Abreu Rivero José Nelson
Eficacia de la melatonina en un modelo de isquemia y reperfusión en ratas
Universidad de Los Andes-Facultad de Medicina-Postgrado en Cardiología. 2001. p. 42
Venezuela
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO AUTÓNOMO
HOSPITAL UNIVERSITARIO DE LOS ANDES
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CARDIOVASCULARES
"Dr. Abdel Fuenmayor"
EFICACIA DE LA MELA TONINA EN UN MODELO DE ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN EN RATAS
Dr. JOSÉ NELSON ABREU RIVERO
MÉRIDA- VENEZUELA 2001
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO AUTONOMO
HOSPITAL UNIVERSITARIO DE LOS ANDES
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CARDIOVASCULARES
" Dr. Abdel Fuenmayor"
EFICACIA DE LA MELA TONINA EN UN MODELO DE ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN EN RATAS
MÉRIDA- VENEZUELA 2001
ASESOR Dr. Dumar Durán D
Título: Eficacia de la melatonina en un modelo de isquemia y reperfusión en ratas
Autor: José Nelson Abreu Rivero. Residente de post- grado de cardiología Departamento de cardiología. l. A. H. U.L.A. Mérida- Venezuela
Asesor Académico: Dr. Dumar Durán D. Profesor Facultad de Medicina. U.L. A. cardiólogo.
titular de la cátedra de farmacología. Farmacólogo cardiovascular. Médico
AGRADECIMIENTO
Al Dr. Dumar Durán por su valiosa orientación en la realización del presente trabajo.
DEDICATORIA
A MI PADRE, DIOS, TODO PODEROSO
A MI VIRGEN COROMOTO
A MI DIOSA ISIS
A MI MADRE VIRGEN DEL ROSARIO
A MI PADRE SAN CIPRIANO
TRABAJO PRESENTADO ANTE EL HONORABLE CONSEJO DE LA
FACULTAD DE MEDICINA COMO CREDENCIAL DE MÉRITO PARA OPTAR
AL GRADO DE ESPECIALISTA EN CARDIOLOGÍA
INDICE
l. Introducción .................................................................................. 1 - 3
II. Antecedentes ................................................................................. 4- 8
III. Materiales y Métodos................................................................... 9 - 17
IV. Resultados ..................................................................................... 18 - 24
V. Discusión ....................................................................................... 25- 29
VI. Conclusión .................................................................................... JO
VII. Bibliografia .................................................................................... 31 - 34
RESUMEN
Compuestos químicos, altamente reactivos, conocidos como radicales libres, son
producidos continuamente a nivel celular como moléculas citotóxicas. Estas sustancias
reactivas se producen en las mitocondrias, como derivadas de las prostaglandinas y de la
xantina-oxidasa. También se forman cuando se produce infiltración de leucocitos en el
miocardio lesionado y por la oxidación de las catecolaminas. Se sabe que causan
peroxidación lipídica de la membrana celular, sobrecarga de calcio intracelular y, por
consiguiente, alteraciones metabólicas, electrofisiológicas, morfológicas y funcionales del
miocardio expuesto. Recientemente, se le ha reportado a la melatonina (ML T), una
hormona sintetizada en la glándula pineal, un efecto barredor de radicales libres. Los más
recientes hallazgos bioquímicos y electrofisiológicos mencionan el efecto antioxidante de la
ML T, como responsable de dichas acciones. Para evaluar la eficacia antiisquémica de la
ML T, a través de su efecto barredor de radicales libres, realizamos un estudio experimental
utilizando ratas expuestas a un evento agudo de isquemia y reperfusión. Metodología: 30
ratas Sprague- Dawley del sexo masculino fueron divididas en tres grupos de 10 animales
cada uno: Un grupo sham ( toracotomía sin ligadura), un grupo control y un grupo tratado
con ML T. Al Wl!PO control y de estudio se les sometió a ligadura coronaria por 15 min. y
dos horas de reperfusión. Se evaluó el tamaño del infarto, la liberación de CK total, la
incidencia de arritmias ventriculares y la producción de peroxidación lipídica en el
miocardio. Resultados La ML T al compararse con el grupo control no mostró diferencia
significativa en reducir el tamaño del infarto ( 28,16 ± 2,55 Vs 30,7 ± 8,45%, p = NS). Los
niveles plasmáticos de CK total fueron menores en el grupo con ML T respecto al control (
496/o ) ( p < 0.05 ). La incidencia de extrasistoles ventriculares ( EV ) durante la fase de
isquemia fueron menores con la MLT al compararse con el grupo control ( p < 0.05 ). No
se encontró significancia con la Taquicardia ventricular ( TV ) en ninguno de los tres
grupos. La ML T mostró un efecto antioxidante potente, superior a los grupos de estudios
Conclusión: La ML T a dosis de 1 O mg 1 Kg 1 IP administrada 15 min. antes del
procedimiento redujo marcadamente los productos de peroxidación lipídica y en menor
grado, aunque de forma significativa, los niveles séricos de CK total y las EV durante la
isquemia, sin embargo no tuvo efecto en reducir el tamaño del infarto.
INTRODUCCION
El infarto agudo del miocardio genera un estrés fisiológico y psicológico intenso que está
asociado a una actividad simpática generalizada aumentada. Esto produce una serie de efectos
adversos sobre el sistema cardiovascular que incluye taquicardia, arritmogénesis,hipertensión,
lipólisis y un incremento de la contractilidad cardiaca. 1
El tamaño del infarto es un factor determinante del pronóstico en sujetos con la forma
aguda. Las personas que mueren en choque cardiovascular a menudo tienen un solo infarto
masivo o uno de tamaño pequeño o moderado, añadido a múltiples infartos previos. A menudo,
las personas que viven después de grandes infartos tienen afección ulterior de la función
ventricular, y la mortalidad a largo plazo es más alta que en aquellos que sobreviven a infartos
pequefios. 2
Dada la importancia pronóstica del tamaño del infarto, se ha dedicado gran atención
experimental y clínica al concepto de que es posible modificar el tamaño de la zona lesionada.
Los esfuerzos por limitar el tamaño de la lesión se dividen en tres estrategias diferentes: 1)
reperfusión temprana, 2) disminución de las necesidades energéticas del miocardio ( oxígeno,
reposo, betabloqueantes, etc. ) y 3) manipulación de las fuentes de energía de dicha capa. 2
En algunos pacientes se produce espontáneamente la reanudación del riego sanguíneo
( reperfusión ). La reperfusión oportuna del miocardio en peligro constituye el medio más eficaz
de restaurar el equilibrio entre el aporte y la demanda de oxígeno del miocardio.
El proceso de reperfusión, aunque beneficioso en el salvamento del miocardio,puede
implicar cierto costo, por el fenómeno denominado daño por reperfusión. 3 Kloner ha resumido
los datos de los cuatros tipos de lesión por reperfusión observados en animales de
experimentación, 4 como sigue: 1) lesión mortal, término que denota la muerte de células que
eran viables para el momento en que se reanudó el flujo coronario, 2) lesión vascular por
2
reperfusión, que es el daño progresivo de vasos finos, de modo que hay una zona creciente sin
flujo nuevo y, con ello pérdida de la reserva vasodilatadora coronaria, 3) miocardio con
reperfusión funcional~ que comprende miocitos salvados cuyo periodo de disfunción contráctil
es duradero , después de reanudar el flujo sanguíneo, por anormalidades de la bioquímica
intracelular que ocasiona una menor producción de energía. 4) arritmias por reperfusión, que
son episodios de taquicardia y a veces fibrilación ventricular que surgen en un término de
segundos de reanudarse la circulación.
Ha atraído atención considerable la toxicidad de radicales libres derivados de oxígeno
mediada por lo menos en parte por los leucocitos estimulados, y su posible participación en la
extensión de la lesión miocárdica. 5 Estos compuestos químicos, altamente reactivos, conocidos
como radicales libres, son producidos continuamente a nivel celular como moléculas citotóxicas.
Se considera que estos radicales citotóxicos participan como mediadores del daño tisular en un
gran número de estados patológicos del miocardio. 6 Estas sustancias reactivas se producen en las
mitocondrias, como derivadas de las prostaglandinas y de la xantina-oxidasa. También se forman
cuando se produce infiltración de leucocitos en el miocardio lesionado y por la oxidación de las
catecolaminas. 7-
8
Últimamente, se ha considerado que el anión superóxido, los radicales hidróxilos y el
peróxido de hidrógeno, como radicales libres que son, producen daño celular cardíaco que se
presenta en la fonna de injuria por isquemia y reperfusión. 9 Estas sustancias reactivas se generan
intra y extracelularmente en el miocardio y en el endotelio vascular durante los eventos
isquémicos. Se sabe que causan peroxidación lipídica de la membrana celular, sobrecarga de
calcio intracelular y, por consiguiente, alteraciones metabólicas, electrofisiológicas, morfológicas
y funcionales del miocardio expuesto 10-
11
La célula cardíaca para defenderse de la producción y citotoxicidad de estos compuestos
intermediarios, se vale de mecanismos como la producción de enzimas antioxidantes entre las
que se encuentran la superóxido dismutasa, la catalasa y la peroxidasa. 12 Las mismas, se
distribuyen ampliamente en todos los téjidos y producen un efecto protector contra los radicales
libres.
3
Recientemente, Sugden 13 y Reiter 14 , le reportan a la melatonina (ML T), una hormona
sintetizada en la glándula pineal, un efecto barredor de radicales libres. Los más recientes
hallazgos bioquímicos y electrofisiológicos mencionan el efecto antioxidante de la ML T.
El mismo Sugden a través de estudios in vitro 13 , demostró que la ML T protege el ADN
del daño inducido por sustancias químicas carcinogénicas . Pierrefiche y col. 15 y Chuang y col. 16 compararon el efecto antioxidante de la melatonina con el que produce el glutation, el manitol
y las vitaminas E y C. Se sabe que la mela tonina es aproximadamente 100 veces más potente
como depurador de radicales libres que estos antioxidantes bien conocidos. 1s- 16
Así, la ML T ha demostrado ser útil en varias enfermedades degenerativas del SNC,
trastornos del sueño, retrazo psicomotor, trastorno inmunológicos, distrofia muscular, hepatitis,
enfermedades renales y ciertos tipos de cancer. 17•
18.
19• 20
Y 21
Los conocimientos de la utilidad de la ML T en isquemia miocárdica es incipiente y existe
escasa literatura que mencionan los resultados de estudios experimentales en animales y clínicos
sobre la posible importancia de su uso en esta afección. Por eso ha despertado nuestra curiosidad
comprobar su eficacia como hormona en una preparación experimental in vivo que reproduce
fisiopatológicamente el papel de los radicales libres como citotóxicos.
4
ANTECEDENTES
La ML T es la principal hormona secretada por la glándula pineal, producida en humanos
con un ritmo circadiano y caracterizada por elevar sus niveles sanguíneos durante la
noche. Aunque su papel en procesos patológicos y fisiológicos en el humano no está
completamente entendido, la ML T cumple un número de funciones a concentraciones
fisiológicas y/o farmacológicas. Los mecanismos involucrados en las acciones de la ML T
incluye interacción con receptores de membranas , recientemente clasificados como mt 1 1 MT2 1
MT3 y a nivel del núcleo con receptores RZR 1 ROR ( 22 ). La ML T no es solamente producida
por la glándula pineal, sino también por la retina y otras células y tejidos de: vertebrados,
invertebrados, hongos, plantas, algas multicelulares y unicelulares.
Recientemente a la ML T se le atribuyen propiedades antioxidantes. 22•23
•24
•25
•26
•27
•28
y29 Se
cree que esta hormona trabaja vía donación de electrones para directamente detoxificar radicales
libres tales como los altamentes tóxicos radicales hidróxilos. Adicionalmente , tanto in vitro
como in vivo, la ML T ha demostrado proteger células, tejidos y órganos contra el daño
oxidativo inducido por una variedad de agentes que generan radicales libres tales como: Safrole,
lipopolisacáridos, ácido Kainic, agentes fentónicos, etc. Otras circunstancias, isquemia y
reperfusión , ejercicio excesivo y radiaciones iónicas también han demostrado ser productores de
radicales libres. La facilidad para ser barredora de sustancias citotóxicas, es probablemente
debido a su facilidad para cruzar las barreras morfofisiológicas, ejemplo: hematoencefálica,
compartimientos celulares y sub- celulares.
Maestroni en 1995 demostró, además de las propiedades antioxidante de la MLT,
propiedades inmunoestimulantes. Parece evidente que citoquinas derivadas de linfocitos T
constituye el principal mediador de los efectos inmunológicos de la MLT. También la
administración de esta hormona resultó en niveles elevados de interleukina - 4. 30
Bartsch en 1999 en un artículo publicado en Adv Exp Med Biol; 467: 247-64 hace
una revisión detallada del comportamiento de los niveles de ML T y su principal metabolito 6 -
Sulphatoxymelatonin en pacientes con diversos tipos de tumores primarios. El encontró una
5
reducción de dichos niveles de ML T y su metabolito, especialmente en los primarios de próstata
y mama. no evidenciandose mejoría de los niveles de la hormona aún después de la remoción de
estos tumores, lo que demuestra que la reducción de los niveles circulantes de esta honnona se
acompaña de cambios neuroendocrinos que afectan el ritmo circadiano de otras hormonas de la
adenohipofisis tales como la prolactina, somatotropina y estimulante del tiroide. 31
Kogan AK y col., determinaron en un modelo experimental de isquemia en ratas que la
severidad de la lesión isquémica puede ser reducida por la inhibición de la peroxidación lipídica
por radicales libres usando agentes antioxidantes de diferentes naturaleza química. Los autores
concluyen que la peroxidación lipídica por radicales libres juegan un papel intensi:ficador en la
patogénesis de la isquemia miocárdica y el infarto, y se recomiendan incluir drogas antioxidantes
en la protección cardíaca. 32
Debido a su potente efecto antioxidante ha crecido el interes en los últimos años en el
efecto protector de la ML T en estados patológicos debidos a la liberación de radicales libres. Sin
embargo, los estudios en isquemia miocárdica son muy escasos.
En modelos de isquemia y reperfusión en corazones aislados de ratas Kaneko y col.,
encontraron que la ML T favoreció de una manera significativa la recuperación de la función
ventricular y disminuyó la duración de episodios de taquicardia ventricular y fibrilación
ventricular. 33
Igualmente, Lagneux y col., en igual tipo de preparación, utilizando ML T en ratas a la
dosis de 1 ó 10 mg 1 Kg 1 IP, como pretratamiento, demostraron que las dosis máximas ( 10 mg 1
Kg 1 ) redujo de manera muy marcada la incidencia y duración de las arritmias de reperfusión,
así como el tamaño del infarto. 34
Dave RH y col., estudiaron el efecto de la MLT sobre parámetros hemodinámicos, flujo
sanguíneo y tamaño del infarto en un modelo de isquemia - reperfusión en conejos, encontrando
un efecto neutro sobre las variables estudiadas sin exacerbación de la isquemia nüocárdica o la
6
necrosis, lo cual lo llevó a concluir que la ML T no posee efectos sobre el sistema cardiovascular,
al menos en este modelo. 35
Sin embargo, Bosman y col., estudiando los mismos parámetros en monos( Baboons ),
encontraron un aumento del gasto cardíaco y de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo
con la administración de ML T por vía endovenosa. 36
Además, en diversos estudios en animales se ha encontrado que la ML T reduce la actividad simpática . 37
Por otro lado, estudios en pacientes con enfermedad isquémica coronaria han reportado disminución en la producción de MLT. 38
Finalmente un estudio por Salie y col., realizado en miocitos ventriculares adultos de ratas
sujetas a hipoxia química y reoxigenación reportó que la ML T reduce el daño, probablemente por
su efecto barredor de radicales libres y la acumulación de calcio intracelular. 39
7
OBJETIVOS E HIPOTESIS
GENERAL
Se evaluó la eficacia antüsquémica de la ML T en un modelo experimental " in vivo" de isquémia y reperfusión en ratas
ESPECÍFICOS
l. Se evaluó el tamaño del infarto en los grupos control y tratados con ML T
2. Se evaluó la integrida de la célula miocárdica por medio de la cuantificación de
enzimas cardíacas en los grupos control, sham y tratados con ML T
3. Se evaluó la incidencia de arritmias cardíacas en los grupos control, sham y tratados conMLT
4. Se evaluó el efecto antioxidante de la MLT mediante la detenninación de los productos de peroxidación lipídica
HIPOTESIS
La administración de ML T , a dosis de 1 O mg 1 kg IP le brinda al corazón de la rata,
expuesta a un evento isquémico y de reperfusión, una protección mayor que el grupo control.
VARIABLES
DEPENDIENTE.
Cambios enzimáticos en ambos grupos experimentales
Incidencia de arritmias cardíacas en ambos grupos experimentales
Cuantificación de el área infartada en ambos grupos experimentales
Cuantificación de productos de peroxidación lipídica en ambos grupos experimentales
INDEPENDIENTE
Administración de ML T a dosis de 1 O mg 1 kg IP
INTERVJNIENTE
Peso de las ratas en los grupos control y tratados con ML T Sexo de las ratas en los grupos control y tratados con ML T
8
9
MÉTODOS DE PROCEDIMIENTO
~LESDEEXPE~NTACIÓN
El protocolo se realizó en un total de 30 ratas sanas Sprague - Dawley, del sexo
masculino con una edad entre 14 y 16 semanas y un peso entre 300 y 350 gramos, obtenidas del
vivario de la Facultad de Medicina. Las mismas fueron trasladadas al Departamento de
Fannacología y Toxicología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Los Andes y se
alimentaron con Ratarina comercial y agua " ad - libitum " en jaulas compartidas por cinco de
ellas.
DISEÑO EXPERIMENTAL
El total de 30 ratas fue dividido al azar antes de provocar el infarto experimental en tres grupos a saber:
Grupo 1: "Sham" experimental ( toracotomía sin ligadura, n= 10)
Grupo ll: Control. Solución salina vía IP , 15 min. previos al procedimiento ( n= 1 O )
Grupo ID: ML T 1 O mg 1 Kg IP 15 min. previos al procedimiento ( n= 1 O )
MODELO EXPERIMENTAL DE ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN
El modelo utilizado se basó en la técnica descrita por Pfeffer y coL, modificada 40 . Las
rata fueron anestesiadas con Pentobarbital a 60 mg 1 Kg IP, diluido en solución salina al 0,90/o.
Se mantuvo la temperatura con la utilización de una lampara a 3 7 o C. Posteriormente, se canuló
la traquea y fueron conectadas a un ventilador con aire de ambiente a un volumen de 1 a 1 ,5 ce
1 100 gr. de peso. Inmediatamente, se procedió a realizar una toracotomía izquierda, disección del
pericardio y exteriorización del corazón mediante presión ligera de las partes laterales del tórax.
Luego con la utilización de una seda cardiovascular 4 -0 se colocó una ligadura en la arteria
coronaria descendente anterior izquierda entre el tracto de salida de la arteria pulmonar y la
aurícula izquierda. Se constató la isquemia por el cambio de coloración del miocardio, la
10
elevación del segmento ST en el ECG y la aparición de arritmias. Luego el corazón fue
colocado en su posición normal y el tórax fue cerrado con seda 2 - O. Transcurrido 15 min. (
fase de isquemia ) se procedió a reabrir el tórax y liberar la arteria previamente ocluida. Se
colocó de nuévo el corazón en su posición nonnal, se cerró el tórax mediante sutura ya descrita y
se mantuvo el animal en estas condiciones durante 120 min. (fase de reperfusión). Fig. 1 A- B
TAMAÑO DEL INFARTO
Al finalizar la fase de reperfusión , se sacrificó al animal, se removió el corazón y se lavó
con solución salina fria Se separaron las auriculas y el ventrículo derecho del ventrículo
izquierdo. El ventriculo izquierdo se pesó y se cortó desde el ápex hasta la base en tres cortes
transversales. Cada corte fue lavado de nuevo en solución salina e incubado en una solución al
1% de cloruro de triphenyl tetrazolium ( TTC ) amortiguado con tris buffer al 0,2 M y a un pH de
7,8 durante 10 min. Posteriormente cada corte fue escaneado con una resolución de 6000 dpí y
almacenado en la memoria de un PC en formato de imagen JPG. Dichas imágenes fueron
proyectadas a través de un video vin a una distancia fija y fueron caligrafiadas por ambas caras de
cada corte en un block de dibujo. Se realizó planimetría del área epicárdica y endocárdica. El área
del VI se obtuvo con la resta del área epicárdica menos la endocárdica. También se realizó
planimetría de la porción infartada, la cual se correlacionó con el área del VI, obteniendo así el
porcentaje de área infartada. El téjido miocárdico necrótico ( infarto ) se reconoce por la falta de
captación del colorante TTC, mientras que el área no infartada toma una coloración rojo ladrillo 41
. Fig • 2 A - B
Figura. 1., Bje.ij1plo elec:trocat"dipgráfico (ECG< ·· :Dll) de A: Ritrno .sm'u:sal nor.tnál previo a. la 1igad1..1.1::a c ,o:ronaric:L B .: Eievacion. marcada: del seg:rt:tento ST dura::tt:te la fase de isquemia_
14
DETERMINACIÓN DE CPK TOTAL
A todos los grupos se le tomaron muestras de sangre de aprox. 2 ce de la vena cava
inferior para la determinación enzimática a las dos horas de iniciado el procedimiento. La
determinación enzimática de la CK total se efectuó mediante la técnica de inmunoinhibición y
espectrofotometría UV descrita por Wuerzburg y col., y Gerhardt y col. 42
•43
•44
•45
•46
Y 47
DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE PEROXIDACION LIPÍDICA
A todos los grupos se le tomó muestras de téjido miocárdico de la base del corazón, las
cuales fueron congeladas. El stress oxidativo fue estudiado mediante la determinación de
productos de peroxidación lipídica basado en la determinación de las concentraciones del ácido
malón dialdehido usando como reactivo al ácido tiobarbitúrico ( TBARS). El día de la
determinación, se descongeló en un bailo de maria. Se cortó un trozo de aprox. 100 mg, se
trituró y se homogeneizó en 5 ce de solución fria salina. Del homogeneizado, se tomaron 100
microlitros para la determinación de los productos de peroxidación lipídica basado en la
determinación de las concentraciones del ácido malón dialdehido usando como reactivo al ácido
tiobarbitúrico ( TBARS ). El TBARS se analizó por espectrofluorometria. 48
INCIDENCIA DE ARRITMIAS
Para la detección de arritmias, se obtuvo de cada animal un registro electrocardiográfico
continuo durante la fase de isquemia y durante la reperfusión mediante la utilización de
electrodos sub- cutáneos insertados en las cuatros extremidades del animal, los cuales fueron
conectados a través de un preamplificador a un aparato de registro polígrafo Grass modelo 7. Se
cuantificó el número de episodios de arritmias ventriculares tales como taquicardia ventricular (
TV ) sostenida, definida como aquella con más de 15 latidos y TV no sostenida, igualmente se
cuantificó el número de extrasistoles ventriculares. Fig. 3 A - B
17
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados fueron expresados para cada grupo en valores promedios± error estándar.
Para la comparación intergrupo de las variables tamaño del infarto, incidencia de arritmias
cardíacas, niveles enzimáticos y productos de peroxidación lipídica se aplicó el análisis de
varianza ( ANOVA) y cuando hubo diferencias significativas entre ellas, estas se analizaron por
el test de Student ( prueba de "t" ) para datos no apareados. Se consideró significativo a todo
valor de p < 0,05.
Todo el análisis estadístico fue procesado con un sofware STATGRAPHICS PLUS 2
18
RESULTADOS
DATOS MORFOMÉTRICOS
La tabla 1 muestra los datos morfométricos de los 3 grupos experimentales utilizados en
nuestro trabajo. Como es de notar, el peso promedio de las ratas controles fue de 423 ± 10.3 grs,
el del grupo tratado con MLT de 352.9 ± 17.9 grs y el grupo sham de 305 ± 9.8 gr. En relación al
peso de los corazones y del VI notamos homogeneidad en los tres grupos ya que no hubo
significancia estadística al aplicarse la prueba correspondiente. (Tabla 1 )
TAMAÑO DEL INFARTO
La administración de ML T a dosis de 1 O mg 1 Kg IP 15 min. previos al procedimiento,
disminuyó el área infartada de 30.70 ± 8.45% (Grupo control) a 28.16 ± 2.55% (Grupo tratado
con ML T ), lo que equivale a un porcentaje de reducción muy bajo de aproximadamente 3%,
siendo la misma no significativa estadísticamente. Gráfico 1
CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE ENZIMA CARDÍACA: CPK- TOTAL
La concentración plasmática de enzimas cardíacas, en este caso de CPK - TOTAL
muestra significancia estadística ( p < O. 04 ) entre los grupos control y tratado con ML T al
obtenerse valores plasmáticos de 3969.6 U/Len el grupo control y de 2006.2 U/Len el grupo
tratado. Así mismo, esta relación fue de mayor significancia ( p< 0.001 ) entre los grupos con
MLT y sham, siendo los valores de este último de 962.5 U/ L. Gráfico 2
INCIDENCIA DE ARRITMIAS CARDÍACAS
La incidencia de arritmias cardíacas, en este caso de taquicardia ventricular y extrasístoles
ventriculares a nivel del grupo control y tratado con ML T durante la fase de isquemia encontró
significancia estadística solamente con la presencia de extrasístoles ventriculares, al presentarse
esta última con un promedio de 62.5 ± 30.02 en el grupo control y de 32.8 ± 28.68 en el grupo
con MLT., lo que equivale a un porcentaje de reducción de un 470/o. Gráfico 3
19
PRODUCTOS DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA
Los productos de peroxidación lipídica evaluados mediante la determinación del TBARS
fue menor en el grupo tratado con W...T ( 22,49 ± 9,95 nmol 1 mg de proteína ) en comparación
con el grupo control ( 61,24 ± 33,44 nmol 1 mg de proteína ) siendo esta diferencia
estadísticamente significativa ( p< 0.001 ). Esta misma tendencia se mantuvo con el grupo sham
cuya concentración fue de 35,58 ± 7,74 nmol 1 mg de proteina. GráfiCO 4
TABLA 1
DATOS MORFOMÉTRICOS
Peso de la rata (gr) Peso del corazón (gr) Peso del U I (gr) Media E.E Media E.E * Media E.E *
CONTROL 423 10,3 1169 25,2 742 17,63
MLT 352,9 17,9 1148 62,1 710 29,0
Sham 305 9,8 1053 60 689 35,2
* NS
50
40 ~ o ca
"C 30 ca t:: ~ S::
ca 20 Q) lo.
<(
10
o
Gráfico 1
Area Infartada en grupos de ratas sham, controles y tratadas con melatonina
*
Control MLT Sham
Grupos Experimentales
* P > 0.05 Vs control
--
Gráfico 2
Concentraciónes plasmáticas de CPK-Total en ratas sham, controles y tratadas con melatonina
6000~--------------------------------------.
J:9 4000 o 1-
1
~ D.. o e: '0 2000 +--·-o f! ~
e: C1) o e: o o o-+---
*
Control MLT
Grupos Experimentales
'~ P < 0.05 Vs Control ** P < 0.01 Vs Sham
**
Sham
-o
Gráfico 3
Incidencia de extrasistoles ventriculares durante la Fase de Isquemia en ratas controles y tratadas con melatonina
100 .-----------------------------------------------.
80 +-----------r---------------------------------~ *
z 60 -¡--- - --~ 40 -t---- -
20 +----
o -t-----
Control MLT
Grupos Experimentales
* P < 0.05 Vs control
Gráfico 4
100
Productos de peroxidación lipídica en grupos de ratas sham, controles y tratadas con
melatonina
90+------r--------------------------------
80+-----~--------------------------------
70+------r--------------------------------ca _. e
a. 'Ci36Q--t--Q)+-' -ce tn c. o C') 50 +----0 E ::l"C_ o o 40 --t---0:. E
e 30+--
20+--
10+--
0+--
Control
*
MLT
Grupos experimentales
* P < 0.05 Vs Control
*
Sham
25
DISCUSIÓN
TAMAÑO DEL INFARTO
La enfermedad arterial coronaria es actualmente una de las principales causas de muerte
en los paises desarrollados. Los radicales libres juegan un papel importante en la patogénesis y
progresión de esta enfermedad.
En un tejido isquémico abundan los radicales libres provenientes del oxígeno y pudieran
contribuir a la lesión del miocardio, en particular después de reanudar el flujo sanguíneo. 49
Durante la isquemia miocárdica, los radicales libres son generados por las mismas células
miocárdicas lesionadas, por los neutrófilos que migran al área de injuria, por las plaquetas y por
las células endoteliales. Igualmente, la reintroducción de oxígeno al miocardio isquémico puede
incrementar la injuria celular a través de un aumento en la producción de radicales libres. Estos
promueven la peroxidación lipídica y adicionan un sustrato para el sistema xantino - oxidasa. Un
aumento en el calcio intracelular durante la isquemia miocárdica y reperfusión pueden
incrementar la actividad de la ATPasa y fosfolipasas, los cuales generan más cantidad de
radicales libres con una mayor injuria so
Un medio directo de limitar la producción de radicales libres es limitar la producción
de los principales metabolitos del oxígeno: anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales
hidroxilos.
Datos de estudios en animales sugirieron que la extensión de la necrosis del miocardio
y la disfunción posisquémica pueden mejorar por medio de eliminadores de radicales libres de
oxigeno, como serian la dismutasa de superóxido, pero los resultados iniciales no han sido
alentadores en seres humanos. 51
Otras formas de terapéutica antioxidante, como las vitaminas E y C se estudian en
animales de experimentación, pero no hay certeza respecto a su posible utilidad en el ser
26
humano. 52 De tal manera que el papel de agentes antioxidantes como medida terapéutica ha
sido un tema de mucha controversia.
Recientemente, Sugden 13 y Reiter 14, han reportado que una hormona sintetizada en la
glándula pineal, y conocida como ML T, posee un efecto barredor de radicales libres. Los más
recientes hallazgos bioquímicos y electrofisiológicos mencionan el efecto antioxidante de la
ML T, como responsable de dichas acciones.
La importancia de la ML T ( N - acetil - 5 - metoxitriptamina ) estriba en su capacidad
de regular numerosos procesos fisiologicos relacionados con los ritmos biológicos y la función
neuroendócrina. Su acción bioquímica consiste principalmente en la inhibición de la
adenilciclasa, probablemente por actuar sobre receptores asociados a proteinas G. Dentro del
SNC se han descrito sitios de fijación específicos para ML T en la retina, pars tuberalis 1
eminencia media, nucleos supraquiasmatico del hipotalamo, área postrema y otras estructuras
relacionadas con la sincronización de ritmos biológicos.
Estudios in vivo e in vitro han sido llevados a cabo con la MLT. Todos han tenido como
objetivo evaluar el efecto antioxidante de esta hormona, principalmente dirigidos a comprobar su
eficacia en patologías del SNC, que tienen como mecanismos fisiopatológicos la producción de
radicales libres.
En contraposición, los conocimientos de la utilidad de la ML T en isquemia miocárdica es
incipiente y existe escasa literatura que mencionan los resultados de estudios experimentales en
animales y clínicos sobre la posible importancia de su uso en esta afección, y si tomamos en
consideración que los radicales libres son determinantes en la extensión de la zona infartada y en
la inestabilidad de la membrana del miocito, a través de los mecanismos mencionados
anteriormente, fue razonable pensar porque no estudiarla en una preparación in vivo que
reprodujera fisiopatologicamente el comportamiento de los radicales libres como citotoxicos. Por
tal motivo se implementó un modelo de isquemia y reperfusión en ratas, las cuales fueron
sometidas a 15 min. de isquemia y 2 horas de reperfusion.
27
Los resultados obtenidos muestran homogeneidad en el peso de los corazones y del VI
en los 3 grupos estudiados. ( tabla 1 ). Se ha demostrado que la edad asi como un mayor tamaño
de la masa ventricular en modelos experimentales llevados a cabo in vivo incrementan la injuria
por isquemia y reperfusión.
La administración de ML T a dosis de 1 O mg 1 Kg IP 15 mio. previos al procedimiento
disminuyó el tamaño de la zona infartada en un 3% al compararse los resultados del grupo
control con el grupo tratado con ML T ( ver Gráfico 1 ). Sobre la eficacia cardioprotectora de la
MLT hay pocos reportes y con resultados controversiales. Así, Lagneux y coe2 en ratas
pretratadas con ML T a dosis de 1 O mg 1 Kgl IP en un modelo de isquemia y reperfusión
reportaron que esta hormona redujo de manera marcada el tamaño del infarto. Otros como Dave
RH y col, estudiaron el efecto de la ML T sobre parámetros hemodinámicos, flujo sanguíneo y
tamaño del infarto en un modelo de isquemia y reperfusión en conejos, encontrando un efecto
neutro sobre las variables estudiadas, lo cual lo llevó a concluir que la ML T no posee efectos
sobre el sistema cardiovascular, al menos en este modelo.
En otros modelos de isquemia y reper:fusión, tales como los de neuroprotección, la ML T
ha demostrado disminuir el tamaño del infarto en ratas sometidas a obstrucción de la arteria
cerebral. 32
LmERACIÓN DE CK Total
La concentración plasmática de enzima cardíaca ( CPK - TOTAL ) mostró significancia
estadística ( p < 0.04 ) entre los grupos control y tratado con MLT al obtenerse valores
plasmáticos de 3969.6 U/Len el grupo control y de 2006.2 U/Len el grupo tratado. Así mismo,
esta relación fue de mayor significancia ( p< 0.001 ) entre los grupos con MLT y Sham, siendo
los valores de este último de 962.5 U/ L ( Grár~eo 2 ).
Estos resultados son acorde a lo esperado, ya que el grupo sham ( traqueostomía y
toracotomía ) no sufrió ligadura coronaria.
En modelos de isquemia en ratas, ligando la coronaria izquierda, los niveles séricos de CK
se elevan entre las 3 y 5 horas post IM ( pico máximo ). La administración de ML T redujo en
forma sifnificativa los niveles de CK total ( 490/o ) al compararla con el control, a pesar de no
28
tener efecto sobre el tamaño del infarto. Esto posiblemente sea debido a su acción antioxidante y
barredora de radicales libres que de algún modo limitó el daño miocárdico tal como se reflejó en
su efecto sobre los productos de peroxidación lipídica, analizados más adelante. El conocimiento
de la utilidad de la ML T en isquemia miocárdica es incipiente y existe escasa literatura que
mencionan los resultados de estudios experimentales en animales. En la literatura revisada, donde
se halló algún efecto cardioprotector de la ML T, no se mencionan su efecto sobre la liberación de
CK total. Consideramos necesario la realización de nuevos estudios con mayor número de
animales para establecer el efecto real de esta droga sobre la cardiopatía isquémica.
ARRITMIAS
Es ya conocido que los radicales libres provocan peroxidación lipídica de la membrana
celular y alteran la excitabilidad de la misma al aumentar los niveles de calcio intracelular, de
manera tal que la aparición de arritmias cardíacas es común en las preparaciones in vivo e in vitro
con agentes oxidantes. En el infarto del miocardio, los radicales libres son en partes responsables
en la aparición de arritmias cardiacas. Nuestro modelo experimental, reprodujo los eventos de
isquemia y reperfusión , notandose durante los mismos la aparición de arritmias cardíacas. Las
taquiarritmias ventriculares del tipo taquicardia ventricular y extrasistoles ventriculares
predominaron durante el estudio, y por tal motivo se tomaron en consideración para el análisis
correspondiente. La incidencia de extrasistoles ventriculares fueron menores y significativas
durante la fase de isquemia entre el grupo control y tratado con ML T. Nuestros resultados
coinciden con otros modelos de isquemia y reperfusión,. Lagneux y col., y Kaneco y col,
utilizando corazones aislados de ratas encontraron que la ML T disminuyó la duración de
episodios de taquicardia ventricular y fibrilación ventricular. 31
PRODUCTOS DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA
La determinación de productos de peroxidación lipídica fueron reducidos marcadamente
por la ML T a la dosis de 1 O mg 1 Kg IP 15 min. previos al procedimiento, esto en comparación
con los otros dos grupos de estudio. El mecanismo de acción de la MLT, como barredora de
radicales libres bien explican este comportamiento. Reiter ha sido un pionero en el estudio del
29
mecanismo de acción de la ML T, en donde la han comparado con otros antioxidantes, siendo la
ML T 100 veces más potente. Este efecto antioxidante de la ML T concuerda con Pierrefiche y col 15 quienes al comparar el efecto antioxidante de la ML T con el que produce el glutatión, el
manitol y las vitaminas E y C, encontraron una superioridad de esta hormona en un 100%.
El efecto intensificador·del daño miocárdico producido por la peroxidación lipídica de la
membrana celular con la formación de radicales libres es bien conocido. Kogan AK y col. 32
determinó en un modelo experimental de isquemia en ratas que la severidad de la lesión
isquémica puede ser reducida por inhibición de la peroxidación lipídica por radicales libres
usando agentes antioxidantes de diferentes naturaleza química. De esta manera explicamos el
efecto cardioprotector exhibido por la ML T en este modelo de isquemia y reperfusión en ratas,
sobre todo expresado en disminución de los niveles de CK total, efecto antiarrítmico y efecto
antioxidante potente.
30
CONCLUSIONES
l. La melatonina a dosis de 1 O mg 1 Kg 1 IP administrada 15 min. antes del procedimiento
redujo marcadamente los productos de peroxidación lipídica y en menor grado, aunque
de forma significativa los niveles séricos de CK total y las extrasistoles ventriculares
durante la isquemia, sin embargo, no tuvo efecto en reducir el tamaño del infarto.
2. Se corroboró en este trabajo el efecto antioxidante predominante de la melatonina
31
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