REPLICAÇÃO DO DNA
Prof. Msc. Ronaldo CelerinoCentro Acadêmico de Vitória
Universidade Federal de Pernambuco
Genética Humana
Complementaridade das fitas – replicação – cada filamento pode servir como molde para síntese de um nova cadeia;
Especificidade do emparelhamento de bases – apenas uma sequência pode ser especificada por cada molde;
Replicação semiconservativa – cada fita original de nucleotídeo permanece intacta (conservada);
Implicações do Dupla Hélice na Replicação do DNA
Modelos de Replicação
Replicação Conservativa
Molécula de DNA inteira serve como molde para uma molécula totalmente nova;
Molécula original – completamente conservada durante a replicação;
Modelos de Replicação
Replicação Dispersiva
Quebra em fragmentos – modelos – síntese de novos fragmentos de DNA;
Remontagem de duas moléculas de DNA completas;
DNA resultante – intercalamento de DNA velho e novo;
Nenhuma molécula original é conservada;
Modelos de Replicação
Replicação Semiconservativa
Duas fitas de nucleotídeos se afastam e cada uma serve como molde para uma nova molécula de DNA
Modelos de Replicação
Qual dos três modelos?
Isótopos – 14N e 15N;
Cultura de E. coli – meio contendo 15N;
Muitas gerações - 15N – incorporado nas purinas e pirimidinas;
Amostra – cultivo em meio contendo 14N
Distinção – centrifugação em alta velocidade – formação de gradiente de densidade;
Experimentos de Meselson e Stahl
Experimentos de Meselson e Stahl
Replicação em Tetha
Replicação bidirecional
Replicação do Ciclo Rolante
Células eucarióticas - muitas moléculas de DNA – muitas origens de replicação;
Velocidade - 500 a 5000 nucleotídeos por minuto para cada forquilha;
Diversas bolhas de replicação – fusão – formação de suas moléculas de DNA idênticas;
Replicação Linear
Replicação: Procariotos x Eucariotos
Um molde de DNA de fita simples;
Substratos para montagem da nova cadeia de nucleotídeo;
Enzimas e proteínas que “lêem” o molde e reuni os substratos na molécula de DNA;
Requerimentos da Replicação
Síntese de uma Nova Fita de DNA
DNA polimerase – adiciona nucleotídeos apenas ao terminal 3’ da cadeia crescente;
Nova cadeia de DNA sempre cresce na mesma direção (5’ → 3’);
Uma fita fica exposta na direção 5’ → 3’ e a outra na 3’ → 5’;
Direção da Replicação
Direção da Replicação
Fita exposta na direção 3’ → 5’ – nova fita sintetizada continuamente na direção 5’ → 3’ – fita leading;
Fita exposta na direção 5’ → 3’ – síntese de pequenos fragmentos (fragmentos de Okazaki) – replicação descontínua – fita lagging;
Fragmentos de Okazaki – 100 a 200 nucleotídeos
Replicação bidirecional – duas forquilhas;
Direção da Replicação
Requerimentos da Replicação
Iniciação
Deselicoidização
Extensão
Término
Etapas da Replicação
Iniciação
Cromossomo circular – única origem de replicação (oriC);
Ligação de proteínas iniciadoras – pequeno corte – abertura – ligação da helicase;
Replicação do DNA Bacteriano
Deselicoidização:
DNA helicase – quebra as pontes de hidrogênio;
Helicase liga-se a fita lagging em cada forquilha e se move na direção 5’→3;
Proteínas de ligação a fita simples (SSB) – estabilidade da fita simples de DNA;
DNA girase (topoisomerase) – reduz a torção da cadeia – reduzindo a super-helicoidização
Replicação do DNA Bacteriano
Replicação do DNA Bacteriano
Primers (iniciadores):
Enzima Primase – síntese de trechos de nucleotídeos de RNA (10 – 12 nucleotídeos) – contendo 3’-OH – ligação da DNA polimerase;
Primers de RNA – devem ser removidas e substituídos por DNA;
Primase forma um complexo com a helicase;
Replicação do DNA Bacteriano
Replicação do DNA Bacteriano
Abertura – adição de primer – extensão da cadeia polinucleotídica pela DNA polimerase;
Diversas DNA polimerases;
Extensão
Sintetiza qualquer sequência especificada pela cadeia molde;
Síntese na direção 5’→3’ – adição de nucleotídeos no grupo 3’-OH;
Utiliza dNTPs para sintetizar novos DNA;
Requer primer para iniciar a síntese;
Catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo fosfato e o 3’-OH;
Fitas sintetizadas – complementares e antiparaleas;
Estão associadas com outras proteínas;
Características das Enzimas DNA Polimerase
DNA ligase – reparação dos cortes na cadeia ;
DNA ligase – catalisa a formação da ligação fosfodiéster sem adicionar outros nucleotídeos na cadeia;
DNA Ligase
Enzimas Atuantes na Replicação
COMPONENTE FUNÇÃO
Proteína Iniciadora Ligam-se a origem e separam os filamentos do DNA para iniciar a replicação
DNA helicase Desenrola o DNA na forquilha de replicação
PLU Ligam-se ao DNA unifilamentar e impede a formação de estruturas secundárias
DNA girase Move-se á frente da forquilha de replicação, liberando a torção que se acumula devido a deselicoidização na forquilha de replicação
DNA primase Sintetiza um primer curto de RNA par dar um grupo 3´-OH para ligação de nucleotídeos de DNA
DNA polimerase III Alonga um novo filamento de nucleotídeos a partir do grupo 3´-OH dado pelo primer
DNA polimerase I Remove os primers de RNA e substitui por DNA
DNA ligase Une os fragmentos de Okazaki fechando os cortes no açucar-fosfato do DNA recém sintetizado
Duas unidades de DNA polimerase III - presentes, uma para cada fita;
O molde da cadeia lagging – forma um loop – DNA polimerase III move-se ao longo da fita no sentido 5’→3’
Forquilha de Replicação
Requesitos:
Helicase para abertura do DNA;
Proteínas de ligação a fita simples – manutenção da separação;
Girase – remoção das torções a frente;
Primase – síntese de primers com 3’-OH;
DNA polimerase – Síntese das fitas leading e lagging;
Forquilha de Replicação
Algumas moléculas – encontro de duas forquilhas de replicação;
Sequências específicas – bloqueiam replicação;
Proteína de terminação (Tus em E. coli) – liga-se a sequência – bloqueia a helicase;
Terminação
Taxa de erro celular – 1 por bilhão de nucleotídeo;
Erros pela DNA polimerase – 1 por 100 mil nucleotídeos – proofreading (revisão) – atividade exonuclease 3’-5’ - correção do erro;
Reparo de mau pareamento (mismatch repar) –deformidades na estrutura secundária do DNA – reconhecimento enzimático – excisão do par de nucleotídeos;
Correção de erros depois da replicação
Habilidade de distinção da fita velha da nova - metilação (–CH3) ;
Fidelidade da Replicação do DNA
Fidelidade da Replicação do DNA
Múltiplas origens de replicação em seus cromossomos;
Mais tipos de DNA polimerase, com diferente funções;
Montagem dos nucleossomos imediatamente após replicação:
nucleossomos são quebrados no decorrer da replicação e depois remontados a partir de uma mistura aleatória de histonas novas e antigas
Replicação em Eucariotos
DNA eucariótico contém muitas origens de replicação;
Em cada origem – um complexo de multiproteinas de reconhecimento de origem – se liga e inicia o desenrolamento do DNA;
Origens em Eucarióticos
DNA Polimerase dos Eucariotos
Existem ao menos 13 diferentes
DNA polimerases em células
eucarióticas.
Telômeros - Fita lagging – retirada de primers – gap - ausência de 3’-OH encurtamento;
Presença de muitas cópias de pequenas sequências repetidas;
Telomerase – enzima que adiciona repetições e permite a extensão;
Replicação das Pontas Cromossômicas
Replicação das Pontas Cromossômicas
Replicação das Pontas Cromossômicas
Sempre semiconservativa;
Início – sequência chamada origem;
Síntese de DNA é iniciada por pequenos segmentos de RNA – primers;
Extensão no sentido 5’→3’
O novo DNA é sintetizado de dNTPs; na polimerização do DNA, dois fosfatos são clivados dos dNTPs e o nucleotídeo resultante é adicionado ao grupo 3’-OH da cadeia crescente;
Continua na fita leading e descontinua na fita lagging;
Novos nucleotídeos são complementares e antiparalelos ao seu molde;
Ocorre em taxas muito elevadas e com muita precisão;
Regras Básica da Replicação
Recommended