MARIANA DE LIMA SANTOS
PROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENES
ANÁLOGOS DE RESISTÊNCIA (RGAS) EM Elaeis spp. E
AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA DE Setaria viridis A
ESTRESSE SALINO E DE FRIO
LAVRAS - MG
2017
MARIANA DE LIMA SANTOS
PROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENES ANÁLOGOS DE RESISTÊNCIA
(RGAs) EM Elaeis spp. E AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA DE Setaria viridis A
ESTRESSE SALINO E DE FRIO
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia Vegetal, área de concentração
em Biotecnologia Vegetal, para a obtenção do
título de Mestre.
Dr. Manoel Teixeira Souza Junior
Orientador
Dr. Alexandre Alonso Alves
Coorientador
LAVRAS - MG
2017
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca
Universitária da UFLA, com dados informados pelo(a) próprio(a) autor(a).
Santos, Mariana de Lima.
Prospecção e caracterização de genes análogos de resistência
(RGAS) em Elaeis spp. e avaliação da tolerância deSetaria viridis a
estresse salino ede frio / Mariana de Lima Santos. - 2017.
115 p.
Orientador(a): Manoel Teixeira Souza Júnior.
Coorientador(a): Alexandre Alonso Alves.
Dissertação (mestrado acadêmico) - Universidade Federal de
Lavras, 2017.
Bibliografia.
1. Estresse biótico e abiótico. 2. Palma de óleo. 3. Planta modelo.
I. Souza Júnior, Manoel Teixeira. II. Alves, Alexandre Alonso. III.
Título.
MARIANA DE LIMA SANTOS
PROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENES ANÁLOGOS DE RESISTÊNCIA
(RGAs) EM Elaeis spp. E AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA DE Setaria viridis A
ESTRESSE SALINO E DE FRIO
PROSPECTION AND CHARACTERIZATION OF DISEASE RESISTANCE GENE
ANALOGS (RGAs) IN Elaeis spp. AND EVALUATION OF Setaria viridis
TOLERANCE TO SALT AND COLD STRESS
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia Vegetal, área de concentração
em Biotecnologia Vegetal, para a obtenção do
título de Mestre.
APROVADA em 24 de abril de 2017.
Dr. Manoel Teixeira Souza Júnior EMBRAPA - Agroenergia
Dr. Carlos Antônio Ferreira de Sousa EMBRAPA - Agroenergia
Dr. Robert Neil Gerard Miller UNB
Dr. Manoel Teixeira Souza Junior
Orientador
Dr. Alexandre Alonso Alves
Coorientador
LAVRAS - MG
2017
Aos verdadeiros amigos que encontrei e que deixaram mais leve e alegre essa jornada,
Ofereço!
Aos meus avós, Maria Lindaura e Euclides (in memorian), pelo exemplo de vida,
Dedico!
AGRADECIMENTOS
A toda a minha família, em especial ao meu pai Almir, minha mãe Cleunice, minha avó
Lindaura e ao meu irmão João, que mesmo à distância sempre me incentivavam a continuar
diante da saudade e da solidão que enfrentamos ao ficar longe de casa.
Ao meu “ noivorido”, Antonio Carlos, por ter me encorajado a sair de casa e buscar
novas conquistas. Pelo amor, carinho e companheirismo. Obrigada por ser essa pessoa que me
faz compreender, todos os dias, que a vida deve ser um eterno autoconhecimento para se viver
feliz.
Ao meu amigo Calil, que foi mais que um colega de laboratório, não medindo esforços
para me ajudar. Amigo de coração, que levarei sempre comigo, repleto de lembranças risonhas
e felizes.
A minha amiga Joice, por ter partilhado comigo um lar “pós-graduando” me ensinando
que a vida pede de nós um pouco mais de desaforo e coragem. Pessoa mais engraçada e
desaforada jamais conheci!
Aos meus “coleguinhas” Elias e Vivianny por estarem comigo no momento em que mais
precisei. Casal que desejo toda felicidade e prosperidade na “ ciência e no amor!”
A Karol, Ana Paula, Valquíria, Nelson, Letícia, Felipe, Rosana, André, Laíse, Júlio,
Michelle, Fernando, Dr. Eduardo e ao Dr. Alexandre, por estarem sempre à disposição, seja
neste ou em outros trabalhos que me fizeram chegar até aqui.
Ao meu orientador, Dr. Manoel Teixeira, pela orientação, confiança e “puxões de
orelha” que muito contribuíram para minha formação.
Ao Dr. Robert, pela ajuda e orientação em todos os momentos em que precisei.
Ao Dr. Gabriel, que com sua didática incrível, me fez conhecer a bioinformática e o
quão fascinante ele pode ser.
Ao Dr. Carlos pela generosidade e humildade com que sempre me tratou, me fazendo
seguir mesmo diante dos erros e dificuldades.
À Universidade Federal de Lavras e ao programa de Biotecnologia Vegetal, pela
oportunidade de realização do mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa
de estudo concedida.
Muito obrigada!
“Vivendo e aprendendo a jogar
Vivendo e aprendendo a jogar
Nem sempre ganhando
Nem sempre perdendo
Mas, aprendendo a jogar! ”
Guilherme Arantes
RESUMO
Os objetivos deste trabalho foram determinar se a Setaria viridis (acesso A10.1) é uma planta
tolerante ou sensível aos estresses de salinidade e às baixas temperaturas do ar, buscando
subsidiar estudos relativos à utilização dessa espécie como planta-modelo para validar genes de
tolerância a estes estresses; além disso, realizar uma abordagem baseada em homologia para
identificação e caracterização de RGAS da família NBS-LRR nos genomas de Elaeis spp. Para
o estresse salino em Setaria viridis foram realizados dois ensaios: de germinação em meio de
cultura com 0, 30, 60, 90, 120, 150 mM de NaCl, mantendo as plântulas resultantes neste
mesmo meio; e no 2º estádio de desenvolvimento em substrato com 0, 2, 4, 6, 8 e 10 g/dm³ de
NaCl. Para o estresse de frio, plantas no 3º e 5º estádio de desenvolvimento foram submetidas
a 10ºC durante seis dias, posteriormente retornando à 25ºC. Observou-se que a germinação foi
pouco afetada pelo aumento da salinidade, enquanto que área foliar das plântulas e variáveis
morfológicas das raízes foram significativamente afetadas. No 2º estádio de desenvolvimento
houve redução no tamanho das plantas em função do aumento da salinidade, sendo que em 8 e
10 g/dm³, todas as plantas morreram. Apenas as plantas submetidas a 6 g/dm³ de NaCl sofreram
redução na taxa de assimilação líquida de CO2 (A) e no índice de concentração de clorofila
(ICC). Em todos os tratamentos houve redução nas taxas de condutância estomática (gs) e
transpiração (E). A concentração interna de CO2 (Ci) apresentou valores mais altos nas plantas-
controle e menores nas plantas submetidas às menores quantidades de NaCl. Para o estresse de
frio, as plantas sofreram redução em A, gs e E em ambos os estádios de desenvolvimento; com
exceção da Ci, que praticamente dobrou. A massa da parte aérea obtida ao final do ciclo não
diferiu entre os tratamentos e estádios, entretanto a produção de sementes no 5º estádio foi
negativamente afetada pelo frio. Para a identificação e caracterização de RGA NBS-LRR em
Elaeis spp. foram utilizadas sequências RGA NBS-LRR identificadas no genoma de Elaeis
guineensis por meio de um perfil HMM aminiacídico e sequências RGA NBS-LRR
identificadas no Draft de Elaeis. oleifera por meio de um perfil HMM nucleotídico.
Adicionalmente, realizou-se a busca das Janelas Abertas de Leituras (ORF) para as sequências
de E.oleifera pelo programa ORFFinder e identificação dos motivos dentro das ORFs por meio
do programa InterPro. Posteriormente construiu-se uma árvore filogenética a fim de classificar
as sequências RGAs NBS- LRR dentro de Elaeis spp. O perfil HMM nucleotídeo identificou
45 scaffolds dentro do genoma de E. oleifera dos quais 36 ORFs apresentaram domínios
estruturais dentro da família NBS-LRR com homólogos em Elaies guineensis, Phoenix
dactylifera, Glycine max e Arabidopsis thaliana. A análise filogenética permitiu a classificação
das sequências de Elaeis spp em sete grupos, sendo CNL, XNL, CN, N, C, TX e TN, além disso
a identificação de seis ortólogos em B distachyon
Palavras chave: Estresse biótico e abiótico. Palma de óleo. Planta modelo. Validação de
genes.
ABSTRACT
The objectives of this work were to determine if Setaria viridis (access A10.1) is a plant tolerant
or sensitive to salinity stresses and low air temperatures, seeking subsidize studies on the use
of this species as a model plant to validate tolerance genes to these stresses. In addition, to
perform a homology-based approach for identification and characterization of RGAS of the
NBS-LRR family in the genomes of Elaeis spp. For saline stress in Setaria viridis two
experiments were carried out: germination in culture medium with 0, 30, 60, 90, 120, 150 mM
NaCl, maintaining the resulting seedlings in the same medium; and in the 2nd stage of substrate
development with 0, 2, 4, 6, 8 and 10 g / dm³ of NaCl. For cold stress, plants in the 3rd and 5th
development stages were submitted to 10ºC for six days, then returning to 25ºC. It was
observed that the germination was little affected by the increase of salinity, while the foliar area
of the seedlings and the morphological variables of the roots were significantly affected. In the
2nd stage of development there was a reduction in the size of plants due to the increase of
salinity, and in 8 and 10 g/dm³, all the plants died. Only plants submitted to 6 g / dm³ of NaCl
had a reduction in the net CO2 assimilation rate (A) and the chlorophyll concentration index
(ICC). In all treatments, there was a reduction in the rates of stomatal conductance (gs) and
transpiration (E). The internal CO2 concentration (Ci) presented the higher values in the control
plants and the lower in the plants submitted to the lower amounts of NaCl. For cold stress, the
plants were reduced in A, gs and E in both development stages; With the exception of Ci, which
almost doubled. The aerial part mass obtained at the end of the cycle did not differ between the
treatments and stages, however the seed production in the 5th stage was negatively affected by
the cold. For the identification and characterization of RGA NBS-LRR in Elaeis spp. RBS NBS-
LRR sequences identified in the Elaeis guineensis genome were used by means of an aminidic
HMM profile and RBS NBS-LRR sequences identified in the Elaeis Draft. Olefin by means of
a nucleotide HMM profile. In addition, the search of the Open Reading Frame (ORF) for the
E.oleifera sequences by the ORFFinder program and identification of the reasons within the
ORFs through the InterPro program . Posteriorly, a phylogenetic tree was constructed in order
to classify the RGAs NBS-LRR sequences within Elaeis spp. The nucleotide HMM profile
identified 45 scaffolds within the E. oleifera genome of which 36 ORFs showed structural
domains within the NBS-LRR family with homologues in Elaeis guineensis, Phoenix
dactylifera, Glycine max and Arabidopsis thaliana. The phylogenetic analysis allowed the
classification of the Elaeis spp sequences into seven distinct groups, being CNL, XNL, CN, N,
C, TX and TN, besides the identification of six orthologs in B distachyon.
Keywords: Biotic and abiotic stress. Oil palm. Plant model. Gene validation
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 - Introdução Geral.................................................................. 12
1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 12
2 REFERENCIAL TEÓRICO........................................................................... 14
2.1 Biodiesel............................................................................................................ 14
2.2 Palma de óleo (Elaeis spp.).............................................................................. 16
2.3 Setaria viridis..................................................................................................... 20
2.4 Estresses abióticos............................................................................................ 22
2.4.1 Salinidade.......................................................................................................... 24
2.4.2 Frio.................................................................................................................... 26
2.5 Estresses bióticos.............................................................................................. 27
2.6 Genes R da família NBS-LRR e Genes Análogos de Resistência (RGA).... 32
2.7 Genômica e Fenômica: prospecção e validação de genes............................. 37
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 41
REFERÊNCIAS .............................................................................................. 42
CAPÍTULO 2 AVALIAÇÃO DE Setaria viridis (ACESSO A10.1) COMO
POTENCIAL PLANTA MODELO PARA A VALIDAÇÃO DE GENES DE
TOLERÂNCIA A ESTRESSES ABIÓTICOS............................................. 53
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 55
2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 57
2.1 Efeito do estresse salino sobre a germinação de sementes e desenvolvimento
inicial de plântulas de Setaria viridis.............................................................. 57
2.2 Efeito do estresse salino sobre plantas de Setaria viridis (acesso A10.1) no 2º
estádio de desenvolvimento............................................................................. 58
2.3 Efeito do estresse por frio sobre plantas jovens e adultas de Setaria viridis 60
2.4 Avaliação das plantas submetidas aos estresses salino e frio e análises
estatísticas dos dados....................................................................................... 61
3 RESULTADOS................................................................................................ 64
3.1 Efeito do estresse salino sobre a germinação de sementes, desenvolvimento
inicial de plântulas e 2º estádio de desenvolvimento da Setaria viridis (acesso
A10.1)............................................................................................................... 64
3.2 Efeito do estresse por frio sobre plantas jovens e adultas de Setaria viridis 71
4 DISCUSSÃO..................................................................................................... 77
4.1 Efeito do estresse salino sobre a germinação de sementes, desenvolvimento
inicial e 2º estádio de desenvolvimento da Setaria viridis (acesso A10.1)... 77
4.2 Efeito do estresse por frio em plantas jovens e adultas de Setaria viridis
(acesso A10.1)................................................................................................... 81
5 CONCLUSÃO................................................................................................. 84
REFERÊNCIAS.............................................................................................. 85
CAPÍTULO 3 ANÁLISE EM LARGA ESCALA DE GENES ANÁLOGOS
DE RESISTÊNCIA (RGAS) CODIFICADORES DE DOMÍNIOS NBS NO
GÊNERO Elaeis spp....................................................................................... 90
1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 92
2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 96
2.1 Identificação de RGAs NBS- LRR no genoma de Elaeis guineensis........... 96
2.2 Identificação de RGAs NBS-LRR no genoma de Elaeis oleifera................. 97
2.3 Análise filogenética.......................................................................................... 97
3 RESULTADOS................................................................................................. 99
3.1 NBS- LRR no genoma de Elaeis guineensis e Elaeis oleifera....................... 99
3.2 Análises filogenéticas para Elaeis spp............................................................ 104
4 DISCUSSÃO..................................................................................................... 107
5 CONCLUSÃO.................................................................................................. 110
REFERÊNCIAS............................................................................................... 111
12
CAPÍTULO 1 - Introdução Geral
1 INTRODUÇÃO
O Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB) foi instituído pelo governo
brasileiro em seis de dezembro de 2004, objetivando a inclusão deste biocombustível na matriz
energética brasileira, mediante a produção e o uso do mesmo de forma sustentável, com
inclusão social e geração de emprego e renda. Neste período de doze anos, desde a criação do
PNPB, a soja foi a principal fonte de matéria prima, sendo responsável, em média, por
aproximadamente 75% de toda a produção desde o início do Programa.
A forte dependência da soja para a produção de biodiesel levou a um desequilíbrio na
inclusão regional, e, consequentemente, na inclusão social, fazendo com que as regiões Norte
e Nordeste pouco contribuíssem para o PNPB. Este desequilíbrio levou o programa a eleger,
como uma de suas metas, a promoção da diversificação das fontes vegetais para a produção de
biodiesel. A palma de óleo vem se destacando dentre as espécies com potencial contribuição
para esta diversificação, devido principalmente à sua alta produtividade de óleo, que chega a
ser dez vezes maior que a da soja.
No Brasil, a Embrapa mantém a quase três décadas um programa de melhoramento da
palma de óleo, sendo executado pela Embrapa Amazônia Ocidental e pela Embrapa Amazônia
Oriental. Este programa objetiva tanto a produção de novos cultivares de Elaeis guineensis (a
Palma de óleo africana, ou dendê), como também de híbridos interespecíficos desta espécie
com a E. oleifera (a Palma de óleo americana, ou caiaué). Em decorrência da importância
potencial dada à Palma de óleo para a produção de biodiesel, e de outros biocombustíveis, a
Embrapa Agroenergia iniciou um programa de pesquisa e desenvolvimento em biotecnologia
de Elaeis spp. Esse programa foca no uso de ferramentas de biologia avançada (genômica,
fenômica, metabolômica, genética molecular, engenharia genética, etc.) para a geração de
conhecimento visando aumentar a eficiência deste programa de melhoramento na geração de
novos cultivares.
Neste contexto, a Embrapa Agroenergia desenvolve estudos visando prospecção,
caracterização e validação de genes candidatos presentes no genoma de Elaeis spp. Estes genes
e suas sequências reguladoras (promotores, etc.) poderão, no futuro, ser aplicados para o
desenvolvimento de cultivares superiores de Palma de óleo, como também de outras espécies,
por engenharia genética. Esta prospecção tem se focado em genes de resistência/tolerância a
estresses bióticos e abiótico, além de outras características, pelo fato dos mesmos acarretarem
grandes prejuízos na agricultura. Estima-se que os gastos com pesticidas agrícolas no Brasil
13
superam os US$ 2,7 bilhões por ano (ARAÚJO et al., 2017), e que as perdas por estresse
abiótico podem chegar a 70% (MANTRI et al., 2012).
Estudos relacionados a genes de resistência a fatores bióticos demostraram que as proteínas
codificadas por estes apresentam domínios conservados (DANGL; JONES, 2001). Diante desse
entendimento, estratégias baseadas na amplificação de motivos dentro desses domínios via PCR
propiciaram isolar inúmeros genes análogos de resistência (RGA). Assim, entende-se que os
RGAs representam um grupo de potenciais genes de resistência (R) que apresentam função
desconhecida e/ou não validadas, mas que codificam esses motivos conservados (YAISH;
SAENZ DE MIERA; PEREZ DE LA VEGA, 2004).
Sabendo-se que todos os genes de resistência a doenças clonados em plantas pertencem a
várias classes de RGAs, a identificação dos mesmos facilitará o desenvolvimento de
marcadores moleculares para o mapeamento de genes R, construção de mapas de haplótipos
para identificação de marcadores diagnósticos e a possível implementação de um programa de
seleção assistida por marcadores moleculares.
Em relação a estresses abióticos, considera-se que a salinidade é o que mais afeta
crescimento e a produtividade das plantas; e o estresse ocasionado pelo frio é um fator relevante
na agricultura do sul do Brasil. A salinidade leva a uma restrição na absorção de água e gera
toxidez nas folhas, enquanto que a formação de gelo nos tecidos das plantas durante o estresse
a frio acarreta sérios danos nas membranas celulares. Considerando que a temperatura é um
fator abiótico imprevisível e que o estresse salino é uma condição de estresse permanente, a
tolerância intrínseca das culturas nos dois tipos de estresses é extremamente importante.
Em suma, independente do estresse ser biótico ou abiótico, os produtos de genes
desempenham um papel-chave nos mecanismos moleculares de resistência ou tolerância (RAO,
K. M., RAGHAVENDRA; REDDY, 2006). Nesse sentido, a Setaria viridis, tem sido proposta
como planta modelo para validação de genes devido a aspectos biológicos favoráveis, a
exemplo de ciclo de vida curto, genoma pequeno e autopolinização. As ferramentas de
fenotipagem podem ser aliadas em estudos relacionados ao grau de suscetibilidade dessa cultura
a diversos estresses, o que pode permitir o uso da mesma para validação de genes de tolerância.
Diante do exposto, os objetivos desse trabalho foram: a) determinar se a Setaria viridis
(acesso A 10.1) é uma espécie sensível aos estresses de salinidade e frio, podendo assim servir
como planta modelo para validação de genes de tolerância a estes estresses; b) realizar uma
abordagem baseada em homologia de sequências para a identificação de potenciais RGAs NBS-
LRR nos genomas de Elaeis spp.
14
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Biodiesel
O uso do biodiesel foi regulamentado no Brasil por meio da lei 11.097/2005 objetivando
“incrementar, a participação dos biocombustíveis na matriz energética nacional em bases
econômicas, sociais e ambientais” (BRASIL, 2005). A melhoria ambiental advém da redução
dos gases do efeito estufa emitidos substancialmente pelos combustíveis de origem fóssil e
também pela utilização de resíduos como sebo bovino e óleo de fritura para a produção do
biodiesel (MAPA, 2014). O biodiesel pode ser produzido por uma série de matérias primas
como, por exemplo, óleo de soja, sebo bovino, óleo de algodão, óleo de fritura usado e óleo de
palma. Entre 2005 e 2012 foram produzidos e consumidos no Brasil 11 bilhões de litros de
biodiesel, o que evitou que 22 milhões de toneladas de CO2 eq. fossem emitidas para a
atmosfera (MAPA, 2014). Além dos danos causados ao meio ambiente, na composição do
diesel existem metais pesados que ao se acumularem no organismo humano causam problemas
de saúde (UBRABIO, 2015).
Em 2003, antes mesmo da lei 11.097/2005 ter sido aprovada e sancionada, foram
iniciadas discussões e estudos para a elaboração de uma política de biodiesel no Brasil. Nesse
contexto foi criado, em 2004, o Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel
(PNPB)(MADUREIRA; GUERRA, 2014). Desde a sua criação, o programa vem estipulando
a mistura do biodiesel ao diesel de petróleo, inicialmente como facultativa, e depois como
obrigatória. Em 2008, o governo federal estabeleceu a mistura de 2%, o chamado B2 e a partir
de 2013 de 5% (B5) (LEITE; LEAL, 2007). Entretanto, em 2010, a meta estabelecida para 2013
foi atingida. Já no ano de 2014 a ampliação foi de 7% (B7) (AGÊNCIA CÂMARA NOTÍCIAS,
2014).
A mais recente atualização da mistura obrigatória, publicado no diário oficial da união
em 24 de março de 2016, ampliou a adição de 7% para 8% até o ano de 2017, 9% até 2018 e
10% até 2019. Essa medida prevê ainda que o aumento pode chegar a 15% após o ano de 2019,
se os resultados de ensaios com os combustíveis no funcionamento dos motores forem
aprovados pelo Conselho de Política Energética (PORTAL BRASIL, 2016).
Em adição a atual porcentagem de biodiesel utilizada, a Ubrabio (União Brasileira do
Biodiesel e Bioquerosene) defende a ampliação do chamado B20 Metropolitano (mistura
obrigatória de 20% no diesel utilizado nos ônibus urbanos), uma medida já adotada em algumas
cidades brasileiras e também em outros países. Segundo o MAPA (2014), cada ponto percentual
a mais de biodiesel que é adicionado ao combustível fóssil equivale a aproximadamente a 7,2
15
milhões de árvores plantadas; em termos de CO2 eq. Em resumo, o uso do B20 na frota urbana
das 40 maiores cidades brasileiras levaria uma redução de 300 milhões de litros de diesel
(UBRABIO, 2015), o que proporcionaria uma maior demanda de biodiesel e, por conseguinte
um maior incentivo ao desenvolvimento do setor.
Entre as os vegetais fornecedores de matéria prima para a produção de biodiesel, a soja,
atualmente, ainda se destaca como a principal fonte, sendo responsável por 75,57% de todo o
óleo fornecido para a produção (FIGURA 1) (ANP, 2015). Entretanto, diversificar as fontes
dessa matéria prima é importante e também uma meta do PNPB. Entre as espécies que merecem
destaque para essa diversificação estão a palma de óleo, o pinhão manso e a macaúba. Além
disso, a diversificação das matérias primas para produção de biodiesel leva a um ganho em
relação à segurança de mercado e também de logística em regiões não produtoras de soja,
agregando, consequentemente um benefício tanto ambiental quanto econômico. (ANP, 2014).
Figura 1 – Distribuição das matérias primas utilizadas para a produção de biodiesel nacional no
ano de 2015.
Fonte: ANP (2015)
Laviola e Alves (2011) afirmam que definir as matérias-primas para a produção de
biocombustíveis é uma questão crucial a ser considerada; evidenciando que o custo final do
mesmo depende da utilização de matérias primas adequadas. Dessa forma, estudos que gerem
dados para um melhor aproveitamento das mais diversas matérias primas existentes, beneficiam
ainda mais a expansão do mercado de biocombustíveis; e, como resultado propicia para o Brasil
vantagens significativas no cenário ambiental e econômico.
16
2.2 Palma de óleo (Elaeis spp.)
A palma de óleo é utilizada em muitos setores como na indústria de alimentos, higiene,
cosméticos, fármacos, siderurgia, e biocombustível (ABRAPALMA, 2015a; BARCELOS et
al., 1995); e é responsável pela maior parte do fornecimento de óleo vegetal consumido no
mundo, sendo 33% da produção mundial e 45% da produção de óleo comestível (SINGH et al.,
2013a). O gênero Elaeis é composto somente por duas espécies, a Elaeis guineensis, de origem
africana, conhecida popularmente como dênde; e a Elaeis oleifera, de origem americana,
conhecida como caiaué. Ambas apresentam 16 pares de cromossomos (2n= 32), que se dividem
em três grupos a depender do tamanho, sendo um cromossomo longo, sete médios e oito
pequenos (CORLEY; TINKER, 2003).
O gênero Elaeis pertence à classe Liliopsida, ordem Arecales e família Arecaceae,
antiga família Palmae (DRANSFIELD et al., 2005). É uma cultura alógama e monóica. O fruto
é do tipo drupa ou baga (MIRANDA et al., 2001), com formato ovoide. É classificada como
monocotiledônea pela posição assimétrica do embrião e por apresentar somente um cotilédone
na semente (MORENO, 1984 apud MAIA, 2016 p 3.). As duas espécies do gênero são
morfologicamente muitos semelhantes, a principal diferença entre as espécies é que no caiaué
os folíolos se apresentam dispostos em um mesmo plano sobre a raque, dando um aspecto liso
as folhas diferentemente do dendê (FARIAS, 2014).
No dendê existem três diferentes tipos de endocarpo em relação à espessura do mesmo,
sendo eles: dura (D), pisífera (P) e tenera (T), sendo o último resultado do cruzamento entre os
dois primeiros. Esta característica é controlada por herança monogênica de interação alélica do
tipo codominante. O tipo dura se caracteriza por ter endocarpo espesso, o tenera endocarpo
intermediário e o pisífera endocarpo ausente (FIGURA 2). Do fruto, são extraídos dois tipos de
óleos, o óleo de palma ou azeite de dendê que é extraído do mesocarpo e o óleo de palmiste
extraído do endosperma (RIOS et al., 2012), (FIGURA 3). O primeiro é utilizado nas indústrias
de cosméticos, farmacêutica, siderúrgica e também de biocombustíveis, e o segundo na
indústria alimentícia e de produção de sabão.
Estudos anteriores indicavam que o genoma de E. oleifera era cerca de metade do
tamanho de E. guineensis, e que o genoma do híbrido entre as duas espécies era maior do que
os genomas parentais (MADON et al., 2008; RIVAL et al., 1997; SRISAWAT et al., 2005).
Entretanto, Camillo et al. (2014), ao realizarem um trabalho com o objetivo de reavaliar o
tamanho dos genomas, concluíram que o tamanho do genoma de E. guineensis, E. oleifera e
do híbrido é de 4,32 ± 0,173, 4,43 ± 0,018 e 4,40 ± 0,016 picogramas (pg) respectivamente,
17
correspondendo a aproximadamente 2 gigabase (Gb). Estes resultados mostram que os genomas
das duas espécies são semelhantes em tamanho, apesar de E. oleifera ser um pouco maior, e
que o hibrido apresenta um genoma próximo a média dos parentais.
Figura 2 – Frutos de Elaeis guineensis com diferentes tipos de endocarpo.
Fonte: Corley; Tinker (2003).
Figura 3 – Fruto de Elaeis guineensis.
Fonte: Akira (2012).
As espécies que compõem este gênero podem cruzar entre si e produzir descendentes
férteis. Desta forma as características benéficas de ambas as espécies constituem a variabilidade
utilizada pelos programas de melhoramento. O dendê já é amplamente cultivado
comercialmente, e a ele pode-se agregar alguns dos caracteres benéficos do caiaué. Entre estas
caraterísticas estão a tolerância a terrenos úmidos, resistência a pragas, doenças e anomalias,
como por exemplo, ao amarelecimento fatal (AF), principal anomalia que afeta a cultura na
América Latina.
A E. oleifera também possui um óleo com elevada taxa de ácidos graxos insaturados e
com maior fluidez do que o óleo de E. guineensis, tendo assim um maior valor comercial. Além
disso, apresenta um menor crescimento vertical o que poderia permitir um período mais longo
de exploração comercial (RIOS et al., 2012; VIEGAS; MULLER, 2001). Nesse sentido, a
Embrapa iniciou o programa de melhoramento voltado para o desenvolvimento de híbridos
interespecíficos dessas espécies em 1980, com o objetivo de aliar a produtividade do dendezeiro
do tipo tenera e a resistência apresentada pelo caiaué.
18
Como resultado do melhoramento, observou-se que em regiões de incidência do AF os
híbridos apresentaram-se como resistentes, lançando assim o cultivar BRS Manicoré. Em 2010,
o estado do Pará, local de alta incidência do AF já contava com aproximadamente dois mil
hectares de híbridos interespecíficos (RIOS et al., 2012). Entretanto, apesar deste avanço,
muitas doenças acarretam grandes prejuízos nos cultivos da palma de óleo no mundo (TABELA
1), o que representa uma ameaça em potencial para os cultivos brasileiros (CARVALHO;
SANTOS, 2013). Os fungos Ganoderma boninense e Fusarium oxysporum, por exemplo,
representam perdas que podem chegar a 80% em cultivos importantes na Ásia e África
(ARIFFIN; IDRIS; SINGH, 2000; DE FRANQUEVILLE; RENARD, 1990). no Brasil, as
doenças que causam as maiores perdas econômicas são a fusariose e o anel vermelho (BOARI,
2008).
Tabela 1 – Exemplos de doenças descritas na palma de óleo.
Doença Referência
Mancha foliar de cercospora TRINDADE, 1997
Mancha foliar de viveiro TRINDADE, 1997
Antracnose TRINDADE, 1997
Necroses foliares TRINDADE, 1997
Anel vermelho TRINDADE, 1997
Fusariose COOPER; FLOOD; REES, 2011; TRINDADE, 1997
Podridão-do-colmo COOPER; FLOOD; REES, 2011; FLOOD, 2006
Podridão-da-coroa CARVALHO; SANTOS, 2013
Mancha anular BOARI, 2008; BRAZILIO et al., 2012
Marchitez sorpresiva BOARI, 2008
Podridão dos brotos BOARI, 2008
Fonte: Do autor (2017).
Devido à grande dependência do óleo de soja como fonte de matéria prima para a
produção de biocombustíveis, outras espécies oleaginosas têm sido estudadas como fonte de
diversificação desta matéria prima. Uma cultura que tem ganhado grande destaque é a palma
de óleo, por apresentar uma alta capacidade de produção de óleo por unidade de área. Como
incentivo ao uso da palma de óleo para a produção de biocombustíveis, o programa de produção
sustentável da palma de óleo foi lançado em 2010, tendo como principal objetivo disciplinar e
promover a expansão do cultivo desta cultura no Brasil (PORTAL BRASIL, 2010).
19
Adicionalmente, o ZAE-Dendê (Zoneamento agroecológico do dendezeiro para as áreas
desmatadas da Amazônia Legal), que engloba sete estados da federação (Acre, Amapá,
Amazonas, Mato Grosso, Pará, Rondônia e Roraima), propiciou “conhecer e espacializar o
potencial agroecológico da produção da cultura do dendezeiro” (EMBRAPA, 2010), também
se caracterizando como um mecanismo utilizado pelo Brasil para propiciar a expansão
sustentável do cultivo da palma de óleo.
Os maiores produtores do óleo de palma são a Indonésia, Malásia e Tailândia
(ABRAPALMA, 2015b). Em 2010 a UNIAMERICA, mostrou que o Brasil era o 11º país entre
os maiores produtores mundiais. Em 2011 a ABRAPALMA através de dados do USDA Foreign
Agricultural Service, indicou que o Brasil já era o 9º, produzindo 300 mil toneladas, sendo que
a maior parte desta produção era proveniente do estado do Pará.
A ABRAPALMA mostrou ainda que a palma de óleo apresenta vantagens em relação a
outras oleaginosas, como maior produtividade de óleo e poder ser plantada em áreas
degradadas, o que contribui no sequestro de carbono e consequentemente leva a uma
diminuição nos problemas ambientais relacionados às mudanças climáticas. Além disso, a
palma de óleo é capaz de produzir, com somente 10% da área plantada de soja, a mesma
quantidade de óleo (AGROANALYSIS, 2014), o que reafirma a alta capacidade de produção
desta cultura.
É notório que o interesse pela palma de óleo não é recente. Segundo a
AGROANALYSIS (2014), desde meados dos anos 70 a produção do óleo de palma, sofreu um
crescimento significativo, passando de uma produção que atendia a demanda local para uma
cultura de interesse mundial, tendo crescido 167% entre 1998 e 2010 (SOUZA JÚNIOR, 2011).
O gênero apresenta cultivares melhoradas com sistema de produção definido, sendo já
comercialmente explorado, o que coloca a palma de óleo como preferida em relação a espécies
produtoras de óleo ainda não domesticadas.
Dois estudos realizados por pesquisadores do escritório de óleo de Palma da Malásia
(MPOB) foram importantes para o desenvolvimento de pesquisas genômicas na Palma de óleo.
Um desses estudos foi responsável por elucidar, em parte, a origem das espécies de palma de
óleo. Os autores sequenciaram o genoma de E. guineensis que resultou em um tamanho de 1,8
gigabase (Gb) em 16 scaffolds (1 por cromossomo). Um total de 1,535Gb de dados de sequência
e transcriptoma foram montados e utilizados para predizer, pelo menos, 34,802 genes, incluindo
genes da biossíntese de óleo e homólogos de WRINKLED1 (WRI1), e outros reguladores da
transcrição, que são altamente expressos na amêndoa (endosperma). No mesmo estudo, foi
montado ainda as sequências do draft de Elaeis oleifera que, segundo os autores, parece ter
20
divergido no Novo Mundo. Duplicações segmentares de braços cromossômicos define a origem
palaeotetraploide das palmeiras (SINGH et al., 2013a). Estes resultados podem ser encontrados
no banco de dados do NCBI.
Além do estudo supracitado, os pesquisadores do MPOB, descreveram o mapeamento
e identificação do gene Shell, responsável pelas diferentes formas de frutos (SINGH et al.,
2013b). Usando o mapeamento de homozigose por sequenciamento, foram encontradas duas
mutações independentes no domínio de ligação ao DNA de um homólogo do gene MADS-box
SEEDSTICK (STK), que controla a identidade do óvulo e o desenvolvimento de sementes em
Arabidopsis, o gene Shell. O tipo tenera contém uma versão normal do gene Shell e uma versão
mutada, essa combinação se traduz por um rendimento de óleo maior que o tipo dura.
Para os pesquisadores do MPOB as sequências do genoma da palma de óleo permitem
a descoberta de genes para características importantes, bem como alterações epigenéticas e
somaclonais que restringem o uso de clones em plantações comerciais. Além disso, a mutação
encontrada no fruto tipo tenera, explica uma das características economicamente mais
importantes na palma de óleo, e tem implicações para a produção global. Adicionalmente, a
obtenção de um marcador genético permitiria acelerar o processo de seleção e reduzir a
superfície cultivada.
Na Embrapa Agroenergia, estudos voltados para essa cultura já foram desenvolvidos, a
exemplo da caracterização de sítios polimórficos, sequências repetitivas e estabelecimento de
coleção nuclear de caiaué (FILHO, 2015), estudo da diversidade genética e estrutura
populacional de E. oleifera por meio de DArTSeq (PEREIRA, 2015), prospecção de genes
tecido específico e metabólitos em Elaeis spp. (VARGAS, 2014) e caracterização do
desenvolvimento floral de E. oleifera (FARIAS, 2014). Além dos estudos supracitados, a
Embrapa conta ainda com a versão 1.0 do Draft do genoma de E. oleifera, acesso Manicoré,
que auxilia na prospecção de genes e marcadores genéticos de interesse.
2.3 Setaria viridis
A Setaria viridis é uma planta pertencente à ordem Cyperales, gênero Setaria, família
poaceae (Gramíneas). É uma planta diplóide (2n = 2x = 18), conhecida popularmente como
rabo de raposa verde. O genoma é relativamente pequeno, aproximadamente 510 Mb
(BRUTNELL et al., 2010). Essa espécie tem sido estudada visando a sua utilização como planta
modelo para estudos de genética reversa objetivando a validação de genes e promotores. As
plantas modelos já utilizadas foram importantes para muitas descobertas científicas, como
mecanismos fundamentais que são conservadas em todas as espécies de plantas. Entretanto, há
21
uma necessidade de novas plantas modelos que se encaixam em muitos outros processos
biológicos que até então as plantas modelos disponíveis não se enquadram.
Uma planta modelo muito conhecida e utilizada na comunidade científica é a
Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), outro exemplo é o arroz (Oryza sativa). Devido as suas
características, como ciclo de vida curto, genoma pequeno, autopolinização, estatura pequena,
variando entre 15 a 40 cm, a Setaria italica e seu ancestral selvagem Setaria viridis, estão sendo
propostas como plantas modelo, especialmente no que se refere a estudos de fotossíntese de C4
(BRUTNELL et al., 2010; JIANG; BARBIER; BRUTNELL, 2013). As duas espécies possuem
um genoma pequeno o que representa por exemplo um quinto do tamanho do genoma do milho,
espécie da mesma família destas (XIANMIN et al., 2014).
No que se refere à genética vegetal, as descobertas em modelos genéticos adiantados
tais como, ervilha (Pisum sativum) e milho (Zea mays), foram essenciais nos conhecimentos
das bases para a genética moderna. Os conhecimentos iniciais gerados pelas plantas modelos e
o desenvolvimentos dessa área de pesquisa permitiram grandes avanços no melhoramento de
plantas, especialmente na chamada era genômica.
O sistema fotossintético C4 é considerado mais eficiente se comparado ao C3 que é
encontrado na maioria das plantas verdes. Segundo Xianmin et al. (2014), o grupo de espécies
pertencentes à subfamília Panicoidae, que é a maior das gramíneas, englobam espécies C4 e
também culturas importantes, a exemplo do milho (Zea mays), sorgo (Sorghum bicolor), cana
de açúcar (Saccharum officinarum), milheto (Pennisetum glaucum), painço foxtail (Setaria
italica), milho comum (Panicum miliaceum) e capim-elefante (Pennisetum purpureum); além
de algumas culturas candidatas a produção de biocombustíveis. O autor reforça ainda que, pelo
fato dessas plantas supracitadas apresentarem um relacionamento evolutivo com um modelo
Setaria, a mesma pode facilitar a genômica funcional para estas culturas.
Além das características biológicas favoráveis apresentadas pela S. viridis, já foi
constatado a eficiente transformação genética desta pelo método Agrobacterium (MARTINS et
al., 2015). Segundo os autores da pesquisa esse protocolo de transformação irá contribuir
significativamente para a adoção dessa espécie como planta modelo adicionando seu emprego
na pesquisa aplicada, incluindo os relacionados com a tolerância ao estresse abiótico e o
melhoramento relacionado à quantidade de biomassa para a produção de etanol de segunda
geração (2G), na cana de açúcar, por exemplo.
22
2.4 Estresses abióticos
Estresse em plantas pode ser definido como um “fator externo que exerce uma influência
desvantajosa sobre a planta” (TAIZ; ZEIGER, 2004). Alguns fatores podem se tornar
estressantes em poucos minutos, outros, no entanto podem levar dias, semanas ou meses. Sabe-
se que estes desempenham um papel importante na distribuição das espécies, pois cada uma se
expressa diferencialmente ao mesmo tipo de estresse (TAIZ; ZEIGER, 2004).
As culturas estão sujeitas a diversos estresses, sejam eles de origem biótica ou abiótica.
Dentre os abióticos estão o estresse hídrico, a salinidade do solo, frio (resfriamento e
congelamento), calor, acidez do solo, luz, deficiência ou excesso de nutrientes, metais pesados
entre outros. Muitas vezes, esses estresses afetam a planta simultaneamente e levam a respostas
similares. Um exemplo disso é o que ocorre quando a planta está sujeita a um solo salino que
dificulta a absorção de água e, consequentemente, leva a um estresse hídrico (OLIVEIRA;
ALENCAR; GOMES-FILHO, 2013). As respostas das plantas a fatores abióticos são diversas,
a depender do estresse que a mesma está sofrendo. Entretanto, de forma geral estas estão
relacionadas ao crescimento, mecanismos fisiológicos e moleculares (RAO;
RAGHAVENDRA; REDDY, 2006), (FIGURA 4).
Genes selecionados em estudos objetivando tolerância a fatores abióticos codificam
enzimas envolvidas na biossíntese de diversos osmoprotetores, detoxificantes e fatores de
transcrição envolvidos na expressão, regulação gênica e tradução de sinais em resposta ao
estresse. Estes últimos apresentam grande importância na engenharia genética para o
melhoramento de características relacionadas à tolerância à seca, salinidade, frio entre outros,
pois participam no processo inicial da percepção e sinalização do estresse (NEPOMUCENO et
al., 2011). Para Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki e Seki (2003), existem pelo menos seis vias
de tradução de sinais em respostas ao estresse a seca, alta salinidade e frio. Três delas são ABA
dependente e três são ABA independente, sendo estas seis vias as mais estudadas
(NEPOMUCENO et al., 2011) (FIGURA 5).
23
Figura 4 – Respostas comuns ao estresse abiótico.
Fonte: adaptado de Rao; Raghavendra; Reddy (2006).
Figura 5 – Fatores de transcrição envolvidos na indução de genes de resposta ao estresse
abiótico.
Fonte: Adaptado Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki e Seki (2003).
Est
ress
e a
bió
tico
em
pla
nta
s
Crescimento:
* Inibição da germinação
* Redução do crescimento
* Senescência prematura
*Redução da produtividade
Fisiologia:
* Redução da captação de água
* Alteração na média de transpiração
* Redução na fotossíntese
* Alteração na respiração
* Diminuição na assimilação de nitrogênio
* Toxidade metabólica
* Acumulação de inibidores de crescimento
Biologia Molecular:
* Alteração na expressão de genes
* Degradação de macromoléculas
* Redução na atividade de enzimas vitais
* Diminuição na síntese de proteínas
* Desorganização do sistema de membranas
24
2.4.1 Salinidade
Sabe-se que a salinização dos solos é decorrente de dois fatores: causas naturais, a
exemplo do intemperismo das rochas e através da ação humana, principalmente pela irrigação.
Grande parte das terras agricultáveis foi e ainda vem sendo salinizadas graças à ação humana,
com a utilização de água com níveis consideráveis de sal. Em 2005, a FAO (Organização das
Nações Unidas para Agricultura e Alimentação) já afirmava que 45 milhões de hectares (19,5%)
das áreas irrigadas no mundo são afetadas pela salinidade. Esse fato é preocupante já que
salinidade afeta o crescimento e a produtividade da planta, pois desvia energia para a
aclimatação ao estresse.
A salinidade do solo é uma condição caracterizada por uma concentração elevada de
sais solúveis (MUNNS; TESTER, 2008). As plantas podem ser classificadas quanto a respostas
a essa salinidade em halófitas e glicófitas. As plantas halófitas apresentam condições
fisiológicas capazes de suportar altas concentrações de sal na solução do solo, enquanto que as
glicófitas, que representam a maioria das plantas cultivadas, suportam níveis mais baixos
(WILLADINO; CAMARA, 2010). Um solo salino que reduz significativamente o rendimento
da maioria das culturas é aquele com aproximadamente 40mM de NaCl que é relativo a uma
condutividade elétrica (Ece) 4 dS m-1 gerando uma pressão osmótica de cerca de 0,2 MPa
(MUNNS; TESTER, 2008).
As plantas são capazes de absorver água quando as forças de absorção dos tecidos das
raízes são superiores as forças de retenção de água no solo; entretanto, a presença de sais leva
a uma maior força de retenção dá água no solo, ou seja, um aumento da pressão osmótica.
Coelho et al. (2014) afirmaram que foram observadas respostas lineares e crescentes dos teores
de umidade nos solos em função do aumento da salinidade. Segundo o autor, esses resultados
foram consequências das quantidades de sais solúveis na solução do solo que levaram a
limitações na absorção de água pela planta, deixando seu potencial osmótico mais negativo.
Dentre os efeitos causados pela salinidade o primeiro deles é, justamente, o de efeito
osmótico ou “fase osmótica” que ocorre no início do stress ou em condições moderadas.
Entretanto, esse efeito pode atingir um nível tal que a planta não apresentará mais forças de
sucção suficiente para superar a pressão osmótica, mesmo em solos húmidos, levando a assim
a uma seca fisiológica (DIAS; BLANCO, 2010).
Nesta primeira fase a planta pode estabelecer uma série de reações como restrição à
abertura estomática e assimilação do CO2. Esses sintomas, na verdade, se caracterizam como
uma resposta fisiológica da planta aos efeitos negativos causados pelo sal, mas que são
25
considerados mecanismos normais em situações adversas. Em condições mais avançadas, a
planta pode ir para uma segunda fase do estresse que é denominada fase tóxica ou iônica. Esta
fase é caracterizada pelo acumulo de íons salinos no citosol, e que difere entre as diversas
espécies a depender da capacidade de compartimentalização de íons salinos e o balanço K+/Na+
no citosol (SILVEIRA et al., 2010).
A salinidade dos solos afeta os processos fisiológicos das plantas, dentre eles um dos
mais prejudicados é a fotossíntese. A redução da área foliar para evitar a perda de água pode
levar, consequentemente, a queda na área de captação da energia da luz (WANG; SHANNON;
GRIEVE, 2001); além disso, o acúmulo de íons nos cloroplastos atinge os processos
bioquímicos e fotoquímicos envolvidos na fotossíntese. Feijão et al. (2013) descreveram que o
excesso de íons tóxicos gerados pela salinidade dos solos leva a uma competição na absorção e
transporte de nutrientes dentro das plantas, o que provoca um distúrbio nutricional. Sabe-se que
o nitrogênio é um elemento fundamental na constituição de várias biomoléculas essenciais a
exemplo dos ácidos nucléicos e proteínas e tem a sua captação prejudicada por esse estresse.
As fases iniciais de desenvolvimento das culturas são afetadas pelo índice de
concentração de sal no solo. Ribeiro et al. (2016) relataram que as sementes de maracujazeiro-
amarelo toleraram os sais apenas até 1,5 dS m-¹ e Albuquerque et al. (2016) que a cultura do
pepino pode ser irrigados com água salina de até 1,8 dS m-¹ durante a sua fase de crescimento
inicial, com breves perdas no crescimento. Qados (2011), utilizando concentrações de 0, 60,
120, 240 mM de NaCl observou que a altura, número de folhas, área foliar, pesos frescos e seco
da parte aérea, conteúdo de clorofila 'a', 'b' e carotenoides foram negativamente afetadas com o
aumento da concentração de sal em feijoeiro Vicia faba (L.).
Em contraste, Mendonça et al. (2010) observaram que mudas de Eucalyptus, submetidas
ao nível máximo de salinidade (8,33 dS m-1), não apresentavam queda significativa no valor
de SPAD (índice da intensidade da cor verde nas folhas) e rendimento quântico potencial do
fotossistema II (Fv/Fm), o que pode ser um indicativo de tolerância destas espécies à salinidade.
Ressaltando ainda que as reduções da biomassa seca e área foliar dos indivíduos estudados
foram relacionadas a estratégias de resistência das plantas ao estresse salino.
Os estudos supracitados demostram que as culturas respondem diferencialmente ao
estresse salino. Para Munns e Tester (2008), o mecanismo fisiológico responsável pela
tolerância à salinidade está diretamente relacionado ao crescimento da planta. No entanto, é
necessário reconhecer se esse está sendo limitado pelo efeito osmótico do sal que está presente
no solo ou pelo efeito tóxico do sal dentro da planta. Segundo aqueles autores, a redução do
26
crescimento da parte área da planta ocorre em duas fases: uma rápida, que é devido à pressão
osmótica externa, e uma mais lenta, em consequência do acúmulo de Na+ nas folhas.
O crescimento das plantas é uma característica diferencialmente afetada quando as
espécies estão sob estresse salino. Entre os cereais, o arroz (Oryza sativa) é considerado o mais
sensível e a cevada (Hordeum vulgare) é a mais tolerantes (MUNNS; TESTER, 2008). Em
adição ao crescimento das plantas, Yi; Ma e Li (2007), descrevem que a maior parte dos estudos
do impacto salino tem sido focado nas características morfológicas e fisiológicas da parte aérea
da planta; tais como fotossíntese, transpiração, processo metabólico, glândula salina, regulação
osmótica, atividade enzimática e germinação das sementes.
2.4.2 Frio
O resfriamento representa uma temperatura que seja baixa para o crescimento normal
da planta, mas não suficientemente baixa que permita a formação de gelo. Nessas condições
ocorre o chamado dano por resfriamento, o crescimento torna-se mais lento, as folhas
apresentam lesões, há uma queda na fotossíntese, translocação de carboidratos, taxas
respiratórias e síntese proteica. Esses danos podem ser minimizados se a exposição for lenta e
gradual, a exposição repentina, no entanto, leva ao choque a frio o que pode aumentar as
chances de dano (TAIZ; ZEIGER, 2004; THAKUR et al., 2010).
Cada planta apresenta níveis de temperaturas para seu bom crescimento e
desenvolvimento, plantas de habitats quentes apresentam sintomas de lesão em baixas
temperaturas. Espécies como milho, soja, algodão, tomate e banana apresentam sinais de lesão
por exposição a temperaturas abaixo de 15 ° C (CHINNUSAMY; ZHU; ZHU, 2007; YADAV,
2010). Selecionar plantas para resistência ao frio em campo é um procedimento complexo, pois
é difícil prevê o acontecimento, duração e intensidade e ainda separar seus efeitos de outros
elementos, levando assim a pesquisas utilizando condições controladas (ROZZETTO, 2015).
Na cultura do arroz, por exemplo, a incidência de baixas temperaturas em diversos
países vem sendo estudada. A faixa de temperatura ótima para essa cultura é de 25°C a 30°C
sendo que abaixo de 20°C é prejudicial ao desenvolvimento da planta (YOSHIDA, 1981). De
forma geral o arroz é uma cultura sensível a baixas temperaturas o que também está relacionado
ao estádio de desenvolvimento da planta (CRUZ; MILACH, 2000).
Em plantas sensíveis ao frio, os lipídeos da bicamada das membranas tendem a
solidificar em um estado semicristalino o que torna as membranas menos fluídas. A fotossíntese
e a respiração são exemplos de mecanismos afetados, pois há um dano nas membranas dos
cloroplastos e mitocôndrias. Diferença na conformação da membrana é um dos aspectos que
27
diferenciam plantas resistentes das sensíveis. Inicialmente os cristais de gelo se formam nos
espaços intercelulares e nos vasos, e o crescimento desses cristais causa o deslocamento da água
líquida das células para a região extracelular causando assim uma desidratação excessiva
(MAHAJAN; TUTEJA, 2005; TAIZ; ZEIGER, 2004; XIN; BROWSE, 2000).
Um levantamento feito por Siebeneichler et al. (2000), mostra que alterações
morfológicas nas plantas podem ocorrer após um estresse térmico. Os autores relatam que em
Solanum commersonii as folhas se tornaram 39% mais espessas e a área foliar cinco vezes
menor quando expostas a 12/9ºC e 5/2ºC (noite/dia), quando comparadas aos indivíduos
cultivados a temperaturas mais altas (20/ 16ºC dia/ noite); e que o espinafre, quando exposto a
temperaturas baixas desenvolve duas ou três camadas de parênquima paliçádico e retardo no
desenvolvimento. Num estudo realizado por esse mesmo autor foi constatado que o estresse por
frio em cultivares de feijão causa espessamento da lâmina foliar e redução no crescimento das
plantas. Para os autores, essas alterações são resultado da adaptação das plantas ao novo
ambiente.
A glicina betaína é um dos solutos que se acumulam nos cloroplastos de certas plantas
halotolerantes quando estas são expostas a estresse salino ou frio. Um estudo realizado por
Hayashi et al. (1997) objetivou transformar a Arabidopsis thaliana com o gene CodA, que
codifica a colina oxidase, a enzima que converte a colina em glicina betaína. Como resultado,
observou-se que a planta acumulou a glicina betaína, o que aumentou a sua tolerância ao
estresse salino e ao frio.
Cruz e Milach (2000) afirmaram que cada estádio de desenvolvimento do arroz
apresenta a ativação de genes diferentes para a tolerância ao frio e que os principais estudos
para caracterizar cada estádio resultam de experimentos com a utilização de condições
controladas. Esse tipo de ensaio permite caracterizar somente o fator frio sem a interferência de
demais fatores, o que realça a adequação de ensaios usando tais condições.
2.5 Estresses bióticos
Os agentes bióticos, como bactérias, vírus, nematoides e protozoários podem afetar a
planta das mais diversas formas como debilitar o hospedeiro por absorção continua de
nutrientes, destruir ou causar distúrbios das células do hospedeiro como consequência da
liberação de toxinas, enzimas ou substâncias reguladoras de crescimento, afetar tecidos
condutores entre outros (MICHEREFF, 2001).
28
Vários conceitos de doença surgiram desde que a fitopatologia se estabeleceu como uma
ciência. Entretanto, a definição de Gaümann (1946) é a mais aceita pelos fitopatologistas, pois
o mesmo estabeleceu que doença é “um processo dinâmico, no qual hospedeiro e patógeno, em
íntima relação com o ambiente, se influenciam mutuamente, do que resultam modificações
morfológicas e fisiológicas (MICHEREFF, 2001). Assim o desenvolvimento da doença decorre
da relação entre três fatores, ambiente, patógeno e hospedeiro.
Inicialmente as plantas apresentam mecanismos físicos e químicos para impedirem a
entrada, colonização e inibição ao desenvolvimento do patógeno. Dentre os mecanismos físicos
pode-se citar a cutícula, os estômatos e os tricomas. Estes últimos podem exsudar substâncias
inibidoras ou, devido à quantidade dos mesmos, interferir na continuidade do filme de água
afetando a penetração do patógeno. Entre os químicos, pode-se citar os compostos fenólicos ou
ácidos hidrocarboxílicos, que são substâncias fungitóxicas, antibacterianas e antiviróticas
(STANGARLIN et al., 2010).
O combate a doenças em plantas é um processo continuo devido à corrida evolutiva
entre planta e patógeno. O sistema de defesa a estresses em plantas, diferentemente do sistema
imunológico em animais, não funciona como uma rede circulatória com ação de um sistema
imune; neste, cada célula vegetal é capaz de se defender por meio de uma combinação de
defesas constitutivas e induzidas (LAMB, 1989 apud STASKAWICZ, 1995, p. 661).
Existem nas plantas dois tipos de receptores imunes, os receptores de reconhecimento
de padrões (PRR), que reconhecem padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs) na
matriz extracelular ou na membrana plasmática (BOLLER; FELIX, 2009), e que permite o
processo de imunidade disparada por PAMP, a PTI (PAMP Triggered immunity), e as proteínas
R, que reconhecem os efetores dos patógenos e iniciam o processo de imunidade disparada por
efetores, a ETI (Effector - Triggered immunity) (QI et al., 2011).
Moléculas microbianas, a exemplo dos lipooligossacarídeos de bactérias gram-
negativas, flagelinas e glucanas bacterianas, quitina existentes nas paredes celulares dos fungos,
e glicoproteínas de oomicetos, são alguns exemplos de PAMPs (ZHANG; ZHOU, 2010). Os
efetores, ao contrário das PMAP, que são essenciais na sobrevivência dos patógenos
(MEDZHITOV; JANEWAY, 1997), visam especificamente os mecanismos de defesa da
planta.
Os receptores PRRs são proteínas transmembranas que geralmente apresentam
repetições ricas em leucina (LRRs) ou motivo de lisina (LysM) no domínio extracelular, região
responsável pelo reconhecimento do ligante (BECK et al., 2012). Quando PAMPs ou efetores
são reconhecidos, o sistema imune das plantas é ativado, ocorrendo assim a PTI. Essa ativação
29
está baseada em mudanças nos níveis de cálcio no citoplasma, produção de espécies reativas de
oxigênio e cascata de sinalização via MAP-quinases (mitogen activated protein kinases).
Hormônios reguladores como ácido salicílico (SA), ácido jasmônico (JA) e o etileno (ET) são
responsáveis por amplificar essas vias de sinalização, o que resulta na ativação de fatores de
transcrição e de genes de defesa, fitoalexinas, lignificação de tecidos, deposição de calose e
outros reforços da parede celular (DALIO et al., 2014; GRANT; LAMB, 2006).
Na ETI ocorre o reconhecimento de efetores do patógeno pelas proteínas R do
hospedeiro. Esses efetores podem ser divididos em apoplásticos, quando atuam na superfície
ou nos espaços intercelulares e citoplasmáticos, quando se translocam através da membrana
celular (BLOCK et al., 2008). Em Fusarium oxysporum lycopersici , fungo patogênico de
interação modelo para estudos em tomate, 11 proteínas efetoras denominadas de proteínas six
(secreted in xylem) já foram identificadas (FILHO; DIANESE; CUNHA, 2015). Outros
exemplos são o gene efetor Avr - Xa1 em Xanthomonas oryzae, com um gene de resistência
Xa1 correspondente em Oryza sativa e Perenospora parasitica que apresenta o gene efetor
AvrRPP1A com um gene de resistência RPP1 correspondente em A. thaliana (DALIO et al.,
2014).
Assim como descrito para PTI, na ETI ocorre uma cascata de sinalização e amplificação
dessas vias de sinalização, resultando, porém, nesta fase, na ativação de fatores de transcrição
de genes de defesa, levando assim a resistência sistêmica adquirida (SAR) ou resistência
sistêmica induzida (TSUDA; KATAGIRI, 2010) Na ETI, o reconhecimento do gene AVR
(efetor) pelo gene R provoca uma cadeia de eventos de transdução de sinal, que leva a ativação
de mecanismos de defesa como a resposta de hipersensibilidade (HR), síntese de proteínas
antimicrobianas e metabólitos, espessamento da parede celular e obstrução dos vasos (MILLER
et al., 2008).
Entende-se, portanto, que para o desenvolvimento da doença existe uma interação
planta-patógeno. O reconhecimento de raça específica é tido como qualitativa, nesta um ou
poucos genes principais estão envolvidos, sendo uma interação gene a gene. A interação não
específica é definida como quantitativa, onde existe interação entre genes de pequeno efeito
que são eficazes para vários patógenos. A imunidade disparada por efetores pode ser explicada
por quatro tipos de modelos, o gene a gene, o guarda, o ziguezague e decoy.
A mais antiga teoria para explicar a resposta imune em plantas é a gene a gene de Flor
(1942), sendo que está é uma resistência raça específica ou vertical. Na teoria gene a gene a
planta possui um gene de resistência (R) e o patógeno um gene de avirulência (Avr). No contato
da planta com o patógeno o produto do gene R reconhece o produto do gene Avr levando a uma
30
cascata de sinais e respostas de defesa. Para o autor da teoria “para cada gene que condiciona
uma reação de resistência no hospedeiro existe um gene complementar no patógeno que
condiciona a avirulência”. Estudos posteriores mostraram que o alelo de avirulência (Avr) do
patógeno codifica uma molécula efetora que por sua vez é reconhecida por um receptor
codificado pelo alelo R da planta hospedeira (BESPALHOK; GUERRA; OLIVEIRA, 2007).
Podem ocorrer quatro tipos de combinações no sistema patógeno hospedeiro. Seguindo
a figura 6 a primeira combinação (A) demonstra que existe uma reação de incompatibilidade, a
planta apresenta um gene R relativo ao gene Avr do patógeno e, portanto, a infecção não ocorre.
Note ainda que o termo incompatibilidade se refere ao patógeno, sendo ele o incompatível para
desencadear a doença. Se qualquer um dos genes dessa interação está inativo ou ausente o
resultado é o desenvolvimento da doença (DANGL; JONES, 2001).
Figura 6 – Quatro tipos de combinações na interação gene a gene.
Fonte: Emediato (2009).
É possível notar que na combinação B, ao contrário do A, ocorre uma reação de
compatibilidade, porém nesse caso nem a planta e nem o patógeno apresentam os genes. Na
combinação C ocorre a reação de compatibilidade, porém ambos possuem o gene AVR e R,
entretanto o gene AVR do patógeno não é detectado pelo gene R da planta que não é
correspondente ao mesmo, não havendo assim reconhecimento de ambas as partes. Na
combinação D o patógeno possui o gene AVR, mas o hospedeiro não apresenta o gene R. A
incompatibilidade do patógeno em relação ao hospedeiro leva a resistência, entretanto os
patógenos estão em contínua evolução para quebrar esse mecanismo.
31
Estudos posteriores não comprovaram que havia ao certo ou somente uma interação
direta entre um gene do hospedeiro e do patógeno, levando assim a formulação de outras
hipóteses, a exemplo da hipótese guarda. Acredita-se nesta que existe uma interação indireta,
ou seja, o reconhecimento ocorre entre o efetor do patógeno e uma segunda proteína do
hospedeiro denominada guarde. Essa interação é, por sua vez, percebida pela proteína R
(proteína guarda), ativando assim a resistência do hospedeiro (GŁOWACKI; MACIOSZEK;
KONONOWICZ, 2011). O que ocorre então, é que a proteína R “guarda” uma segunda proteína
denominada “guardee”, a qual é alvo da proteína Avr (MARATHE; DINESH-KUMAR, 2003).
Um exemplo disso é o que ocorre com a proteína RPM1 de A. thaliana. Esta não interage
diretamente com a proteína Avr (avrRPM1) correspondente, em vez disso a proteína RIM4
interage com o avrRPM, gerando uma sinalização para a RPM1 (proteína derivada do gene R)
que por sua vez vai desencadear uma resposta de hipersensibilidade.(MACKEY et al., 2002).
Essa hipótese é considerada plausível para um modelo evolutivo, pois não seria
vantajoso para o patógeno ter um alelo de avirulência, com o fim exclusivo de ‘alertar’ o
hospedeiro (DE WIT, 2002), mostrando também que a interação planta-patógeno envolve pelo
menos mais um gene no hospedeiro. No modelo Decoy, acredita- se também que ocorra uma
interação indireta. Neste modelo, em algumas interações planta-patógeno, o hospedeiro produz
proteínas específicas, que são similares a alvos de elicitores patogênicos. A única função dessas
proteínas decoy é de se ligar ao efetor e atuar como um mediador nas interações com proteínas
R (VAN DER HOORN; KAMOUN, 2008).
Boyd et al. (2013), com o objetivo de discutir os avanços científicos na compreensão da
genética de interações planta-patógeno, mostraram que a atual compreensão das interações
planta-patógeno e resistência envolvem duas vias: a planta deve ser capaz de reconhecer e se
defender, e o agente deve ser capaz de manipular a defesa da planta para criar um ambiente para
seu desenvolvimento, havendo assim uma evolução dos genes para permitir essa comunicação.
Nesse sentido, para Jones; Dangl (2006), o sistema de defesa da planta pode ser
representado por um modelo de quatro fases denominado “zig-zag”, (FIGURA 7). A primeira
linha de defesa da planta envolve o reconhecimento do patógeno, ou seja, o reconhecimento
dos PAMPs, que por sua vez vão desencadear a resposta de defesa do vegetal, a PAMP -
triggered immunity (PTI). Se o agente patogênico por sua vez, for capaz de suprimir os
componentes da PTI, desencadeia a segunda linha de defesa, gerando assim uma suscetibilidade
disparada por efetores (ETS). Se um efetor é reconhecido por uma proteína NB-LRR da planta,
a ETI é ativada, sendo esta uma amplificação da PTI. A ETI permite a indução da morte celular
e resposta de hipersensibilidade, caracterizando a terceira linha de defesa. Os isolados dos
32
patógenos podem evoluir, perdendo ou ganhando novos efetores, permitindo assim que o
mesmo suprima a ETI. Essa seleção favorece novos alelos NB-LRR para reconhecimento dos
efetores recém-adquiridos, resultando novamente em ETI (JONES; DANGL, 2006).
Figura 7 – Modelo Zig-Zag do sistema imune em plantas.
Legenda: Na fase 1 as plantas detectam os (PAMPs / mAmps, losangos vermelhos) através dos
receptores de reconhecimento padrões (PRRs) para desencadear a imunidade disparada por PAMPs
(PTI). Na fase dois os patógenos de sucesso produzem efetores que interferem com a PTI, resultando
em suscetibilidade desencadeada por efetores (ETS). Na fase 3, se um efetor (indicado em vermelho) é
reconhecido por uma proteína da planta NB-LRR, a imunidade disparada por efetores (ETI) é ativada,
sendo uma versão amplificada de PTI. Na fase 4, isolados do patógeno podem evoluir, perdendo efetores
(em vermelho) ou ganhar novos efetores (em azul), permitindo que o patógeno suprima ETI.
Fonte: Jones e Dangl (2006).
Os genes R reconhecem um grande número de patógenos diferentes, apesar disso
compartilham sequências e motivos estruturais que apresentam considerável semelhança o que
sugere que as interações proteína-proteína, os componentes de sistemas receptores e a
sinalização nas respostas de defesa das plantas sejam semelhantes (MILLER et al., 2008).
2.6 Genes R da família NBS-LRR e Genes Análogos de Resistência (RGA)
Em 1995, Staskawicz já afirmava que a clonagem molecular e estudo dos genes R foram
importantes para permitir que as plantas resistissem a uma grande variedade de agentes
patogênicos, revelando ainda que as proteínas codificadas por estes genes possuem várias
características em comum. Para o autor, na época, esses resultados sugeriam que as plantas
podiam ter evoluído mecanismos comuns de transdução de sinal para a expressão de resistência
33
a uma vasta gama de agentes patogênicos não relacionados. Vários estudos atuais confirmam
esse pensamento e adicionam que estas características em comum são os domínios conservados.
Diversas espécies de plantas codificam proteínas estruturalmente semelhantes, o que sugere um
elevado grau de conservação entre as vias que as plantas utilizam para desencadear resposta de
defesa (BENT, 1996).
A partir da homologia e função bioquímica dos seus domínios, os produtos proteicos
dos genes R puderam ser agrupados em famílias (DANGL; JONES, 2001). Até o momento,
pelo menos oito classes de genes R são reconhecidas com base na organização de motivos de
aminoácidos conservados e seus domínios de membrana (GURURANI et al., 2012; BOYD et
al., 2013) (FIGURA 8). Entretanto, a família NBS-LRR representa o maior grupo de genes de
resistência em plantas já clonados (DANGL; JONES, 2001; GUIMARÃES et al., 2005;
ROMMENS; KISHORE, 2000). Além disso, a única função relatada para essa família é a
resistência a doenças (DANGL; JONES, 2001; MEYERS; KAUSHIK; NANDETY, 2005),
levando ao entendimento que a maioria dos genes de resistência em planta pertence a famílias
que codificam motivos pertencentes aos domínios NBS e LRR (YAISH; SAENZ DE MIERA;
PEREZ DE LA VEGA, 2004).
A família NBS-LRR apresenta duas subclasses, a TIR (Toll interleucine receptor) NBS
e não TIR NBS baseados em aminoácidos localizados no N terminal (MILLER et al., 2008). O
NBS pode estar ligado a um coiled coil (CC) no N terminal ou um NLS e WRKY, totalizando
assim quatro subfamílias. Sendo, portanto: NBS- LRR com motivo TIR no N- terminal, NBS-
LRR com motivo CC no N-terminal, NBS-LRR com N-terminal sem motivo CC e NBS-LRR
com motivo TIR no N-terminal, um domínio WRKY (proteína ativadora transcricional) e um
domínio NLS (sinal de localização nuclear) (FIGURA 9).
O domínio NBS apresenta motivos altamente conservados, como o P-loop, Kinase-2,
GLPL, RNBS-D entre outros (LEE et al., 2003) (FIGURA 10). Já o domínio LRR (repetições
ricas em leucina) é localizado no C-terminal e confere resistência a diversos patógenos como
bactérias, fungos, vírus e nematoides (ROSSI et al., 1998). O comprimento mais comum de
uma LRR é de 24 resíduos, mas repeats contendo entre 20 e 29 resíduos também são
encontrados. Esse domínio distingue-se por uma sequência consenso que consistem
predominantemente de resíduos de leucina (KOBE; DEISENHOFER, 1994) e é altamente
irregular e variável (BENT, 1996). Essa alta taxa de mutação no LRR contribui para a
variabilidade genética necessária para o reconhecimento específico de diversos agentes
patogênicos (MILLER et al., 2008).
34
Figura 8 – Principais classes de genes de resistência (R) em plantas baseadas na organização
dos domínios funcionais.
Legenda: LRR: repetições ricas em leucina, NBS: sítio de ligação de nucleotídeo, TIRToll/ Receptor de
interleucina-1, C-C: bobina enrolada (coiled-coil), TrD: domínio transmembrana, PEST: Proteína de
domínio de degradação (prolina-glicina-serina treonina), ECS - domínio de sinalização celular de
endocitose; NLS - Sinal de localização nuclear; WRKY: domínio de aminoácidos, HM1 - enzima
Helminthosporium carbonum toxina redutase.
Fonte: Gururani et al. (2012).
Figura 9 – Representação das duas subclasses, a TIR (Toll interleucine receptor) NBS e não
TIR NBS.
Fonte: Adaptado de Emediato (2009).
35
Figura 10 – Alguns dos motivos conservados dentro do domínio NBS.
Legenda: Retângulos azuis representam motivos presentes em TIR e não-TIR; retângulos vermelhos os
motivos não-TIR e retângulos amarelos os motivos TIR.
Fonte: Emediato (2009).
Amaral et al. (2006) relatam que os produtos do gene NBS- LRR são geralmente
compostos por três principais domínios, sendo eles: um domínio N-terminal variável de cerca
de 200 aminoácidos, um domínio NBS de 300 aminoácidos e um mais variável, o LRR.
Acrescentando ainda que se acredita que o domínio NBS participa da tradução de sinal
provocada pelo patógeno, enquanto que o domínio LRR participa no reconhecimento do
patógeno. Estudos mostram que os loci dessa família podem ser encontrados em singletons ou
em clusters (HOLUB, 2001).
Observa-se pelo exposto que os genes de resistência apresentam similaridades
estruturais, especialmente na família NBS-LRR. Dentre deste contexto estão os genes análogos
de resistência (RGAs), que apresentam função desconhecida e/ou não validadas, mas que
codificam esses motivos conservados (YAISH; SAENZ DE MIERA; PEREZ DE LA VEGA,
2004). Trabalhos baseados em reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores (primers)
degenerados objetivando buscar domínios conservados na família NBS-LRR já resultaram em
genes candidatos para resistência em várias culturas (TABELA 2).
O trabalho de Amaral et al., (2006) com objetivo de procurar RGAs em Carica papaya
L. e Vasconcellea cauliflora Jacq. A. DC utilizou três combinações de primers degenerados,
sendo o primer sense com anelamento no motivo P-loop (três variações), combinado com o
primer antisense no motivo RNBS-D (uma variação); ambos motivos dentro do domínio NBS.
Como resultado obteve sucesso em uma combinação de primers que foi clonada e sequenciada.
O alinhamento múltiplo demostrou que C. papaya compartilha sequências conservadas
descritas em genes de resistência.
Os autores realçam que depois de encontrado esse tipo de marcador pode resultar em
uma série de aplicações a exemplo de sonda para rastrear genes em bibliotecas de cDNA,
marcador em seleção assistida e ainda obter resistência pela superexpressão no genoma da
planta. Afirmam ainda que “esforços para encontrar novos análogos de genes de resistência
devem continuar, principalmente para fornecer bases para o desenvolvimento de plantas de
36
mamão transgênicas com resistência a doenças” afirmação que pode, evidentemente, ser
estendido para outras culturas.
Tabela 2 – Estudos com a utilização de primers degenerados para a busca de domínios
conservados na família NBS-LRR.
Fonte: Do autor (2017).
Estes trabalhos, bem como diversos outros empregando RGAs para diferentes espécies,
revelam a utilidade desses marcadores em estudos genéticos, evolutivos e de melhoramento
visando resistência de plantas a doenças.
RGAs podem também ser identificados em genomas sequenciados com o auxílio de
ferramentas de bioinformática (TABELA 3). Uma revisão publicada por Sekhwal et al.
(2015),com o objetivo de avaliar os recentes avanços em estudos das estruturas e funções do
Cultura Autor
Batata LEISTER et al., 1996
Milho COLLINS et al., 1998
Girassol GENTZBITTEL et al., 1998
Alface SHEN et al., 1998
Brassica JOYEUX et al., 1999
Arroz MAGO; NAIR; MOHAN, 1999
Feijão RIVKIN; VALLEJOS; MCCLEAN, 1999
Citros DENG et al., 2000
Café NOIR et al., 2001
Grão de Bico HUETTEL et al., 2002
Uva DONALD et al., 2002
Trigo LACOCK et al., 2003
Soja HE et al., 2003
Maça LEE et al., 2003
Lentilha YAISH; SÁENZ DE MIERA; PÉREZ DE LA VEGA, 2004
Sorgo TOTAD; FAKRUDIN; KURUVINASHETTI, 2005
Amendoim GUIMARÃES et al., 2005
Banana MILLER et al., 2008
Framboesa SAMUELIAN et al., 2008
Manga LEI et al., 2014
Amora-preta AFANADOR-KAFURI et al., 2015
Ervilha DJEBBI et al., 2015
37
RGAs, trouxe essa nova abordagem. O autor relata os vários métodos de bioinformática que
tem sido aplicado para identificar RGAs, a exemplo de alinhamento de sequencias utilizando o
BLAST (Basic Local Alignmente Search Toll), análise filogenética, análise de motivos e
domínios usando ferramentas como Hidden Markov Model (HMM), SMART, Prosite, Pfam e
InterProScan5.
Tabela 3 – Estudos com a utilização de ferramentas da bioinformática para a busca de domínios
conservados na família NBS-LRR.
Cultura Autor
Arabidopsis thaliana MEYERS et al., 2003
Arroz WANG et al., 2004
Medicago truncatula AMELINE-TORREGROSA et al., 2008
Sorgo MACE et al., 2014
Tomate ANDOLFO; JUPE; WITEK, 2014
Trigo, cevada e centeio BOUKTILA et al., 2014; GU et al., 2015
Mamão PORTER et al., 2009
Nabo MUN et al., 2009
Batata JUPE et al., 2012
Brachypodium distachyon TAN; WU, 2012
Milho CHENG et al., 2012
Setaria italica ZHU et al., 2014
Fonte: Do autor (2017).
2.7 Genômica e Fenômica: prospecção e validação de genes
O desenvolvimento tecnológico aplicado a biologia, especialmente com o advento do
sequenciamento dos genomas, propiciou um acúmulo extremamente elevado de dados
biológicos que em determinado momento não puderam ser mais explorados por ferramentas
computacionais não especializadas, surgindo assim a bioinformática. Ficou claro que uso e/ou
desenvolvimento de softwares específicos para a análise desse grande volume de dados tornou-
se fundamental. Com o avanço da bioinformática foi possível agrupar as informações em um
banco de dados disponível para todo o mundo o que facilitou a interligação e desenvolvimento
dos estudos. Segundo Prosdocimi (2007), “um banco de dados pode ser considerado uma
coleção de dados inter-relacionados, projetado para suprir as necessidades de um grupo
específico de aplicações e usuários”.
38
Avanços nas tecnologias de sequenciamento levaram a uma drástica redução nos custos
e também no desenvolvimento de ferramentas que permitem a análise de genomas inteiros.
Entretanto, o grande desafio na era pós-genoma é obter anotações de alta qualidade
(YANDELL; ENCE, 2012), desse modo o potencial completo das sequências genômicas
podem ser dirigidos a estudos funcionais e análise comparativa (LOVELAND et al., 2012).
Tomando-se como exemplo a identificação de RGAs em genomas anotados de plantas,
ou em sequências expressas, as etapas para identificação e caracterização desses RGAs seguem
basicamente quatro passos: (1) um banco de dados de RGA em plantas, incluindo todas as
sequências de genes de plantas e proteínas conhecidas, é gerado; (2) as pesquisas de BLAST
contra a base de dados de RGA são realizadas para a identificação de sequencias candidatas;
(3) usando os RGA candidatos como entrada, diversas ferramentas de software são empregadas
para detectar vários domínios e motivos conservados; e (4) um script de classificação é
necessário para agrupar os RGA candidatos em classe de acordo com sua estrutura de domínios
e motivos ou uma combinação destes (FIGURA 11) (SEKHWAL et al., 2015).
Nota-se pelo exemplo, que a criação dos bancos de dados e o avanço da bioinformática
foram fundamentais para automatização dos processos relacionados à pesquisa genética. Do
mesmo modo, muitas outras estratégias podem ser usadas a fim de prospectar genes nesses
conjuntos de dados. Entretanto, é preciso entender que o desafio central da análise genética
moderna é compreender a interação da informação genômica com fatores externos como
estresses de origem biótica e abiótica, por exemplo. Esses fatores externos criam um fenótipo
interno que inclui propriedades celulares e fisiológicas. Estes fenótipos internos, por sua vez,
moldam os fenótipos externos que podem ser mais facilmente medidos com técnicas não
invasivas de alto rendimento (GROSSKINSK et al., 2015).
Para entender esse caminho percorrido do genoma até o fenótipo, o conhecimento
evoluiu para o que hoje se conhece como a era das ômicas: genômica, transcriptômica,
proteômica, metabolômica, fisionômica e fenômica (FIGURA 12). Cada uma delas está
relacionada a uma etapa desde o código genético até a manifestação da característica, entretanto
todas elas de alguma forma se relacionam com a bioinformática.
A genômica avançou muito nos últimos anos com o desenvolvimento de genotipagem
altamente robotizada. Entretanto, a fenotipagem não acompanhou esse avanço, tornando-se um
fator limitante das análises genéticas. Para Weber e Broman (2001) era necessário que existisse
uma fenotipagem de precisão e em larga escala para que a mesma pudesse ser devidamente
associada a informações genômicas. Atualmente, a fenômica ou fenotipagem de próxima
39
geração (Next Generation Phenotyping) que é a fenotipagem em larga escala e com alta acurácia
está em desenvolvimento e traz grandes progressos (COBB et al., 2013).
Figura 11 – Procedimento comum para identificação e caracterização de RGAs em plantas.
Fonte: Adaptado de Sekhwal et al. (2015).
Figura 12 – Trilha das ômicas e as relações entre si com os processos biológicos.
Fonte: Borém e Frische-Neto (2013).
40
Essa nova abordagem tem surgido para suprir as necessidades dos programas de
melhoramento que requerem fenotipagem dos indivíduos em grande escala, precisão,
reprodutibilidade e exploração de novas características tanto em condições controladas quanto
em campo, diferindo assim das técnicas tradicionais (SOUSA et al., 2015).
Sousa et al. (2015) expõem que existe a proposta de que a fenômica seja associada como
um complemento ao sequenciamento do genoma e que o mapa genótipo-fenótipo associado a
genótipo-ambiente já está sendo alvo de pesquisas relacionada à tolerância de plantas a estresse
abiótico. Entretanto, os autores ainda argumentam que há quem discorde, afirmando que apesar
dos avanços já obtidos é preciso um grande desenvolvimento da fenômica para que a mesma
alcance o patamar de desenvolvimento obtido pela genômica. Este avanço tem se tornado
possível através de estruturas denominadas plataformas de fenotipagem de plantas e que já tem
sido explorada em países da Europa, Oceania e nos Estados Unidos da América além de
iniciativas na América do Sul incluindo o Brasil.
Dentre as ferramentas utilizadas pela fenômica estão as câmeras digitais para captura e
análise de imagens, a exemplo da área foliar; as câmeras de infravermelho, que podem mostrar
gradientes de temperatura e que estão diretamente relacionados com a dissipação de energia; o
uso de imagens geradas por detectores de fluorescência e índices de concentração de clorofila.
O IRGA, Infrared Gas Analyzer, por exemplo, foi um dos equipamentos pioneiros; sendo que
com o mesmo é possível medir parâmetros como taxa de assimilação liquida de carbono, taxa
de fotossíntese e transpiratória (BORÉM; FRISCHE-NETO, 2013).
Mendonça et al. (2010) relatam que características relacionadas à fotossíntese, como por
exemplo, a fluorescência da clorofila e o teor de clorofila tem sido utilizada para identificar
diferenças em respostas fisiológicas de espécies ou cultivares, sob estresse salino, por diversos
autores. Jamil et al. (2007) acrescentam ainda que quando as plantas crescem sob estresse de
salinidade, a sua atividade fotossintética diminui levando a um menor conteúdo de clorofila.
Para responder aos estresses abióticos e bióticos as plantas desencadeiam várias
respostas, que vão desde alterações na expressão gênica e metabolismo celular até alterações
na taxa de crescimento e produção de biomassa (MARTINS et al., 2007). Dessa forma, os
bancos de dados disponíveis e as ferramentas de bioinformática representam uma via de
prospecção de genes para os diversos tipos de estresses. A fenotipagem, por sua vez, permite
que esses genes prospectados sejam melhor validados através da quantificação da expressão da
característica de interesse.
41
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
As mudanças climáticas globais ocasionadas por ações antrópicas através da liberação
deliberada de CO2 na atmosfera tem sido, em grande parte, devido ao modelo energético
utilizado durante os dois últimos séculos. O desenvolvimento de biocombustíveis, como o
biodiesel, tem sido uma proposta bem-sucedida para mitigar danos futuros e presentes
ocasionados pelo uso desse modelo energético, que é altamente dependente de fontes não
renováveis. A diversificação das matérias primas para produção deste biodiesel, proposta pelo
PNPB, se constitui também, uma iniciativa de extrema importância, pois possibilita a inclusão
de regiões não produtoras de soja, além de gerar maior segurança na produção e mercado por
meio da não dependência de um conjunto limitado de matérias primas.
Estudos genéticos que propõem a prospecção de RGAs visam incorporar aos programas
de melhoramento da palma de óleo características benéficas, propiciando reduzir prejuízos
fortuitos causados por agentes bióticos através da viabilização de cultivares resistentes. Além
disso, o uso de genética reversa para a validação de genes candidatos a tolerância/resistência a
estresses abióticos e bióticos, necessitam de plantas modelo, que, além das características
inerentes a este tipo de planta, apresentem também suscetibilidade aos estresses alvo. É o que
propõe os estudos de respostas a estresses em Setaria viridis, que dentre as plantas modelos
disponíveis é a evolutivamente mais próxima da palma de óleo e de outras espécies
bioenergéticas monocotiledôneas, a exemplo da cana de açúcar e da macaúba.
Assim, estudos voltados para características relacionadas à tolerância/resistência a
estresses biótico e/ou abióticos buscam viabilizar estratégias de engenharia genética e edição
de genes para a agregação de valor a cadeia produtiva da palma de óleo, espécie que apresenta
grande potencial para uma maior contribuição na diversificação das matérias primas para a
produção de biodiesel.
42
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53
CAPÍTULO 2
Avaliação de Setaria viridis (acesso A10.1) como potencial planta modelo para a
validação de genes de tolerância a estresses abióticos
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi determinar se o acesso A10.1 de Setaria viridis é tolerante ou não
à salinidade, bem como às baixas temperaturas do ar, buscando subsidiar futuros estudos
relativos à utilização dessa espécie como planta-modelo para a validação de genes de tolerância
a tais estresses. Inicialmente, sementes de S. viridis foram submetidas à germinação em meio
de cultura com diferentes concentrações de NaCl (0, 30, 60, 90, 120, 150 mM). As plântulas
resultantes foram mantidas no meio usado para germinação durante os estádios iniciais de
desenvolvimento. Em outro experimento, plantas no 2º estádio de desenvolvimento foram
submetidas a estresse salino mediante adição de quantidades crescentes de NaCl (0, 2, 4, 6, 8 e
10 g/dm³) ao substrato. Observou-se que a germinação das sementes foi pouco afetada pelo
NaCl, caindo de 98% no controle para 89 e 82% em 120 e 150 mM de NaCl, respectivamente.
Houve uma relação praticamente linear entre o aumento na concentração de NaCl e a redução
na área foliar e nos valores das variáveis morfológicas das raízes. As plântulas mantidas sob
150 mM de NaCl apresentaram, em média, apenas 8% da área foliar das plantas-controle. As
variáveis radiculares mais negativamente afetadas foram volume, comprimento por volume e
comprimento, com uma queda de 88,73; 86,01 e 77,78%, respectivamente. Já o diâmetro foi o
menos afetado, apresentando uma queda de apenas 15,94%. Quando o NaCl foi aplicado no 2º
estádio de desenvolvimento, houve redução no tamanho das plantas à medida em que se
aumentou a quantidade de NaCl até 6 g/dm3; nas concentrações acima deste valor (8 e 10
g/dm³), todas as plantas morreram. Apenas as plantas submetidas a 6 g/dm³ de NaCl sofreram
redução tanto na taxa de assimilação líquida de CO2 quanto no ICC; porém, todas as plantas
que receberam NaCl, independentemente da quantidade, sofreram redução nas taxas de
condutância estomática e transpiração. A concentração interna de CO2 (Ci) apresentou os
valores mais altos nas plantas-controle e os menores valores foram observados nas plantas
submetidas às menores quantidades de NaCl. À medida que se aumentou a quantidade de NaCl,
houve, também, aumento em Ci, de forma que em 6 g/dm³ de NaCl, os valores de Ci não
diferiram estatisticamente do controle. Para o estresse de frio, plantas no 3º e 5º estádio de
desenvolvimento foram submetidas a 10ºC durante seis dias, posteriormente retornando à 25ºC.
Estas plantas sofreram redução nas taxas de assimilação líquida de CO2, condutância estomática
ao vapor d’água e transpiração, em ambos os estádios de desenvolvimento; por outro lado a
concentração interna de CO2 praticamente dobrou. Após o retorno a 25ºC, as plantas do 3º
estádio recuperaram as taxas de trocas gasosas mais rapidamente do que as no 5º estádio. A
massa da parte aérea obtida ao final do ciclo não diferiu entre os tratamentos,
independentemente do estádio no qual o estresse foi aplicado. A produção de sementes, por
sua vez, foi negativamente afetada pelo frio, mas somente quando o mesmo foi aplicado no 5º
estádio de desenvolvimento.
Palavras-chave: Salinidade, frio, fenotipagem, fenômica, germinação de sementes.
54
ABSTRACT
The objective of this work was to determine if the A10.1 access of Setaria viridis is tolerant or
not to the salinity, as well as the low air temperatures, seeking to subsidize future studies
regarding the use of this species as a model plant for the validation of tolerance genes tosuch
stresses. Initially, S. viridis seeds were submitted to germination in culture medium with
different concentrations of NaCl (0, 30, 60, 90, 120, 150 mM). The resulting seedlings were
maintained in the medium used for germination during the early stages of development. In
another experiment, plants in the second development stage were subjected to saline stress by
adding increasing amounts of NaCl (0, 2, 4, 6, 8 and 10 g/dm³) to the substrate. It was observed
that seed germination was slightly affected by NaCl, decreasing from 98% in control to 89 and
82% in 120 and 150 mM NaCl, respectively. There was a practically linear relationship between
the increase in NaCl concentration and the reduction in leaf area and the values of the roots
morphological areas. Seedlings kept under 150 mM NaCl presented, on average, only 8% of
the leaf area of the control plants. The most negatively affected root variables were volume,
length by volume and length, with a fall of 88,73; 86,01 and 77,78%, respectively. The diameter
was the least affected, with a drop of only 15,94%. When NaCl was applied in the 2nd
development stage, there was a reduction in the size of the plants as the amount of NaCl
increased up to 6 g/dm3; at concentrations above this value (8 and 10g/dm³), all plants died.
Only the plants submitted 6 g/dm³ of NaCl have suffered reduction in both the net assimilation
rate of CO2 and in the ICC; however, all the plants that have received NaCl, independently of
the quantity, suffered a reduction in the rates of stomatal conductance and transpiration. The
internal CO2 concentration (Ci) presented the highest values in the control plants and the lowest
values were observed in the plants submitted to the lowest amounts of NaCl. As the amount of
NaCl increased, there was also an increase in Ci, so that at 6 g/dm³ NaCl, the Ci values did not
differ statistically from the control. For cold stress, plants in the 3rd and 5th stages of
development were submitted to 10ºC for six days, then returning to 25ºC. These plants suffered
a reduction in the rates of CO2 net assimilation, stomatal conductance to water vapor and
transpiration, at both stages of development; on the other hand the internal concentration of
CO2 practically doubled. After returning to 25ºC, the plants of the 3rd stage recovered gas
exchange rates faster than those in the 5th stage. The aerial part mass obtained at the end of the
cycle did not differ between treatments, independently of the stage at which stress was applied.
Seed production, in turn, was negatively affected by the cold, but only when it was applied in
the 5th stage of development.
Keywords: Salinity, cold, phenotyping, phenomics, seeds germination.
55
1 INTRODUÇÃO
Os estresses abióticos, de maneira geral, acarretam grandes perdas à agricultura mundial.
Alta salinidade, seca, frio, e calor, influenciam negativamente a sobrevivência, produção de
biomassa e rendimento das principais culturas em até 70% (MANTRI et al., 2012). A salinidade
é um dos estresses abióticos mais preocupantes. Estima-se que mais de 6% dos solos do mundo
sejam afetados pela salinidade (MUNNS; TESTER, 2008). O uso de água com quantidades
consideráveis de sais e o uso excessivo de fertilizantes são as principais causas desse problema
(PEDROTTI; CHAGAS; RAMOS, 2015). Estimativas da FAO (2017), indicam que, dos atuais
230 milhões de hectares de terras irrigadas, 45 milhões são afetados pelo excesso de sal, o que
corresponde a 19,5%.
A salinidade faz com que as forças de retenção de água no solo sejam maiores do que as
forças responsáveis pelo processo de absorção de água pelas raízes (DIAS; BLANCO, 2010),
o que ocasiona uma redução do potencial osmótico levando inicialmente a um estresse por
déficit hídrico. Posteriormente, se a planta não conseguir compartimentalizar as excessivas
quantidades de sal que entram no citoplasma, este pode alcançar níveis tóxicos e,
consequentemente, causar a senescência prematura das folhas mais velhas. A senescência foliar,
por sua vez, poderia reduzir a área foliar fotossintética da planta e afetar o crescimento
drasticamente (MUNNS, 2002).
As plantas sensíveis à salinidade se caracterizam por não suportarem o déficit hídrico
ocasionado pela redução do potencial osmótico e as altas taxas de íons no citoplasma. Por outro
lado, as plantas tolerantes são capazes de abrigar maiores quantidades de íons no citoplasma,
diminuindo o efeito tóxico do mesmo e permitindo um gradiente osmótico mais favorável para
absorção de água pelas raízes (GUPTA; HUANG, 2014). Essa tolerância pode estar relacionada
a genes únicos responsivos, ligados a mecanismos bioquímicos e moleculares para tolerar o
estresse salino, os quais estariam ausentes em plantas sensíveis (PARIHAR et al., 2015).
Além das altas taxas de salinidade dos solos, as baixas temperaturas restringem o cultivo
de espécies sensíveis ao frio em muitas regiões. Apenas um terço da área total de terra está livre
de gelo, e cerca de 42% apresentam quedas regulares de temperaturas abaixo de 20ºC
(JUNTTILA; ROBBERECHT, 1999). Na Região sul do Brasil, as temperaturas podem chegar
abaixo de 0ºC, acompanhada de geadas (NERY, 2005), o que dificulta o cultivo da cana de
açúcar, por exemplo, espécie que apresenta grande demanda para a produção de
biocombustíveis. Além da cana de açúcar, culturas importantes como arroz, milho, soja,
56
algodão e tomate, também, são sensíveis ao resfriamento e incapazes de tolerar a formação de
gelo em seus tecidos (CHINNUSAMY; ZHU; ZHU, 2007).
As baixas temperaturas do ar causam redução nas taxas metabólicas, diminuição na
fluidez das membranas celulares, danos aos cloroplastos e às moléculas de clorofila, reduzindo
assim a taxa fotossintética (CRUZ et al., 2010; STHAPIT; WITCOMBE; WILSON, 1995).
Pode ocorrer, ainda, atraso na taxa de desenvolvimento diário das folhas e floração, abscisão
das flores, esterilidade do pólen e diminuição no rendimento dos frutos (THAKUR et al., 2010).
A variação no nível de tolerância ao frio é geneticamente determinada, bem como influenciada
pela intensidade e duração do estresse, além do estádio de desenvolvimento da planta no
momento da exposição (JANSKÁ et al., 2010).
A compreensão dos mecanismos pelos quais as plantas percebem os sinais ambientais
para ativar respostas adaptativas é de fundamental importância para o desenvolvimento de
estratégias de melhoramento e transgenia, pelo fato dos mesmos estarem diretamente ligados a
genes de adaptação ao estresse (MANTRI et al., 2012). Dessa forma, iniciativas que visem o
melhoramento genético para tolerância a estresses abióticos viabilizam o cultivo de espécies
em áreas originalmente consideradas inapropriadas, permitindo a expansão das áreas agrícolas,
utilizando estas espécies.
Devido a aspectos biológicos favoráveis, a Setaria viridis vem sendo estudada para se
tornar uma planta modelo para validação desses genes de tolerância a estresses (JIANG;
BARBIER; BRUTNELL, 2013). Entretanto, para que seja utilizada em estudos de validação de
genes, é necessário que, além de características inerentes a uma planta modelo, a S. viridis
apresente suscetibilidade aos estresses alvo. Considerando que a adaptação ao estresse está
relacionada à capacidade das plantas de manter níveis metabólicos que permitam a realização
de mecanismos fisiológicos vitais, mesmo em condições desfavoráveis, parâmetros como a taxa
de fotossíntese e transpiração, concentração intracelular de CO2, concentração de clorofila, área
foliar, biomassa e morfologia de raiz são capazes de caracterizar as respostas das plantas ao
estrese e, consequentemente, separar plantas tolerantes das sensíveis (FERRAZ et al., 2012;
SILVA et al., 2011).
Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi determinar por meio de dados fenotípicos
o grau de susceptibilidade de S. viridis (acesso A10.1) ao excesso de sais no substrato, bem
como às baixas temperaturas do ar, buscando subsidiar os estudos relativos à utilização dessa
espécie como planta modelo para a validação de genes de tolerância ao estresse salino e/ou ao
frio.
57
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Efeito do estresse salino sobre a germinação de sementes e desenvolvimento inicial de
plântulas de Setaria viridis
Sementes de S. viridis (acesso A10.1) foram submetidas à quebra de dormência pelo
tratamento com ácido sulfúrico (1000 µM) por 15 minutos. Após a remoção do ácido sulfúrico
pelo enxague exaustivo em água destilada, as sementes foram submetidas à desinfecção em
solução com hipoclorito de sódio (2%) e Tween 20® (0.1%). Em seguida, as sementes foram
secas em papel de filtro estéril e transferidas para placas de Petri contendo o meio de cultura
com diferentes concentrações de NaCl.
Utilizou-se o meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) a 1/2 força e pH 5,8 para a
germinação das sementes. No seu preparo, foram adicionados os seguintes produtos, nas
seguintes quantidades: 2,15 g.L-1 de meio MS, 1 ml.L-1 de vitaminas, 20 g.L-1 de sacarose, 2,0
g.L-1 de Phytagel, e 100 mg.L-1 de inositol. Tomaram-se alíquotas com volume padronizado do
meio MS, às quais foram acrescentadas quantidades crescentes de NaCl, de forma a se obter
concentrações salinas de 0, 30, 60, 90, 120 e 150 mM. As alíquotas salinizadas foram
autoclavadas por 20 minutos e, por fim, distribuídas em placas de Petri.
Para este ensaio foram utilizadas quatro placas de Petri para cada concentração salina e
semeadas 20 sementes em cada uma delas. Um total de 24 placas de Petri contendo sementes
foram acondicionadas em uma câmara de crescimento Conviron® modelo Adaptis 1000TC
(Controlled Environments Inc., Winnipeg, Canada) e mantidas sob fotoperíodo de 16/8 horas
(luz/escuro), temperatura de 25±2°C e intensidade de luz de 150 μmol m‐2s‐1. Esse ensaio foi
repetido por duas vezes.
A taxa de germinação das sementes foi avaliada sete dias após o semeio. Foram
consideradas germinadas as sementes que originaram plântulas compostas de parte aérea e
sistema radicular. Aos nove dias após o semeio, determinou-se a área foliar e variáveis
relacionadas à morfologia do sistema radicular das plântulas.
A área foliar das plântulas foi determinada por meio da técnica de fluorescência de
clorofila por imagem, utilizando-se um fluorômetro Walz modelo IMAGING-PAM versão
Maxi (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Alemanha). Para isso, as plântulas foram previamente
mantidas no escuro por 30 minutos e, em seguida, submetidas a uma rotina que mede,
inicialmente a fluorescência inicial (Fo), com a menor intensidade luminosa possível, e a
fluorescência máxima (Fm), a partir de um pulso de luz saturante (2800 µmol m-2s-1). O
software Imaging Win, que controla o equipamento, permite a determinação da área que gera
58
um sinal de fluorescência a partir da imagem de qualquer parâmetro. Para as plântulas de S.
viridis, a área foliar foi estimada a partir da área de emissão do sinal de fluorescência máxima
(Fm). O cálculo da área é independente da concentração de clorofila e da intensidade do sinal
de fluorescência.
Para a determinação das variáveis relacionadas à morfologia do sistema radicular,
utilizou-se o sistema de escaneamento de raízes Regent WinRHIZO v. 4.0 (Regent Systems,
Quebec, Canadá), acoplado a um scanner profissional Epson XL 10000, equipado com unidade
de luz adicional (TPU). As raízes foram dispostas em uma cuba de acrílico de 20x30 cm (de
comprimento) contendo uma lâmina de água. As imagens geradas forma avaliadas em duas
plantas por placa, determinando-se as seguintes variáveis: comprimento total de raízes (cm),
área projetada total (cm²), área superficial total (cm2), diâmetro médio (mm), comprimento por
volume (cm/m3) e volume das raízes (cm3).
2.2 Efeito do estresse salino sobre plantas de Setaria viridis (acesso A10.1) no 2º estádio de
desenvolvimento
Inicialmente, foi conduzido um ensaio preliminar com o objetivo de se determinar o
tempo necessário para que o sal adicionado ao substrato entrasse em equilíbrio com a solução.
Este período de tempo pode ser considerado como o período mínimo necessário de incubação,
a partir do qual a medida de condutividade elétrica (CE), com base no extrato de saturação,
estabiliza-se no meio. Para a realização desse ensaio, foram preparadas soluções com as
seguintes concentrações salinas: 0, 30, 60, 90, 120 e 150 mM de NaCl, em cinco repetições.
Determinou-se a CE de cada uma dessas soluções.
A seguir, aplicou-se ao substrato uma quantidade padrão de cada solução salina,
suficiente para alcançar a máxima capacidade de retenção de água (capacidade de campo). O
substrato foi mantido em câmara de crescimento Conviron® modelo PGW40 (Controlled
Environments, Winnipeg, Canada), sob fotoperíodo de 16/8 horas (luz/escuro), temperatura de
25±2°C, umidade relativa de 60%, e intensidade de luz de 500 µmol m-2s1, com monitoramento
diário do peso visando reposição da água evaporada. A reposição foi feita com água destilada,
retornado o vaso com o substrato ao seu peso original. A retirada da solução do substrato para
as medições de CE foi realizada com o auxílio de uma bomba de vácuo Büchi® modelo V-700
(Sigma-Aldrich, Missouri, Estado Unidos da América).
Após o ensaio preliminar, para o experimento que veio a seguir, as sementes de S. viridis
(acesso A10.1) foram submetidas à quebra de dormência, esterilização, secagem e semeio
59
conforme descrito no item 2.1, sem adição de Nacl ao meio. Foram semeadas 20 sementes em
cada placa de Petri, as quais foram acondicionadas em uma câmara de crescimento Conviron®
modelo Adaptis 1000TC (Controlled Environments Inc., Winnipeg, Canada) e mantidas sob
fotoperíodo de 16/8 horas (luz/escuro), temperatura de 25±2°C e intensidade de luz de 150 μmol
m‐2s‐1.
Sete dias após o semeio, as plântulas originadas foram transplantadas individualmente
para vasos de 0,2 L contendo 100 g de substrato e, depois, estas plantas foram cultivadas em
uma câmara de crescimento Conviron® modelo PGW40 (Controlled Environments, Winnipeg,
Canada) sob fotoperíodo de 16/8 horas (luz/escuro), temperatura de 25±2°C, umidade relativa
de 60% e intensidade de luz de 500 µmol m-2s1.
O substrato utilizado para este experimento foi preparado mediante mistura de terra,
substrato comercial (Bioplant® - www.bioplant.com.br) e vermiculita, na proporção (2:1:1;
v/v/v). Antes da mistura, a vermiculita e o substrato comercial foram autoclavados por 30
minutos, e a terra esterilizada em 121ºC a 1 atm por 30 minutos.
Quando as plântulas atingiram o segundo estádio de desenvolvimento, aos sete dias após
o transplantio (14 dias após a semeadura) (MARTINS et al., 2016), foram submetidas a
diferentes quantidades de NaCl no substrato: controle (sem NaCl), tratamento 1 (0,2 g),
tratamento 2 (0,4 g), tratamento 3 (0,6 g), tratamento 4 (0,8 g), tratamento 5 (1,0 g), sendo
utilizadas 10 plantas para cada tratamento. Vasos contendo a mesma quantidade de substrato,
porém sem plantas, também receberam as mesmas quantidades de NaCl, no total de cinco vasos
por tratamento. O objetivo foi de estimar a quantidade do sal em solução que poderia ser
removido pelas plantas.
A adição de NaCl foi realizada através da dissolução do mesmo na quantidade de água
suficiente apenas para atingir a capacidade de campo (100% de retenção de água), com base no
peso do vaso. Durante todo o experimento, a reposição de água em cada vaso foi realizada de
forma que retornasse ao peso inicial na capacidade de campo. O mesmo ocorreu com os vasos
que continham apenas substrato, sem plantas. O ensaio foi conduzido durante 12 dias.
Oito dias após a aplicação do sal no substrato, foram coletadas duas plantas de cada
tratamento para a determinação do peso, o qual foi adicionado ao peso final do vaso, visando
corrigir o cálculo da quantidade diária de água necessária para fazer com que o substrato
retornasse a 100% da capacidade de campo.
60
2.3 Efeito do estresse por frio sobre plantas jovens e adultas de Setaria viridis
Sementes de S. viridis (acesso A10.1) foram submetidas à quebra de dormência,
esterilização, secagem, semeio e germinação, conforme descrito no item anterior. Foram
semeados dois grupos de sementes, com um intervalo de 14 dias. Sete dias após a germinação,
as plântulas foram transplantadas para vasos com capacidade de 0,2 L, contendo 120 g de
substrato. Estas foram cultivadas em uma câmara de crescimento Conviron® modelo PGW40
(Controlled Environments, Winnipeg, Canada), sob fotoperíodo de 16/8 horas (luz/escuro),
temperatura de 25±2°C, umidade relativa de 60%, e intensidade de luz de 500 µmol m-2s1, até
o início do estresse.
Aos 15 e 29 dias após o transplantio (15 e 29 DAT), quando se encontravam no 3º e 5º
estádio de desenvolvimento (MARTINS et al., 2016) respectivamente (FIGURA 1), 15 plantas
foram submetidas ao frio. Enquanto que cinco plantas, nos mesmos estádios de
desenvolvimento, permaneceram sob condição de cultivo (controle). Para a submissão ao frio,
as plantas, previamente cultivadas a 25±2°C, foram submetidas a uma queda gradual na
temperatura (1ºC a cada 4 minutos) do ar da câmara de crescimento até atingir 10ºC,
permanecendo assim por seis dias. As demais variáveis ambientais, tais como temperatura,
umidade relativa e intensidade luminosa não sofreram alterações.
61
Figura 1 – Estádios de desenvolvimento das plantas de Setaria viridis (acesso A10.1)
imediatamente antes da submissão ao estresse por frio.
Legenda: (A) plantas aos15 dias após o transplantio (15 DAT, 3º estádio) e (B) plantas aos 29 dias após
o transplantio (29 DAP, 5º estádio).
Fonte: Do autor (2017).
2.4 Avaliação das plantas submetidas aos estresses salino e frio e análises estatísticas dos
dados
Durante o período experimental no qual as plantas foram submetidas ao estresse salino,
retiraram-se amostras da solução do substrato em cada vaso, com e sem plantas, com o auxílio
de uma bomba de vácuo Büchi® modelo V-700 (Sigma-Aldrich, Missouri, Estado Unidos da
América). Nessas amostras foram determinadas a condutividade elétrica e o potencial hídrico,
utilizando-se um condutivímetro Hanna modelo HI98311 (Hanna Instruments, Rhode Island,
Estados Unidos) e um medidor de potencial hídrico Decagon modelo WP4C (Decagon Devices,
Pullman, Estado Unidos), respectivamente. As medidas foram realizadas no final do
experimento, para os vasos com plantas, e quatro dias após a adição do sal, para os vasos
contendo apenas substrato.
A avaliação das plantas sob estresse salino e frio ocorreu basicamente pela medição das
trocas gasosas, utilizando-se o analisador de gases por infravermelho (IRGA) LI-COR modelo
62
6400XT (LI-COR, Nebraska, EUA). A radiação fotossinteticamente ativa foi configurada para
1,500 μmol m-2s-1, o CO2 no interior da câmara foi mantido em torno de 400 μmol CO2 mol-1
e a temperatura foi fixada em 25ºC. Para o experimento de estresse de frio a temperatura da
câmara foi fixada em 10ºC. Procedeu-se à determinação das seguintes variáveis: A - Taxa de
assimilação líquida de CO2 (µmol de CO2 m-2s-1); gs - taxa de condutância estomática ao vapor
d’água (mol de H20 m-2s-1); E - taxa de transpiração (mmol de H20 m-2s-1); e Ci - concentração
intracelular de CO2 (µmol de CO2 mol-1). As avaliações foram realizadas na folha mais jovem
completamente expandida.
Nas plantas submetidas ao estresse salino, no 2º estádio de desenvolvimento, além das
trocas gasosas, foi também avaliado o índice de concentração de clorofila na folha mais jovem
completamente expandida. Essa medição foi feita por meio do clorofilômetro portátil (modelo
CCM-200, Opti-Science). Forma realizadas cinco leituras em uma área pré-determinada da
folha. As duas leituras mais discrepantes foram excluídas, sendo utilizadas apenas as três
leituras restantes para o cálculo da média.
Para o experimento de estresse salino, no 2º estádio de desenvolvimento, as plantas foram
medidas apenas ao final do experimento, ou seja, doze dias após o início do estresse. No
experimento de estresse de frio foram realizadas oito avaliações, sendo a primeira quando as
plantas-controle e aquelas que seriam submetidas ao frio ainda se encontravam na temperatura
normal de cultivo (Dia 1). Depois, foram realizadas mais seis medições diárias durante o
período de estresse, iniciando-se a partir do dia 3, após o início do tratamento por frio. Por fim,
a oitava avaliação, foi realizada durante o período de recuperação, dois dias após o aumento da
temperatura para 25 oC.
A parte aérea e as sementes das plantas foram colhidas separadamente, aos 52 dias após
o transplantio. Depois, foram secas em estufa a 72 oC, com ventilação forçada, até a obtenção
de massa constante e, em seguida, pesadas, para a determinação da massa seca. O peso de toda
a estrutura da inflorescência madura foi tomado como o peso das sementes.
Os dados de germinação foram submetidos à análise de variância utilizando o
delineamento em blocos casualizados com quatro repetições. Cada ensaio, separadamente, foi
considerado como um bloco. Os dados do experimento de salinidade no 2º estádio de
desenvolvimento foram submetidos à análise de variância utilizando o delineamento
inteiramente casualizado. As médias de ambos os experimentos foram comparadas pelo teste
Tukey (α: 0,05), utilizando o programa estatístico Assistat versão 7.7 (SILVA, 2014). Os dados
de área foliar e parâmetros de raiz foram submetidos à análise de regressão linear com o uso da
função abline do software R (R CORE TEAM, 2017).
63
Para avaliação dos dados de frio, sortearam-se cinco plantas dentre as quinze submetidas
ao estresse. Os dados de trocas gasosas mensurados neste ensaio foram plotados em gráficos
utilizando o software R (R CORE TEAM, 2017). Os dados de biomassa da parte aérea e das
sementes nos dois estádios de desenvolvimento foram submetidos à análise de variância,
considerando-se o delineamento experimental inteiramente casualizados com repetições, sendo
cinco repetições no controle e cinco repetições no tratamento. As médias foram comparadas
pelo teste Tukey (α: 0,05).
64
3 RESULTADOS
3.1 Efeito do estresse salino sobre a germinação de sementes, desenvolvimento inicial de
plântulas e 2º estádio de desenvolvimento da Setaria viridis (acesso A10.1)
De maneira geral, o aumento da concentração salina no substrato, em maior ou menor
grau, alterou as respostas das variáveis medidas, tanto relativas à germinação das sementes
quanto ao desenvolvimento inicial das plântulas de S. viridis. Ocorreu uma alta percentagem
de germinação das sementes tanto no controle quanto nos tratamentos em que a concentração
salina atingiu até 90 mM de NaCl. A partir de 120 mM de NaCl no substrato, a percentagem de
germinação das sementes foi reduzida. Enquanto o controle apresentou 98% de germinação, as
sementes mantidas em meio com concentrações salinas de 120 e 150 mM de NaCl apresentaram
percentagem de germinação de 89 e 82%, respectivamente (TABELA 1).
Tabela 1 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato de cultivo sobre a
germinação das sementes de S.viridis sob diferentes concentrações de NaCl.
Médias seguidas de mesma letra nas colunas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey
(p≤0,05).
Fonte: Do autor (2017).
Diferentemente da germinação das sementes, a parte aérea das plântulas de S. viridis foi
drasticamente afetada pelo aumento da concentração salina no substrato, ocasionando uma
relação praticamente linear entre o aumento na concentração de NaCl e a redução na área foliar
(FIGURAS 2 e 3). O efeito do aumento da concentração salina sobre a área foliar foi tão forte
que as plântulas mantidas sob 150 mM de NaCl apresentaram, em média, apenas 8 % da área
foliar das plantas-controle.
Concentração de NaCl (mM) % de sementes germinadas
0 98a ± 3,72
30 95ab ±4,17
60 98a ±5,30
90 95ab ±4,96
120 89bc ±6,23
150 82c ±9,64
CV% 5.84
65
Figura 2 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato sobre a área foliar das
plântulas de Setaria viridis (acesso A10.1).
Fonte: Do autor (2017).
Figura 3 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato sobre o aspecto visual e
imagem da fluorescência da clorofila da parte aérea de plântulas de S. viridis.
0 1
(1) Imagem digital RGB de plântulas de S. viridis (acesso A10.1); (2) imagem derivada da técnica
fluorescência da clorofila por imagem (método do pulso de saturação). Os valores dos dados relativos a
cada planta na imagem podem ser mapeados com o auxílio da falsa barra de cores localizada abaixo.
Concentração de NaCl: 0 mM (A), 30 mM (B), 60 mM (C), 90 mM (D), 120 mM (E) e 150mM (F). Fonte: Do autor (2017).
2
1
66
À semelhança dos efeitos observados sobre a área foliar, as variáveis relacionadas à
morfologia radicular também foram drasticamente afetadas pelo aumento da concentração
salina no substrato. Em consonância com o efeito visual (FIGURA 4), houve uma forte
correlação linear negativa entre a concentração salina e o valor determinado para cada variável
(FIGURA 5). As variáveis mais negativamente afetadas foram o volume, comprimento por
volume e comprimento, com uma queda de 88,73; 86,01 e 77,78% respectivamente. Por outro
lado, a variável menos afetada foi o diâmetro, que apresentou uma queda de apenas 15,94%.
Figura 4 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato sobre a imagem escaneada
de plântulas de S. viridis (acesso A10.1).
Concentração de NaCl: 0 mM (A), 30 mM (B), 60 mM (C), 90 mM (D), 120 mM (E) e 150mM (F).
Fonte: Do autor (2017).
67
Figura 5 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato sobre as variáveis de
morfologia radicular em S. viridis (acesso A10.1).
A: comprimento total (cm); B: área total projetada (cm²); C: área total da superfície (cm²); D:
Diâmetro médio (mm); E: comprimento por volume (cm/mm³); e F: volume (cm³).
Fonte: Do autor (2017).
Os valores de condutividade elétrica medidos nas soluções salinas originais, com
diferentes concentrações de NaCl, mantiveram a proporcionalidade esperada (TABELA 2).
Após a aplicação destas soluções sobre o substrato, de acordo com o tratamento, a
condutividade elétrica medida inicialmente manteve certa proporcionalidade com a
concentração inicial de NaCl da solução original (FIGURA 6), com algumas particularidades.
Observou-se, por exemplo, que a CE do substrato foi maior do que a CE da solução original,
em todos os tratamentos. Mesmo no substrato que não recebeu adição de NaCl, em que a CE
da solução original foi praticamente zero, a condutividade elétrica medida atingiu valores
superiores a 5 dS m-1. A explicação, muito provavelmente, pode estar relacionada
principalmente ao efeito iônico dos sais presentes nos adubos químicos, previamente
misturados ao substrato para a nutrição das plantas.
68
De maneira geral, o substrato apresentou a maior condutividade elétrica no primeiro dia,
após a adição de NaCl, independentemente da concentração salina utilizada. Ao longo do
tempo, houve queda na CE dos substratos em todas as concentrações salinas, porém de forma
mais pronunciada em concentrações salinas mais altas. A estabilidade na CE foi atingida mais
rapidamente nas concentrações salinas mais baixas (0 e 30 mM), por volta de 4 dias, seguidas
pelas demais concentrações (60, 90, 120 e 150 mM), por volta de 6-8 dias. Isto sugere que há a
necessidade de um período de incubação, após a aplicação do sal, para que as trocas iônicas
entre o substrato e a solução entrem em equilíbrio, o qual depende da quantidade de sal aplicada.
Tabela 2 – Efeito do aumento da concentração de NaCl sobre a condutividade elétrica das
soluções de rega.
Fonte: Do autor (2017).
Figura 6 – Efeito do aumento da concentração de NaCl sobre as mudanças nos valores de
condutividade elétrica do substrato durante o período de incubação (dia 1, 4, 6 e 8).
Fonte: Do autor (2017).
Concentração de NaCl (mM) CE (mS -1)
0 0,01
30 3,1
60 6,44
90 9,61
120 12,5
150 15,43
69
De forma semelhante ao ensaio preliminar anterior, os valores de CE do substrato,
considerando as doses de NaCl a que as plantas de S. Viridis foram efetivamente submetidas,
mantiveram-se diretamente proporcionais à concentração salina aplicada (TABELA 3). Ou
seja, quanto maior a quantidade de sal aplicada ao substrato, maior a condutividade elétrica e
menor o potencial hídrico. Após o cultivo das plantas, apesar de se manter a proporcionalidade
da CE e o do potencial hídrico entre os tratamentos, em função da concentração salina, os
valores de CE tornaram-se mais baixos e, consequentemente, os valores de potencial hídrico
tornaram-se mais altos (TABELA 4). Tais resultados sugerem que uma determinada quantidade
de sal pode ter sido removida da solução do substrato, seja por adsorção às paredes celulares
das raízes ou por absorção ou, ainda, por ambos os processos.
Tabela 3 – Efeito do aumento da concentração salina sobre os valores de condutividade elétrica
(CE) e potencial hídrico (Ψw) no substrato sem cultivo de plantas de Setaria viridis.
NaCl (g/dm³) CE (dS m-1) Ψw
0 6,99 ± 0,22 -0,11 ± 0,08
2 12,32 ± 0,69 -0,28 ± 0,07
4 18,41 ± 1,24 -0,63 ± 0,08
6 28,23 ± 1,91 -0,87 ± 0,06
8 33,89 ± 2,54 -1,06 ± 0,06
10 37,61 ± 2,63 -1,26 ± 0,14
Fonte: Do autor (2017).
Tabela 4 – Efeito do aumento da concentração de NaCl sobre os valores de condutividade
elétrica (CE) e do potencial hídrico (Ψw) determinados no substrato com cultivo de
plantas de Setaria viridis.
NaCl (g/dm³) CE (dSm-1) Ψw
0 4,78 ± 0,46 -0,02 ± 0,08
2 9,89 ± 1,54 -0,34 ± 0,07
4 14,71 ± 1,85 -0,49 ± 0,07
6 20,39 ± 4,28 -0,63 ± 0,12
8 24,21 ± 2,71 -0,61 ± 0,11
10 32,84 ± 4,21 -0,80 ± 0,18 Fonte: Do autor (2017).
As observações visuais ao final do experimento e os dados de pesagem da parte aérea e
raiz no 8º dia de estresse indicam que as diferentes concentrações de NaCl aplicadas ao
substrato de cultivo manifestaram o seu efeito principalmente sobre o tamanho e a
sobrevivência das plantas de S. viridis (FIGURA 7, TABELA 5). Houve redução no tamanho
70
das plantas a medida em que se aumentou a quantidade de NaCl até 6 g/dm3. Nos tratamentos
com maiores quantidades de NaCl, ou seja, 5 (8g/dm³) e 6 (10g/dm³), todas as plantas morreram.
Figura 7 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato de cultivo sobre o aspecto
visual de plântulas de Setaria viridis (acesso A10.1).
Imagem digital RGB de plântulas após 12 dias submetidas aos seguintes tratamentos: 0,2,4,6,8 g/dm³
de Nacl. Quantidade de NaCl: (1) 0 g/dm³, (2) 2 g/dm³, (3) 4 g/dm³, (4) 6 g/dm³, (5) 8 g/dm³ e (6)
10g/dm³.
Fonte: Do autor (2017).
Tabela 5 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato de cultivo sobre a massa
da parte aérea e do sistema radicular das plantas de Setaria viridis (acesso A10.1) aos
oito dias após a submissão a diferentes quantidades de NaCl.
NaCl (g/dm³) Parte aérea (g) Raízes (g)
0 2,965 ± 0,29 1,01 ± 0,08
2 1,68 ± 0,01 0,56 ± 0,06
4 1,28 ± 0,07 0,44 ± 0,06
6 0,775 ± 0,04 0,185 ± 0,05
8 0,145 ± 0,04 0,065 ± 0,01
10 0,135 ± 0,01 0,05 ± 0,00
Fonte: Do autor (2017).
Comparando-se ao controle, cujas plantas não receberam NaCl, os dados de trocas
gasosas (TABELA 6) e ICC (TABELA 7) indicam que, entre as plantas que sobreviveram ao
estresse salino, apenas aquelas submetidas ao tratamento 4 (6g/dm³) sofreram redução tanto na
taxa de assimilação líquida de CO2 quanto no ICC. Porém, todas as plantas que receberam NaCl,
independentemente da quantidade, sofreram redução nas taxas de condutância estomática e
transpiração. É interessante observar que a concentração interna de CO2 apresentou os valores
mais altos nas plantas-controle. Por outro lado, os menores valores de Ci foram observados nas
plantas submetidas às menores quantidades de NaCl. À medida que se aumentou a quantidade
71
de NaCl no substrato, houve, também, aumento em Ci, de forma que no tratamento 4 (6g/dm³),
os valores de Ci não diferiram estatisticamente do controle.
Tabela 6 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato de cultivo sobre as variáveis
de trocas gasosas em plantas de Setaria viridis (acesso A10.1) submetidas a
diferentes quantidades de NaCl após 12 dias de estresse.
NaCl (g/dm³) A gs E Ci
0 28,83a 0,242a 3,62a 170,86ª
2 28,89a 0,188b 2,95b 118,51c
4 26,11ab 0,184bc 2,86bc 141,45b
6 21,57b 0,15c 2,47c 151,36ab
CV% 12,75 13,13 11,12 11,45
As médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05).
A: Taxa de assimilação líquida de CO2 (µmol de CO2 m-2 s-1); gs: taxa de condutância estomática ao
vapor d’água (mol de H20 m-2 s-1), E: taxa de transpiração (mmol de H20 m-2 s-1); Ci: concentração
intracelular de CO2 (µmol de CO2 mol-1).
Fonte: Do autor (2017).
Tabela 7 – Efeito do aumento da concentração de NaCl no substrato de cultivo sobre o índice
de concentração de clorofila (CCI) em folhas de plantas de Setaria viridis (acesso
A10.1).
As médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05).
Fonte: Do autor (2017).
3.2 Efeito do estresse por frio sobre plantas jovens e adultas de Setaria viridis
O estresse por frio afetou as plantas de Setaria viridis em ambos os estádios de
desenvolvimento avaliados, porém com intensidade diferente. As taxas de trocas gasosas, tais
como assimilação líquida de CO2, condutância estomática e transpiração foram drasticamente
reduzidas nas plantas de S. viridis na primeira medição efetuada após a submissão a 10 oC, em
ambos os estádios de desenvolvimento (FIGURA 8). As reduções nos valores foram,
proporcionalmente, semelhantes em ambos os estádios de desenvolvimento. Tais valores se
mantiveram constantes ao longo de todo o período de estresse. Por outro lado, a concentração
interna de CO2 praticamente dobrou no mesmo período, em ambos os estádios de
desenvolvimento.
NaCl (g/dm³) ICC
0 31,27ª
2 31,11ª
4 28,68ª
6 13,01b
CV% 28,95
72
Após o retorno às condições normais de cultivo, todas as taxas de trocas gasosas das
plantas mais jovens se encontravam mais próximas ao controle do que das plantas mais velhas.
Porém, ainda não haviam alcançado os valores das plantas-controle.
Após oito dias de tratamento, as plantas-controle tornaram-se visualmente maiores do
que as plantas estressadas, em ambos os estádios de desenvolvimento (FIGURAS 9 e 10).
Entretanto, a massa da parte aérea obtida ao final do ciclo não diferiu entre os tratamentos,
independentemente do estádio no qual o estresse por foi aplicado. A produção de sementes, por
sua vez, foi negativamente afetada pelo frio, mas somente quando o mesmo foi aplicado nas
plantas no 5º estádio de desenvolvimento (TABELA 8).
73
Figura 8 – Efeito do frio sobre as taxas de trocas gasosas em Setaria viridis (acesso A10.1) cultivadas sob condições normais de 25oC (controle)
ou submetidas a estresse por frio com temperatura de 10oC durante 8 dias.
74
Dia 1: medição realizada imediatamente antes da submissão ao frio; dia 3 a 8: medições realizadas do 3º ao 8º dia, após o início do estresse; recuperação:
medição realizada no 3º dia, após o retorno a temperatura normal de cultivo. A: Taxa de assimilação líquida de CO2 (µmol de CO2 m-2 s-1); gs: taxa de condutância
estomática ao vapor d’água (mol de H20 m-2s-1; C) E: taxa de transpiração (mmol de H20 m-2s-1); Ci: concentração intracelular de CO2 (µmol de CO2 mol-1).
Fonte: Do autor (2017).
75
Figura 9 – Efeito do estresse por frio (10oC) sobre o aspecto visual das plantas de Setaria viridis
(acesso 10.1) a partir do terceiro estádio de desenvolvimento imediatamente quando
retornaram as condições de 25ºC.
C: Plantas controle, T: Plantas submetidas ao frio.
Fonte: Do autor (2017).
Figura 10 – Efeito estresse por frio (10ºC) sobre o aspecto visual das plantas de Setaria viridis
(acesso 10.1), partir do quinto estádio de desenvolvimento imediatamente quando
retornaram as condições de 25ºC.
C: Plantas controle, T: Plantas submetidas ao frio.
Fonte: Do autor (2017).
76
Tabela 8 – Efeito do estresse por frio sobre a produção de biomassa em plantas jovens e adultas
de Setaria viridis (acesso 10.1).
Estádio de desenvolvimento 15 DAT (3º estádio) 29 DAT (5º estádio)
Parte da Planta Parte aérea Semente Parte aérea Semente
Controle 5,16ª 2,52 a 6,25a 4,79a
Tratamento 4,92ª 2,188a 5,66a 3,30b
CV% 8,56 15,70 14,89 11,95
As médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p≤0,05).
Fonte: Do autor (2017).
77
4 DISCUSSÃO
4.1 Efeito do estresse salino sobre a germinação de sementes, desenvolvimento inicial e
2º estádio de desenvolvimento da Setaria viridis (acesso A10.1)
As plantas exibem diferentes respostas à salinidade do solo, incluindo adaptações que
funcionam em diferentes estádios de desenvolvimento (ABARI et al., 2011; BAYUELO-
JIMENEZ; CRAIG; LYNCH, 2002; MUNNS; TESTER, 2008). A taxa de germinação de
sementes e crescimento de raiz em substratos salinos tornou-se variáveis bastante utilizada para
se avaliar a tolerância das plantas cultivadas sob tais condições (ARAGÃO et al., 2009;
CORDEIRO et al., 2014; YI; MA; LI, 2007).
Plantas glicófitas, quando submetidas a estresse salino, exibem tipicamente germinação
reduzida e retardada, bem como o crescimento reduzido das plântulas (GUO et al., 2012;
KHALIL; BOUFOUS; MOUSADIK, 2011). Inicialmente, a presença de sais no solo reduz o
seu potencial hídrico, restringindo a absorção de água pela semente (PEREIRA et al., 2012). A
penetração de solutos através do revestimento da semente induz ainda à toxicidade iônica,
mudanças na composição lipídica e interfere no funcionamento da membrana plasmática,
incluindo a permeabilidade e o transporte (BLISS; PLATT-ALOIA; THOMSON, 1984;
CORDEIRO et al., 2014; GALPAZ; REYMOND, 2010; JOB et al., 2005). Todos esses fatores
interferem, portanto, na emergência da plântula.
As sementes de S. viridis (Acesso 10.1) apresentam altas percentagens de germinação,
mesmo na concentração salina mais alta utilizada. Experimentos realizados em espécies da
família Poaceae, da qual S. viridis faz parte, mostraram resultados similares. Sementes de
Capim-arroz, por exemplo, quando submetidas a concentrações crescentes de NaCl,
apresentaram germinação superior a 80% até na concentração de 150 mM, tendo a germinação
completamente inibida somente em 400 mM de NaCl (SADEGHLOO; ASGHARI;
GHADERI-FAR, 2013). Em milho, ensaios utilizando aproximadamente 40, 80, 120, 160 e 200
mM, para três diferentes tipos de sais (NaCl, CaCl2 e KCl), mostraram que a germinação das
sementes não foi afetada por nenhum dos sais utilizados, independentemente da concentração
(CONUS et al., 2009).
Contrastando com os resultados destes estudos, sementes de um cultivar de soja, e de
sua derivada transgênica, apresentaram queda considerável na germinação com o aumento da
salinidade. Entretanto, os genótipos se diferenciaram ao se avaliar o volume e o comprimento
das raízes das plântulas. O transgênico obteve melhor reação frente à situação de estresse,
passando a investir as reservas da semente no crescimento da raiz primária, o que, segundo os
78
autores do experimento, pode ser considerado uma estratégia para ampliar a região de captação
de água (CARVALHO et al., 2012).
Apesar de algumas espécies apresentarem germinação reduzida quando submetidas à
salinidade, Muscolo; Panuccio; Eshel, (2013) afirmam que a maioria das culturas é mais
suscetível à salinidade durante o crescimento inicial pós-germinação do que em outros estágios
do seu ciclo de vida. Estudos mostram que apesar de se observar uma alta taxa de germinação
em substratos salinos, pode ocorrer uma redução na área foliar, altura das plântulas e número
de folhas, com consequente redução da fitomassa da parte aérea (CAVALCANTI et al., 2005a,
2005b; CONUS et al., 2009).
Em condições salinas, a redução na taxa de crescimento da parte aérea das plantas, em
geral, é proporcionalmente maior do que a redução na taxa de crescimento das raízes
(GONÇALVES; TÁVORA; HERNANDEZ, 2001). Tais resultados foram observados,
também, nas plântulas de S. viridis avaliadas neste estudo. Acredita-se que a redução no
tamanho da parte aérea e no sistema radicular esteja associada a certa sensibilidade da S. viridis
ao estresse salino. A área foliar é um parâmetro importante na avaliação de plantas submetidas
à salinidade, uma vez que está intimamente relacionada ao processo fotossintético e,
consequentemente, à produção de biomassa.
Thellungiella halophila, uma espécie considerada tolerante ao sal, teve os efeitos da
salinidade sobre a germinação e o crescimento de plântulas comparada com A. thaliana, numa
concentração crescente de 0-200 mM de NaCl. Os resultados demostram que a salinidade inibiu
a germinação de sementes em ambas as espécies. No entanto, sementes de T. halophila não
sofreram toxicidade iônica, o que foi evidenciado pela maior taxa de germinação final após
sementes não germinadas pré-tratadas com NaCl serem transferidas para água destilada. As
mudas de T. halophila apresentaram maior tolerância ao sal do que aquelas de A. thaliana, tendo
melhor crescimento de plantas (comprimento de raiz, massa fresca e seca) (GUO et al., 2012).
Os efeitos do estresse salino sobre as raízes de três espécies halófitas, na fase de plântula
foram estudados com o sistema Rootedge, semelhante ao Winrhizo. Observou-se que as
relações entre crescimento e o ambiente osmótico foram claramente refletidas no sistema
radicular. Diferentes concentrações de NaCl não tiveram influência significativa sobre o
diâmetro médio do sistema radicular, embora com uma ligeira tendência de diminuição com o
aumento da concentração de sal (YI; MA; LI, 2007). Resultado semelhante foi encontrado em
S.viridis. Das variáveis radiculares mensuradas, o diâmetro foi a menos afetado apresentando
uma queda de apenas 15,94% para a concentração mais alta. Este resultado mostra que o
79
diâmetro das raízes parece não representar uma resposta para suscetibilidade ou tolerância ao
estresse salino.
Os Acessos Col-0, Ws e Ler da planta modelo A. thaliana, comumente usadas para
ensaios de laboratório, são considerados extremamente sensíveis ao sal, entretanto, existe
variação entre acessos de ocorrência natural (BAXTER et al., 2010; GALVAN-AMPUDIA;
TESTERINK, 2011; KATORI et al., 2010). Acessos de A. thaliana quando avaliados sob
estresse salino a 125, 175 ou 200 mM de NaCl, por meio de uma metodologia similar a utilizada
neste estudo para S. Viridis, apresentaram grande variação de resposta. Sob 125 mM de NaCl,
a maioria dos acessos foi capaz de geminar, mas o desenvolvimento da raiz foi prejudicado.
Alguns acessos mostraram sensibilidade extrema e não germinaram nesta concentração de
NaCl. A resposta ao estresse salino foi quantificada como a percentagem de redução no
comprimento da raiz. O acessos mais sensíveis apresentaram redução de até 95% (GALPAZ;
REYMOND, 2010).
A redução inicial no crescimento da parte aérea da planta é, provavelmente, devido aos
sinais hormonais gerados pelas raízes (MUNNS, 2002). Entretanto, a raiz pode interagir com o
estresse ambiental, ajustando seu sistema no que diz respeito a adaptações morfológicas e
fisiológicas (YI; MA; LI, 2007), mantendo, assim, um crescimento da parte área da planta. As
plântulas tendem a direcionar suas reservas para o desenvolvimento radicular à medida que seus
tecidos passam por estresses salino ou hídrico (GALVAN-AMPUDIA; TESTERINK, 2011;
SANCHEZ-CALDERON et al., 2005). No entanto, se houver um declínio do crescimento da
raiz, a absorção de nutrientes é prejudicada; o que, consequentemente, reduz o crescimento de
todos os órgãos das plantas (FEIJÃO et al., 2013; MUNNS; TESTER, 2008; SOUSA et al.,
2016; TAGLIAFERRE et al., 2016).
Os resultados demostraram que tanto as plântulas de S. viridis do ensaio de germinação,
quanto as plantas no 2º estádio de desenvolvimento, apresentaram redução na taxa de
crescimento da parte aérea e raiz. Mais especificamente no 2º estádio de desenvolvimento as
plantas morreram quando submetidas aos tratamentos 8 e 10 g/dm³ de NaCl, e a parte aérea e
raiz dessas plantas apresentavam cerca de somente 5% do peso das plantas controle. A morte
das plantas, além de outros fatores como o estresse hídrico ocasionado pelo efeito osmótico,
pode estar ligada a redução da absorção de nutrientes por competição iónica gerada pela alta
salinidade (FEIJÃO et al., 2013).
Independentemente do tipo de estresse, plantas tolerantes conseguem manter taxas
fotossintéticas razoáveis, mesmo em condições desfavoráveis (OLIVEIRA JUNIOR et al.,
2016). A redução da taxa fotossintética pelo estresse salino pode ocorrer devido a desidratação
80
das membranas celulares, o que reduz a permeabilidade do CO2, fechamento de estômatos, o
que gera a redução do suprimento de CO2, a senescência das folhas, mudança na atividade das
enzimas, como por exemplo, a inibição na atividade de fixação do carbono fotossintético e
toxicidade por sais, que se acumuladas nos cloroplastos (ESTEVES; SUZUKI, 2008; SONG et
al., 2005).
Em resumo, a redução da fotossíntese em função da salinidade tem sido atribuída a
limitações de origem estomática e não estomática (MUNNS; TESTER, 2008; PARIHAR et al.,
2015; SOUZA et al., 2011). Em S. viridis, a taxa de condutância estomática (gs) e transpiração
(E) apresentaram uma queda próxima de um terço do controle em 6g/dm³, indicando
fechamento dos estômatos para evitar a perda de água. Além disso, observou-se que a taxa de
assimilação líquida de CO2 (A) só obteve queda significativa em 6g/dm³ e que a concentração
intracelular de CO2 (Ci) apresentou uma queda em 2 e 4/dm³ e posterior elevação em 6g/dm³,
sendo que este não se diferenciou estatisticamente do controle.
Acredita-se que a manutenção na taxa fotossintética nas concentrações 2 e 4/dm³ de
NaCl foi mantida graças ao conteúdo de CO2 já fixado pela planta antes da medição, pois foi
constatado diminuição em gs e E mas não de A. Adicionalmente, a observação visual da
biomassa das plantas aos 12 dias de estresse (FIGURA 7), permitiu concluir que as plantas,
independentemente da concentração aplicada, apresentaram redução de crescimento, o que
consequentemente está relacionada a redução da entrada de CO2 via fotossíntese.
Resposta similar, utilizando o IRGA, foi encontrada para erva-sal (Atriplex numulária),
uma planta halófita altamente tolerante ao estresse salino. Nesta a diminuição da assimilação
de CO2 coincidiu com o aumento de Ci, indicando uma inibição da fixação de carbono
fotossintético. Entretanto, por ser uma planta tolerante a salinidade, houve uma pequena
variação dos valores de Ci nos últimos períodos avaliados e retorno da assimilação
fotossintética de CO2, retratando assim um período de aclimatação ao estresse imposto
(OLIVEIRA JUNIOR et al., 2016); o que não foi observado para S. viridis, pois medidas após
o 12º dia de estresse não foram realizadas.
Em plantas de S. viridis no 2º estádio de desenvolvimento, o aumento da concentração
salina além de gerar uma redução nas taxas de condutância estomática e transpiração, afetou
também o índice de concentração de clorofila. Resultados semelhantes foram encontrados em
O. sativa submetida a estresse de salinidade. Nestas houve uma redução dos teores de clorofila
a (33%) e b (41%), com 200 mM de NaCl (AMIRJANI, 2011) e 30% a e 45% b em 100 mM
NaCl (CHUTIPAIJIT; CHA-UM; SOMPORNPAILIN, 2011) e em Vigna radiata a 150 mM
de NaCL houve uma queda de 31% para a clorofila total (SAHA; CHATTERJEE; BISWAS,
81
2010). Para S viridis somente o tratamento 6 g/dm³, se diferenciou entre os demais tratamentos,
apresentando uma queda considerável no ICC, de aproximadamente um terço do controle, o
que pode estar relacionada à deterioração da membrana dos cloroplastos (MANE et al., 2010).
Alguns autores classificam as plantas cultivadas quanto à sensibilidade ao sal em quatro
categorias: sensíveis, moderadamente sensíveis, moderadamente tolerantes e tolerantes.
Segundo esta classificação, por ordem crescente de tolerância, as plantas não germinam, não
crescem e nem produzem adequadamente quando a condutividade elétrica do extrato de
saturação do solo seja superior a 1,3; 3; 6, 6,0 e 10 dS m-1 (CAVALCANTE et al., 2009;
CAVALCANTE; JÚNIOR; SÁ, 2007; RIBEIRO et al., 2016). Além disso, segundo Munns e
Tester (2008) um solo salino que reduz significativamente o rendimento da maioria das culturas
é aquele com aproximadamente 40mM de NaCl, que é relativo a uma condutividade elétrica
(Ece) 4 dS m-1 gerando uma pressão osmótica de cerca de 0,2 Mpa.
De acordo com o exposto, não se pode dizer que a S. viridis (acesso A10.1) é uma planta
sensível à salinidade com base apenas na germinação, pois a espécie apresentou alta
percentagem de germinação, mesmo na mais alta concentração de sal utilizada. Entretanto,
houve uma queda drástica na área foliar e, também, no comprimento total das raízes nos dois
estádios estudados. Estes resultados demostram que as plantas não se desenvolveram
adequadamente quando submetidas ao estresse salino, apresentando uma queda destes
parâmetros já em 30mM e 2g/dm³ de NaCl, para o ensaio de germinação e 2º estádio de
desenvolvimento respectivamente, o que demostra certo grau de sensibilidade deste acesso.
Em se tratando de espécies para a produção de biocombustíveis, por exemplo, a
biomassa é um fator altamente relevante. Esses resultados indicam, portanto que os genes
prospectados visando à melhoria dessas características podem, nesse contexto, ser validados
em S. Viridis.
4.2 Efeito do estresse por frio em plantas jovens e adultas de Setaria viridis (acesso A10.1)
As baixas temperaturas causam redução na taxa de transporte de elétrons, na atividade
da rubisco, translocação de açucares e seletividade da membrana do cloroplasto. Todos esses
fatores estão diretamente ligados à diminuição da taxa fotossintética (BATISTA-SANTOS et
al., 2011; MAHAJAN; TUTEJA, 2005). A taxa fotossintética da S. viridis foi drasticamente
afetada pelo frio em ambos os estádios de desenvolvimento avaliados, o que concorda com um
estudo realizado com genótipos de café. Estes possuíam diferentes níveis de tolerância ao frio,
apesar disso, a fotossíntese líquida e vários parâmetros de fluorescência da clorofila foram
fortemente afetados em todos os genótipos avaliados. Um aumento em Ci, no café, apontou
82
para uma ausência de limitação estomática à disponibilidade de CO2 (BATISTA-SANTOS et
al., 2011).
Em contraste, um estudo realizado em Mangifera indica, a queda drástica da taxa de
fotossíntese foi atribuída ao fechamento dos estômatos devido a alteração da sensibilidade de
células guarda ao CO2, e também a uma menor atividade da Rubisco (ALLEN et al., 2000).
Outro estudo em café demostrou que a diminuição gradual da temperatura (25/20°C dia e 15/10
°C noite), levou a uma fotoinibição induzida pelo frio. Considerando que os mesmos também
apresentavam altos índices de concentração interna de CO2, esse fator foi atribuído à inativação
bioquímica (atividade de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase /oxigenase e síntese de
carboidratos) e biofísica (funcionamento do sistema antena, eficiência do fotossistema II e
transporte linear de elétrons), ao invés de restrições estomáticas à condutância ao CO2
(RAMALHO et al., 2003).
Segundo Yamori et al., (2010) as espécies de plantas tolerantes ao frio, como o
espinafre, o trigo de inverno, o centeio e o feijão-fava, são capazes de manter elevadas taxas de
assimilação de CO2, devido à alteração do conteúdo da Rubisco. Para Marenco et al. (2014), a
aclimatação à baixa temperatura está relacionado ao aumento no conteúdo de enzimas da
fotossíntese, como por exemplo a Rubisco; síntese de formas da Rubisco tolerantes ao frio e
síntese de componentes de membrana que permitam a manutenção de fluidez em baixas
temperaturas.
Considerando que em S. viridis a taxa de condutância estomática e a taxa de transpiração
apresentaram uma queda considerável, e que, a concentração intracelular de CO2 (Ci)
apresentou um aumento significativo, acredita-se que por ter havido uma inativação enzimática
responsável pela fixação de CO2, já que mesmo com uma diminuição da condutância estomática
os níveis de concentração intracelular de CO2 permaneceram altos nos dias de estresse. Outro
fator a ser observado é que a taxa fotossintética (assimilação líquida de CO2) voltou a aumentar
na recuperação, indicando assim que não houve danos irreversíveis ao sistema fotossintético.
Entretanto, medidas fotoquímicas em S. viridis submetida ao frio podem caracterizar de forma
mais clara se há ou não danos ao sistema de membranas dos cloroplastos e, consequentemente,
ao centro de reação do PSII.
Plantas submetidas ao frio apresentam ainda crescimento mais lento, o que pode ser
reflexo da redução da atividade metabólica. Em famílias mutantes de arroz submetidos a 15 ºC
por exemplo, houve uma diminuição de até 20% na estatura (MARTINS et al., 2007).
Linhagens e híbridos de milho tolerantes ao frio foram submetidos a 10 ºC dia / 7 ºC noite e 10
ºC dia / 4 ºC noite, respectivamente, durante uma semana. Estes apresentaram, em geral, uma
83
estagnação do crescimento durante a exposição ao frio, embora alguns genótipos continuassem
crescendo lentamente, o que foi recuperado após a elevação da temperatura. Os autores
afirmaram que esse resultado sugere que a estagnação do crescimento pode ser uma estratégia
de recuperação rápida após um estresse leve (RIVA-ROVEDA et al., 2016).
Estes resultados concordam com o encontrado para S. viridis, que quando submetidas
ao frio apresentaram visual estagnação de crescimento, entretanto ao voltarem para temperatura
de 25 ºC não apresentaram diferença da biomassa final em relação ao controle. No entanto,
como essa avaliação foi apenas visual, não se pode afirmar uma total estagnação do
crescimento. Para o ensaio com milho supracitado, por exemplo, a manutenção do crescimento,
mesmo lenta, em alguns genótipos, apesar da redução da capacidade fotossintética, sugeriu uma
fixação de carbono altamente eficiente, mostrando assim uma tolerância ao frio, o que não se
pode afirmar em S. viridis (RIVA-ROVEDA et al., 2016).
84
5 CONCLUSÃO
Os ensaios de salinidade mostraram que a Setaria viridis (acesso 10.1), apresentou alta
germinação mesmo na concentração salina mais alta utilizada, entretanto os parâmetros de raiz
e parte área foram fortemente afetos, tanto nas plântulas oriundas do ensaio de germinação
quanto no 2º e estádio de desenvolvimento. Apenas as plantas submetidas ao tratamento 4
(6g/dm³) sofreram redução tanto na A quanto no ICC, porém, todas as plantas sofreram redução
nas taxas de gs e E. A concentração intracelular de CO2 (Ci), por sua vez, teve os valores mais
baixos nas concentrações salinas mais baixas e o valor mais alto na concentração salina mais
alta, em que as plantas sobreviveram, sendo que esta não se diferenciou estatisticamente do
controle.
O ensaio de frio demostrou que a Setaria viridis (acesso 10.1) apresenta redução em gs,
E e A quando submetida a 10°C nos dois estádios avaliados. Contudo, a Ci aumenta quando as
plantas são estressadas. A biomassa da parte aérea, por sua vez, não foi afetada pelo frio em
ambos os estádios avaliados, exceto a biomassa da semente que foi negativamente afetada no
5º estádio de desenvolvimento.
Entendendo que existe uma escassez de estudos que avaliem a sensibilidade dos acessos
de Setaria viridis quanto a estresse abióticos, acredita-se que este estudo pode contribui para o
uso dessa espécie como planta modelo para validação de genes de resistência a estes estresses.
Os resultados aqui apresentados indicam certa sensibilidade da S. viridis para os dois estresses
avaliados; entretanto, estes necessitam ser melhor caracterizados.
Testes adicionais, a exemplo de estresse salino que vão desde a fase de germinação,
prolongando-se até os estágios de desenvolvimento mais avançados, ou seja, partindo da fase
osmótica e embebição das sementes até a fase tóxica de íons nas folhas fotossintetizantes,
podem caracterizar melhor o comportamento de S. viridis ao estresse salino. Para o estresse de
frio, testes para avaliação de forma mais prologada da recuperação dessa cultura podem inferir
com mais clareza se existe ou não uma recuperação efetiva nas trocas gasosas relacionados aos
componentes do sistema fotossintético. Além disso, estresses mais prolongados e com
diferentes níveis de temperatura podem inferir mais adequadamente os níveis de sensibilidade
de S.viridis ao frio.
85
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90
CAPÍTULO 3
Análise em larga escala de genes análogos de resistência (RGAs) codificadores de
domínios NBS no gênero Elaeis
RESUMO
A palma de óleo é responsável pela maior parte do fornecimento de óleo vegetal consumido no
mundo, sendo utilizada em vários setores, a exemplo da indústria de cosméticos, farmacêutica,
siderúrgica, alimentícia e mais recentemente no setor de biocombustíveis. Um dos grandes
desafios para o cultivo dessa cultura é a suscetibilidade a diversas doenças, o que gera grandes
prejuízos. A introgressão de genes de resistência é uma medida importante para mitigar esse
problema e viabilizar com mais segurança o desenvolvimento da cadeia produtiva da palma de
óleo. A maioria dos genes de resistência identificados em plantas codificam proteínas da família
NBS-LRR que desempenham importante papel no reconhecimento de uma variedade de
patógenos e na resposta de defesa. Diante da problemática exposta, este estudo teve como
objetivo identificar e caracterizar potenciais genes NBS-LRR presentes no genoma de Elaeis
spp. Para isso, foram utilizadas sequências de NBS-LRR identificadas no genoma de E.
guineensis por meio de um perfil HMM aminiácidico e sequências RGA NBS-LRR
identificadas na montagem parcial do genoma de E. oleifera por meio de um perfil HMM
nucleotídico. As sequências encontradas para E. oleifera foram ainda submetidas a uma busca
das Janelas Abertas de Leituras (ORF) pelo programa ORFFinder e a identificação dos motivos
dentro das ORFs encontradas por meio do programa InterPro. As sequências identificadas em
E.guineensis e E oleifera foram utilizadas para a construção de uma árvore filogenética. Para a
construção desta árvore foram incluídas ainda sequências de Arabidopsis thaliana
(dicotiledônea) e Brachypodium distachyon (monocotiledônea), espécies com NBS-LRR bem
caracterizados, o que possibilitou a classificação das sequências NBS- LRR dentro de gênero
Elaeis. O Perfil HMM aminoácido, permitiu encontrar 220 sequências NBS-LRR em Elaeis
guineensis, 20 a mais do que reportado na literatura até então. O perfil HMM nucleotídeo
identificou 45 scaffolds dentro do genoma de E. oleifera dos quais 36 ORFs apresentaram
domínios estruturais dentro da família NBS-LRR com homólogos em proteínas já descritas para
Elaeis guineensis, Phoenix dactylifera, Glycine max e Arabidopsis thaliana. A análise
filogenética permitiu a classificação das sequências de Elaeis spp. em sete grupos distintos,
sendo CNL (CC-NBS-LRR), XNL (X-NBS-LRR), CN (CC-NBS), N (X-NBS), C (CC-X), TX
(TIR-X) e TN (TIR-NBS), além disso a identificação de seis ortólogos em B. distachyon. Este
estudo representa a primeira análise em grande escala da diversidade desta família de genes no
gênero Elaeis.
Palavras-chave: Elaeis guineensis. Elaeis oleifera. Estresse biótico. NBS-LRRs.
91
ABSTRACT
Oil palm is responsible for most of the vegetable oil supply consumed in the world, being used
in several sectors, such as the cosmetics, pharmaceutical, steel, food and more recently in the
biofuels industry. One of the great challenges for the cultivation of this culture is the
susceptibility to various diseases, which generates great damages. The introgression of
resistance genes is an important measure to mitigate this problem and to oil palm productive
chaim more safely. Most resistance genes identified in plants encode NBS-LRR family proteins
that play an important role in the recognition of a variety of pathogens and in the defense
response. In view of the exposed problem, this study aimed to identify and characterize potential
NBS-LRR genes present in the genome of Elaeis spp. For this, NBS-LRR sequences identified
in the E. guineensis genome were used by means of an aminoacyanic HMM profile and RBS
NBS-LRR sequences identified in the partial assembly of the E. oleifera genome by means of
a nucleotide HMM profile. The sequences found for E. oleifera were also subjected to a search
of the Open Reading frames (ORF) by the ORFFinder program and the identification of the
reasons within the ORFs found through the InterPro program. The sequences identified in
E.guineensis and E oleifera were used to construct a phylogenetic tree. For the construction of
this tree, sequences of Arabidopsis thaliana (dicotyledonous) and Brachypodium distachyon
(monocotyledonous) were also included, species with well-characterized NBS-LRR, which
allowed the classification of NBS-LRR sequences within genus Elaeis. The HMH aminoacid
profile, allowed to find 220 NBS-LRR sequences in Elaeis guineensis, 20 more than reported
in the literature so far. The nucleotide HMM profile identified 45 scaffolds within the E. oleifera
genome of which 36 ORFs showed structural domains within the NBS-LRR family with protein
homologues already described for Elaeis guineensis, Phoenix dactylifera, Glycine max and
Arabidopsis thaliana. The phylogenetic analysis allowed the classification of the Elaeis spp.
sequences into seven distinct groups, being CNL (CC-NBS-LRR), XNL (X-NBS-LRR), CN
(CC-NBS), N (X-NBS), C (CC-X), TX (TIR-X) and TN (TIR-NBS), in addition to the
identifying six orthologs in B. distachyon. This study represents the first large-scale analysis of
the diversity of this gene family in the genus Elaeis.
Keywords: Elaeis guineensis. Elaeis oleifera. Biotic stress. NBS-LRRs
92
1 INTRODUÇÃO
O gênero Elaeis é constituído por duas espécies, a Elaeis guineensis (a Palma de óleo
africana, ou dendê) e a Elaeis oleifera (Palma de óleo americana ou caiaué), ambas possuem
16 pares de cromossomos (2n=2x=32) e podem cruzar entre si produzindo descendentes férteis
(CORLEY; TINKER, 2003; DRANSFIELD et al., 2005). Aproximadamente um terço de todo
óleo vegetal consumido no mundo é oriundo da Palma de óleo (SINGH et al., 2013). Este óleo
está presente em diversos setores e vem ganhando espaço no mercado de biocombustíveis,
servindo como fonte de diversificação de matéria prima para a produção de biodiesel
(BORGES; COLLICCHIO; CAMPOS, 2016; CORLEY, 2009).
A hibridação interespecífica entre as duas espécies do gênero busca associar
características benéficas do caiaué, como resistência a doenças, a alta produtividade do dênde.
Um exemplo disso é o híbrido BRS Manicoré, que além de outras características importantes,
apresenta resistência ao Amarelecimento Fatal (AF), anomalia que apresenta desenvolvimento
inicial quase imperceptível, e que, apesar de ser um problema grave nos cultivos da palma de
óleo, ainda apresenta etiologia desconhecida (BRAZILIO et al., 2012; 2010; RIOS et al., 2012).
Mesmo diante deste avanço, sabe-se que os cultivos da palma de óleo estão susceptíveis a
muitas outras doenças, como é o caso da mancha foliar de cercospora, antracnose, necroses
foliares e anel vermelho (TRINDADE, 1997). As doenças causadas pelos patógenos fúngicos
Ganoderma spp. e Fusarium oxysporum, por exemplo, podem levar a grandes perdas.
A infecção das raízes e tecidos de caule inferior por Ganoderma boninense resulta em
podridão basal da haste, seguido por murchidão da fronde e redução nos rendimentos de frutos
(SINGH, 1991). Considerando que mortalidade pode chegar a 70 ou 80% (ARIFFIN; IDRIS;
SINGH, 2000; DE FRANQUEVILLE; RENARD, 1990), e que o patógeno reduz a vida
produtiva das palmas com o aumento da incidência da doença ao longo de sucessivos ciclos de
plantio (MILLER et al., 1999; TURNER, 1981), a podridão basal da haste apresenta-se como
uma doença significativa à produção sustentável de palma de óleo, principalmente em áreas
importantes de produção como na Ásia.
O Fusarium oxysporum f. sp. elaeidis, por sua vez, causa a murcha vascular em
palmeiras adultas e também em palmeiras imaturas após replantação. A murcha quando aguda
se caracteriza por uma secagem das folhas que pode levar a morte em três meses. Já na murcha
crônica, as plantas podem permanecer vivas, porém atrofiadas, durante vários anos. A
observação microscópica das raízes afetadas revela tipicamente o escurecimento dos tecidos
vasculares, com tiloses e gomas bloqueando os vasos do xilema (FLOOD, 2006). Como
93
observado para Ganoderma, a mortalidade pode ser drástica, atingindo até 70% em certas áreas
de produção na África (DE FRANQUEVILLE; RENARD, 1990). Somando a isso, existem
ainda patógenos não relatados que podem ser introduzidos através de intercâmbios de materiais
vegetais e ampliar ainda mais esse problema (CARVALHO; SANTOS, 2013).
O uso de agroquímico para controle de doenças gera tanto custo econômico quanto
ambiental. Diante disto, faz-se necessário desenvolver medidas sustentáveis para mitigar
futuros prejuízos causados pela proliferação de doenças. Apesar dos avanços conseguidos pelos
programas de melhoramento estabelecidos, o longo ciclo reprodutivo da palma de óleo dificulta
o melhoramento clássico, necessitando assim de técnicas biotecnológicas para o emprego da
resistência genética que se caracteriza como uma alternativa viável para a introgressão de alelos
de resistência em genótipos de palma de óleo de elite.
Para se defender dos patógenos, as plantas apresentam primeiramente barreiras físicas
e químicas. Como uma segunda linha da resposta imunológica, os receptores existentes em
proteína de resistência citoplasmáticos (R) podem reconhecer os efetores de agentes
patogénicos e ativar a imunidade provocada por efetor (ETI), (ELLIS; DODDS; PRYOR, 2000;
JONES; DANGL, 2006). A ETI leva a respostas de defesa que limitam o avanço do patógeno
através da ativação de uma resposta hipersensível e morte localizada das células infectadas.
As proteínas codificadas pelos genes de resistência apresentam domínios conservados
(BENT, 1996) e, a partir da homologia e função bioquímica dos seus domínios, os produtos
proteicos dos genes R puderam ser agrupados em famílias (DANGL; JONES, 2001). Cerca de
75% dos genes R codificam proteínas semelhantes a receptores citoplasmáticos com o domínio
de ligação a nucleotídeos (NBS) e os domínios de repetição ricos em leucina (LRR),
pertencentes a uma família conhecida como NBS-LRR (AFANADOR-KAFURI et al., 2015) e
que apresentam grande importância no reconhecimento do patógeno e ativação de resposta de
defesa (DANGL; JONES, 2001)
Os produtos de genes NLR (NBS-LRR) são geralmente compostos por um N-terminal
altamente conservado e um domínio C-terminal LRR de comprimento variável, constituído por
10 a 40 motivos LRR curtos (CANNON et al., 2002). O domínio N-terminal NBS está
envolvido em vias de transdução de sinal, desencadeadas pela presença de patógeno, resultando
numa resposta de defesa pela planta, enquanto o domínio C-terminal LRR está relacionado ao
reconhecimento de moléculas efetoras produzidas pelo patógeno invasor (DODDS et al., 2006;
JIA et al., 2000). Esta classe de genes R pode ser ainda subdividida em duas subclasses, TIR-
NBS-LRR (TNL), e não-TIR-NBS-LRR (CNL) a depender do N-terminal.
94
A primeira subclasse contém um domínio com homologia com a Drosophila TOLL e o
receptor de interleucina-1 humano (TIR), enquanto que para a segunda subclasse, os membros
podem conter um motivo de coiled-coil (CC) (MAEKAWA et al., 2011; MEYERS et al., 1999)
um dedo de zinco (zinc finger) ou domínio RPW8 B (AMELINE-TORREGROSA et al., 2008;
BENT, 1996; MEYERS; MORGANTE; MICHELMORE, 2002; MILLIGAN et al., 1998).
Todos estes domínios N-terminais parecem estar envolvidos na especificidade e regulação da
sinalização (DEYOUNG; INNES, 2006). Acredita-se que as proteínas da classe TIR NBS-LRR
(TNL) são essencialmente presentes em dicotiledôneas, com raros relatos em genomas de
monocotiledôneas até à data. Em contraste, a classe de proteína não-TIR (CNL) está presente
tanto em monocotiledóneas como em dicotiledóneas (MEYERS et al., 1999).
Os genes análogos de resistência (RGAs) podem ser definidos como potenciais genes R
que contêm domínios conservados específicos e motivos característicos de famílias de gene R
conhecidas. Na ausência de sequências de genoma completo, o uso de iniciadores (primers)
específicos e degenerados para identificação de motivos dentro da família NBS- LRR, como
por exemplo o P-loop, kinase 2 e RNBS-D (TAKKEN; ALBRECHT; TAMELING, 2006) já
foram descritos em muitas culturas. Entre as monocotiledôneas, por exemplo, esse tipo de
estudo já foi realizado em milho (COLLINS et al., 1998), arroz, cevada, trigo (CHEN; LINE;
LEUNG, 1998) e banana (MILLER et al., 2008) dentre outras. Mais recentemente, tem-se
buscado RGAs diretamente nos genomas disponíveis nos bancos de dados (SEKHWAL et al.,
2015), por meio de métodos de homologia computacional. Estudos com espécies como arroz
(SINGH et al., 2015), trigo (BOUKTILA et al., 2014), milho (CHENG et al., 2012), sorgo
(CHENG et al., 2010; MACE et al., 2014) e cevada (MAYER et al., 2012) são exemplos do
uso dessa nova abordagem.
Até à publicação da primeira sequência do genoma de referência de E. guineensis
(SINGH et al., 2013), apenas poucas sequências genéticas NBS-LRR em Elaeis spp. estavam
publicamente disponíveis, derivadas da clonagem por PCR (FOAN et al., 2012) ou através da
anotação de genes transcritos (LOW et al., 2014). Embora tenha sido previsto um total de 200
genes NBS-LRR a partir das 34.802 sequências preditas de genes codificadores de proteínas na
primeira sequência completa do genoma de E. guineensis (SINGH et al., 2013) não existe
atualmente informação publicamente disponível sobre a abundância de genes e diversidade
NBS-LRR em E. oleifera, apesar do reconhecimento desta espécie como fonte de resistência a
doenças.
Considerando o recente sequenciamento do genoma de E. guineensis (SINGH et al.,
2013), o draft do genoma de E. oleifera (acesso Manicoré) gerado pela Embrapa Agroenergia
95
e a escassez de estudos que caracterizaram RGAs no genoma de Elaeis spp., objetiva-se nesse
estudo realizar a identificação e caracterização de potenciais RGAs NBS-LRR nos genomas de
Elaeis spp.
96
2 MATERIAL E MÉTODOS
Para a identificação de genes RGAs NBS-LRR em Elaeis spp., foram utilizados dois
conjuntos de dados: (i) sequências RGA NBS-LRR identificadas no genoma de E. guineensis
e (ii) Sequências RGA NBS-LRR identificadas na montagem parcial do genoma de E. oleifera.
2.1 Identificação de RGAs NBS- LRR no genoma de Elaeis guineensis
Para identificação de genes NBS-LRR no genoma de referência de E. guineensis
(SINGH et al., 2013), 52 sequências proteicas de genes R NBS-LRR derivadas de espécies de
plantas monocotiledóneas e dicotiledôneas foram selecionadas de acordo com Jupe et al.
(2012), servindo como um conjunto de treinamento para a identificação de motivos estruturais
característicos de proteínas NBS-LRR. Estas sequências foram alinhadas através do programa
MAFFT (KATOH et al., 2002) versão 6.717b e, posteriormente, filtradas para detecção das
regiões aminoacídicas mais conservadas, ou seja, presentes em mais de 50% das sequências,
por meio do programa GBlocks 0.91b (CASTRESANA, 2000).
Os alinhamentos filtrados serviram como base para a criação de um perfil de Modelo de
Markov Escondido (Perfil HMM) com auxílio do programa HMM build do pacote HMMER
3.0 (EDDY, 2008). Este perfil foi utilizado para detectar genes que codificam sequências com
elementos estruturais NBS-LRR no conjunto proteico predito do genoma de referência de E.
guineensis, por meio do programa HMM Search. Em seguida as sequências encontradas foram
recuperadas no formato FASTA pelo HMM Search to Fasta. Todas as etapas foram realizadas
em um workflow, usando os refiridos algoritimos encapsulados e disponíveis na plataforma
Southgreen Galaxy (http://gohelle.cirad.fr/galaxy/root).
Os passos supracitados também foram realizados em duas espécies, a Arabidopsis
thaliana e Brachypodium distachyon. As sequências NBS-LRR encontradas para estas duas
espécies foram filtradas e classificadas com base em IDs contidos em artigos publicados e/ ou
com base na nomenclatura disponível em bases de dados. Sendo o banco de dados NIB LRRs
da UCDAVIS (http://niblrrs.ucdavis.edu/data_links.php) para Arabidopsis thaliana e o arigo
de Tan; Wu (2012) para Brachypodium distachyon . O conjunto de sequências proteicas preditas
de E. guineensis foi acessado na base de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e as
demais espécies foram acessadas pelo Joint Genome Institute-JGI (http://jgi.doe.gov/).
97
2.2 Identificação de RGAs NBS-LRR no genoma de Elaeis oleifera
Os 200 genes que codificam as proteínas NBS-LRR na versão atual do genoma de
referência de E. guineensis (SINGH et al., 2013) foram utilizados para construir um segundo
perfil HMM, como descrito na sessão 2.2. Entretanto esse perfil foi construído baseando-se em
sequências nucleotídicas, e não aminoacídicas. A confiabilidade do perfil foi confirmada após
a identificação das mesmas 200 proteínas anotadas no genoma de referência, em seguida,
aplicado para identificar NBS-LRR nos scaffolds obtidos na montagem parcial do genoma não
anotado de E. oleifera. O genoma parcial foi obtido com o sequenciamento de um indivíduo da
população natural do estado do Amazonas (acesso Manicoré) por meio plataforma Illumina
HISeq 2000 (130X de cobertura) e montado pela Embrapa Agroenergia.
A partir dos scaffolds encontrados no genoma de E. oleifera foi realizada uma busca das
Janelas Abertas de Leituras (ORFs) pelo programa ORFFinder NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/), ajustado em um tamanho mínimo de 300
nucleotídeos. Esse procedimento foi realizado, para confirmar se os scaffolds encontrados se
comportavam como um potencial gene com comprimento esperado para a família NBS-LRR
em vez de um pseudogene. Foram selecionadas as duas maiores ORFs que não se sobrepuseram.
Com as sequências aminoacídicas para cada uma das ORFs identificadas dentro de cada
scaffold foi realizado um Smart BLAST para a identificação de sequencias homólogas nos
bancos de dados. Posteriormente, foi realizado a identificação dos motivos proteicos nas
sequencias aminoacidicas extraídas das ORFs selecionadas com auxílio do programa InterPro
Scan (https://www.ebi.ac.uk/interpro/).
2.3 Análise filogenética
As sequências proteicas NBS-LRR encontradas para E. guineensis e E. oleifera por
meio do perfil HMM nucleotídico e aminiacídico, respectivamente, foram utilizadas para a
construção de uma árvore filogenética. A fim de caracterizar a família NBS- LRR dentro de
Elaeis spp foram incluídas espécies com NBS-LRR bem caracterizados, sendo a A. thaliana
como representante em dicotiledônea e B. distachyon como representante dentro das
monocotiledôneas
As sequências de proteínas homólogas foram alinhadas utilizando o programa MAFFT. Os
alinhamentos foram filtrados utilizando GBlocks (CAPELLA-GUTIERREZ; SILLA-
MARTINEZ; GABALDON, 2009). Após a filtragem foi feita a conversão do formato de
arquivo FASTA paraPhylip, que é o arquivo de entrada do Software da árvore. Por fim foi feita
98
a construção da arvore pelo PhyML utilizando os modelos evolutivo de substituição
aminoacidica JTT e de suporte dos ramos SH-like aLRT. A árvore genética foi reconciliada
com a árvore das espécies da ordem viridiplantea (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?
Db = taxonomy) usando o software RAP-Green e visualizada através do Itol v3 (Interactive
Tree Of Life) disponível em http://itol.embl.de/.
99
3 RESULTADOS
3.1 NBS- LRR no genoma de Elaeis guineensis e Elaeis oleifera
Por meio do perfil HMM proteico baseado no conjunto de sequências de
monocotiledôneas e dicotiledôneas de acordo com por Jupe et al. (2012) foi possível encontrar
220 sequências com elementos estruturais NBS-LRR para E. guineensis, 20 a mais do que é
descrito para as proteínas NBS-LRR preditas no genoma disponibilizado por Singh et al.
(2013). O perfil empregado neste estudo permitiu ainda encontrar 520 sequências em B.
distachyon, e 199 em A. thaliana. Espécies que foram incluídas na análise pelo fato de
codificarem proteínas da família NBS-LRR (TNL e CNL) em dicotiledónea e
monocotiledóneas, respectivamente.
A análise com o perfil HMM nucleotídeo na montagem parcial do genoma de E. oleifera
identificou 45 scaffolds candidatos a conter genes NBS-LRR. A busca pelas ORFs dentro
desses 45 scaffold resultou em 36 ORFs com domínios estruturais NBS-LRR como
exemplificado na figura 1. Os resultados do Smart BLAST demostraram que das 36 ORFs
encontradas, 25 apresentaram grau de homologia com sequências de putativos genes de
resistência (RGAs) descritos em E. guineensis com identidade variando de 45% a 99% , 3 para
Phoenix dactylifera com identidade de 79, 87 e 87%, uma para Glycine max com identidade de
33% , além disso para genes de resistência descritos, sendo cinco em E. guineensis com
identidade variando entre 85 e 99%, um em A. thaliana com identidade de 53% e um P.
dactylifera com identidade de 72%. Observa-se, portanto, que das 36 sequências encontradas,
30 tiveram identidade com sequências já descritas para E. guineensis (TABELA 1).
Tabela 1 – Resultado da análise Smart BLAST para as 36 ORFs identificadas nos scaffolds do
genoma de Elaeis oleifera por meio do perfil HMM nucleotídico criado a partir das
200 sequências com domínio estruturais NBS-LRR anotadas no genoma de Elaeis
guineensis por Singh et al. (2013). (continua)
Scaffold Proteína correspondente Número de acesso Max
Score
Query
cover E value Ident
11149
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA1 [Elaeis guineensis]
XP_019710397.1 2064 99% 0.0 83%
11149
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA1 [Elaeis guineensis]
XP_019710397.1 1787 99% 0.0 96%
100
Tabela 1 – Resultado da análise Smart BLAST para as 36 ORFs identificadas nos scaffolds do
genoma de Elaeis oleifera por meio do perfil HMM nucleotídico criado a partir das
200 sequências com domínio estruturais NBS-LRR anotadas no genoma de Elaeis
guineensis por Singh et al. (2013). (continua)
Scaffold Proteína correspondente Número de acesso Max
Score
Query
cover E value Ident
26230
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA3 [Elaeis guineensis]
XP_010925190.2 2471 98% 0.0 99%
28361
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA3 [Elaeis guineensis]
XP_019703760.1 1700 98% 0.0 85%
12556
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA3 [Elaeis guineensis]
XP_019703761.1 1948 100% 0.0 95%
17555
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA3
[Phoenix dactylifera]
XP_008790471.1 1659 96% 0.0 79%
20729
PREDICTED: LOW
QUALITY PROTEIN:
putative disease resistance
protein RGA4
[Elaeis guineensis]
XP_019702111.1 2165 99% 0.0 96%
21766
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA3
[Phoenix dactylifera]
XP_008780541.1 443 56% 1 e- 158 87%
21766
PREDICTED: putative
disease resistance
protein At3g14460
[Elaeis guineensis]
XP_019703765.1
1198 92% 0.0 98%
27428
PREDICTED: disease
resistance
protein RPM1like
[Elaeis guineensis]
XP_010942924.1
1439 100% 0.0 98%
29079
PREDICTED: probable
disease resistance
protein At1g61300
[Elaeis guineensis]
XP_010936575.2
808 100% 0.0 95%
29079
Disease resistance protein
(CCNBSLRR class) family
[Arabidopsis thaliana]
NP_173041.1 70.1 56% 6 e - 14 53%
29338
PREDICTED: disease
resistance
protein RPM1like
[Elaeis guineensis]
XP_010942385. 1865 100% 0.0 99%
101
Tabela 1 – Resultado da análise Smart BLAST para as 36 ORFs identificadas nos scaffolds do
genoma de Elaeis oleifera por meio do perfil HMM nucleotídico criado a partir das
200 sequências com domínio estruturais NBS-LRR anotadas no genoma de Elaeis
guineensis por Singh et al. (2013). (continua)
Scaffold Proteína correspondente Número de acesso Max
Score
Query
cover E value Ident
30065
PREDICTED: probable
disease resistance
RPP8like protein 2
[Elaeis guineensis]
XP_019703763.1
1314 100% 0.0 92%
30781
PREDICTED: putative
disease resistance
protein At3g14460
[Glycine max]
XP_014621169.1
382 84% 4e -113 33%
32905
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA3 [Elaeis guineensis]
XP_010911917.1 1507 100% 0.0 96%
32988
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA3
[Elaeis guineensis]
XP_019703761.1
1617 100% 0 80%
33454
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA3
[Elaeis guineensis]
XP_010911917.1 1715 99% 0 80%
34229
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA1
[Elaeis guineensis]
XP_010909618.1
651 97% 0 98%
34914
PREDICTED: disease
resistance protein
RGA2like
[Elaeis guineensis]
XP_019711198.1 2026 98% 0 97%
34961
PREDICTED: putative
disease resistance RPP13like
protein 3 [Elaeis guineensis]
XP_019703764.1
1472 88% 0 97%
35204
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA3
[Elaeis guineensis]
XP_019702258.1 649 97% 0 94%
40570
PREDICTED: LOW
QUALITY PROTEIN:
putative disease resistance
protein RGA3
[Elaeis guineensis]
XP_019701453.1 1111 100% 0 63%
102
Tabela 1 – Resultado da análise Smart BLAST para as 36 ORFs identificadas nos scaffolds do
genoma de Elaeis oleifera por meio do perfil HMM nucleotídico criado a partir das
200 sequências com domínio estruturais NBS-LRR anotadas no genoma de Elaeis
guineensis por Singh et al. (2013). (continua)
Scaffold Proteína correspondente Número de acesso Max
Score
Query
cover E value Ident
42382
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA3 [Elaeis guineensis]
XP_019710349.1 2030 81% 0 97%
44786
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA3 isoform X1
[Elaeis guineensis]
XP_010914606.1
772 98% 0 45%
45348
PREDICTED: probable
disease resistance RPP8like
protein 2
[Elaeis guineensis]
XP_019703763.1 1262 99% 0 72%
49873
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA3 [Elaeis guineensis]
XP_019703761.1 1556 99% 0 77%
59748
PREDICTED: putative
disease resistance
protein At3g14460
[Elaeis guineensis]
XP_019709593.1 1072 93% 0 89%
60123
PREDICTED: LOW
QUALITY PROTEIN:
putative disease resistance
protein At3g14460
[Elaeis guineensis]
XP_019709651.1 855 100% 0 79%
63531
PREDICTED: putative
disease resistance protein
RGA3 [Elaeis guineensis]
XP_019703760.1 1170 100% 0 91%
66732
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA1 isoform X2
[Phoenix dactylifera]
XP_017698358.1 526 93% 0 87%
68411
PREDICTED: disease
resistance protein
RPM1like
[Elaeis guineensis]
XP_010905786.1 403 90% 2e -136 85%
69337
PREDICTED: LOW
QUALITY PROTEIN:
disease resistance protein
RPM1like
[Phoenix dactylifera]
XP_008777694.2 529 100% 0 72%
103
Tabela 1 – Resultado da análise Smart BLAST para as 36 ORFs identificadas nos scaffolds do
genoma de Elaeis oleifera por meio do perfil HMM nucleotídico criado a partir das
200 sequências com domínio estruturais NBS-LRR anotadas no genoma de Elaeis
guineensis por Singh et al. (2013). (conclusão)
Scaffold Proteína correspondente Número de acesso Max
Score
Query
cover E value Ident
72580
PREDICTED: disease
resistance protein
RPM1like
[Elaeis guineensis]
XP_010942931.2 673 100% 0 89%
80428
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA3
[Elaeis guineensis]
XP_010911466.2 582 100% 0 91%
82318
PREDICTED: putative
disease resistance
protein RGA3
[Elaeis guineensis]
XP_010914604.2 578 100% 0 94%
Fonte: Do autor (2017).
Figura 1 – Exemplo das representações gráficas dos domínios NBS-LRR encontrados nos
Scaffolds do genoma de Elaeis oleifera por meio do InterPro.
Legenda: dominio NBS e motivo p-loop representados em verde, dominio LRR representado em roxo
e amarelo.
Fonte: Do autor (2017).
104
3.2 Análises filogenéticas para Elaeis spp.
Das 520 sequências encontradas pelo perfil HMM para B. distachyon, foi possível
utilizar somente 183 sequências e das 199 encontradas em A. thaliana foi possível utilizar 188.
O número de sequências para cada uma destas espécies supracitadas foi resultante da filtragem
realizada a partir de artigos e bancos de dados de sequências NBS-LRR; busca que possibilitou
a classificação destas sequências em subgrupos de CNL e TNL e, posteriormente, a ancoragem
e o reconhecimento das sequências das sub-família NBS-LRR de Elaeis spp.
Um conjunto de 627 sequências aminoácidicas NBS-LRR RGAs, o que inclui as
sequências filtradas de A. thaliana e B. distachyon, além das 220 sequências identificadas para
E. guineensis por meio do perfil aminoácido e 36 sequências para E. oleifera identificadas por
meio da análise de ORFs e domínios foram alinhadas para a construção de uma árvore
filogenética global.
Os domínios NBS em A. thaliana podem ser filogeneticamente classificados em dois
grupos distintos, distinguidos pela presença e ausência de um motivo TIR nas regiões N-
terminais (MEYERS et al., 2003). Em B. distachyon, há descrição somente para o grupo
caracterizados pela ausência de um motivo TIR na região N-terminal (TAN; WU, 2012), o que
é também relatado amplamente para outras espécies monocotiledôneas. Genes NBS-LRR que
contém alguns motivos desconhecidos, foram neste estudo simbolizados como X. De acordo
com a disposição das sequências de Elaeis spp. na árvore filogenética em relação A. thaliana e
B. distachyon foi possível classificar as sequências de Elaeis em sete grupos, sendo: CNL (CC-
NBS-LRR), XNL (X-NBS-LRR), CN (CC-NBS), N (NBS), CXX (CC XX), TX (TIR X) e TN
(TIR-NBS) (TABELA 2). O grupo C incluiu sequências definidas por clados mais distantes
classificados como CN e CNL, o que permitiu inferir que estas sequências classificadas como
C apresentavam motivo CC, mas não permitiu defini-las como pertencentes a grupos de
sequências de genes regulares (CC-NBS-LRR) ou não.
Esta análise demostrou ainda divergências significativas entre as sequências regulares
de CNL em monocotiledônea e dicotiledônea (FIGURA 2), ou seja, entre as sequências
pertencentes a A. thaliana e B. distachyon. A topologia da árvore evidenciou também um grupo
bem definido para TNL, destacado em azul claro na árvore, não sendo encontradas sequências
de Elaeis spp. dentro deste grupo. Foram encontradas seis sequências de E. guineensis ortólogos
a sequências CNL descritas para B. distachyoncomo por TAN; WU (2012) como demostrado
na tabela 3.
105
Tabela 2 – Classificação dos subgrupos NBS encontrados em Elaeis spp. baseado em análise
filogenética.
Subgrupos CNL Código E. guineensis E. oleifera
CC-NBL-LRR CNL 120 24
X-NBS-LRR XNL 5 1
CC-NBS CN 46 7
NBS N 1 0
TIR-X TX 25 2
TIR-NBS TN 3 1
CC-X C 20 21
Total 220 36 Fonte: Do autor (2017).
Tabela 3 – Ortólogos entre sequências de Elaeis guineensis,descritas neste estudo e sequências
de Brachypodium distachyon e Arabidopsis thaliana descritas por Tan; Wu (2012).
Fonte: Do autor (2017).
ID Elaeis spp. Ortólogo em B. distachyon Ortólogo em A. thaliana
XP 010923974.1 ELAGV Bradi1g15650.1.pBRADI AT3G14470.1
XP 010905012.1 ELAGV
XP 010905013.1 ELAGV
Bradi3g41960.1.p BRADI AT3G14470.1
XP 010906772.1 ELAGV Bradi2g52150.1.p BRADI AT4G26090.1
XP 010910950.1 ELAGV Bradi1g67840.1.p BRADI AT4G26090.1
XP 010909985.1 ELAGV Bradi4g03230.1.p BRADI AT4G33300.1
XP 010937447.1 ELAGV Bradi2g37990.1.p BRADI AT3G07040.1
106
Figura 2 – Análise filogenética entre as sequências NBS-LRR de Brachypodium distachyon,
Arabidopsis thaliana e RGAs NBS-LRR no gênero Elaeis spp.
Legenda: XP...ELAGV: Elaeis guineensis, ARATH: Arabdopsis thaliana, BRADI: Brachypodium
distachyon, ORF...ELAGV: Elaeis oleifera. Link para visualização da árvore:
https://1drv.ms/b/s!As084N7WlXAIqHVibDsoIEIxt03M
Fonte: o autor (2017).
107
4 DISCUSSÃO
A palma de óleo (E. guineensis) e o híbrido interespecífico (E. guineensis × E. oleifera)
se destacam pelo elevado rendimento de óleo, podendo produzir no estado do Pará de 4 a 6
t/ha/ano, estado em que se concentra mais de 80% do plantio no Brasil (CHIA et al., 2009). A
demanda por óleos vegetais deve atingir 240 milhões de toneladas até 2050 (CORLEY, 2009).
Sabendo-se que a palma de óleo pode fornecer até 10 vezes mais óleo do que outras oleaginosas
(ABRAPALMA, 2015), é provável que a produção eficiente desta cultura desempenhe um
papel cada vez mais importante nessa oferta.
O crescimento da área plantada da palma de óleo, seja na região do Pará, ou nas demais
áreas de cultivo no Brasil, se encontra sob o risco de ataques de pragas e doenças. A fusariose
e o Ganoderma, por exemplo representam riscos consideráveis em certas áreas de produção.
Para Carvalho e Santos, (2013) as doenças se destacam como ameaça primária ao cultivo dessa
cultura, dessa forma, o melhoramento para resistência a doenças é essencial para prevenir e/ou
sanar futuros problemas fitossanitários. Uma das principais abordagens para a prevenção de
doenças é o desenvolvimento de variedades resistentes e a disponibilidade das sequências dos
genomas de Elaeis spp. se constitui uma ferramenta extremamente útil para a prospecção de
genes de resistência nessa cultura (FOAN et al., 2012).
Muitos genomas de plantas estão disponíveis nos bancos de dados, apesar deste grande
recurso, apenas uma quantidade relativamente pequena de genes R foram clonados e totalmente
caracterizados. Em contrapartida, muitos RGAs já foram identificados em diversas culturas
(SEKHWAL et al., 2015). Para o gênero Elaeis, no entretanto, estudos para prospecção e
diversidade de RGAs NBS-LRR são escassos. Até a data encontra-se apenas um estudo em que
foram isolados três putativos homólogos de genes de resistência (RGHs) em E. guineensis,
utilizando iniciadores (primers) direcionados para os motivos conservados do domínio de
ligação de nucleótidos (NBS). A comparação dessas sequências de RGH isoladas com a base
de dados mostrou identidade para resistência à doença como proteínas em coco (90%) e tomate
(87%) (FOAN et al., 2012).
No presente estudo, para a o genoma de E. oleifera foram encontrados 45 scaffolds, dos
quais pôde-se identificar 36 ORFs (RGA) com motivos estruturas presentes na família de genes
de resistência NBS-LRR. Essas 36 ORFs apresentam sequências homólogas a putativos e genes
de resistência já descritos para Elaeis guineensis, Phoenix dactylifera, Glycine max e
Arabidopsis thaliana. Além disso, para E. guineensis, o perfil HMM utilizado permitiu a
identificação de 220 sequências com motivos estruturais NBS-LRR, 20 a mais do que reportado
108
na literatura (SINGH et al., 2013). Estudos para a validação da função destes putativos genes
de resistência a doença é extremamente importante, especialmente dada a ausência de genes de
resistência conhecidos para patógenos importantes neste gênero.
Os genes NBS-LRR são a maior classe de proteínas de resistência à doença e têm um
papel importante no reconhecimento de efetores dos agentes patogénicos (DANGL; JONES,
2001). O domínio NBS pode ser classificado de acordo com motivos na região N- terminal,
podendo ser constituído por proteínas que transportam o receptor TOL/ interleucina-1 (TIR) ou
codificar um domínio N-terminal com coiled-coil (CC). O primeiro denominado de proteínas
TNL (TIR-NBS-LRR) e o segundo proteínas CNL (CC-NBS-LRR) (LOZANO et al., 2015;
MEYERS et al., 2003) Esta divisão se reflete tanto na análise filogenética como nas suas vias
de sinalização (MEYERS et al., 1999).
A evolução dos genes NBS-LRR divergiu significativamente entre monocotiledóneas e
dicotiledóneas (LOZANO et al., 2015). Uma análise filogenética entre espécies dicotiledôneas
e monotiledôneas mostrou que a classe Tir- NBS-LRR (TNL) é muito mais conservado entre
as dicotiledôneas enquanto que CC- NBS-LRR (CNL) é mais diversa entre monocotiledôneas
e dicotiledôneas. (SEKHWAL et al., 2015). O predomínio destes genes TNL ou CNL no
genoma pode ser determinado pelos patógenos que infectam as espécies vegetais ao longo de
sua história evolutiva (LOZANO et al., 2012; PAN; WENDEL; FLUHR, 2000).
A presença de T e TN dentre as classificações apresentadas neste estudo, não evidencia
a presença de grupos TNL em Elaeis spp. Devido ao pequeno grupo de sequências utilizadas
dentro de B. distachyon, por exemplo, a classificação deste estudo não permitiu distinguir
algumas sequências NBS-LRR. Adicionalmente, por não apresentar domínio NBS, nem LRR,
o T não pode ser considerado um TNL. Já a presença de TN pode indicar, talvez, TNL truncado
dentro dos genomas de Elaeis spp. Tais incertezas quanto a classificação das sequências
evidencia a necessidade do uso de mais representantes de outras culturas, permitindo o uso de
um conjunto maior de sequência, que sejam bem definidas para os subgrupos desta família.
Dessa forma, a classificação das sequências de NBS-LRR em Elaeis spp. pode ser mais bem
esclarecida.
As proteínas que apresentam N ou NL podem ser originadas por uma perda de domínio
que, na maioria dos casos, leva a criação de pseudogenes (LOZANO et al., 2012). Estes
pseudogenes, por sua vez, pode ocorrer devido a rápida evolução desta família de genes, o que
pode ser constatado entre diferentes cultivares da mesma espécie em ambientes com diferentes
estresses bióticos, por exemplo (LOZANO et al., 2015). A análise de sequências relacionadas
dentro de famílias de plantas elucida a relação evolutiva e o processo envolvido no
109
desenvolvimento de resistência de doenças. Esta informação pode auxiliar na compreensão da
distribuição dos genes de resistência dentro dos genomas de plantas.(SAMUELIAN et al.,
2008). Além disso, esse tipo de estudo proporciona não apenas uma informação sobre a
distribuição, evolução e classificação dos genes NBS- LRR, mas também a geração de recursos
genéticos úteis para a criação de novos cultivares resistentes (LIU et al., 2007).
Das 34.802 proteínas preditas no genoma de E.guineensis, pela análise realizada neste
estudo, ~0,63 % (220), apresentam RGAs NBS-LRR, número maior do que encontrada para o
milho com 179 entre os 32.540 de genes anotados (CHENG et al., 2012), e inferior ao sorgo,
que apresenta 332 NBS-LRR em 34.496 de genes anotados (CHENG et al., 2010; MACE et
al., 2014).
NBS-LRR identificados em sequências com função conhecida em outras espécies de
plantas pode indicar uma função potencial das sequências de espécies em estudo. Dos sete genes
de resistência encontrados com identidade para sequências NBS-LRR em E. oleifera quatro
pertencem a família de proteínas de resistência RPM1 descrita como responsável por
desencadear a resposta de hipersensibilidade em Arabidopsis thaliana (MACKEY et al., 2002)
e associada a à resistência contra Puccinia triticina (ferrugem) em trigo (FEUILLET et al.,
2003), além da classe CC NBS LRR descrito por conferir resistência ao fungo Blumeria
graminis em arroz (LIU et al., 2016).
Adicionalmente foram encontradas 6 ortólogos em B. Distachyon que apresentam
proteína de resistência a doenças com domínio NB-ARC e LRR ortólogos a 4 proteínas NBS-
LRR presentes A. thaliana (TAN; WU, 2012), sendo a sequência AT3G07040.1, conhecida
como proteína RPM1 descrita por conferir resistência às estirpes de Pseudomonas syringae que
carregam os genes avirB e avrRpm1,a sequência AT4G26090.1 que codifica uma proteína da
membrana plasmática com repetição rica em leucina que confere resistência à infecção por
Pseudomonas syringae ao interagir com o gene de avirulência avrRpt2, a sequência
AT3G14470.1, sendo descrita como uma proteína envolvida na resposta de defesa, presente na
região extracelular com função de ligação de proteínas, e a sequência AT4G33300.1 que
codifica um receptor imune membro da família ADR. Todas as funções destas proteínas em A.
thaliana estão descritas no The Arabidopsis Information Resource-TAIR disponível em
https://www.arabidopsis.org/.
110
5 CONCLUSÃO
A caracterização em larga escala de genes análogos de resistência contendo o domínio
NBS-LRR para o gênero Elaeis permitiu encontrar 20 RGAs NBS-LRR a mais do que reportado
na literatura pra E. guineensis até então, sendo ainda um estudo inédito para caracterização de
tais sequências para E. oleifera, encontrando 36 sequências com homólogos a putativos e genes
de resistência disponíveis em bancos de dados.
Acredita-se que a identificação e classificação de NBS-LRR dentro do gênero Elaeis
para a filogenia das sequências genéticas realizada neste estudo, não foi determinada com
precisão no contexto de espécies de plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas para as
subfamílias NBS-LRR, necessitando assim da inclusão de um maior número de espécies com
estas sequências bem definidas. Acredita-se ainda que apesar de não ter sido caracterizados
genes funcionais neste estudo, a homologia observada com genes de resistência conhecidos em
outras espécies de plantas, tais como A. thaliana, Phoenix dactylifera, Glycine max e ortólogos
em B. distachyon pode fornecer evidências para potenciais papéis dos genes de resistência
apresentando domínios estruturais NBS-LRR em Elaeis spp em respostas a estresses bióticos.
È plausivel considerar ainda que este estudo abre gaps para futuras pesquisas, a exemplo
do método de sequenciamento preferencial de alto rendimento, conhecido como
sequenciamento de enriquecimento de genes de resistência (RenSeq), que se baseia no
enriquecimento para famílias de genes específicas, além de pesquisas relacionadas a análise da
posição cromossômica dos genes NBS-LRR, podendo fornecer informações sobre distribuição
e arranjo genômico, análise de expressão gênica durante respostas de defesa a patógenos
importantes, desenvolvimento de marcadores moleculares e OGMs apresentando genes NBS-
LRR entre outros, o que contribuirá para o melhoramento visando a resistência a doenças nesta
importante cultura.
111
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