa concentração muito baixa,
demostrando ser um bom agente antimicrobiano in vitro.
É possivel que nem sempre os isolados de S. aureus sejam inibidos em doses tão
baixas do óleo de Melaleuca sp., pois resultados de suscetibilidades observados em 20
amostras clínicas de MRSA obtidas de pacientes da Coreia do Sul mostraram CIM e CBM
bem acima das observadas neste estudo (PARK et al., 2007). Nessa mesma linha de trabalho,
foi avaliado a CIM de 13 óleos essenciais em relação a 65 estirpes bacterianas, dentre elas S.
aureus, as quais existiam duas estirpes susceptiveis à metaciclina e cinco suscetiveis à
meticilina (MAYAUD et al., 2008). Os autores classificaram os óleos com base nas atividades
antimicrobianas, em relação ao gênero Staphylococcus. O óleo da planta Melaleuca
alternifolia foi incluído no grupo em que ocorreu atividade bactericida em concentrações
superiores a 2% e após 24 horas (MAYAUD et al., 2008). Mostraram também que outros
tipos de óleos essenciais apresentaram ação bactericida superior, em que a ação ocorreu em
concentrações menores ou iguais a 2% e com um tempo de ação que não ultrapassou 30
minutos (MAYAUD et al., 2008).
A partir dos anos 90, os estudos com plantas do gênero Melaleuca foram
direcionados à obtenção de resultados que mostrassem ação bactericida sobre microrganismos
que adquiriram resistência a antibióticos, principalmente aos S. aureus resistentes à meticilina
(CARSON et al., 2006). A busca por princípios ativos com capacidade de substituir os
antibióticos usuais, aos quais muitas cepas de microrganismos já apresentam resistência, tem
sido uma das prioridades no cenário mundial.
O baixo crescimento de propágulos da bactéria S. aureus no tratamento controle
entre a primeira e a segunda leitura mostrou que as feridas dos ratos não estavam infectadas, e
sim colonizadas e contaminadas, segundo os conceitos de SCHULTS et al. (2003). Ele e seus
colaboradores descreveram que feridas colonizadas são aquelas em que se encontram
microrganismos, mas esses não estão se multiplicando; já o conceito de feridas contaminadas
foi descrito como aquela situação em que se encontram os microrganismos com ativa
33
multiplicação. Essa observação pode ser justificada pelo fato de que nem todas as bactérias
inoculadas conseguiram ser ativadas, ou seja, parte delas não cresceu. Por último, o conceito
de ferida infectada foi proposto por eles como sendo aquela situação em se encontram os
microrganismos colonizando inclusive os tecidos saudáveis adjacentes ao local da ferida, fato
não observado neste trabalho.
O trabalho de RODRIGUES e SILVA (2012) mostrou que a limpeza da ferida por
meio de uma solução líquida é importante no tratamento, pois ajuda na prevenção da infecção
e ajuda na remoção de material solto, agentes patogênicos, corpos estranhos, tecido necrosado
e no excesso de exsudado que podem contribuir para o desenvolvimento da infecção. Essa
observação foi confirmada por RESENDE et al. (2012) que realizou a limpeza de feridas com
água de torneira. Os resultados desse experimento mostraram que a simples limpeza com a
água de torneira influencia na colonização microbiana das feridas realizadas em pele de ratos,
assim como acontece com a limpeza de feridas quando se utiliza solução salina a 0,9%.
MARTINS e MENEGHIN (2012) fizeram uma avaliação de três técnicas de
limpeza do sítio cirúrgico infectado, utilizando soro fisiológico como fluido de irrigação, em
pacientes com feridas infectadas e internados no Hospital Universitário de Londrina. O
trabalho mostrou redução do número de bactérias, em todas as técnicas, destacando como a
mais eficiente a irrigação do soro fisiológico sobre a ferida com seringa de 20 mL e agulha
25x8 (21 Gauges – pressão de 12,5 psi) em primeiro lugar, seringa 20 mL e agulhas 40x12
(18 Gauges- pressão de 9,5 psi) em segundo lugar e remoção mecânica com pinças e gases em
último lugar.
Não foi o foco desta pesquisa, mas vale mencionar a eficiência da técnica de
irrigação-aspiração como uma técnica fidedigna de quantificação de microrganismos em
feridas em ratos. Poucos trabalhos foram dedicados a mencionar essa técnica no Brasil, a
exceção de FERREIRA et al. (2004), que fizeram um trabalho em que relataram a diferença
entre a quantificação de microrganismos por essa técnica e a compararam com a
quantificação de microrganismos pela técnica mais popular, a do “Swab”. Esses autores
observaram uma diferença significativa quanto ao número de bactérias, quando comparado o
material coletado mediante irrigação-aspiração e a técnica do “Swab”. Entre os resultados
observados neste trabalho, destacou-se que das 46 colônias que cresceram em ambas as
técnicas, 36 (78,3%) delas apresentaram maior número de UFC/mL pela técnica de irrigação-
aspiração quando comparadas com 8 (17,4%) colônias identificadas pela técnica de “swab”,
sendo que apenas 2 (4,3%) colônias apresentaram o mesmo número de UFC/mL em ambas
técnicas. No entanto, somente para a bactéria Pseudomonas aeruginosa, capturada pela
34
técnica de irrigação-aspiração, houve diferença estatisticamente significante (p < 0,05) no
número de UFC.
A tetraciclina foi o melhor dos tratamentos para eliminação de S. aureus,
resultado já esperado, pois esse antibiótico possui características e resultados
comprovadamente positivos de ação sobre esse microrganismo. Apesar de haver a redução
dos microrganismos devido à lavagem das feridas, a ação antimicrobiana do antibiótico ficou
evidenciada ao mostrar-se a redução e a eliminação no número de S. aureus durante todo
experimento. Nesse caso, o tratamento com antibiótico foi eficiente na descolonização e na
descontaminação da ferida. Para BOWLER et al. (2001), quanto antes realizar a eliminação
dos microrganismos, mais importante será o produto em termos de eficiência para se evitar
um processo infeccioso. Apesar da tetraciclina ser recomendada como um antibiótico de uso
sistêmico (DE OLIVEIRA e DE PAULA, 2012), neste trabalho, o uso tópico apresentou um
bom resultado contra a cepa de S. aureus isolada da lesão de joelho e inoculada nas lesões dos
ratos.
Os princípios gerais do tratamento de feridas referem que a infecção pode
influenciar negativamente a cura de duas maneiras distintas: ação no local da lesão ou de
maneira sistêmica. Evidências sugerem que a presença de bactérias na ferida interfere em
várias etapas do processo de cicatrização. A infecção prolonga a fase inflamatória e interfere
na epitelização, contração e deposição de colágeno. As endotoxinas e metaloproteases
bacterianas alteram a resposta inflamatória na ferida e liberam colagenases que contribuem
para o turnover de colágeno e destruição tecidual (PAGGIARO et al., 2010) retardando assim
o processo de cicatrização.
Neste trabalho não foi percebida uma descolonização das feridas dos ratos por
nenhum dos óleos testados, fato observado por outros autores quando trabalharam com o óleo
da M. alternifolia in vivo. EDMONDSON et al. (2011) testaram o óleo derivado de M.
alternifolia na descolonização de MRSA em feridas não controladas, abertas. Como resultado
primário, esses autores também não obtiveram o êxito na descolonização de feridas agudas,
crônicas e de etiologias mistas que estavam colonizadas por MRSA- positivo. No entanto, o
trabalho relatou que existe uma inibição das bactérias e uma contribuição do óleo na redução
do tamanho das feridas. O óleo também foi apontado por DRYDEN et al. (2004) e CAELLI
et al. (2000) como um medicamento utilizado para a descolonização de S. aureus, apesar de
não serem estatisticamente significativos, quando comparados a outras terapias. Em se
tratando ainda de descolonização, os tratamentos tópicos são amplamente empregados e
avaliados, destacando-se como os principais agentes antimicrobianos testados para tal função:
mupirocina, clorohexidina, dicloridrato octenidine, povidine-iodine, óleo tea tree, prontoderm
35
e polisporin (BATRA et al., 2010, SIMOR et al., 2007, HACEK et al., 2008. BODE et al.,
2010, MODY et al., 2003).
A partir do 8º dia de leitura do experimento, o óleo da Melaleuca alternifolia foi
mais eficiente que o óleo da Melaleuca sp., apesar de não haver diferenças estatísticas. No
entanto, a partir dessa leitura também houve uma redução dos microrganismos no tratamento
controle, fato esse que sugere que a aparente ação do óleo da M. alternifolia pode estar
relacionada com a limpeza das feridas por meio da lavagem por aspersão do que pela ação do
óleo da planta.
O óleo de Melaleuca sp. possui uma ação importante nos primeiros dias de
tratamento (até o 5º dia) e depois passou a apresentar resultados menos expressivos no
decorrer de toda a pesquisa. Isso pode ter acontecido por uma série de fatores, que devem ser
melhor estudados, como a via de administração inadequada (tratamento tópico), baixa
concentração do princípio ativo (foi utilizado o óleo da Melaleuca sp. a 1% baseado nos
resultados dos testes “in vitro” CIM = 0,2% e CBM = 0,4%) ou ainda atribuído ao baixo
número de aplicações diárias (1 vez ao dia). Ainda assim, o trabalho mostrou que existe um
resultado positivo desse fitoterápico em relação ao controle e que sua ação é muito similar ao
tratamento realizado com o óleo da Melaleuca alternifolia, que já é um óleo bastante estudado
e comercializado em todo o mundo.
Outros estudos devem ser realizados com o óleo de Melaleuca sp., objetivando,
principalmente, relacionar o teor de 1,8 cineol ou eucaliptol com a atividade antimicrobiana,
assim como determinar a concentração ideal, a melhor via de administração e o número de
aplicações diárias.
A utilização de várias diluições mostrou ser desnecessária para avaliação desse
tipo de experimento, pois os resultados foram obtidos até a diluição de 10-3, enquanto que as
demais não apresentaram crescimento de S. aureus (Tabelas 5, 6, 7, 8, 9 e 10). As diluições
em que se percebem os resultados mais significantes são as de 10-1 e 10-2. Os resultados
avaliados na diluição 10-1 mostraram que a Melaleuca sp. obteve um melhor resultado em
relação à M. alternifolia. Por outro lado, esse resultado não foi confirmado nas demais
diluições 10-2 e 10-3. Neste trabalho a leitura dos resultados foi descrita e tomaram com base a
diluição de 10-1, mas se faz necessária uma melhor discussão sobre qual das diluições pode
ser a melhor indicada para avaliação de resultados ao se empregar a metodologia de irrigação
e de aspiração.
36
6 - CONCLUSÕES
O óleo da planta Melaleuca sp. cultivada no Brasil, mais precisamente na cidade
de Pouso Alegre – MG, mostrou um bom potencial bactericida in vitro, mas quando foi
avaliada in vivo a sua capacidade antibacteriana foi diminuída. Ainda assim, o seu
comportamento antibacteriano é igual ao do óleo de M. alternifolia.
Para as cepas testadas neste experimento não se recomenda o tratamento com os
óleos fitoterápicos estudados, e sim com tetraciclina.
37
7 - IMPACTO SOCIAL
O óleo da Melaleuca sp. mostrou ser eficiente contra algumas cepas de
Staphylococcus aureus, nas condições in vitro e in vivo, tendo seus resultados semelhantes aos
descritos e observados com o óleo da Melaleuca alternifolia. A contribuição do presente
trabalho está na identificação de uma planta ainda pouco estudada e bem adaptada ao
ambiente na região do sul de Minas Gerais, a qual poderá ser futuramente utilizada como um
fitoterápico no controle de bactérias do gênero S. aureus. Desta forma, contribuirá para um
tratamento mais barato e com eficiência similar ao óleo de Melaleuca alternifolia. Essa planta
é amplamente comercializada em todo mundo, na forma de produtos como shampoos, cremes,
sabonetes, enxaguantes bucais, esmaltes, géis de limpeza, desinfetantes, fungicidas e
bactericidas para a agricultura. Acredita-se que esses produtos também possam ser
desenvolvidos no Brasil com o óleo da Melaleuca sp. Outra forma de impacto social indireto
na região é na agricultura, por meio do cultivo da planta, bem como o uso na indústria, por
meio da produção de um óleo de boa atividade antimicrobiana no Brasil.
38
8 - REFERÊNCIAS
Almeida GCM, dos Santos MM, Lima NGM, Cidral TA, Melo MCN, Lima KC. Prevalence and factors associated with wound colonization by Staphylococcus spp. and Staphylococcus aureus in hospitalized patients in inland northeastern Brazil: a cross-sectional study. BMC Infect Dis 2014 Jun;14:328. doi: 10.1186/1471-2334-14-328 Alves LF. Produção de Fitoterápicos no Brasil: História, Problemas e Perspectivas. Revista Virtual de Química 2013 Jul; 5(3): 450-513.
Amri I, Mancini E, De Martino L, Marandino A, Lamia H, Molshen H, Bossen Y, Scognanidio M, Reveichan E, De Feo V. Chemical composition and biological activities of the essential oil, from tree Melaleuca species grown in Tunisia. Int J Mol Sci 2012 Dec; 13(12): 16580-91. Aburjai T, Natsheh FM. Planted used in cosmetics. Phytother Res. 2003 Nov; 17(9):987-1000. PMID: 14595575.
Atzingen DANCV, Gragnani A, Veiga DF, Abla LEF, Cardoso LLF, Mendonça ARA, Ferreira LM. Unripe Musa sapientum peel in the healing of surgical wounds in rats. Acta Cir Bras 2013 Jan; 28(1): 33-38. Basařová P, Bartovská L, Kořínek K, Horn D. The influence of flotation agent concentration on the wettability and flotability of polystyrene. J. Colloid Interface Sci 2005 Jun; 286(1): 333-8. Batra R, Cooper BS, Whiteley C, Patel AK, Wyncoll D, Edgeworth JD. Efficacy and limitation of a chlorhexidine-base decolonization strateg in preventing transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an intensive care unit. Clin Infect Dis 2010 Jan; 50(2): 210-7. Bhattaram VA, Graefe U, Kohlert C, Veit M, Derendorf H. Pharmacokinetics and bioavailability of herbal medicinal products. Phytomedicine 2002; 9 Suppl 3:1-33.
Bicas JL, Neri-Numa IA, Ruiz ALTG, De Carvalho, JE, Pastore GM. Evaluation of the antioxidant and antiproliferative potential of bioflavors. Food Chem, Toxicol 2011; 49: 1610-15. Bode LG, Kluytmans JA, Wertheim HF, Bogaers D, Vandenbroucke-Grauls CM, Roosendaal R Troelstra A, Box AT, Voss A, Vandertweel I, Van Belkum A, Verbenan HA, Vos MC. Preventing surgical-site infections in nasal carriers of Staphylococcus aureus. N Engl J Med 2010 Jan; 362(1):9-17. Borges EL, Saar SRC, Magalhães MBB, Gomes FSL, Lima VLAN. Feridas: como tratar. 2 ed. Belo Horizonte (MG): Coopemed. 2008; 130 p. Boucher HW, Corey GR. Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococccus aureus. Clin. Infect Dis 2008 Jun; 46 Suppl 5: 344-9.
39
Bowler PG, Duerden BI, Armstrong DG. Wound microbiology and associated approaches to wound management. Clin Microbiol Rev 2001 Apr;14(2): 244-69. Brinkman WJ, Xuan VT. Melaleuca leucadendron, a useful and versatile tree for acid sulphate soils and some other poor environments. Int Tree Crops J 1991 6(4): 261-74. Brooks GF, Carrol KC, Butel J S, Morse SA. Jawetz, Melnick e Adelberg: Microbiologia Médica. 24 ed. Rio de Janeiro: McGraw Hill, 2009, p224-32. Brunton LL, Parker KL, Blumenthal DK, Buxton ILO. Goodman & Gilman: Manual de farmacologia e terapêutica. McGraw Hill Brasil. 2010 Caelli M, Porteous J, Carson CF, Heller R, Riley TV. Tea tree oil as an alternative topical decolonization agente for methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Hosp Infect. 2000 Nov; 46(3): 236-7. Carson CF, Cookson BD, Farrelly HD, Riley TV. Susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Antimicrob Chemother. 1995 Mar(3); 35: 421-4. Carson CF, Hammer KA, Riley TV. In-vitro activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia against Streptococcus spp. J Antimicrob Chemother 1996 Jan; 37(6):1177-8. Carson CF, Hammer KA, Riley TV. Melaleuca alternifólia (tea tree) oil: a review of antimicrobial and other medicinal properties. Clin Microbiol Rev. 2006 Jan; 19(1): 50-62.
Cox SD, Mann CM, Markham JL, Bell HC, Gustafson JE, Warmington JR, Wyllie SG. The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). J Appl Microbiol 2000 Jan; 88(1): 170-5. Cruvinel AR, Silveira AR, Soares JS. Perfil antimicrobiano de Staphylococcus aureus isolado de pacientes hospitalizados em UTI no Distrito Federal. Cenarium Pharmacêutico 2011 mai-nov; 4:4. De Oliveira AC, De Paula AO. Descolonização de portadores de Staphylococcus aureus: indicações, vantagens e limitações. Texto Contexto Enferm, Florianópolis, 2012; 21(2): 448-57. Duarte DA, Sá ALB. Resistência e sensibilidade de cepas do Staphylococcus aureus a antibióticos ß-lactamicos isolados de unidades hospitalares: revisão bibliográfica sistemática metanalítica dos últimos dez anos. REAS 2011, acesso em: 21 nov 2014; 2: 108-21. Disponível em: www.acervosaude.com.br/artigo_010_60.html Dryden MS, Dailly S, Crouch M. A randomized, controlled trial of tea tree topical preparations versus a standard topical regimen for the clearance of MRSA colonization. J Hosp Infect 2004 Apr; 56(4): 283-6. Edmondson M, Newall N, Carville K, Smith J, Riley TV, Carson CF. Uncontrolled, open-label, pilot study of tea tree (Melaleuca alternifólia) oil solution in the descolonization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus positive wounds and its influence on wound healing. International Wound Journal 2011 Aug; 8 (4): 375-84.
40
Elston JWT, Barlow GD. Community- associated MRSA in the United Kingdom. J Infect 2009 Sep; 59(3): 149-55. Farag RS, Shalaby AS, El-Baroty GA, Ibrahim NA, Ali MA, Hassan EM. Chemical and biological evaluation of the essential oils of different Melaleuca species. Phytother Res 2004 Jan; 18(1):30-5. Ferreira AM, Santos I, Sampaio CEP. O cuidado de enfermagem nos procedimentos de coleta para análise microbiológica de feridas: aplicabilidade de duas técnicas. Arquivo de Ciências da Saúde 2004 Jul-Set; 11(3): 137-41. Hacek DM, Robb WJ, Paule SM, Kudrna JC, Stamos VP, Petterson LR. Staphylococcus aureus nasal decolonization in joint replacement surgery reduces infection. Cin Orthop Relat Res 2008 Jun; 466(6): 1349-55. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Antifungical effects of Melaleuca alternifolia (tea tree) of dermathophytes and others filamentous fungi. Jounal Antimicrobial Chemotherapy 2004 Jun; 53(6): 1081-5. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Effects of Melaleuca alternifólia (tea tree) essential oil and the major monoterpene componente terpinen-4 ol on the development of single-and multistep antibiotic resistance and antimicrobial susceptibility. Antimicrb Agents Chemother 2011; 56 (2): 909-15. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Susceptibility of transient and commensal skin flora to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Am J Infect Control 1996 Jun; 24:186-9. Juergens UR, Dethlefsen U, Steinkamp G, Gillissen A, Repges R, & Vetter H. Anti-inflammatory activity of 1.8-cineol (eucalyptol) in bronchial asthma: a double-blind placebo-controlled trial. Respiratory Medicine 2003 Mar; 97(3): 250-6. Kalra M, Khatak M, Khatak S. Conventional vs Botanical & Nutritional Therapy Int. J. Drug Dev. & Res. 2011 Jan-Mar; 3 (1): 314-27. Lang G, Buchbauer G. A review on recent research results (2008–2010) on essential oils as antimicrobials and antifungals. A review Flavour Fragr. J. 2012 Jan (1); 27: 13-39. Lavery LA, Fontaine JL, Bhavan K, Kim PJ, Williams JR, Hunt NA. Risk factors for methicillin-resistant Staphylococcus aureus in diabetic foot infections. Diabet Foot Ankle 2014 Apr 5: doi: 10.3402/dfa.v5.23575. Levinson W. (2010). Microbiologia Médica e Imunologia. Ed Artmed: Porto Alegre. 2010: 113-8. Liu XC, Ping Li Y, Qin Li H, Deng ZW, Zhou L, Long Liu Z, Shan Du S. Identification of repellent and insecticidal constituents of the essential Oil of Artemisia rupestris L. Aerial Parts against Liposcelis bostrychophila Badonnel. Molecules 2013; 18: 10733-46. Loughlin R, Gilmore BF, McCarron PA, Tunney MM. Comparasion of cidal activity of tea tree oil and terpineol-4-ol aganist clinical bacterial skin isolates and human fibroblast cells. Latters in Apllied Microbiology 2008 Apr (4); 46: 428-33.
41
Maróstica Júnior MR, Pastore GM. Biotransformação de limoneno: uma revisão das principais rotas metabólicas. Quím Nova 2007; 30 (2): 382-7. Martins, EAP, Meneghin P. Avaliação de três técnicas de limpeza do sítio cirúrgico infectado utilizando soro fisiológico. Ciência, Cuidado e Saúde 2012; 11(5): 204-10 Mayaud L, Carricajo A, Zihri A, Aubert G. Comparison of bacteriostatic and bactericidal activity of 13 essential oil against strains with varying sensitivity to antibiotics. Lett Appl Microbiol. 2008 Sept ; 47: 167-173. Mody L, Kauffman CA, McNeil SA, Galecki AT, Bradley SF. Mupirocin-based decolonization of Staphylococcus aureus carries in residentes of 2 long-term care facilities: a randomizd, doubleblind, placebo-controlled trial. Clin Infect Dis. 2003 Dec; 37(11):1467-74. Oliveira ACM, Fontana A, Negrini TC, Nogueira MNM, Bedran TBL, Andrade CR, Spolidoro LC, Spolidoro DMP. Emprego do óleo de Melaleuca alternifólia Cheel (Myrtaceae) na odontologia: perspectiva quanto à utilização como antimicrobiano alternativo às doenças infecciosas de origem bucal. Rev Bras Pl Med, Botucatu. 2011; 13(4): 492-9. Paggiaro AO, Neto NT, Ferreira MC. Princípios gerais do tratamento de feridas. Rev Med (São Paulo) 2010 Jul/Dez;89(3/4): 132-6. Palos MAP, Silva DVB, Gir E, Canini SRM da S, Anders PS, De Oliveira Leão LSN, Pimenta FC. Microbiota das mãos de mães e de profissionais de saúde de uma maternidade de Goiânia. Rev Eletr Enf [Internet]. 2009; 11(3): 573-8. Park H, Jang CH, Cho YB, Choi CH. Antibacterial effect of tea-tree oil on methicillin-resistant Staphylococcus aureus biofilm formation of the tympanostomy tube: an in vitro study. In vivo. 2007 Nov-Dec; 21(6):1027-30. Pereira, MC, Teixeira, MA. Estudo in vitro da ação do óleo de Melaleuca sp. e extrato bruto de Cinnamomum zeylanicum, cultivadas no Brasil, em relação à Staphylococcus SP [Trabalho de Conclusão de Curso] Universidade do Vale do Sapucaí. Pouso Alegre; 2012. Porazinska DL, Pratt PD, Glblin-Davis RM. Consequences of Melaleuca quinquenervia Invasion on Soil Nematodes in the Florida Everglades. J Nematol 2007 Dec; 39(4): 305-12. Pristo I. Cicatrização de Feridas: Fases e fatores de influência. Acta Veterinaria Brasilica. 2013; 6(4): 267-71. Probst IS. Atividade antibacteriana de óleos essenciais e avaliação de potencial sinérgico [Dissertação]. Mestrado em Biomoléculas – Estrutura e função – Instituto de Biociências de Botucatu: Universidade Estadual Paulista, Botucatu 2012. Quintão FJO. Caracterização dos óleos essenciais de Microlicia graveolens, Melaleuca leucadendron e de extratos hidroalcoólicos das folhas e caules de Vellozia Squamata para o desenvolvimento de nanoemulsões para uso farmacêutico [Dissertação]. Mestrado em Biotecnologia: Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2013.
42
Resende M, Hochman B, Gragnani A, Veiga DF, Damansceno C, Juliano Y, Ferreira LM. Tap water has no influence on microbial colonization of skin wounds in rats. Wounds 2012 Sep;24(9):275-82. Rodeheaver GT (1997). Wound cleansing, woound irrigation, wound disinfection. In: Krasner D, Kane D. Chronic wound care: Clinical source book for healthcare professionals (2nd ed ., pp 369-87). Wane, PA: Health Management Publicatione Ine. Rodrigues C, Silva D. Limpeza de feridas: técnicas e soluções. Journal of Tissue Regeneration & Healing 2012, 25-31. Ruhe JJ, Menon A. Tetraciclines as na oral treatment option for patients with community onset skin and soft tissue infections caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51 (9): 3298-303. Schultz GS, Sibbald RG, Falanga V, Ayello EA, Dowsett C, Harding K, Romanelli M, Stacey NC, Teot L, Vanscheidt W. Wound bed preparation: a systematic approach to wound management. Wound Repair Regen. 2003 Mar; 11 Suppl 1: S1-S28. Siani A C, Sampaio ALF, De Souza M, Henriques MGMO, De Souza Ramos MD. Óleos essenciais: potencial antiinflamatório. Biotecnologia Ciência e desenvolvimento, Rio de Janeiro, ano 3: 16, 38-43, 2000. Sigel JD, Rhinehart E, Jackson M, Chiarello L. Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee. Management of multidrug- resistant organisms in healthcare setting, 2006. Am J Infect Control 2007 Dec; 35 (10 Suppl 2): 165-93. Silva CJ, Barbosa LCA, Demuner AJ, Montanari RM, Pinheiro AL, Dias I, Andrade NJ. Chemical composition and antibacterial activities from the essential oils of myrtaceae species planted in Brazil. Quím Nova 2010; 33(1):104-8. Simor AE, Phillips E, McGeer A, Konvalinka A, Loeb M, Devlin HR, Kiss A. Randomized controlled trial of chlorhexidine gluconate for washing, intranasal mupirocin, and rifampin and doxycycline versus no treatment for the eradication of methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization. Clin Infect Dis 2007 Dec; 44(2): 178-85. Tazima MFGS, Vicente YAMVA, Moriya T. Biologia da ferida e cicatrização. Medicina, Ribeirão Preto, 2008; 41 (3): 259-64. Tenover FC. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Infect Control. 2006 Jun; 34(5 Suppl 1):S3-10; discussion S64-73. Tyrrel MH. Evolution of natural flavor development with the assistance of modern technologies. Fd Tech 1990 Jan; 68-72. Vitti MAS, Brito JO. Óleo essencial de eucalipto. Documentos florestais, n° 17, 2003. Walker ES, Vasquez JE, Dula R, Bullock H, Sarubbi FA. Mupirocin-resistant, methicillin-resistant Staphylococcus aureus: does mupirocin remain effective? Infect Control Hosp Epidemiol 2003 May; 24(5): 342-6.
43
Young-Cheol Y, Han-Young C, Won-Sil C, Clark JM, Young-Joon AJ. Ovicidal and adulticidal activity of Eucalyptus globulus leaf oil terpenoids against Pediculus humanus capitis (Anoplura: Pediculidae) Agric Food Chem 2004 May, 52(9), 2507-11. Yuasa Y & Yuasa Y. A practical synthesis of d-α-terpineol via markovnikov addition of d-limonene using trifluoroacetic acid. Organic process research & development. 2006; 10(6), 1231-2. Yunes RA, Pedrosa R C, Cechinel Filho V. Fármacos e fitoterápicos: a necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Química Nova. 2001; 24(1): 147-52. Zalavras CG, Christensen T, Rigopoulos N, Holtom P, Patzakis MJ. Infection following operative treatment of ankle fractures. Clin Orthop Relat Res 2009 Jul; 467 (7): 1715-20.
44
9 - NORMAS ADOTADAS
C.O.B.E.A. (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) – Princípios éticos da
experimentação animal. Disponível no endereço eletrônico:
http://www.meusite.com.br/cobea/index.htm.
Manual de procedimento para painéis de Gram-Positivos Desidratados-
MicroScan®– SIEMENS.2010; 31-32.
A Standards Association of Australian (1985), por meio da AS 2782, e
International Standards Organization (1996),
45
10 - APÊNDICES
Apêndice: Contagem de UFC nas diluições 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 em cada
grupo, no decorrer do tratamento.
FIGURA 12: contagem de UFC na diluição 10-1 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1, 5
, 8, 12 e 15 de tratamento.
FIGURA 13: contagem de UFC na diluição 10-2 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento.
46
FIGURA 14: contagem de UFC na diluição 10-3 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento.
FIGURA 15: contagem de UFC na diluição 10-4 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1, 5,
8, 12 e 15 de tratamento.
47
FIGURA 16: contagem de UFC na diluição 10-5 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1 5,
8, 12 e 15 de tratamento.
FIGURA 17: contagem de UFC na diluição 10-6 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento.
48
FIGURA 18: contagem de UFC na diluição 10-7 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento.
49
11 - ANEXOS
ANEXO I - Microscopia óptica – microorganismos do gênero Staphylococcus: cocos
Gram-positivos únicos, aos pares ou agrupados.
Fonte: http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xsa/xsa01.jpg
50
ANEXO II - Cultura de Staphylococcus aureus.
Fontes: http://medchrome.com/wp-content/uploads/2010/05/s.aureus-agar.jpg
http://medchrome.com/wp-content/uploads/2010/05/s.aureus-agar.jpg
51
ANEXO III : Padrão de sensibilidade e resistência aos antibióticos de bactéria isolada de
lesão de pé pelo aparelho MicroScan® auto SCAN-4 System da SIEMENS.
ANTIBIOGRAMA AUTOMATIZADO Amostra: Lesão Pé
52
ANEXO IV: Padrão de sensibilidade e resistência aos antibióticos de bactéria isolada de
lesão de joelho pelo aparelho MicroScan® auto SCAN-4 System da SIEMENS
ANTIBIOGRAMA AUTOMATIZADO Amostra: Lesão Joelho
53
ANEXO V - Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVÁS
54
ANEXO VI – Informativo sobre o filme de cobertura da ferida
INSTRUÇÕES DE USO
OpSite* FLEXIGRID*
Curativo de Filme Transparente
DESCRIÇÃO
OPSITE* FLEXIGRID* é um curativo formado por uma película fina e transparente de poliuretano,
coberta com adesivo acrílico. Esta película é sustentada por um filme plástico que proporciona um
sistema de aplicação simples, e possui PDMS (Polidimetilsiloxano), mais comumente conhecido como
silicone, que melhora as propriedades de anticisalhamento do filme, evitando assim o atrito entre o
filme e quaisquer coberturas.
MODO DE AÇÃO E INDICAÇÃO
Quando aplicado sobre lesões, o curativo OPSITE* cria um meio úmido através da retenção do
exsudato. A película é permeável a vapores úmidos, permitindo assim a evaporação do excesso de
exsudato e prevenindo a maceração da pele. OPSITE* FLEXIGRID é impermeável a água e bactérias,
prevenindo a contaminação externa. A película é altamente flexível e confortável, sendo portanto
facilmente adaptável a áreas de contorno do corpo. O filme plástico de suporte, por ser quadriculado,
pode ser utilizado para mapear a evolução do processo de cicatrização.
INSTRUÇÕES DE USO
1. Limpe, seque e desengordure a área de aplicação.
2. Remova o papel protetor do adesivo.
3. Aplique o curativo, pressionando-o para fixá-lo.
4. Se necessário, desenhe o contorno da lesão no quadriculado verde do filme plástico de suporte antes
de removê-lo.
5. Remova o suporte plástico, ao mesmo tempo que fixa a película pressionando-a sobre a pele.
6. Para remover o curativo, descole delicadamente uma das pontas da película e estique-a no sentido
paralelo à pele. O curativo pode permanecer aplicado à pele por até 14 dias, dependendo do caso que
pode requerer acompanhamento de profissional de saúde.
PRECAUÇÕES DURANTE O USO
OPSITE* FLEXIGRID* pode ser utilizado em lesões infectadas se as seguintes precauções forem
seguidas:
• O paciente deverá estar sob supervisão médica/clínica.
• O curativo deverá ser trocado diariamente.
• O paciente deverá estar recebendo medicação sistêmica adequada.
55
Pacientes imunodeprimidos e diabéticos podem requerer cuidados especiais. Nestes casos deve-se
tomar o cuidado de evitar qualquer tipo de dano à pele através de repetidas aplicações, o mesmo se
aplicando a pacientes com pele muito fina e frágil.
56
ANEXO VII – Meios de cultivo de microrganismos
ÁGAR SAL MANITOL : é um meio de cultura muito utilizado para o isolamento de
Staphyloccocus aureus de amostras biológicas como urinas, secreções, feridas e exudatos.
Contém peptona de caseína, peptona de carne, extrato de carne, D-manitol, cloreto de sódio,
vermelho de fenol e ágar. A degradação do manitol com a produção de ácido muda a cor do
meio de rosado a amarelo. Devido ao seu alto conteúdo de cloreto de sódio pode-se fazer uma
inoculação maciça da amostra em estudo. Geralmente se incubadas as placas por mais ou
menos 36 horas, aparecem as colônias de estafilococos não-patogênicos de tamanho pequeno
e rodeadas de uma zona vermelha. As colônias de Staphylococcus aureus fermentadores do
manitol são maiores e rodeadas de uma zona amarela.
O meio se apresenta vermelho rosado.
CALDO DE TIOGLICOLATO : é um meio altamente nutritivo e versátil, utilizado para a
cultura de microrganismos anaeróbios, microaerófilos e aeróbicos em materiais oriundos de
sítios estéreis. A presença de tioglicolato (agente redutor) e cistina aumentam a recuperação
de anaeróbios Contém peptona de caseína, extrato de levedura, glicose, cloreto de sódio, L-
cistina, Tioglicolato sódico e ágar.
A turvação do meio indica crescimento de microorganismos.
Referências:
MBiolog Diagnósticos Ltda (www.mbiolog.com.br)
mbiolog.com.br/produtos/Agar_Sal_Manitol.pdf
mbiolog.com.br/produtos/Caldo_Tioglicolato.pdf