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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE

PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS

TRATAMENTO MICROBIOLÓGICO SEQUENCIAL DE

SOLO PROVENIENTE DE UNIDADE DE DESSORÇÃO

TÉRMICA

ULRICH VASCONCELOS DA ROCHA GOMES

Rio de Janeiro, 2011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE

PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS

TRATAMENTO MICROBIOLÓGICO SEQUENCIAL DE

SOLO PROVENIENTE DE UNIDADE DE DESSORÇÃO

TÉRMICA

TESE APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS (DSc.)

Orientadores: Francisca Pessôa de França, D.Sc.

Fernando Jorge Santos de Oliveira, D.Sc.

Rio de Janeiro, 2011

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G 633t Gomes, Ulrich Vasconcelos da Rocha.

Tratamento microbiológico sequencial de solo proveniente de unidade de dessorção térmica/ Ulrich Vasconcelos da Rocha Gomes. – 2011.

xvi, 180 f.: il.

Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, 2011. Orientadores: Francisca Pessôa de França e Fernando Jorge Santos de Oliveira

1. Biorremediação. 2. Resíduos da Indústria do Petróleo. 3. Hidrocarbonetos

Policíclicos Aromáticos. 4. Bioestímulo – Teses. I. França, Francisca Pessôa de. (Orient.). II. Oliveira, Fernando Jorge Santos de (Orient.). III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química. IV. Título.

CDD: 628.55

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i

“Medicus curat, natura sarat”

Hipócrates (460 AC – 377 AC)

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Este trabalho é dedicado à memória de meu pai, José Rocha Gomes (1945-2008), que partiu tão cedo para a espiritualidade e não assiste entre nós à realização desse momento. É para você com todo o meu amor, respeito e consideração.

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iii

AGRADECIMENTOS

O final de uma etapa nos apresenta o início de um novo ciclo de desafios, quando

novas tramas são desenhadas, criando posteriormente vida, de acordo com as nossas ações e

merecimentos. Nesta etapa finalizada, gostaria de expressar meus sinceros agradecimentos:

Aos meus orientadores por acreditarem na minha capacidade, pelo apoio técnico e

pelo encorajamento, mesmo que em tantas vezes não o tenha percebido nitidamente.

À minha amada mãe, Dulce por toda a força, apoio e estímulo que precisei durante

todos estes anos. Obrigado por sempre ter estado por perto, protagonizando meu porto seguro

nos momentos de aflição.

Ao meu pai que partiu para a espiritualidade antes da finalização deste projeto, por me

cobrir de apoio e não deixar perder a garra de enfrentar meus desafios. Nosso último

momento nesta vida, em 21 de setembro de 2008 foi selado com um caloroso abraço.

Às minhas irmãs Uliana e Ulnary pelo apoio, amizade, crédito e por me fazerem

enxergar o verdadeiro sentido de família.

Aos meus avós maternos, também já na espiritualidade, Evalda e Gastão, pelas cartas

de incentivo, enviadas nos meus tempos de criança, para que estudasse e amasse a arte de

estudar.

À Professora Glícia Calazans, grande amiga, mentora e razão de ter vindo ao Rio de

Janeiro. Sua contribuição à minha formação acadêmica e aos caminhos que desejo percorrer

foi fundamental e sem ela, meu destino teria sido outro.

Ao Professor Carlos Roberto Weber Sobrinho, testemunha de todas as tramas

envolvidas nesta tese, iniciada na postagem dos meus documentos para o Rio. Agradeço por

sua valiosa companhia, conhecimento, palavras de incentivo e participação ativa em

momentos-chave deste trabalho.

À Professora Eliana Flávia, por praticar o significado da palavra educador. Obrigado

pela sua paciência, pela doçura de seus gestos e voz, pela chave da porta do Laboratório, pela

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confiança depositada, pelo carinho de amiga, pela preocupação de mãe, pela orientação

afetiva, por ser o meu porto seguro nos momentos difíceis e por ter me ajudado a não desistir.

À Pragati Nigam, que sempre será a referência acadêmica da minha geração, por

acompanhar esta caminhada há anos, sempre acreditando no meu potencial.

À Swati Nigam pela motivação e amizade.

Aos meus grandes companheiros de amizade e trabalho no laboratório E-109. Mesmo

sob forte pressão e dificílimos desafios diários, entre risos e lágrimas, continuamos mantendo

o humor, a criatividade, o companheirismo e a cumplicidade: Diogo Simas, Aike Costa,

Flávia Padilha, Camila Gonzales, Rafael Bittencourt, Rafael Lima, Leonardo Jordão, Gustavo

Sant’Anna, Renata Calixto, Carlos Eduardo Felippe, Milton Anterio, Adilza Evangelista e Eni

Silva.

À amiga, confidente e cumadi Teresa Cristina do Nascimento pelos bons momentos

juntos.

Um agradecimento especial à Jamille Lima, pela fiel amizade e reais palavras

encorajadoras. Tenho você como a minha terceira irmã e o Thor como sobrinho.

Aos meus vizinhos do estratégico laboratório E-107, meus agradecimentos pelo apoio

e amizade nas horas de trabalho e de lazer, particularmente Diego Cara, Juliana Davies e

Mahdi Gobai.

À Kally Souza, pela amizade e companheirismo na república e no laboratório, assim

como pelo auxílio na parte estatística desse trabalho.

Ao André Tavares, pela amizade e divisão do apartamento na Ilha.

Ao Paulo Santana, meu reconhecimento pela força e dedicação ao trabalho.

Às professoras Érika Chrisman, Maria Antonieta Couto e Magali Cammarota, cujo

contato durante minha vida de doutorando representou pontos de luz, em momentos decisivos

da tese.

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Ao Dr. Leon Rabinovich pelas valiosas sugestões e contribuições, principalmente com

respeito aos ensaios microbiológicos.

Aos funcionários da EQ, em especial às senhoras Marlene de Souza, Suely Rocha e

Cátia de Assis.

Aos amigos Douglas Guedes, Mariana Galvão do INT e Adriana Nunes da Micoteca

URM/UFPE, pela gentileza na identificação das linhagens bacterianas e das linhagens

fúngicas.

À Doutora Ana Paula Ahualli e ao Mestre Klaus Reichel dos laboratórios Ipex, pela

gentileza na análise de dioxinas e furanos.

Ao senhor Luiz Carlos de Oliveira pela realização das análises granulométricas.

Ao Prof. Luiz Guilherme Marques pela amostra de glicerol bruto.

Ao amigo Kenneth R. Vanlerberghe do King’s Cross Doctor’s Office-Toronto, por

toda revisão e correções gramaticais dos textos em língua inglesa, relacionados à esta tese.

À equipe instalada na Bahia, pela sempre amável receptividade do povo baiano e pelo

suporte durante as visitas técnicas.

Aos cariocas e fluminenses pelo convívio, ao som do mais musical sotaque do Brasil.

Aos membros da banca por suas apreciações e sugestões, em sua maioria, acatadas.

Ao Petróleo Brasileiro S/A pelo incentivo financeiro e apoio técnico.

À CAPES, CNPq e FAPERJ pelo financiamento dos projetos que são desenvolvidos

no Laboratório de Microbiologia do Petróleo (E-109).

E finalmente à espiritualidade, que me acompanha em todos os momentos. Agradeço

pelo merecimento da conquista, pela inspiração em momentos-chave, pela proteção e por me

fazerem perceber que crescimento também se faz com dor, sem que para isso, a fé seja

abalada.

SJT

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SUMÁRIO

Lista de Figuras ix

Lista de Tabelas xii

Lista de abreviaturas xiv

Resumo xv

Abstract xvi

1 Introdução 17

2 Objetivos 23

2.1 Objetivo geral 23

2.2 Objetivos específicos 23

3 Revisão da Literatura 24

3. 1 Resíduos da indústria do petróleo 24

3. 2 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) 29

3. 3 Vias para tratamento de solos contaminados com óleo 34

3. 3. 1 Dessorção térmica 36

3. 3. 2 Biorremediação 44

3. 4 Degradação dos HPA por micro-organismos hidrocarbonoclásticos do solo 48

3. 5 Glicerol: generalidades e uso como cossubstrato 56

3. 6 Ensaios de fitotoxicidade 60

4 Materiais e Métodos 62

4. 1 A Unidade de Dessorção Térmica (UDT) 62

4. 2 Amostragens e coleta 65

4. 3 Isolamento e identificação de micro-organismos presentes no solo 67

4. 3. 1 Identificação das bactérias 68

4. 3. 2 Identificação dos fungos filamentosos 69

4. 4 Adaptação dos isolados em óleo 71

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vii

4. 5 Experimentos de biodegradação 72

4. 5. 1 Planejamento experimental 72

4. 5. 2 Experimentos com aplicação dos dados obtidos no planejamento

experimental

76

4. 5. 3 Experimentos utilizando glicerol bruto 76

4. 6 Análises quantitativas 78

4. 6. 1 Umidade em base seca

4. 6. 2 Capacidade de Retenção de Água (CRA)

78

78

4. 6. 3 pH em água 79

4. 6. 4 Textura do solo 79

4. 6. 5 Teores de Carbono Orgânico Total, Nitrogênio Total e Fósforo Total 80

4. 6. 6 Hidrocarbonetos Totais do Petróleo (TPH) 80

4. 6. 7 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) 81

4. 6. 8 Dioxinas e Furanos 81

4. 6. 9 Ensaios microbiológicos das amostras 82

4. 6. 10 Ensaios de fitotoxicidade 82

5 Resultados e Discussão 86

5. 1 Características do contaminante do solo 86

5. 2 Características do solo antes do tratamento por dessorção térmica 88

5. 3 Identificação dos contaminantes remanescentes e propriedades do solo tratado

na UDT

91

5. 4 Microbiota do solo tratado na UDT 98

5. 5 Ensaios de fitotoxicidade do solo contaminado e do solo tratado na UDT 99

5. 6 Ensaios de biorremediação 105

5. 6. 1 Micro-organismos utilizados no bioaumento 105

5. 6. 2 Biorremediação com uso do planejamento experimental 107

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viii

5. 6. 3 Monitoramento da biorremediação 119

5. 7 Aplicação dos resultados do planejamento experimental 124

5. 7. 1 Testes de fitotoxicidade nos solos biorremediados 135

5. 8 Biorremediação utilizando glicerol bruto 138

6 Conclusões 143

Referências Bibliográficas 145

ANEXO A1- Produção bibliográfica 180

Este documento foi elaborado em conformidade ao Decreto n° 6583/08-MRE, que promulga o acordo ortográfico da língua portuguesa, assinado em Lisboa em 16 de dezembro de 1990. O estilo antigo foi mantido como originalmente impresso apenas nos títulos publicados anteriormente à publicação do Decreto no D.O.U., em 30/09/2008.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 Percentual de resíduos perigosos gerados em uma refinaria de

grande porte, calculados a partir de dados de Mariano (2001)

27

Figura 3.2 Estruturas químicas dos 16 HPA prioritários da USEPA

(fonte: RAVINDRA; SOKHI e VAN GRIEKEN, 2008)

32

Figura 3.3 Esquema simplificado de uma Unidade de Dessorção Térmica.

1- armazenamento do resíduo; 2 – preparação e estoque; 3-

admissão; 4 – dispositivo transportador; 5 – forno; 6- sistema

de tratamento de gases; 7 – sistema de tratamento e reciclo dos

efluentes; 8 – armazenagem dos sólidos; θ – inclinação do

forno (adaptado de SECOND, 2000)

39

Figura 3.4 Corte longitudinal de um forno rotatório (adaptação de

HEYDENRYCH, GREEFF e HEESINK, 2002)

41

Figura 3.5 Mecanismos de transporte dos HPA por micro-organismos:

difusão simples - HPA de baixa massa molecular (1) e

transporte facilitado - HPA de alta massa molecular (2). O

efluxo dos HPA ocorre com gasto de energia (3) (elaboração

própria)

52

Figura 3.6 Vias propostas para o metabolismo dos HPA de baixa massa

molecular, naftaleno (A) e de alta massa molecular, pireno (B)

por bactérias aeróbias. Fontes: Mrozik, Piotrowska-Seget e

Labuzec (2003); Kanaly e Harayama (2000)

54

Figura 3.7 Principais rotas do metabolismo microbiano do glicerol

(RIVALDI et al. 2009)

57

Figura 4.1 Diagrama de operação da Unidade de Dessorção Térmica 62

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x

Figura 4.2 Unidade de Dessorção Térmica 64

Figura 4.3 Aspecto do solo contaminado com resíduo de vácuo (A) e

tratado por dessorção térmica (B), retido na área de quarentena

66

Figura 4.4 Método de isolamento microbiano do solo (adaptado de

BECKER, 1999)

67

Figura 4.5 Confecção do inóculo 74

Figura 5.1 Germinação Relativa das Sementes (GRS) 100

Figura 5.2 Elongação Relativa da Raiz (ERR) 102

Figura 5.3 Elongação das raízes de Cucumis anguria (maxixe-do-norte)

no extrato do solo contaminado com resíduo oleoso de fundo

da câmara de destilação a vácuo, apresentando

desenvolvimento de raízes secundárias (destaque, aumento:

4X). Foto: Ulrich Vasconcelos

103

Figura 5.4 Índice de Germinação das sementes (IG) 104

Figura 5.5 Diagrama de Pareto 111

Figura 5.6 Curva de contorno demonstrando o efeito da utilização do

fertilizante comercial NPK e de glicerol sobre o percentual de

biodegradação dos HPA no solo

112

Figura 5.7 Curva de contorno demonstrando o efeito da utilização de

fertilizante comercial NPK e da cultura mista sobre o

percentual de biodegradação dos HPA no solo

114

Figura 5.8 Curva de contorno demonstrando o efeito da utilização do

glicerol e da cultura mista sobre o percentual de biodegradação

dos HPA no solo

118

Figura 5.9 Quantificação das Bactérias Heterotróficas Aeróbias do solo

durante 60 dias nos diferentes tratamentos sequenciais:

120

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xi

1- fertilizante + cossubstrato + bioaumento; 2- cossubstrato +

bioaumento; 3- fertilizante + cossubstrato; 4- cossubstrato;

5- fertilizante + bioaumento; 6- bioaumento; 7- fertilizante;

8- sem tratamento

Figura 5.10 Quantificação dos Fungos Filamentosos do solo durante 60

dias nos diferentes tratamentos sequenciais: 1- fertilizante +

cossubstrato + bioaumento; 2- cossubstrato + bioaumento; 3-

fertilizante + cossubstrato; 4- cossubstrato; 5- fertilizante +

bioaumento; 6- bioaumento; 7- fertilizante; 8- sem tratamento

123

Figura 5.11 Biodegradação dos HPA durante 60 dias de processo

(concentração inicial de HPA = 8,43 mg/kg)

125

Figura 5.12 Bactérias Heterotróficas Aeróbias no solo 126

Figura 5.13 Fungos Filamentosos no solo 127

Figura 5.14 Variação da temperatura média do ambiente e do solo e da

umidade relativa do ar durante o experimento

134

Figura 5.15 Biodegradação dos HPA em presença de glicerol de diferentes

origens durante 60 dias de processo (concentração inicial de

HPA = 8,43 mg/kg)

139

Figura 5.16 Bactérias Heterotróficas Aeróbios no solo 140

Figura 5.17 Fungos Filamentosos no solo 140

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xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 Resíduos gerados na indústria do petróleo listados por

origem*

25

Tabela 3.2 Características físico-químicas e classificação da atividade

genotóxica dos 16 HPA prioritários listados pela EPA*

31

Tabela 3.3 Exemplos de tratamentos de solos contaminados por óleo e

derivados*

35

Tabela 3.4 Principais fatores limitantes na remoção dos HPA no solo 45

Tabela 4.1 Especificações técnicas do forno do sistema de dessorção 65

Tabela 4.2 Caracterização das amostras de glicerol bruto e glicerol PA 77

Tabela 4.3 Características das sementes do teste de fitotoxicidade 83

Tabela 5.1 Teores de HPA e TPH do resíduo oleoso de fundo da coluna

de destilação a vácuo

86

Tabela 5.2 Características físico-químicas e microbiológicas do solo

contaminado com resíduo oleoso de fundo da câmara de

vácuo

89

Tabela 5.3 Concentração dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos

(HPA) no solo contaminado com resíduo oleoso de fundo da

câmara de destilação a vácuo (p<0,05)

90

Tabela 5.4 Características físico-químicas do solo tratado na UDT 92

Tabela 5.5 Concentração de HPA de baixa massa molecular no solo

tratado na UDT (p<0,05)

94

Tabela 5.6 Concentração de HPA de alta massa molecular no solo

tratado na UDT (p<0,05)

94

Tabela 5.7 Comparação e quantificação dos teores de micro-organismos

do solo contaminado com resíduo de fundo da câmara de

98

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xiii

destilação a vácuo e do solo tratado na UDT, armazenado na

área de quarentena

Tabela 5.8 Matriz estendida do planejamento fatorial 23 108

Tabela 5.9 Coeficientes de regressão 109

Tabela 5.10 Tabela ANOVA e de parâmetros estimados 110

Tabela 5.11 Percentual de biodegradação dos 16 HPA prioritários da

USEPA (p<0,05)

129

Tabela 5.12 Taxa de redução diária dos HPA (mg/kg x dia-1) (p<0,05) 133

Tabela 5.13 Germinação Relativa das Sementes após biorremediação

(p<0,05)

135

Tabela 5.14 Elongação Relativa das Raízes após biorremediação

(p<0,05)

136

Tabela 5.15 Índice de Germinação das sementes nas amostras de solo

(p<0,05)

137

Tabela 5.16 Índice de Germinação das sementes nas amostras de solo

(p<0,05)

142

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xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

BHA Bactérias Heterotróficas Aeróbias

CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente

CPC Câmara de Pós-Combustão

CRA Capacidade de Retenção de Água

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

ERR Elongação Relativa da Raiz

FAO Food and Agriculture Organization

FF Fungos Filamentosos

FTB Fotoblastismo

GLP Gás Liquefeito de Petróleo

GRS Germinação Relativa das Sementes

HPA Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos

HPA-AMM HPA de Alta Massa Molecular

HPA-BMM HPA de Baixa Massa Molecular

HPA-AMM:HPA-BMM Razão entre HPA de alta e de baixa massa molecular

IG Índice de Germinação

INMET Instituto Nacional de Meteorologia

Kw/o Constante de partição em água/octanol

PCDD Dibenzo-p-dioxinas Tetra a Octacloradas

PCDF Dibenzofuranos Tetra a Octaclorados

OECD Organization for Economic Co-operation and Development

OMS Organização Mundial da Saúde

OTAN Organização do Tratado do Atlântico Norte

pb Pares de base

TEF Fatores de Toxicidade Equivalente

TPH Hidrocarbonetos Totais de Petróleo

UDT Unidade de Dessorção Térmica

UFC/g Unidades Formadoras de Colônias por grama de solo

UFC/mL Unidades Formadoras de Colônias por mililitro

USEPA United States Environmental Protection Agency

ΔHPA-AMM:BMM Variação da razão dos HPA de alta e baixa massa molecular

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xv

RESUMO

GOMES, Ulrich Vasconcelos da Rocha. Tratamento Microbiológico Sequencial de Solo

Proveniente de Unidade de Dessorção Térmica. Rio de Janeiro, 2011. Tese (Doutorado em

Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, 2011

Os resíduos oleosos gerados nas operações industriais são perigosos e a gestão correta

representa um desafio para o setor industrial. Tratamentos térmicos são amplamente

utilizados na remediação de solos contaminados por petroderivados, porém as temperaturas

empregadas podem permitir a presença de compostos remanescentes ao final do processo. O

presente trabalho teve como objetivo avaliar estratégias de tratamento microbiológico

sequencial de um solo oriundo de uma Unidade de Dessorção Térmica. No extrato total do

solo foram identificados os 16 HPA prioritários da USEPA, não sendo detetadas dioxinas e

furanos. Em seguida, foi empregado um planejamento experimental fatorial completo 23,

utilizando como variáveis de entrada: adição de fertilizante mineral NPK, adição de glicerol

PA e presença ou ausência do bioaumento. A biodegradação dos HPA foi escolhida como

variável de resposta. A análise estatística indicou que a adição de glicerol PA em uma

concentração menor que 0,63 mg/kg, em detrimento do bioaumento e da adição de

fertilizante, foi o fator determinante na biorremediação. A partir desse resultado, foram

testadas as concentrações de 0,32 e 0,16 mg/kg do cossubstrato. A primeira condição

estudada obteve a melhor biodegradação dos HPA, em 60 dias de tratamento, 71,8±0,2%.

Posteriormente foi empregado glicerol bruto, proveniente da indústria do biodiesel, em

condições similares, obtendo-se um percentual de biodegradação de 68,0±0,1%, confirmando

que o composto pode ser empregado como cossubstrato, bem como agregando valor a este

resíduo. Os ensaios de ecotoxicidade no solo provaram que a biorremediação eliminou o

efeito fitotóxico ainda observado após o tratamento térmico.

Palavras-chaves: Biorremediação. Bioestímulo. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos. Glicerol. Dessorção

térmica.

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xvi

ABSTRACT

GOMES, Ulrich Vasconcelos da Rocha. Sequential Microbiological Treatment of Soil

Obtained from a Thermal Desorption Unit. Rio de Janeiro, 2011. Thesis (Post-Graduation in

Technology of Chemical and Biochemical Processes) – Escola de Química, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, 2011

Oily wastes generated in industrial operations are hazardous and proper management

represents a challenge to the industrial sector. Thermal treatment is a widely used technique

for oil-contaminated soil remediation however some temperatures may lead to the presence

of residual compounds. The purpose of this investigation was to evaluate the efficacy of

sequential microbiological treatment strategies in a soil obtained from a Thermal Desorption

Unit. The USEPA 16 priority PAHs were found in the soil extracts, but neither dioxins nor

furans were detected. Screening was then performed by using a complete 23 factorial

experimental design with these input factors: addition of mineral NPK fertilizer, addition of

pure glycerol and the presence or absence of bioaugmentation. PAH degradation was chosen

as the response variable. Statistical analysis indicated that the addition of pure glycerol at a

concentration lower than 0.63 mg/kg was the determinant factor in bioremediation. Based on

this result, further experiments were carried out using pure glycerol at 0.32 and 0.16 mg/kg.

The first condition resulted in the best PAH biodegradation at 60 days, 71.8±0.2%.

Afterwards, raw glycerol obtained as a by-product from the biodiesel manufacturing industry

was used in similar testing and achieved 68.0±0.1%, confirming that this compound may be

used as a cosubstrate and adding value to this residue. Ecotoxicity assays on soil samples

proved that bioremediation eliminated the phytotoxic effects still observed after the thermal

treatment.

Key words: Bioremediation. Biostimulation. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Glycerol. Thermal

Desorption.

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Tratamento Microbiológico Sequencial de solo... Vasconcelos, U. (nome para citação)

17

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

A matriz energética atual depende de combustíveis fósseis e petroderivados. Com a

industrialização, o aumento dessa demanda gerou ao longo das décadas, impactos positivos na

qualidade de vida da população mundial, bem como a perturbação ambiental, como um dos

seus maiores efeitos adversos, seja resultado de acidentes e vazamentos de óleo, sejam por

atos de guerra (MOHAMED et al. 2006, LEMIEUX; LUTES e SANTOIANNI, 2004).

Independentemente do grau de desenvolvimento tecnológico e da gestão ambiental,

toda atividade industrial de ampla escala gera grande quantidade de resíduos, em

determinados casos, como no setor químico e petroquímico, o manejo de resíduos demanda

elevada atenção, assim como recursos financeiros e humanos especializados (OUYANG et al.

2005).

Por se tratarem de substâncias perigosas, a destinação final dos resíduos é

cuidadosamente planejada, seguindo normas e parâmetros previstos por legislações, manuais

ou estudos técnicos (RÖMBKE et al. 2005). Os resíduos da indústria do petróleo e gás natural

estão inseridos nesse contexto, por compreenderem uma mistura de hidrocarbonetos alifáticos

e aromáticos, metais pesados e compostos sulfurados, nitrogenados e oxigenados, de

toxicidade variada (MOHAMED et al. 2006, YUSTE et al. 2000).

Estima-se que 90% da descarga de contaminantes na natureza sejam de origem

antropogênica e cerca de 70% de todos os contaminantes ambientais sejam hidrocarbonetos.

Em termos de contaminação por óleo, o solo é considerado a porção mais afetada. Muitos

poluentes estão no solo há anos, porém o público não tem a consciência adequada da

magnitude e da importância desse fato (WILCKE, 2007, NIKOLOPOULOU et al. 2006,

ALEXANDER, 2000).

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No caso de descarte de contaminantes em solos, todos os seus constituintes são

impactados, incluindo a microbiota, considerada a chave central para a recuperação da área.

Tal recuperação é caracterizada como um processo lento, quando comparado à velocidade da

contaminação, mesmo que ocorra de forma gradual ou por vezes, indireta como nos casos de

microvazamentos e contaminação relacionada à pluviosidade (WATANABE e

HAMAMURA, 2003).

A variedade e a concentração dos contaminantes oriundos dos resíduos oleosos podem

influenciar negativamente a fertilidade do solo, principalmente pelas características de alguns

compostos, que podem ocasionar mutações e alterações na composição da macro e da

microbiota nativa. Não obstante, o aporte de hidrocarbonetos no solo proporciona ao longo do

tempo, a seleção de micro-organismos degradadores, fundamentais ao processo de

recuperação do sistema impactado (CRAWFORD et al. 2005). É importante enfatizar que a

natureza persistente de alguns contaminantes, como os Hidrocarbonetos Policíclicos

Aromáticos (HPA), pode interromper ou estender o tempo do bioprocesso (HERWIJNEN et

al. 2003).

Os HPA compreendem uma das classes de moléculas mais ocorrentes no ambiente. De

caráter hidrofóbico, estas moléculas tendem a se ligar fortemente às partículas do solo,

dificultando o bioacesso e consequentemente sua biodegradação. Além disso, o potencial

mutagênico e carcinogênico dos HPA é conhecido e amplamente divulgado na literatura

(GONG et al. 2007, MATER et al. 2006, ENELL et al. 2005, WATANABE, 2001).

Considerando a complexidade inerente aos solos, bem como a diversidade e natureza

dos contaminantes, várias tecnologias têm sido desenvolvidas e empregadas na remoção de

compostos químicos poluentes. Dentre esse grupo de processos, destacam-se as operações

térmicas, como por exemplo, a dessorção térmica, cuja maior vantagem diz respeito à

eficiência na remoção de grande quantidade de constituintes em um curto espaço de tempo

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(WARD; SINGH e VAN HAMME, 2003, REMMLER e KOPINKE, 1995). A dessorção

térmica é uma técnica baseada no aquecimento do solo, em uma faixa de temperatura

variando de 100 a 350°C, na qual promove a transferência de massa dos contaminantes da

matriz do solo para a fase gasosa, sem que haja destruição desses compostos (MERINO e

BUCALÁ, 2007, LIGHTY; SILCOX e PERSHING, 1990).

A dessorção térmica não foi uma técnica desenvolvida para a destruição dos

compostos orgânicos, entretanto, algumas dessas moléculas podem ser parcialmente

decompostas, gerando produtos indesejados, como HPA, dioxinas e furanos (KULKARNI;

CRESPO e AFONSO, 2008). Recentemente, em uma extensa revisão sobre produtos

formados a partir de mecanismos envolvendo pirólise e pirossíntese, Ravindra, Sokhi e Van

Grieken (2008) enfatizaram a formação de compostos carcinogênicos e mutagênicos,

sobretudo HPA. A faixa de temperatura, na qual a maioria destes compostos é formada,

através de reações catalisadas pelos minerais presentes no solo, coincide com a faixa de

temperatura empregada na dessorção térmica.

Neste contexto, o grau de eficiência desse processo pode estar sujeito às oscilações

intrínsecas das condições, em escala industrial, à reforma de moléculas, ao tipo do solo e ao

teor e natureza dos contaminantes. Tais fatores podem contribuir para a presença de HPA e

outros compostos nos solos já tratados, justificando a necessidade de um tratamento

sequencial, que tenha por objetivo, diminuir ou extinguir o risco que os HPA residuais podem

representar.

Geralmente, os tratamentos sequenciais para a remoção de compostos em solo

envolvem combinações de metodologias complementares a um tratamento físico ou químico

prévio, cuja finalidade será aumentar a disponibilidade das moléculas para uma posterior

remoção por via microbiológica. A utilização de micro-organismos na remoção de

hidrocarbonetos de petróleo em solos naturais encontra-se amplamente documentada na

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literatura, sendo considerada ambientalmente correta e com boa aceitação pela opinião

pública (JACQUES et al. 2007, SUPAPHOL et al. 2006, BONTEN; GROTENHUIS e

RULKENS, 1999).

De uma forma geral, dois tipos de abordagens podem ser aplicados na biorremediação

de solos: bioestímulo e bioaumento. Tais estratégias compreendem um conjunto de técnicas

consolidadas tanto pelo meio científico como pela indústria. As metodologias que empregam

o bioestímulo ou o bioaumento estão atreladas às estratégias metabólicas dos micro-

organismos, por exemplo, a produção de biossurfatantes e o cometabolismo, as quais auxiliam

a remoção dos contaminantes do solo por convertê-los em biomassa e metabólitos. Ressalta-se

que as interações ecológicas positivas entre diferentes grupos microbianos potencializam o

bioprocesso como um todo (SENEVIRATNE et al. 2008, CHAÎNEAU et al. 2005,

MULLIGAN, 2004).

Em solos, a biodegradação dos HPA é mais lenta quando comparada a outros

hidrocarbonetos. Tais moléculas não constituem fontes preferenciais de carbono, fazendo com

que o processo de remoção microbiológica ocorra por meio de vias cometabólicas. Partindo

deste princípio, a adição de cossubstratos, como o glicerol, ao solo contaminado, pode

contribuir para o aumento da velocidade de biodegradação. O glicerol é um dos adjuvantes

mais empregados na função de cossubstrato em diversos bioprocessos industriais e bons

resultados foram reportados na literatura quando da utilização do composto na biodegradação

de óleo cru (ZHANG et al. 2005) e no processo de desnitrificação de águas residuárias

(BODÍK et al. 2009).

O glicerol possui diversas vantagens em relação a outros cossubstratos, tais como, a

propriedade osmorreguladora (NEVOIGT e STAHL, 1997), o fato de poder atuar como fonte

preferencial de carbono na síntese de biossurfatantes (BATISTA et al. 2006) e a grande

disponibilidade no mercado. Neste contexto, o glicerol bruto, um coproduto da indústria do

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biodiesel, passa a ter valor agregado, pelo seu reuso dentro do setor de petróleo e gás, uma

vez que sua produção e oferta vêm sendo crescentes ao longo dos últimos anos, por

conseguinte estimulam pesquisas visando o desenvolvimento de aplicações funcionais para o

produto (OOI et al. 2004).

O glicerol bruto é considerado um resíduo industrial em função da concentração de

metais alcalinos, sabões e outras impurezas, oriundas do processo de produção de biodiesel e

mesmo na forma bruta, o composto pode ser assimilado como fonte de carbono para obtenção

de energia e produção de biomassa, apresentando resultados similares aos obtidos quando

empregado o glicerol PA (LIU et al. 2009).

Por tratar-se como uma matéria recente, na literatura pesquisada não foram

encontrados estudos que investigaram a aplicação do composto como cossubstrato durante a

biorremediação de solos contaminados com HPA. Outro ponto importante refere-se à

ausência de investigações sobre as estratégias de tratamento sequencial, microbiológicos ou

de outra natureza, na remoção dos HPA residuais em solos tratados por dessorção térmica.

A única explicação para a deficiência deste tipo de abordagem pode estar na própria

bibliografia relacionada ao tema “dessorção térmica” como um método propriamente dito.

Até hoje, a literatura especializada se preocupou apenas em esclarecer as dúvidas relacionadas

aos possíveis pontos críticos do processo, bem como demonstrar e discutir a sua eficácia, sob

o ponto de vista das análises físico-químicas, negligenciando o grau de risco que uma possível

presença de compostos residuais, pode representar, como nos casos da fitotoxicidade, do

bioacúmulo e da biomagnificação, mesmo quando as concentrações de compostos

remanescentes são baixas. Neste cenário, torna-se clara a necessidade de estudos que visam

investigar como a integração de metodologias pode garantir a real eficácia da intervenção.

Por razões já mencionadas, um questionamento sobre a presença dos HPA residuais no

solo pode vir à luz, tornando possível a percepção da existência de lacunas no que diz respeito

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ao risco à saúde humana e ambiental, representado por tais compostos. Estas lacunas podem

também se estender aos eventos que se seguem ao tratamento de solos por dessorção térmica,

diretamente relacionados à microbiota, à dinâmica dos nutrientes no solo e à recuperação do

equilíbrio do ecossistema (DAZY; FÉRARD e MASFARAUD, 2009).

As informações presentes neste documento dissertam sobre o ineditismo do tema e

descrevem estratégias de tratamento microbiológico sequencial, em escala de laboratório, de

um solo previamente tratado em uma Unidade de Dessorção Térmica, em escala industrial,

contendo ao final deste processo, baixos teores de HPA residuais, implicados na toxicidade de

grau moderado à alto, nos vegetais testados.

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CAPÍTULO 2

OBJETIVOS

2. 1 – Objetivo geral

Avaliar o tratamento microbiológico sequencial de um solo tratado por dessorção

térmica, utilizando a degradação dos 16 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos

listados pela United States Environmental Protection Agency, como variável de

resposta.

2. 2 – Objetivos específicos

Caracterizar o resíduo oleoso de fundo de coluna da câmara de destilação a vácuo,

contaminante do solo.

Avaliar a eficiência do tratamento térmico através da caracterização das amostras de

solo antes e depois do processo.

Identificar os contaminantes residuais no solo após tratamento térmico.

Investigar a biodegradação dos hidrocarbonetos residuais identificados, empregando

técnicas de bioestímulo e bioaumento, com uso de ferramentas estatísticas e de

planejamento experimental.

Utilizar o glicerol bruto, resíduo da fabricação do biodiesel, como cossubstrato do

processo de biodegradação dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos residuais.

Avaliar a fitotoxicidade dos solos pré e pós-dessorção térmica, bem como após a

biorremediação.

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CAPÍTULO 3

REVISÃO DA LITERATURA

3. 1 Resíduos da indústria do petróleo

Há pouco mais de 150 anos, desde a primeira exploração comercial do petróleo nos

Estados Unidos, o ouro negro, como ficou conhecido, firmou-se como um dos mais

importantes pilares da atividade humana em toda a história, assumindo uma posição

privilegiada em nossa sociedade e decidindo os progressos, comodidades, benefícios

oferecidos e a organização de como a conhecemos (CHEREMISINOFF e ROSENFELD,

2009).

O óleo cru necessita de vários tratamentos, sendo o refino, a operação, pela qual são

obtidos os derivados, com maior valor comercial, ao menor custo operacional. O processo do

refino do petróleo consiste em etapas de separação, conversão, tratamento de derivados e

formulação. Na etapa de separação ocorre o desmembramento das frações básicas do óleo

empregando operações primárias, como a destilação atmosférica e operações secundárias, por

exemplo, a destilação a vácuo (CUNHA, 2009, SZKLO, 2005).

Após a separação das frações, os resíduos depositados no fundo das câmaras de

destilação a vácuo são principalmente constituídos por resinas e asfaltenos. Nas operações de

conversão, ocorre a transformação das frações separadas e também do resíduo de fundo das

câmaras de separação, através de reações de quebra, de reagrupamento ou de reestruturação

molecular, tais como, técnicas de craqueamento, alquilação e condensação de anéis,

respectivamente. Na fase de tratamento de derivados são eliminadas ou modificadas algumas

propriedades indesejadas, associadas à presença de diversos contaminantes do óleo, como o

enxofre, por exemplo. Na etapa de formulação, os derivados do petróleo sofrem um

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polimento, alcançando diferentes especificações de pressão de vapor, peso específico,

conteúdo de enxofre, viscosidade, entre outras (CUNHA, 2009, SZKLO, 2005).

Apesar do planejamento e gerenciamento adequados nas refinarias, visando minimizar

possíveis perturbações ambientais, importantes impactos ainda podem ocorrer. Alguns

exemplos desses impactos são o consumo excessivo de água e energia, a produção de grandes

quantidades de efluentes líquidos, a emissão de gases tóxicos e o efeito estufa, bem como a

geração de resíduos sólidos, de difícil tratamento e disposição (BAIRD, 2008).

De acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas, ABNT (2004), os

resíduos são definidos como um material resultante da atividade humana de origem industrial,

doméstica, hospitalar, agrícola, de serviços e de varrição. Em função de suas características

físico-químicas, podem representar risco para a saúde pública e ambiental, dado os diferentes

graus de toxicidade, podendo ser teratogênicos, quando afetam a vida embrionária;

mutagênicos, quando aumentam as taxas de alterações genéticas espontâneas e

carcinogênicos, quando aumentam a probabilidade do desenvolvimento de câncer.

Os resíduos oleosos da indústria do petróleo compreendem uma mistura de substâncias

hidrofóbicas, de graus de recalcitrância distintos e por vezes, carcinogênicas, podendo ser de

natureza orgânica e inorgânica. Os resíduos sólidos, semissólidos e líquidos são formados em

muitas etapas do processo do refino e tratamento de efluentes, bem como durante o transporte

e estocagem da matéria-prima ou do produto pronto (DEUEL Jr. e HOLLIDAY, 1997). A

Tabela 3.1 apresenta alguns dos principais resíduos gerados na indústria do petróleo.

Tabela 3.1 – Resíduos gerados na indústria do petróleo listados por origem*

Tipo de operação Exemplos

Refino

lama do dessalinizador; resíduo de fundo de tanque de

refino; resíduo de coque; borras oleosas; catalisadores

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Refino (continuação) exauridos; finos do catalisador exaurido; finos depositados

nos tratamentos térmicos; lamas dos processos de

conversão de produtos de fundo de câmaras de destilação a

vácuo; águas ácidas; argilas de conversão; argilas de

filtração de óleo lubrificante; sólidos emulsionados em

óleos; sedimento de filtração; lamas ácidas; lamas de

enxofre; produtos fora da especificação.

Tratamento lamas do tratamento de efluentes; lodo de separação óleo-

água; sobrenadante de separadores; lodo biológico; lama

de limpeza dos trocadores de calor e torres de refrigeração;

argilas de absorção.

Limpeza lodo de limpeza de tubos; lodo de limpeza de separadores;

lodo de poeiras do sistema de emissão de gases; efluentes

oleosos em condensadores.

Transporte e estocagem sedimento de fundo do tanque de armazenamento; borras

oleosas; sólidos emulsionados no óleo; ferrugem; crostas;

solo contaminado por derramamentos.

* dados reunidos a partir de diversas fontes

Os resíduos gerados na indústria do petróleo e gás natural podem ser classificados

como resíduos perigosos e não perigosos. Os resíduos perigosos ou classe I apresentam

propriedades que lhes conferem graus de periculosidade, ou seja, inflamabilidade,

corrosividade, reatividade, toxicidade e patogenicidade. Ressalta-se que um resíduo classe I

não necessariamente tem que apresentar todas essas propriedades (ABNT, 2004). As borras

oleosas, resíduos de fundo de tanques e das câmaras de destilação, lodos de tratamento de

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Sólidos emulsionados no óleo (67,2%) Catalisadores exauridos (25,0%)Borra oleosa (4,5%) Sedimentos depositados (2,4%)Lodo biológico (0,6%) Lamas (0,4%)Argilas de absorção (0,2%) Resíduo de fundo de câmara de destilação (0,1%)

efluentes e de limpeza, amônia e catalisadores exauridos, isto é, saturados por metais pesados

e hidrocarbonetos, são exemplos de resíduos gerados na indústria do petróleo, pertencentes à

esta classe.

Os resíduos não perigosos ou classe II compreendem os compostos que não se

enquadram na definição para os resíduos perigosos. Os resíduos classe II se subdividem em

dois grupos: classe IIA ou não inertes, os quais podem apresentar características como

biodegradabilidade, combustibilidade e solubilidade em água; e classe IIB ou inertes,

caracterizados desta forma quando todos os seus constituintes solubilizados apresentam

valores inferiores aos padrões de potabilidade da água, excetuando aspecto, cor, turbidez,

dureza e sabor (ABNT, 2004).

A Figura 3.1 apresenta o percentual de resíduos perigosos gerados em uma refinaria de

grande porte.

Figura 3.1 – Percentual de resíduos perigosos gerados em uma refinaria de grande porte,

calculados a partir de dados de Mariano (2001)

Os resíduos perigosos da indústria de petroderivados são constituídos principalmente

por hidrocarbonetos aromáticos monocíclicos, policíclicos e heterocíclicos, de alta e baixa

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massa molecular, além de água e partículas minerais, incluindo metais pesados. No ponto de

sua geração, podem conter, em média, os seguintes teores: 40-60% de óleo, 30-90% de água e

5-40% de sólidos totais. Desta forma, qualquer resíduo gerado em operações industriais

representa risco para o ambiente e um problema para o setor, determinando que o correto

gerenciamento dos resíduos seja empregado, prática existente mesmo antes do atual

movimento ecológico (DAS e MUKHERJEE, 2007, LAZAR et al. 1999, DEAN, 2005). A

literatura sugere que antes da destinação de tais resíduos, se faz necessário o emprego de

operações de manejo e de tratamento, como por exemplo, o acondicionamento seguro, a

estabilização e a disposição em aterros (MACHÍN-RAMIREZ et al. 2008, MARIANO, 2001).

Quando se dispõem borras oleosas ou qualquer outro tipo de resíduos em aterros, esse

processo deve ser conduzido de forma a garantir a estabilidade hidrológica e mecânica, no

intuito de evitar lixiviação e contaminação por infiltrações. Do contrário, o tratamento e a

disposição final impróprios desses materiais podem causar impactos relevantes e adversos,

principalmente ao solo e aos corpos hídricos subterrâneos (RITTER et al. 2006, MISHRA et

al. 2001, VASUDEVAN e RAJARAM, 2001).

Ao se optar em dispor resíduos oleosos diretamente no solo, a execução equivocada ou

insegura dessa operação pode causar graves danos ao ambiente. No entanto,

independentemente do cuidado e da tecnologia empregada na disposição de resíduos

diretamente no solo, a transferência de massa dos contaminantes através de suas camadas

pode ocorrer e dessa forma, o transporte da matéria orgânica pode seguir três vias: parte se

dissolve na fase líquida do solo, outra fica retida nos poros e uma terceira, compõe a fase

gasosa. Além disso, observa-se que a área onde ocorre a adsorção dos contaminantes nos

agregados é maior do que toda a área encontrada na superfície do solo (NADIM et al. 2000).

Uma vez em contato, os resíduos do petróleo podem afetar propriedades importantes

do solo, tais como, permeabilidade, porosidade, densidade, resistência, estabilidade, umidade,

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entre outras. Em alguns casos, a ação do tempo pode potencializar o impacto negativo no

bioacesso e na biodisponibilidade de certas moléculas, tornando os Hidrocarbonetos

Policíclicos Aromáticos uma das principais classes de compostos reconhecidamente

persistentes (SEMPLE et al. 2007, DUA et al. 2002, VISVANATHAN, 1996).

3. 2 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA)

Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) compõem uma importante e

complexa classe de compostos ubíquos, dotados de dois ou mais anéis aromáticos e

ciclopentanos, condensados e arranjados na forma linear, angular ou em grupos. Os HPA são

geralmente formados a partir de hidrocarbonetos saturados, sob condições deficientes de

oxigênio, utilizando vias de pirossíntese ou de pirólise, catalisadas por certos constituintes

presentes no meio (MUCKIAN et al. 2007, VO-DINH; FETZER e CAMPIGLIA, 1998).

Os HPA se originam a partir de três fontes: 1 – vegetal, pela razão de muitos dos

constituintes das plantas serem formados por moléculas aromáticas, tais como, carotenoides,

lignina, alcaloides e terpenoides; 2- geoquímica, quando a matéria orgânica é exposta à altas

temperaturas, permitindo a formação desses compostos; 3- antropogênica, mais comum e

muito acima do padrão natural de formação (MUELLER; CERNIGLIA e PRITCHARD,

2005).

A maior preocupação com relação aos HPA diz respeito ao seu elevado potencial

mutagênico e carcinogênico, amplamente divulgados na literatura (MATER et al. 2006,

ENELL et al. 2005, WATANABE, 2001, entre outros). Dada a natureza hidrofóbica, os HPA

são bem absorvidos pelos mamíferos, através de três rotas de exposição: ingestão, inalação e

dérmica, resultando em mutações e perturbação nos gametas, além do acúmulo na cadeia

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trófica (FARHADIAN et al. 2011, CEBULSKA-WASILEWSKA et al. 2007, CHEN e LIAO,

2006).

Como xenobióticos, os HPA são considerados os principais contaminantes orgânicos

na natureza, tendo o solo como principal receptor. Essas moléculas podem sofrer

transformações por de diversas vias: oxidação, fotólise, volatilização e biodegradação. Os

principais fatores determinantes da rota de remoção dos HPA estão principalmente

relacionados ao ambiente e às propriedades químicas dessas moléculas, por exemplo, tamanho

e o número e a configuração dos anéis (HAMDI et al. 2007, ZHANG et al. 2006, GONG et al.

2005, KANALY e HARAYAMA, 2000).

Os HPA são classificados em dois grupos de acordo com o número de anéis em HPA

de baixa massa molecular, com dois ou três e HPA de alta massa molecular, com quatro ou

mais anéis (DAUGULIS e McCRACKEN, 2003). A Tabela 3.2 apresenta as principais

características dos dezesseis HPA prioritários listados pelo órgão americano de proteção

ambiental, USEPA (United States Environmental Protection Agency).

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Tabela 3.2 – Características físico-químicas e classificação da atividade genotóxica dos 16 HPA prioritários listados pela USEPA*

HPA

n° de anéis

Massa

molecular (g)

Genotoxicidade

(classes) †

Fórmula

Solubilidade

(mg/L)

Pressão de vapor (mmHg)

logKw/o

Ponto de fusão

(°C)

Ponto de

ebulição (°C)

d (g/L) §

Naftaleno 2 128,17 2B C10H8 31,0 8,89x10-2 3,4 80 218 1,14 Acenafteno 3 154,21 3 C12H10 3,8 3,75x10-3 3,9 94 280 1,02 Acenaftileno 3 152,20 -- C12H8 16,1 2,90x10-2 4,1 91 280 1,01 Fluoreno 3 166,22 3 C13H10 1,9 3,24x10-3 4,2 116 295 1,20 Fenantreno 3 178,23 3 C14H10 1,1 6,80x10-4 4,6 101 339 1,25 Antraceno 3 178,23 3 C14H10 0,045 2,55x10-5 4,5 218 340 1,25 Fluoranteno 4 202,26 3 C16H10 0,26 8,13x10-6 5,2 111 375 1,25 Pireno 4 202,26 3 C16H10 0,132 4,25x10-6 5,2 146 404 1,27 Benzo[a]antraceno 4 228,29 2B C18H12 0,011 1,54x10-7 5,6 162 435 1,27 Criseno 4 228,29 2B C18H12 0,0015 7,80x10-9 5,9 254 448 1,27 Benzo[b]fluoranteno 5 252,32 2B C20H12 0,0015 8,06x10-8 6,1 168 481 1,24 Benzo[k]fluoranteno 5 252,32 2B C20H12 0,0008 9,59x10-11 6,8 217 480 1,24 Benzo[a]pireno 5 252,32 1 C20H12 0,0038 4,89x10-9 6,5 179 495 1,24 Dibenzo[a,h]antraceno 5 276,34 3 C22H12 0,005 2,10x10-11 6,5 267 324 1,28 Benzo[g,h,i]perileno 6 278,35 3 C22H14 0,00026 1,00x10-10 6,6 278 550 1,30 Indeno[1,2,3-c,d]pireno 6 278,35 2B C22H14 0,062 1,40x10-10 7,1 164 536 1,30

fontes: IARC (2010); Bojes e Pope (2007), Cai et al. (2007), Eom et al. (2007), Zhang et al. (2006), Daugulis e McCracken (2003) e Pope, Peters e Howard (2000) * United States Environmental Protection Agency † classes: 1- carcinogênico para humanos; 2B- possivelmente carcinogênico para humanos; 3 – não classificado como carcinogênico para humanos ‡ constante de partição água/octanol § densidade (g/L)

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Os dezesseis HPA prioritários listados pela USEPA representam um modelo de

unidade geral para um grande grupo de moléculas e foram escolhidos utilizando critérios

baseados nos seguintes fatos: 1- há bastante informação disponível; 2- são compostos

representativos da classe, em termos de toxicidade e 3- se encontram em concentrações

superiores aos demais HPA, consequentemente, aumentando o risco, pela maior exposição

(RAVINDRA; SOKHI e VAN GRIEKEN, 2008, THOMAS e WORNAT, 2008)

A Figura 3.2 apresenta as estruturas químicas dos 16 HPA prioritários da USEPA.

Figura 3.2 – Estruturas químicas dos 16 HPA prioritários da USEPA (fonte:

RAVINDRA; SOKHI e VAN GRIEKEN, 2008)

As moléculas dos HPA são bastante hidrofóbicas, em razão de fenômenos de

ressonância eletrônica e outras propriedades químicas, ligando-se fortemente às partículas do

solo, dificultando o bioacesso e aumentando a resistência à biodegradação (GONG et al.

2007, ENELL et al. 2005). Diversas razões podem ser identificadas para explicar o caráter

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persistente desses compostos: baixa solubilidade em água (JACQUES et al. 2008,

HARAYAMA, 1997), baixa biodisponibilidade (SAMANTA; SINGH e JAIN, 2002),

estabilidade molecular (KANALY e HARAYAMA, 2000, YUSTE et al. 2000), alto

coeficiente de adsorção no solo (MOHAMED et al. 2006, VAN HAMME; SINGH e WARD,

2003), altos pontos de fusão e ebulição (GONG et al. 2007), atividade inibitória da microbiota

(TOLEDO et al. 2006) e participação de reações de condensação de anéis e de formação de

radicais livres, catalisadas por metais do solo (RISOUL et al. 2005, LEDESMA et al. 2000,

KARIMI-LOFTABAD; PICKARD e GRAY, 1996).

O Ministério da Habitação, Planejamento e Meio Ambiente da Holanda considera a

soma da concentração de 10 HPA padrões (naftaleno, antraceno, fenantreno, fluoranteno,

benzo[a]antraceno, criseno, benzo[a]pireno, benzo[g,h,i]perileno, benzo[k]fluoranteno e

indeno[1,2,3-c,d]pireno), cujos valores são distintos para duas categorias denominadas valor

de referência, 1 mg/kg e valor de intervenção, 40 mg/kg. O valor de referência indica o padrão

natural desses HPA no solo, não representando risco para a saúde do ambiente e do homem.

Por outro lado, o valor de intervenção refere-se ao caso de contaminação do solo, cuja

implantação imediata de estratégias de remediação da área é necessária (NEDERLAND,

2006).

No Brasil, o Conselho Nacional do Meio ambiente, CONAMA, determina valores

orientadores dos HPA para solo, distribuídos em três classes denominadas: referência,

prevenção e intervenção. Os valores de intervenção ainda estão subdivididos em outras três

categorias: para áreas agrícolas, para áreas residenciais e para áreas industriais. Diferente na

lista holandesa, os valores orientadores de intervenção em áreas industriais não correspondem

à uma soma de 10 HPA padrões e sim, a valores individuais, em mg/kg de solo seco, de 10

HPA, cujas concentrações não poderão estar acima dos seguintes valores: antraceno (0,0),

benzo[a]antraceno (65,0), benzo[k]fluoranteno (0,0), benzo[g,h,i]perileno (0,0),

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benzo[a]pireno (3,5), criseno (0,0), dibenzo[a,h]antraceno (1,3), fenantreno (95,0),

indeno[1,2,3-c,d]pireno (130,0) e naftaleno (90,0) (BRASIL, 2009).

3. 3 Vias para tratamento de solos contaminados com óleo

Ao longo das últimas décadas, o aumento da necessidade da proteção ambiental

proporcionou uma intensa cobrança por parte da opinião pública, motivada principalmente

por eventos de grande apelo visual e impacto na mídia, tais como, os derramamentos de óleo,

a poluição de corpos hídricos, as grandes chaminés de fábricas e o desmatamento de florestas.

O momento histórico que deu início ao que chamamos de consciência ambiental ocorreu a

partir do impacto causado pelas fotos do planeta Terra, vista no espaço, tiradas por

astronautas, entre os anos de 1968-1970. Pela primeira vez na história, o planeta foi visto por

inteiro e pôde-se perceber o quão solitário e frágil está no espaço. Nas décadas seguintes,

registrou-se o crescimento da preocupação com relação à poluição ambiental, proteção de

áreas naturais e crescimento populacional, entre outros. Por vezes, assuntos como a guerra fria

e a recessão puseram a necessidade de proteção ambiental em segundo plano, somente

tornando-se prioritário com a proximidade do início do século XXI (ODUM e BARRETT,

2008, LESCHINE, 2002).

O tratamento do solo contaminado por óleo tem como objetivo a redução do volume

do contaminante e a desintoxicação da área impactada. Os métodos e tecnologias aplicados

são limitados pelas condições ambientais e requerem decisão baseada em estudos de caso

(ANDERSON, 2002, NORDVIK, 1999, SAXENA e JOTSHI, 1996). A Tabela 3.3 apresenta

as principais estratégias aplicadas no tratamento de solos impactados com óleo e derivados.

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35

Tabela 3.3 – Exemplos de tratamentos de solos contaminados por óleo e derivados*

Tratamentos físicos Tratamentos químicos Tratamentos biológicos

Dessorção térmica

Escavação e Aterro

Extração do vapor do solo

Remoção mecânica

Lavagem

Imobilização

Queima in situ e ex situ

Injeção de oxidantes

Injeção de emulsificantes

Aplicação de dispersantes

Extração por solvente

In situ flushing

Estratégias de Bioestímulo

Bioaumento

Biopilha

Fitorremediação

Compostagem

Biorreatores

Biofiltros

Landfarming * dados reunidos a partir de diversas fontes

Dentre as técnicas mais empregadas e comercialmente disponíveis para a remoção de

contaminantes em solos impactados por óleo destacam-se os tratamentos térmicos,

reconhecidos por alguns autores, como os mais eficientes. No entanto, as alternativas

biológicas são consideradas menos invasivas e ambientalmente corretas. De acordo com a

temperatura empregada, os tratamentos térmicos são classificados em dois tipos: 1- técnicas

de dessorção, operando na faixa de temperatura entre 100 e 350°C, as quais promovem o

aquecimento do solo e a separação física através da transferência de massa para a fase gasosa

e 2- técnicas de destruição, operando na faixa de temperatura acima de 350°C, promovendo a

modificação química dos contaminantes (MERINO e BUCALÁ, 2007, SAXENA e JOTSHI,

1996).

A complexidade e a concentração dos poluentes, as propriedades dos solos e a

contaminação residual após algumas alternativas de tratamento térmico, com ênfase nos

compostos menos voláteis, sugerem a necessidade de alternativas sequenciais, menos

agressivas e economicamente atrativas. Nesses casos, os tratamentos biológicos seriam

indicados como uma complementação. Outro fator importante na determinação da estratégia

de tratamento de solos impactados com óleo é o tempo necessário para a remediação. Esse

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36

período pode variar de poucos meses a muitos anos e a escolha do processo depende de

alguns fatores, tais como, qualidade e quantidade dos contaminantes presentes, tamanho e

profundidade da área contaminada, tipo de solo e condições ambientais. Entre esses fatores, o

tipo do contaminante é considerado o parâmetro determinante (FRIIS et al. 2006, ENELL et

al. 2005, ARARUNA Jr. et al. 2004).

Geralmente, a interação entre os tratamentos físico-químicos com os tratamentos

biológicos ocorre de forma sequencial ou secundária, sendo empregados antes ou depois da

biorremediação. Tais abordagens podem ser exemplificadas pela adição de solventes ao solo

ou pelo emprego do reagente de Fenton ou ozônio após o biotratamento, respectivamente. No

primeiro exemplo, os compostos hidrofóbicos são dissolvidos, favorecendo a assimilação

desses compostos pelos micro-organismos, isto é, aumentando sua biodisponibilidade. No

segundo exemplo, as estratégias empregadas participam de reações de oxidação dos

contaminantes residuais e seus metabólitos (GAN; LAU e NG, 2009).

Na extensa literatura consultada, a aplicação de qualquer tratamento biológico

sequencial para a remoção de compostos residuais, em solos tratados por dessorção térmica,

ainda não foi executada, uma vez que os autores enfatizam a eficiência da operação baseados

nas características físico-químicas do solo após a passagem pelo forno. Contudo, ressalta-se

que as altas temperaturas e certas oscilações intrínsecas do processo podem promover

determinadas condições, nas quais, um tratamento secundário se faça necessário.

3. 3. 1 Dessorção térmica

A dessorção térmica é um processo de remoção de moléculas no estado líquido ou

gasoso, aderidas à superfície, contidas nos micro e nos mesoporos dos sólidos, através da

aplicação de energia térmica. O tratamento de solos contaminados utilizando o processo de

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37

dessorção térmica é considerado uma das técnicas de remediação mais adequadas e versáteis,

dentre as existentes na atualidade. Isto se deve ao amplo espectro de contaminantes orgânicos

e de alguns metais que podem ser convertidos às suas formas voláteis. Em solos

contaminados com óleos, o método está fundamentado no fenômeno de volatilização dos

constituintes do contaminante, envolvendo equilíbrio de fases e transferência de massa, sendo

a temperatura, um dos principais fatores do processo. Os tipos dos contaminantes, as

características do solo, incluindo a textura e o tempo de residência do material nos

equipamentos, também são fatores importantes ao sucesso da dessorção térmica

(FALCIGLIA; GIUSTRA e VAGLIASINDI, 2011, DAZY; FÉRARD e MASFARAUD,

2009, GEORGE et al. 1995, BUCALÁ et al. 1994).

Várias tecnologias podem ser empregadas na extração ou na recuperação de

compostos orgânicos, bem como no tratamento de solos contaminados por óleo. No entanto, a

partir da década de 1990, a dessorção térmica, apesar de envolver grande investimento,

recebeu destaque pela eficácia, ganho em tempo e menor investimento por tonelada de solo,

correspondendo à aproximadamente 50% dos gastos quando comparada à biorremediação.

Outras importantes vantagens apresentadas pela técnica são a possibilidade de remediar

grandes quantidades de solo em menor tempo, a não produção de metabólitos por não

envolver atividade biológica, o potencial de aplicação na recuperação do óleo e a

possibilidade de aumentar a biodisponibilidade do contaminante através de sua redistribuição

no solo (ROBINSON et al. 2008, WORLD OIL, 2001, BROTEN; GROTENHUIS e

RULKENS, 1999).

Deve-se também ressaltar que embora o processo de dessorção térmica não tenha sido

desenvolvido para decompor moléculas orgânicas, alguns deles podem o ser, de forma parcial.

As temperaturas empregadas podem promover reações de isomerização e ou alongamento de

cadeia, gerando a presença de compostos residuais após a passagem pelo forno. Em relação a

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este processo, a não destruição total dos constituintes tóxicos pode se tornar um problema,

caso não haja um planejamento eficaz para descarte de resíduos remanescentes. Outros pontos

críticos importantes da operação são a geração de emissões de gases de efeito estufa e a

formação de produtos e subprodutos da combustão incompleta, tais como, dioxinas, furanos,

óxidos de enxofre e nitrogênio e os vapores de metais. Para contornar tais inconvenientes, a

Unidade de Dessorção Térmica possui um sistema de controle de poluição de gases, que será

discutido mais adiante (POPE; PETERS e HOWARD, 2000, McGOWAN; GREER e

LAWLESS, 1996).

Os fenômenos envolvidos na dessorção térmica são divididos em duas etapas:

liberação de compostos orgânicos voláteis e água, seguida pela liberação lenta de óleo com o

aumento gradual da temperatura, tendo como consequência a perda de massa representada

pelas perdas de água, hidrocarbonetos, material húmico, metais e alguns minerais como

carbonatos. A dessorção térmica pode ser aplicada nos casos de solos contaminados com

misturas de hidrocarbonetos, no entanto, um elevado grau de atenção deve ser tomado quando

o tratamento envolve solos contaminados com óleos ou resíduos oleosos contendo elementos

metálicos em elevadas concentrações, em especial, arsênio e mercúrio, bastante comuns em

alguns óleos crus (WORLD OIL, 2001).

A natureza do óleo e do solo pode requerer ainda, um elevado gradiente de

temperatura, associado a um aumento do tempo de residência no equipamento térmico para a

remoção satisfatória dos contaminantes, conferindo o aumento significativo do custo, um dos

limitantes do processo (LEE et al. 1998).

Geralmente, as Unidades de Dessorção Térmica em escala industrial utilizam o

esquema simplificado apresentado na Figura 3.3.

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39

1 2 3

8

4

5

6 7

Resíduo

Efluente GasosoTratado

SólidosTratados

Efluente LíquidoTratado

Figura 3.3 - Esquema simplificado de uma Unidade de Dessorção Térmica. 1-

armazenamento do resíduo; 2 – preparação e estoque; 3- admissão; 4 – dispositivo

transportador; 5 – forno; 6- sistema de tratamento de gases; 7 – sistema de tratamento e

reciclo dos efluentes; 8 – armazenagem dos sólidos; θ – inclinação do forno (adaptado de

SECOND, 2000)

Segundo De Percin (1995), independentemente do tipo do resíduo, esse material

necessita passar por unidades de operações de recepção e armazenamento temporário visando

dar condições para as análises no material recebido e o correto acondicionamento, respeitando

a compatibilidade química entre os vários materiais. Nessa etapa, pode ser verificado se os

materiais possuem propriedades radioativas, oxidantes, explosivas, entre outras, e por isso é

de fundamental importância para a segurança do processo e dos trabalhadores, bem como para

o desempenho do processo. Os dados obtidos na recepção e armazenagem dos resíduos

permitem escolher as operações unitárias a serem empregadas na preparação do material que

seguirá para o equipamento térmico. Dentre essas operações, destacam-se a mistura dos

sólidos e dos líquidos, moagem e a separação granulométrica. Assim, pode-se obter uma

mistura de resíduos, com poder calorífico adequado, evitando explosões dentro do forno e

reduzindo custos com energia.

Após a etapa de preparação, também conhecida como blendagem, segue a operação de

admissão. Nessa etapa, a massa a ser admitida no equipamento térmico é dosada, em geral,

com um equipamento denominado moega. A quantidade de material que sai da moega

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40

depende das características da mistura preparada na etapa de blendagem, da temperatura do

forno, das dimensões do equipamento e dos sistemas de controle de emissões acoplados.

Após a moega, encontra-se a operação de transporte dos resíduos para o forno. Esta

etapa determina o fluxo de massa na entrada, de forma a garantir uma homogeneidade do

material, incrementando a eficiência do processo. O transporte de material para o forno pode

ser feito por meio de equipamentos mecânicos, como as correias transportadoras e os

parafusos-sem-fim. As operações manuais de transporte podem ser realizadas, no entanto, são

menos eficientes, pois apresentam dificuldades para manutenção de velocidade constante e

estão relacionadas aos problemas de saúde ocupacional.

Ao serem admitidos no forno, os resíduos entram em contato com a energia térmica

presente no equipamento. Esse contato pode ser feito de forma direta ou indireta. Os

equipamentos que possibilitam o contato direto dos resíduos com a chama no forno são

denominados Unidades de Dessorção Térmica com chama direta, já os equipamentos que não

possibilitam o contato dos resíduos com a chama são denominados de Unidades de Dessorção

Térmica com chama indireta. Nesse caso, o calor é transferido à uma superfície que conduz

calor aos materiais nela dispostos. A temperatura de operação dos fornos varia, conforme o

ponto de ebulição dos compostos que se deseja remover dos resíduos (DE PERCIN, 1995).

O tempo de residência dos resíduos no forno é controlado por duas variáveis: a

inclinação e a rotação do forno. Os sistemas rotatórios para dessorção térmica são os mais

comuns e tais sistemas, quando aplicados em chama direta contracorrente, são considerados

mais eficientes para o processo (McGOWAN; GREER e LAWLESS, 1996). A Figura 3.4

apresenta o esquema de um forno rotatório usado no tratamento de solos contaminados por

óleo.

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41

Figura 3.4 – Corte longitudinal de um forno rotatório (adaptado de HEYDENRYCH;

GREEF e HEESINK, 2002)

À medida que ocorre o movimento giratório, o solo dentro do tambor rotatório se

distribui em duas regiões com características distintas. Próximo à base, forma-se a camada

passiva, que compreende a maior porção, enquanto que na parte superior, forma-se a camada

ativa. A camada ativa possui uma profundidade variável em função da velocidade empregada

e das partículas que se movem da superfície para a parte inferior da face do rotor, ocorrendo

nesta região a transferência de massa (HEYDENRYCH; GREEF e HEESINK, 2002).

O tempo de residência e a velocidade de rotação também promovem modificações da

matriz sólida. Essas modificações são causadas pela quebra das partículas em função do atrito,

gerando partículas com diâmetros menores, principalmente na camada passiva. Além da

temperatura, a matriz do solo é outro fator importante e geralmente areia e cascalho produzem

resultados melhores que solos argilosos (ARARUNA Jr. et al. 2004, McGOWAN; GREER e

LAWLESS, 1996, RINK et al. 1993).

Os vapores e gases emanados no forno são direcionados para o sistema de tratamento

de gases. Esse sistema pode possibilitar a condensação do efluente gasoso através da redução

da temperatura, permitindo, assim, a recuperação de contaminantes de interesse, como por

exemplo, hidrocarbonetos. Em outros casos, o sistema é equipado com uma câmara de pós-

Luz do forno

camada ativa

camada passiva

sentido da rotação

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combustão, CPC, na qual ocorre nova adição de calor no sistema, promovendo a oxidação da

fase gasosa. Para esse caso, a temperatura deve estar entre 800 e 1200°C (BRASIL, 2002).

Independentemente da presença da CPC ou de sistema de condensação, os efluentes

gasosos emanados desses dispositivos são encaminhados para sistemas de resfriamento,

visando reduzir a formação de outras moléculas, destacam-se as dioxinas e os furanos,

compostos altamente carcinogênicos. Os efluentes gasosos, em seguida, são encaminhados

para lavadores de gases e para ciclones e/ou filtros visando à remoção de gases ácidos, óxidos

de nitrogênio e de enxofre, bem como remoção de material particulado (KULKARNI;

CRESPO e AFONSO, 2008).

A legislação brasileira preconiza que esses sistemas de tratamento de gases devem ser

equipados com sistemas automáticos para monitoramento das emissões, possibilitando o

fechamento da entrada do forno para casos de emissões fora dos padrões estabelecidos,

ausência de chama, baixo teor de oxigênio, alto teor de monóxido de carbono, entre outros

parâmetros que possam indicar queima inadequada (BRASIL, 2002). Esse processo de

monitoramento contínuo das emissões, com interligação da resposta analítica automatizada à

porta do forno é denominado de intertravamento.

Para resfriamento e tratamento dos gases usam-se líquidos e equipamentos diversos.

Os líquidos gerados na unidade são em geral, recirculados no processo com vista à redução

dos custos do processo e os sólidos tratados são encaminhados para um local de

armazenamento para análises. Caso seja considerado adequado, o resíduo tratado é

encaminhado para destino selecionado, caso seja considerado inadequado, retorna à etapa de

preparação, reingressando ao processo.

O tratamento térmico promove modificações no solo, alterando suas características

micro e macroscópicas, bem como muitas de suas propriedades físicas, por exemplo,

resistência, plasticidade, densidade e capacidade de retenção de água. A temperatura

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apresenta efeitos significativos principalmente na faixa acima de 100°C (ABU-ZREIG; AL-

AKHAS e ATTOM, 2001).

De acordo com McGrath, Sharma e Hajaligol (2001), dentro do forno ocorrem

concomitantemente, várias reações mediadas pela temperatura e pelo tempo de residência, de

modo que HPA podem ser eliminados e outras substâncias podem ser transformadas em HPA,

através do processo denominado por “reforma” ou “síntese de novo”1, isto é, quando sob altas

temperaturas, moléculas complexas são formadas a partir de precursores simples. Em recente

estudo, o catecol, molécula composta por apenas um anel aromático, foi utilizado como

modelo para a investigação da formação de produtos de combustão incompleta, sendo

observada a formação de 43 diferentes tipos de HPA, desde naftaleno (C10) ao coroneno (C24)

(THOMAS e WORNAT, 2008).

Os compostos de C1 a C5 constituem as maiores fontes para formação dos HPA. Tais

moléculas submetidas à temperaturas acima de 300°C perdem radicais alquila, gerando a

liberação de hidrogênio e de hidrocarbonetos leves, destacando-se o acetileno e o metano.

Neste cenário também é possível a formação de radicais livres, que ao se combinarem com os

hidrocarbonetos leves, promovem reações de condensação de anéis aromáticos, bem como

interações com HPA de baixa massa molecular, produzindo isômeros ou aumentando a massa

molecular por conta do alongamento da cadeia (RAVINDRA; SOKHI e VAN GRIEKEN,

2008, POPE; PETERS e HOWARD, 2000, BUCALÁ et al. 1996).

Neste contexto, pode existir também a conversão de HPA não mutagênicos em HPA

mutagênicos como, por exemplo, pireno em benzo[a]pireno. Os HPA mais reativos são o

acenafteno, fluoreno, antraceno, e as formas metiladas de naftaleno, fenantreno e antraceno.

As reações de isomerização e aromatização também podem ocorrer e serem catalisadas por

1 Do latim de novo – que vem do novo, do início ou do zero

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minerais e metais presentes no solo (POPE; PETERS e HOWARD, 2000, REMMLER e

KOPINKE, 1995).

3. 3. 2 Biorremediação

A biorremediação é um processo que visa a recuperação de solos contaminados por

substâncias tóxicas pela ação de micro-organismos. A biorremediação de solos pode ser

classificada em dois grupos: in situ, isto é, na própria área contaminada, ou ex situ, quando se

faz necessária remoção física (MARGESIN et al. 2007, PALA et al. 2006, POPP;

SCHLÖMANN e MAU, 2006).

Do ponto de vista do seu planejamento, a biorremediação de solo contaminado por

hidrocarbonetos é um processo transdisciplinar, envolvendo interações entre engenharia,

microbiologia, ecologia, geologia e a química (SAMANTA; SINGH e JAIN, 2002). A

biorremediação é uma alternativa atraente e de baixo custo, baseada no estímulo da atividade

metabólica dos micro-organismos para a conversão dos contaminantes em substâncias

atóxicas e biomassa (CHAÎNEAU et al. 2005, PŁAZA et al. 2005, RAHMAN et al. 2002,

WATANABE, 2001). Entre as vantagens consideradas mais importantes da biorremediação

de solos contaminados por óleo destacam-se: o custo, a possibilidade de aplicação em

conjunto a outros métodos de remoção e a aceitação pública. Por outro lado, o acúmulo de

metabólitos tóxicos se caracteriza como a principal desvantagem do processo (CHAILLAN et

al. 2004, BOOPATHY, 2000).

A biorremediação de solos contendo HPA requer tempo e apresenta maior

complexidade quando comparada aos processos desenvolvidos para tratamento de ambientes

contaminados com alguns hidrocarbonetos alifáticos. A maior dificuldade vem do fato de que

parte significativa dos HPA e de metabólitos pode estar incorporado à matéria húmica,

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tornando a razão sorção/dessorção dos HPA, o principal fator governante de sua remoção

(BARRIOS, 2007, WATANABE, 2001, YUSTE et al. 2000).

É importante salientar que fatores intrínsecos e extrínsecos incrementam a dificuldade

de biorremediar solos contaminados com HPA e alguns deles estão listados na Tabela 3.4.

Tabela 3.4 – Principais fatores limitantes na remoção dos HPA no solo

Fatores Exemplos Referências

Intrínsecos da Microbiota

composição

tamanho e diversidade

versatilidade metabólica

aumento da atividade enzimática

produção de biossurfatantes

viabilidade de aceptores de elétrons

interações ecológicas

do Contaminante

natureza

tamanho e estrutura da molécula

biodisponibilidade

toxicidade de metabólitos

histórico da contaminação

Øvreås (2000)

Liu et al. (2006)

Marin, Hernandez e Garcia (2005)

Löser et al. (1998)

Singh, Van Hamme e Ward (2007)

Mulligan e Yong (2004)

Tilman (2000)

Atlas (1981)

Bossert, Kachel e Bartha (1984)

Semple et al. (2007)

Boopathy (2000)

Płaza et al. (2006)

Extrínsecos

do Ambiente

temperatura

tempo

mudanças sazonais

umidade

matéria orgânica

nutrientes essenciais

pH

propriedades do solo

profundidade

Dibble e Bartha (1979)

Rivas (2006)

Marschner e Kalbitz (2003)

Ettema e Wardle (2002)

Amellal, Portal e Berthelin (2001)

Čejková, Masák e Jirků (1997)

Rahman et al. (2002)

Margesin et al. (2007)

Vasudevan e Rajaram (2001)

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Extrínsecos

(continuação)

presença de cossubstrato Romantschuk et al. (2000)

A biorremediação de solos contaminados com HPA é um processo controlado que

necessita aplicação de condições muitas vezes não encontradas naturalmente. O revolvimento

do solo é uma das condições primordiais, permitindo a homogeneização, ao mesmo tempo em

que promove aeração, quebra de agregados, eliminação de compostos voláteis e o aumento do

contato de micro-organismos com nutrientes e substratos (JONER et al. 2004). O tipo e a

estrutura do solo afetam diretamente a biodisponibilidade do contaminante, bem como a

organização e a densidade das comunidades degradadoras, consideradas os pontos centrais da

biorremediação (SCHERR et al. 2007).

Os micro-organismos dominam e possuem um papel fundamental na natureza, por

conta da sua biomassa e da atividade metabólica, envolvendo na maioria das vezes a atuação

de enzimas indutivas e constitutivas. Geralmente, os consórcios microbianos são o foco dos

processos de biorremediação, sendo a sua importância atribuída à cooperação metabólica e ao

cometabolismo (ALDÉN; DEMOLING e BÅÅTH, 2001, JOHNSEN; WICK e HARMS,

2005, SPAIN e VAN VELD, 1983).

A temperatura é considerada o principal fator na biodegradação dos HPA quando

presentes no solo. A faixa ótima está estabelecida entre 30 e 40°C, facilitando a mobilização

dos HPA e aumentando a solubilidade (PERFUMO et al. 2007, LEAHY e COLWELL, 1990),

como também refletindo diretamente na atividade microbiana, promovendo o aumento da

atividade enzimática (POPP; SCHLÖMANN e MAU, 2006).

A faixa de pH considerada ideal da biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo,

incluindo HPA, se encontra entre 7,4 e 7,8, sendo considerada ótima em 7,8 e valores de 8,5

ou superior, não indicados (FRANCO et al. 2004, RAHMAN et al. 2002, ROWLAND et al.

2000).

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O teor de umidade entre 15 e 20% é considerado ideal da biodegradação dos HPA.

Nesta faixa, pode ser estabelecido um cenário propício à competição entre as moléculas de

água pelos mesmos sítios minerais de sorção dos HPA nos agregados do solo. Dessa forma,

maior quantidade de HPA pode ser encontrada não sorvida à matriz e como consequência, o

bioacesso pode sofrer um aumento (KOTTLER; WHITE e KELSEY, 2001).

A presença de oxigênio é fundamental para o início do processo degradativo porque

diversas enzimas envolvidas na quebra das moléculas são oxigenases. A aeração artificial

acelera o processo e se caracteriza como fator determinante na velocidade da biorremediação

(LEAHY e COLWELL, 1990).

A concentração de nutrientes, representados principalmente por nitrogênio e fósforo é

o fator limitante mais comum da biorremediação de solos. As fontes de nitrogênio e fósforo

são essenciais para aumento da biomassa, refletindo diretamente na eficiência da

biodegradação (KIM et al. 2005, SARKAR et al. 2005, VAN HAMME; SINGH e WARD,

2003, O’DONNELL et al. 2001).

A melhoria da aeração, a correção do pH e a umidade do ambiente, bem como a

adição de nutrientes compõem etapas da técnica de bioestímulo e visam adequar o ambiente

às melhores condições para a biodegradação (MARGESIN; HÄMMERLE e TSCHERKO,

2007, BENTO et al. 2005, SARKAR et al. 2005).

Por outro lado, o bioaumento baseia-se na introdução de micro-organismos originados,

na sua grande maioria, do próprio solo a ser tratado (DEJONGHE et al. 2001). A forma usual

da aplicação do bioaumento é realizada utilizando consórcios microbianos. Preferidos no

lugar de culturas axênicas, os consórcios microbianos são extremamente práticos, podendo ser

exclusivamente bacterianos (JACQUES et al. 2008, AYOTAMUNO et al. 2007),

exclusivamente fúngicos (MEYSAMI e BAHERI, 2003) ou mistos, isto é, compostos por

bactérias e fungos (BOONCHAN et al. 2000).

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É estabelecido na literatura que a concentração do inóculo esteja entre 107 e 1012

UFC/g para os solos onde a biodisponibilidade é um fator limitante, como no caso dos solos

contaminados por HPA. No caso do bioaumento, acredita-se que o inóculo deve ser maior ou

igual à população microbiana encontrada no solo a ser tratado. Isto pode promover garantias

contra obstáculos importantes a partir da inoculação, tais como, adaptação, predação,

competição, imobilidade e substâncias inibidoras como metabólitos ou altas concentrações de

cossubstratos e fertilizantes (MACNAUGHTON et al. 1999, VOGEL, 1996, LEAHY e

COLWELL, 1990).

Alguns autores sugerem, no entanto, que a interação das técnicas de bioaumento e

bioestímulo seria uma alternativa muito interessante, dada as vantagens que este tipo de

associação pode trazer para a biorremediação de solos contaminados por petroderivados

(HAMDI et al. 2007, NIKOLOPOULOU; PASADAKIS e KALOGERAKIS, 2007,

MÁRQUES-ROCHA et al. 2005). Outros autores comparam as duas técnicas na tentativa de

eleger qual o tipo ideal de tratamento, isto é, se o aumento da população por injeção de micro-

organismos ou por estratégias de bioestímulo. No entanto, cada histórico de contaminação é

único, não podendo assim ser apontado qual o melhor tratamento antes de uma investigação

prévia. Em algumas situações o bioaumento foi melhor que o bioestímulo (MANCERA-

LÓPEZ et al. 2008) e em outras, foi observado o contrário (BENTO et al. 2005).

3. 4 Degradação dos HPA por micro-organismos hidrocarbonoclásticos do solo

O solo caracteriza-se como um ambiente de alta complexidade biológica, contendo a

maior porção de biodiversidade, contribuindo dessa forma, para a sustentabilidade de diversos

ecossistemas. Grande parte da atividade humana ocorre em terra, razão pela qual é conferida

ao solo, a maior suscetibilidade a possíveis impactos, resultados da contaminação por diversas

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fontes, tais como pesticidas, resíduos sólidos urbanos e hidrocarbonetos do petróleo.

Particularmente o petróleo, produto explorado comercialmente desde 1859, apresenta um

significativo potencial de risco ao ambiente durante qualquer etapa de sua produção,

distribuição e consumo (BARRIOS, 2007, PAUL, 2007, LILLEY et al. 2006, THOMAS,

2001).

A introdução de hidrocarbonetos do petróleo no solo tem origem antropogênica em

mais de 90% dos casos. A presença dos hidrocarbonetos no solo é responsável pelo aumento

da razão C:N:P, tornando-a muito mais alta do que em ecossistemas livres desses compostos.

Em muitos casos, ao ser identificada a contaminação, encontra-se no solo uma mistura de

metabólitos com óleos não biodegradados (NIKOLOPOULOU; PARADAKIS e

KALOGERAKIS, 2006, OLLIVIER e MAGOT, 2005).

As reações microbianas são a chave para a recuperação de solos contaminados por

óleo e o processo de adaptação dos micro-organismos na presença do contaminante, bem

como o estresse causado ao ecossistema promovem uma pressão seletiva permitindo que

gerações de indivíduos hidrocarbonoclásticos se estabeleçam (LEE; OH e KIM, 2008,

HAMAMURA et al. 2006). Ao longo do tempo, tais micro-organismos reduzem o avanço da

contaminação através da formação de produtos menos tóxicos ou da sua total mineralização

(MULLIGAN e YONG, 2004, SMETS e PRITCHARD, 2003). A biodegradação de

hidrocarbonetos do petróleo em solo é dividida em duas fases distintas: a primeira, mais

rápida e mediada pela biodisponibilidade do poluente e a segunda fase, mais lenta, controlada

pela relação sorção/dessorção dos hidrocarbonetos nos agregados do solo (KAPLAN e

KITTS, 2004, CORNELISSEN et al. 1998).

Em solos não contaminados por óleo, estima-se que apenas 0,1% dos organismos

sejam hidrocarbonoclásticos, no entanto, nos casos de solos contaminados por longos

períodos, podem representar 100% dos indivíduos. A presença de hidrocarbonetos do petróleo

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muda a composição da microbiota endógena do solo e esta mudança é proporcional à

concentração das substâncias xenobióticas (MOON et al. 2006, ATLAS, 1981).

Cada classe de hidrocarbonetos é degradada por diferentes maneiras pelos micro-

organismos, utilizando enzimas indutivas e constitutivas. Ao longo do tempo, o fenômeno de

tolerância ao contaminante é estabelecido, tornando o sistema mais resistente a estresses

adicionais, até que os hidrocarbonetos e os metabólitos resultantes da biodegradação sejam

totalmente degradados (HAMAMURA et al. 2006, ZOCCA et al. 2004).

Os micro-organismos e as plantas são os maiores agentes de remoção dos HPA do

solo. Dada a sua estrutura química, os HPA não são substratos de preferência microbiana,

entretanto, a maioria dos micro-organismos pode degradar HPA de baixa massa molecular,

utilizando-os como cossubstratos durante a metabolização dos HPA de alta massa molecular

(BEN SAID et al. 2008, TOLEDO et al. 2006, YUSTE et al. 2000).

Nos solos contaminados por hidrocarbonetos de petróleo, pode ocorrer o

desenvolvimento de micro-organismos aeróbios, anaeróbios, facultativos e microaerófilos.

Dentre os grupos predominantes, as bactérias Gram-negativas são as principais responsáveis

pela biodegradação dos hidrocarbonetos. Vale ressaltar que os fungos também são relevantes

no processo de degradação dos HPA, dada a inespecificidade enzimática, significativamente

importante durante a fase inicial (MARGESIN; HÄMMERLE e TSCHERKO, 2007,

CHAILAN et al. 2006, TOBOR-KAPLON et al. 2005).

A concentração e a biodisponibilidade dos HPA no solo influenciam sua degradação,

por implicarem diretamente na taxa de transferência de massa para os micro-organismos. Em

condições apropriadas, a microbiota utiliza de artifícios e estratégias que visam driblar o

caráter persistente dos HPA, por exemplo: quimiotaxia (CELANI e VERGASSOLA, 2010),

aumento da afinidade por HPA com produção de fatores de adesão (JOHNSEN; WICK e

HARMS, 2005), formação de biofilme (BURMØLLE; HANSEN e SØRENSEN, 2007),

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cometabolismo (CARMICHAEL e PFAENDER, 1997) e aumento da solubilidade de

compostos hidrofóbicos pela síntese de moléculas com propriedades emulsificantes e

surfatantes (DAS e MUKHERRJEE, 2007, YUSTE et al. 2000). Os bioemulsificantes e

biossurfatantes são substâncias de diversas naturezas que interagem diretamente nas gotas de

óleo ou na interface óleo/água e possuem características importantes como, por exemplo,

baixa toxicidade, seletividade, biocompatibilidade e eficiência nos extremos para valores de

pH, temperatura e salinidade. Todo biossurfatante é um bioemulsificante, entretanto, nem

todo bioemulsificante é um biossurfatante (LUNA-VELASCO et al. 2007, SINGH; VAN

HAMME e WARD, 2007, BATISTA et al. 2006).

Tornar uma molécula biodisponível é um processo dinâmico, determinado pela

transferência de massa do substrato para as células microbianas e quanto maior for a massa

molecular do contaminante, menor será a sua biodisponibilidade. Cabe ressaltar que, com

respeito à biodisponibilidade, a fração total presente do contaminante no solo é maior que a

fração acessível ao micro-organismo, implicando no aumento das interações microbianas

(SEMPLE et al. 2007, JOHNSEN; WICK e HARMS, 2005, ALEXANDER e ALEXANDER,

2000).

As bactérias são os organismos mais especializados na utilização dos HPA como fonte

de carbono, apesar de que por vezes, o caráter persistente dessas moléculas, possa constituir

um obstáculo ao processo de biodegradação. Embora algumas bactérias sejam dotadas de

estruturas de locomoção como flagelos, tais micro-organismos podem penetrar cerca de 3 a 5

cm no solo à uma velocidade média de difusão de 0,1 cm2.dia-1, ao mesmo tempo que a taxa

de dessorção dos HPA nos agregados é de muito baixa à nenhuma. Dessa forma, o bioacesso

às moléculas dos HPA depende muito mais das interações microbianas do que da própria

constituição morfológica de um único indivíduo. O transporte de micro-organismos

desprovidos de estruturas de locomoção, através dos canais abertos pelas hifas, resultando um

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aumento do deslocamento para cerca de 1 cm2 por dia é um claro exemplo de como as

interações entre bactérias e fungos podem ocorrer no solo (GONG et al. 2007, ZHANG et al.

2006, KOHLMEIER et al. 2005, JOHNSEN; WICK e HARMS, 2005; HARMS e BOSMA,

1997).

Huesemann, Huesemann e Fortman (2004) argumentam que a interação da microbiota

no solo torna o processo de biodegradação de HPA mais eficiente, pelo fato dos diferentes

micro-organismos possuírem diferentes estratégias metabólicas, entretanto bactérias e fungos

não se diferenciam pelo modo de assimilação das moléculas, como mostrado na Figura 3.5.

Figura 3.5 – Mecanismos de transporte dos HPA por micro-organismos: difusão simples -

HPA de baixa massa molecular (1) e transporte facilitado - HPA de alta massa molecular (2).

O efluxo dos HPA ocorre com gasto de energia (3) (elaboração própria)

Nas bactérias e nos fungos, o transporte dos HPA do meio externo para o meio interno

da célula pode ser realizado sem gasto de energia, independente da temperatura, através de

difusão simples ou por transporte facilitado. Isto se dá em função da baixa solubilidade em

água e da elevada Ko/w dos HPA e pelos fosfolipídeos presentes na membrana. A interação

entre a membrana externa e a molécula do HPA ocorre pela alta afinidade desse composto

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com os fosfolipídeos, mesmo quando as células estão mortas. A velocidade de difusão é lenta,

dada a natureza polar na membrana e do HPA. Entretanto, a passagem do composto através da

membrana não é mediada pelo gradiente de concentração formado, sendo desta forma

dependente da presença de metabólitos intermediários e/ou finais no interior da célula, uma

vez que o processo de metabolismo do HPA inicia assim que soluto é difundido para o meio

intracelular (ICHIKAWA et al. 2010, BATEMAN et al. 1986).

A maioria dos estudos sobre difusão simples dos HPA foi realizada utilizando

compostos de baixa massa molecular. A partir de modelos matemáticos gerados em um

estudo do efeito da ligação do fenantreno e fluoreno à uma matriz orgânica, concluiu-se que

HPA com mais de 24 átomos, isto é, com 4 ou mais anéis, podem ser transportados na

membrana a partir de transporte facilitado e para tal, é necessário alta afinidade com a

permease (SABBAH; REBHUN e GERSTL, 2004).

Alguns autores sugerem a possibilidade de moléculas de HPA muito grandes serem

transportadas através da membrana por transporte ativo, porém este tipo de fenômeno ainda

não foi confirmado. Sabe-se que o gasto de energia pela célula ocorre durante o efluxo dos

HPA, nas condições da molécula ser tóxica ao micro-organismo ou quando não há

possibilidade de armazená-lo em vesículas. O consumo de ATP durante a passagem do HPA

para o meio externo é explicado pela natureza hidrofóbica da molécula e quanto maior for sua

Kw/o, maior será a demanda de energia (CHAUHAN et al. 2008, BUGG et al. 2000).

No caso dos fungos filamentosos, apesar da participação de enzimas extracelulares no

processo de degradação dos HPA, estes compostos também podem ser metabolizadas no meio

intracelular. Independentemente da massa molecular, após a passagem pela membrana, os

HPA são armazenados em vesículas lipídicas, localizadas nas hifas, as quais constituam

possivelmente o local inicial para oxidação desses compostos (VERDIN et al. 2005).

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A degradação intracelular é na maioria das vezes iniciada pela fissão do anel através

da incorporação do oxigênio molecular nos núcleos aromáticos. Nas condições de

anaerobiose, aceptores de elétrons alternativos, tais como NO3-, Fe+2 e SO4

-2 são utilizados,

porém, a aerobiose é a principal via de degradação dos HPA (YUSTE et al. 2000).

Como apresentado na Figura 3.6, acredita-se que as vias metabólicas utilizadas para

degradação aeróbica quer sejam os HPA de baixa massa molecular, por exemplo, naftaleno,

quer sejam os HPA de alta massa molecular, como o pireno, seguem o mesmo padrão, isto é,

a produção de catecol com posterior formação de intermediários do ciclo do ácido cítrico.

Figura 3.6 – Vias propostas para o metabolismo dos HPA de baixa massa molecular,

naftaleno (A) e de alta massa molecular, pireno (B) por bactérias aeróbias. Fontes: Mrozik,

Piotrowska-Seget e Labuzec (2003); Kanaly e Harayama (2000)

A B catecol

catecol

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O mecanismo de biodegradação dos HPA melhor compreendido diz respeito aos HPA

de baixa massa molecular iniciado pela ação de mono-oxigenases e dioxigenases levando à

formação de intermediários centrais que, convertidos por outras dioxigenases e mono-

oxigenases, formam o catecol. Por fim, a quebra do anel do catecol pode conduzir a síntese de

citrato, sucinato e fumarato, entre outros intermediários do ciclo do ácido cítrico. Já na

biodegradação dos HPA de quatro ou mais anéis, isto é, HPA de alta massa molecular, as

bactérias necessitam utilizar o recurso do cometabolismo e para isto, são necessários sistemas

enzimáticos multicompetentes (ZHANG et al. 2006, SAMANTA; SINGH e JAIN, 2002,

KANALY e HARAYAMA, 2000).

Por conta das características morfológicas dos fungos filamentosos, tais como, o

tamanho e os constituintes estruturais, por exemplo, as hifas, estes micro-organismos podem

alcançar regiões mais amplas do solo, quando comparados às bactérias e por consequência,

estabelecem maior contato mecânico e enzimático. A inespecificidade das enzimas dos fungos

promove o primeiro ataque aos HPA e através desse sistema enzimático inespecífico ocorre a

formação de metabólitos menos tóxicos e mais solúveis, podendo ser aproveitados por

diversos outros micro-organismos, incluindo outras espécies fúngicas e bactérias (ROMERO

et al. 2010, LI et al. 2008, BOONCHAN; BRITZ e STANLEY, 2000).

Sabe-se que o sistema enzimático dos fungos filamentosos envolve três grupos

principais: lignina peroxidases, manganês peroxidases e lacases. Um dos grandes artifícios

metabólicos dos fungos diz respeito à liberação de altas concentrações de enzimas, na

tentativa de suprir as perdas por sorção ou complexação no solo. No entanto, muitos fatores

ainda conferem obstáculos, tais como, a formação de peróxidos e a biodisponibilidade

limitada das moléculas, entre outros (D’ANIBALLE et al. 2006, NOVOTNÝ et al. 2004,

CANET et al. 2001).

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3. 5 Glicerol: generalidades e uso como cossubstrato

O glicerol, glicerina ou 1,2,3-propanotriol (C3H8O3) é um álcool, líquido,

higroscópico, incolor, inodoro, viscoso, de sabor doce, solúvel em água, insolúvel em éter

que se caracteriza como uma das moléculas mais abundantes na natureza, com inúmeras

aplicações na indústria, podendo ser transformado tanto por reações biológicas, quanto por

reações químicas. No entanto, apesar da abundância, o glicerol é somente encontrado na

forma combinada aos ácidos graxos compondo os triglicerídeos, principais constituintes de

óleos e gorduras (DE ARRUDA; RODRIGUES e FELIPE, 2007, SDA, 1990). As três

hidroxilas, grupamentos hidrofílicos que compõem a molécula do glicerol são responsáveis

pela alta solubilidade na água e pela natureza higroscópica do composto. A sua baixa massa

molecular confere um elevado coeficiente de permeabilidade à membrana, implicando no

acúmulo intracelular do composto pelos micro-organismos. Alguns deles, como os fungos,

garantem o acúmulo de glicerol intracelular através de transportadores localizados na

membrana, com grande afinidade à molécula de glicerol (RAHMAT; ABDULLAH e

MOHAMED, 2010, DAVIS; BURLAK e MONEY, 2000).

A assimilação microbiana do composto pode ocorrer tanto via transporte passivo

como via transporte ativo. No primeiro caso, o glicerol penetra na célula por difusão simples

ou por difusão facilitada, mediada por proteínas. O transporte ativo acontece através de

simporte glicerol/H+ ou glicerol/Na+ dependente de ATP (RIVALDI et al. 2009, LIN, 1976).

Um grande número de micro-organismos aeróbios e anaeróbios utiliza o glicerol, durante a

fase exponencial, para produção de biomassa ou síntese de diversos compostos, tais como,

ácidos orgânicos, gliceraldeídos, cetonas, alcoóis, enzimas intracelulares e extracelulares

(JOHNSON e TACONI, 2009, DECKWER, 1995), como apresentado na Figura 3.7.

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Figura 3.7 – Principais rotas do metabolismo microbiano do glicerol (RIVALDI et al. 2009)

O glicerol possui um importante papel osmorregulador por desempenhar a função de

soluto compatível. Muitos micro-organismos podem acumular uma variedade de compostos,

entre íons e moléculas orgânicas, em concentrações superiores ao meio externo, gerando uma

diferença de gradiente, o qual permite o fluxo de água para o interior da célula, mantendo suas

funções vitais.

O glicerol em concentrações menores que 1 mol/L mantém a mesma pressão osmótica

dos polióis de alta massa molecular, conferindo uma vantagem, do ponto de vista dos custos.

Além do papel como osmólito, o glicerol acumulado realiza as funções de reserva de carbono

e energia, bem como de agente de proteção das enzimas e estruturas intracelulares contra os

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efeitos das mudanças no meio externo, isto é, proteção contra a dessecação e extremos de

salinidade e temperatura (D’ERRICO; CICCARELLI e ORTONA, 2005, WELSH, 2000).

Outra importante vantagem metabólica do glicerol diz respeito ao fenômeno de

tolerância dos micro-organismos a compostos tóxicos presentes no meio. Em um estudo de

degradação de fenol utilizando 0,1% (m/v) de glicerol como cossubstrato, foi observado um

melhoramento no mecanismo de tolerância microbiana ao fenol, discutido pelos autores como

um fenômeno de “antagonismo à toxicidade”, ilustrado pelo aumento significativo da

população microbiana e degradação completa do fenol (CHEN; CHEN e CHANG, 2007).

Quando o foco da investigação é a biodegradação de hidrocarbonetos, a propriedade

emulsificante do glicerol também pode ser explorada. Mais importante que a propriedade

emulsificante, o composto pode servir de substrato para síntese de biossurfatantes, durante a

fase estacionária de crescimento, mesmo quando o glicerol está presente em concentrações

abaixo de 0,1 mol/L (PARTHASARATHI e SIVAKUMAAR, 2009, TURKOVSKAYA;

DMITRIEVA e MURATOVA, 2001).

É de extrema importância o uso do glicerol como fonte de carbono solúvel, dadas as

diversas aplicações que o composto possui, incluindo o potencial para fins biotecnológicos,

considerando que ao longo dos anos, o produto se tornou uma fonte abundante e de baixo

custo, para o desenvolvimento de novas tecnologias (GALAN et al. 2009). A indústria bélica

promoveu o primeiro grande aumento na demanda mundial de glicerol, em meados do século

XIX, com a invenção da dinamite. A segunda elevação na demanda mundial ocorreu mais

recentemente, tornando mais nobres as aplicações práticas do produto, através do aumento da

produção de biodiesel, em um cenário, cuja busca por combustíveis alternativos foi motivada,

principalmente, em função da política de preços e das projeções sobre as reservas de petróleo

no mundo (MORITA et al. 2007, LEUNG; KOO e GUO, 2006, PINTO et al. 2005). O

biodiesel é obtido na maioria das vezes pelo processo de transesterificação, caracterizado pela

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reação entre os ácidos graxos presentes nos óleos e gorduras, com um álcool de cadeia curta,

metanol ou etanol, em presença de um catalisador alcalino, ácido ou enzimático. A reação de

transesterificação resulta em uma mistura heterogênea composta de duas fases, uma de ácidos

graxos metilados, isto é, o biodiesel propriamente dito e a outra correspondendo ao glicerol

bruto (BOURNAY et al. 2005, OOI et al. 2004).

Desta forma, o glicerol bruto é o maior coproduto da indústria do biodiesel. O

composto é caracterizado como um líquido de coloração marrom escura, de composição

variável, dependente de diversos fatores, principalmente das condições empregadas na reação

de transesterificação. Para cada litro de biodiesel são produzidos 100 mL de glicerol bruto,

contendo um teor de glicerol na faixa entre 85 e 98%. As impurezas mais significativas são a

água, álcool, resíduos do catalisador, glicerídeos e sabões, que variam de acordo com a

refinaria e o material utilizado na preparação do biodiesel. O custo do processo de purificação

do glicerol bruto é bastante dispendioso e neste contexto, encorajou diversos estudos por

alternativas biotecnológicas de aproveitamento deste resíduo, apresentando resultados muito

semelhantes aos obtidos quando glicerol PA foi utilizado como substrato (CAVALHEIRO et

al. 2009, LIMA, 2009, EASTERLING et al. 2009, WOLFSON et al. 2009,

PAPANIKOLAOU et al. 2008).

O glicerol bruto pode ser utilizado como fonte primária ou secundária de carbono em

diversos bioprocessos enfatizando-se a produção de biossurfatantes e a biorremediação. Como

o composto é proveniente da indústria do biodiesel, comercialmente o valor de mercado é

muito lucrativo, em comparação ao valor de outros substratos, em média US$ 0,08 por mL,

gerando um crédito de US$ 115 milhões, por tonelada, em um ano (ATHALYE; GARCIA e

WEN, 2009, BODÍK et al. 2009, JOHNSON e TACONI, 2007).

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3. 6 Ensaios de fitoxicidade

A germinação das sementes é um mecanismo complexo, no qual se inicia com o

intumescimento da semente e termina com a emergência da raiz primária e do cotilédone. Este

processo pode ser influenciado por diversos fatores, como por exemplo, a umidade, o pH e a

salinidade do meio (HAMDI et al. 2007, DOS SANTOS e CARDOSO, 2001). O tegumento

que envolve a semente, além de servir de filtro de luz, participa dos estágios iniciais da

germinação por estabelecer uma barreira de permeabilidade e interferir nos processos de

difusão de água e troca gasosa, os quais exercem efeitos de constrição ou expansão mecânica

no embrião. Na maioria das espécies, o rompimento do tegumento ocorre através de processos

enzimáticos e dessa forma, regulam o tempo de emergência da radícula (DOS SANTOS e

CARDOSO, 2001).

Entende-se por fitotoxicidade, a intoxicação de plantas por substâncias presentes no

meio, as quais podem ser absorvidas e acumularem nos tecidos vegetais (ARAÚJO e

MONTEIRO, 2005). A determinação da fitotoxicidade compreende um dos critérios mais

utilizados para avaliação da biodisponibilidade de compostos tóxicos, a exemplo dos HPA,

empregando para isso, metodologias simples, rápidas e confiáveis (REYNOSO-CUERVAS et

al. 2008, WANG et al. 2002).

Na literatura, a maioria dos estudos relacionados à fitotoxicidade discutiu os efeitos

tóxicos de pesticidas e de alguns metais, porém o número de publicações abordando o efeito

dos compostos derivados do óleo vem sendo crescente (ANASTASI et al. 2009, HAMDI et

al. 2007, SVERDRUP et al. 2003). A fitotoxicidade dos HPA tem sido descrita como um

importante efeito adverso para o metabolismo das plantas, em concentrações, que na maioria

dos estudos variam na faixa de 10 a 1000 mg/kg (DEBIANE et al. 2008, BAECK et al. 2004).

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Tratamento Microbiológico Sequencial de solo... Vasconcelos, U. (nome para citação)

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Em contrapartida, as concentrações superiores a 1000 mg/kg de óleo já foram reportadas

como estimulantes do crescimento de plantas (REYNOSO-CUERVAS et al. 2008).

A OECD, sigla inglesa para Organização de Cooperação e Desenvolvimento

Econômico, órgão com sede na França e ligado à Organização de Alimentos e Agricultura das

Nações Unidas (FAO), em seu manual publicado em 1984, ainda em uso, sugere que os testes

de fitotoxicidade sejam realizados pelo menos com três espécies vegetais, no entanto podem

ser reduzidos para uma dicotiledônea e uma monocotiledônea. Os testes buscam identificar os

parâmetros mais sensíveis, sendo a germinação da semente e a elongação da raiz, um dos mais

utilizados (OECD, 1984).

Outra característica importante diz respeito ao efeito que o tipo e o tamanho da

semente exercem sob a resposta do teste, isto é, as sementes com dois cotilédones, pequenas e

escuras são mais sensíveis que as sementes maiores, com um cotilédone e claras (TIQUIA;

TAM e HODGKISS, 1996). Além disso, considerando que as sementes escuras absorvem

mais energia que as sementes claras, a presença de luz para sua germinação é requerida,

enquanto que nas sementes claras, a germinção pode ocorrer em condições de presença ou

ausência de energia luminosa. Logo, as características das sementes escolhidas devem ser

bem conhecidas, principalmente no que diz respeito ao seu tempo de germinação e

fotoblastismo (CORDAZZO e ARACAMA, 1998).

A maioria dos ensaios in vitro é preferencialmente conduzida por 5 dias e em ausência

de luz, sendo assim, o resultado expressa a fitoxicidade do contaminante e não do produto das

reações foto-oxidativas que podem ocorrer durante o experimento (WIECZOREK e

WIECZOREK, 2007). As principais vantagens do método dizem respeito ao fato das plantas

crescerem independentemente da sazonalidade e da facilidade na manipulação. Além disso,

podem revelar potenciais candidatos para aplicação na fitorremediação (REYNOSO-

CUERVAS et al. 2008).

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Solo contaminado

Peneiramento Mistura Adução Transporte

FornoQueima dos gasesDescarte dos gases

Solo tratado

Solos

Sistema de preparação e adução de solos contaminados

Sistema de dessorção

Gases

Sistema de Tratamento de Gases

Sistem

aS

upervisório de deC

ontrole

Solo contaminado

Peneiramento Mistura Adução Transporte

FornoQueima dos gasesDescarte dos gases

Solo tratado

Solos

Sistema de preparação e adução de solos contaminados

Sistema de dessorção

Gases

Sistema de Tratamento de Gases

Sistem

aS

upervisório de deC

ontrole

CAPÍTULO 4

MATERIAIS E MÉTODOS

4. 1 A Unidade de Dessorção Térmica (UDT)

A Unidade de Dessorção Térmica (UDT) era móvel e composta por um conjunto de

equipamentos de grande porte, acoplados de forma a montar um sistema para a remoção de

compostos orgânicos do solo, por ação de energia térmica, através da volatilização dos

contaminantes e a posterior oxidação em câmara de combustão secundária. A unidade

industrial era automatizada e composta por quatro sistemas: preparação e adução de solos

contaminados; dessorção dos compostos orgânicos; tratamento dos gases dessorvidos e por

fim, do sistema supervisório, para o controle e o intertravamento da planta. O diagrama de

operação da UDT está apresentado na Figura 4.1.

Figura 4.1 – Diagrama de operação da Unidade de Dessorção Térmica

Lavagem

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Considerando o fluxo do resíduo na planta, o primeiro sistema era usado para a

preparação e adução de solos contaminados. Esse conjunto de facilidades era constituído por

um pátio de mistura, peneira rotatória, moega e correia transportadora dos solos. A correia

transportadora representava o elo com o segundo sistema, de dessorção térmica. Este sistema

consistia de um forno rotativo, construído em aço carbono e revestido por materiais

refratários. O forno estava equipado com dispositivos para proporcionar e controlar a

velocidade de rotação e a inclinação do equipamento. O forno também contava com

queimadores que operavam em um conjunto único, funcionando à base de gás liquefeito de

petróleo (GLP). A inclinação do forno e a velocidade de rotação permitiam o controle do

tempo de residência dos solos no interior do equipamento, cuja passagem ocorreu por ação da

força da gravidade, sendo posteriormente descartados no pátio de armazenamento temporário

de solos. O material tratado era então resfriado e transferido para a área de quarentena até

liberação pelo controle de qualidade, após semanas. Uma vez comprovada a redução dos

contaminantes para os limites pré-estabelecidos, o solo era considerado tratado, sendo

posteriormente transferido para o local de destinação final, denominado por reaterro.

O gradiente de temperatura, 300 a 350°C, no forno, proporcionou a dessorção de

certos compostos orgânicos do solo para a mistura gasosa contida no interior do equipamento.

Essa mistura de gases, por sua vez, era encaminhada para o terceiro sistema da planta, no qual

se realizava o tratamento de gases. O sistema de tratamento de gases era constituído por uma

tubulação, uma câmara de pós-combustão (CPC), também denominada de câmara de

combustão secundária, um equipamento para resfriamento e lavagem dos gases, e uma

chaminé. Na câmara de combustão secundária, os gases foram oxidados por ação do calor

obtido na queima de GLP em queimadores dispostos ao longo do equipamento.

No quarto e último sistema, denominado supervisório, eram atribuídas atividades de

supervisão, controle e intertravamento da UDT. Os parâmetros de controle e monitoramento

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desse sistema compreendiam: a temperatura no forno e na câmara de combustão, a velocidade

de alimentação de solos, a velocidade de rotação e o ângulo de inclinação do forno, bem como

a ausência e presença de chama e os parâmetros de controle de emissão de efluentes gasosos

na chaminé. Caso alguma das variáveis controladas apresentasse anomalias operacionais, o

sistema supervisório de intertravamento da UDT podia ser acionado de forma automatizada,

impedindo a entrada de material no forno.

A Figura 4.2 apresenta uma vista parcial da UDT, destacando o forno rotatório.

Figura 4.2 – Unidade de Dessorção Térmica

Dadas as características dos contaminantes presentes no solo, a UDT operou com uma

faixa de temperatura no forno que permite classificá-la como um equipamento de baixa

temperatura, LTTD, sigla inglesa para Dessorção Térmica à Baixa Temperatura (GEORGE et

al. 1995). As especificações do equipamento estão apresentadas na Tabela 4.1.

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Tabela 4.1 - Especificações técnicas do forno do sistema de dessorção

Porte Industrial

Capacidade de tratamento 25 ton/h

Chama Direta

Voltagem 480 V

Alimentação da chama GLP

Volume diário tratado 200 m3/dia

Frequência 18 Hz

Temperatura de trabalho do forno 300-350°C

Temperatura máxima atingida no forno

Temperatura da Câmara de Pós-Combustão

800°C

1200°C

Tempo de residência 12 min GLP – gás liquefeito de petróleo

4. 2 Amostragens e coleta

Foram realizadas amostragens do solo contaminado com resíduo oleoso de fundo de

coluna da câmara de destilação a vácuo e do solo submetido ao tratamento por dessorção

térmica, coletadas antes da admissão na UDT e na área de quarentena, respectivamente

(Figura 4.3). Ademais, objetivando caracterizar o resíduo oleoso, foram tomadas amostras do

contaminante, disperso em espaços ao longo da face exposta do solo, em função da escavação.

O procedimento de coleta das amostras do solo contaminado e do solo tratado na UDT

foi conduzido sob duas formas, em conformidade aos ensaios de caracterização físico-química

e microbiológica, aos quais foram submetidos. Para as amostras utilizadas na caracterização

físico-química, foi realizada a coleta de cerca de 200 g de solo a uma profundidade de 15 a 20

cm a partir do nível do terreno, com o auxílio de uma espátula. As amostras foram

acondicionadas em frascos de vidro, com capacidade para 200 mL, dotados de bocas

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rosqueadas e tampas de teflon. Os frascos vedados foram identificados e transportados sob

refrigeração à 4°C até o laboratório para a realização das análises.

Figura 4.3 – Aspecto do solo contaminado com resíduo de vácuo (A) e tratado por dessorção

térmica (B), retido na área de quarentena

Para as amostras utilizadas na caracterização microbiológica foram coletados cerca de

50 g de solo a uma profundidade de aproximadamente 10 a 15 cm com relação ao nível do

terreno, utilizando coletores universais descartáveis para amostras biológicas, confeccionados

em poliestileno, com capacidade de 80 mL, dotados de espátula de poliestileno e esterilizados

com óxido de etileno (Discret, Rio de Janeiro, Brasil). Os frascos vedados foram identificados

e transportados sob refrigeração à 4°C até o laboratório para a realização das análises.

Para as amostras utilizadas na caracterização físico-química do resíduo oleoso de

fundo de coluna da câmara de destilação a vácuo, contaminante do solo, foram coletados

cerca de 200 g do resíduo a uma profundidade de 10 cm a partir da superfície da cava, com o

auxílio de uma espátula. As amostras foram posteriormente acondicionadas em frascos de

vidro, com capacidade para 200 mL, dotados de bocas rosqueadas e tampas de teflon. Os

frascos vedados foram identificados e transportados até o laboratório sob refrigeração à 4°C.

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Finalmente, para a condução dos ensaios de biorremediação, cerca de 80 kg de solo

tratado na UDT foram coletados com auxílio de pás apenas da área de quarentena. O solo foi

acondicionado em saco plástico, o qual foi vedado e transportado em uma caixa de madeira

até o laboratório.

4. 3 Isolamento e identificação de micro-organismos presentes no solo

Para o isolamento dos micro-organismos foi empregada a técnica de plaqueamento

Pour Plate descrita por Genhartdt et al. (1994). A metodologia está apresentada

esquematicamente na Figura 4.4.

Figura 4.4 - Método de isolamento microbiano do solo (adaptado de BECKER, 1999)

Foram isolados Bactérias Heterotróficas Aeróbias (BHA) e Fungos Filamentosos (FF)

do solo contaminado com o resíduo oleoso de fundo de coluna da câmara de destilação a

vácuo e do solo tratado na UDT. Para tal, uma amostra de 10 g do solo foi assepticamente

transferida para um frasco de capacidade de 500 mL contendo 90 mL de solução tampão

Diluições seriadas em sol. salina

Amostra do solo em tampão fosfato (pH = 7,0)

1mL em meio definido

Determinação das UFC/g de solo seco

Separação de colônias por esgotamento

Escolha arbitrária dos isolados

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fosfato estéril (pH 7,0), sendo homogeneizada sob agitação de 150 rpm (Tecnal TE920),

durante 15 minutos.

A seguir, diluições decimais seriadas foram realizadas utilizando solução salina estéril

(NaCl 0,85%) e alíquotas de 1 mL foram transferidas para placas de Petri previamente

esterilizadas, nas quais foram vertidos 10 mL de Agar Nutriente (Merk, Darmstadt,

Alemanha), adicionado de 50 mg/L de nistatina suspensão 10.000 UI/mL (Sigma, St. Louis,

EUA) para o isolamento de BHA. Para o isolamento de FF utilizou-se Agar Sabouraud com

2% de glicose (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil), adicionado de 50 mg/L de ampicilina tri-

hidratada 96,0-100,5% de pureza (Sigma, St. Louis, EUA). Após o período de incubação em

estufa à 281°C (Nova Ética, 411D), 48 h para BHA e 72 h para FF, todas as placas foram

observadas, sendo escolhidas as colônias predominantes desenvolvidas na superfície do agar,

as quais foram isoladas através da técnica do esgotamento em placa (HALDEMAN e AMY,

1993). Posteriormente, cada isolado foi mantido em tubos contendo meios inclinados, Agar

Nutriente ou Agar Sabouraud com 2% de glicose, sob refrigeração à 5ºC (Cônsul 310). Nesta

fase, todas as linhagens receberam a identificação preliminar CW, seguida de um algarismo

arábico.

4. 3. 1 Identificação das bactérias

A identificação biomolecular dos isolados bacterianos foi gentilmente realizada de

acordo com o protocolo seguido pelo Laboratório de Biocorrosão e Biodegradação (LABIO),

do Instituto Nacional de Tecnologia (INT). O DNA dos cultivos foi extraído com auxílio do

kit UltraClean Microbial DNA (MOBio, Carlsbad, EUA) com posterior visualização por

eletroforese em gel de agarose 1%, utilizando SYBR Safe como marcador. A amplificação do

gene do RNA ribossomal 16S (1500 pb) foi efetuada através de PCR, utilizando primers

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universais: SAdir (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAGA-3’) e S17rev (5’-

GTTACCTTGTTACGACTT-3’).

As reações de amplificação foram realizadas em termociclador (GeneAmp PCR

System 9700, Applied Biosystems) nas seguintes condições: ciclo inicial de desnaturação à

94°C por 5 minutos, 30 ciclos intermediários de desnaturação à 94°C por 30 segundos,

anelamento à 55°C por 30 segundos, extensão à 72°C por 30 segundos e ciclo de extensão

final à 72°C por 5 minutos. Os produtos de PCR foram visualizados através de eletroforese

em gel de agarose 1%, marcado com SYBR Safe e posteriormente purificados com auxílio do

kit UltraClean PCR Clean-up (MOBio, Carlsbad, EUA). A pureza dos produtos de PCR foi

determinada por densidade ótica em espectrofotômetro (ND-1000 UV-Vis, Thermo

Scientific). A seguir, as amostras foram enviadas para o Setor de Sequenciamento de DNA do

Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo (USP).

Utilizou-se um sequenciador composto por 48 capilares de 36 cm (ABI 3730 DNA

Analyser, Applied Biosystems), os quais separaram os fragmentos de DNA utilizando o

polímero POP-7. Ao final das corridas, um número entre 600 e 700 pb foi analisado pelo

software Sequencing Analysis®, versão 5.3.1, integrado ao programa KB Basecaller.

Os resultados do sequenciamento foram verificados com a ajuda do programa

Chromas Lite®, versão 2.01. As sequências de DNA obtidas foram comparadas às depositadas

no banco de dados do GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). A análise de similaridades foi

conduzida utilizando o programa BLASTn (Basic Alignment Search Tool).

4. 3. 2 Identificação dos fungos filamentosos

A identificação dos isolados fúngicos foi gentilmente realizada de acordo com o

protocolo seguido pela Micoteca URM, do Departamento de Micologia, da Universidade

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Federal de Pernambuco (UFPE). A identificação fundamenta-se na observação da morfologia

da colônia e nos aspectos microscópicos, a partir de uma colônia inoculada no ponto central,

em Agar Czapeck (Merk, Darmstadt, Alemanha) ou BDA, Agar Dextrose Batata (Difco,

Franklin Lakes, EUA), distribuído em placa de Petri. A velocidade de crescimento da colônia

pode variar de menos de 7 a mais de 15 dias, sendo fundamental para identificação presuntiva

do fungo. Durante a análise macroscópica da colônia, foram observadas as características de

cor, textura, superfície e pigmento difusível no meio de cultura, entre outros.

A análise microscópica foi conduzida através da técnica do microcultivo, na qual foi

preservado o arranjo original dos esporos sobre as hifas, bem como certas estruturas

formadoras de esporos. O microcultivo dos fungos filamentosos foi realizado sob condições

assépticas, em placas de Petri. Os micro-organismos foram semeados a partir de repique

recente, nos quatro lados de um cubo de agar apropriado (Czapeck ou BDA), sendo disposto

na placa sobre uma lâmina apoiada em um suporte. O cubo de agar foi recoberto com uma

lamínula e para evitar dessecação, foi adicionado à placa um pequeno chumaço de algodão

estéril embebido por 1 a 2 ml de água destilada estéril. A incubação se deu à temperatura

ambiente por 7 a 10 dias, até que fosse observado o desenvolvimento de hifas, com ou sem

pigmentação.

Após este período, a esporulação foi inibida com formol por 24 a 48h e a seguir, a

lamínula foi cuidadosamente removida com auxílio de uma pinça, sendo o cubo de agar

desprezado. Adicionou-se uma gota de azul de lactofenol-algodão por sobre a lamínula e na

lâmina que serviu de suporte para o cubo de agar. Os tipos de hifas e a formação e disposição

dos esporos foram observados em microscópio ótico, com objetiva de 40X. A identificação

das espécies foi conduzida utilizando bibliografia especializada de textos, manuais e atlas.

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4. 4 Adaptação dos isolados em óleo

O procedimento para a aclimatação dos isolados em óleo foi conduzido como descrito

por Palittapongarnpim et al. (1998). Uma alíquota de 1 mL da suspensão em solução

fisiológica estéril, NaCl 0,85%, das células jovens, de cada um dos micro-organismos

isolados do solo foi transferida para frasco de capacidade de 500 mL contendo 100 mL de

Caldo Bushnell-Haas (BUSHNELL e HAAS, 1941) e 1% de óleo árabe leve, como única

fonte de carbono. O intuito da aclimatação nesse óleo se deu por conta do seu elevado teor de

compostos aromáticos e polares.

O óleo utilizado na aclimatação dos isolados foi obtido do tanque n° 441.005 do navio

Doecannyon. Apresentando uma densidade relativa de 0,856 (20/40 °C), o produto era

composto por 46,5% de hidrocarbonetos saturados, 32,2% de compostos aromáticos e 21,3%

de compostos polares, relacionados principalmente às resinas e asfaltenos (DEL’ARCO e DE

FRANÇA, 2001).

Os frascos contendo cada um dos micro-organismos isolados foram incubados sob

agitação de 150 rpm durante 7 dias à 28 ±1°C (Tecnal TE920). O processo de aclimatação

prosseguiu, em concentrações crescentes de óleo até perfazer 10%, utilizando 1 mL de

inóculo de um frasco para outro. Durante o processo, observações microscópicas foram

realizadas para o acompanhamento dos cultivos e para verificação de possíveis contaminações

das culturas. As linhagens adaptadas foram mantidas sob refrigeração à 5°C.

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4. 5 Experimentos de biodegradação

4. 5. 1 Planejamento experimental

Foi utilizado um planejamento fatorial 23 completo, representando oito combinações

possíveis, com três variáveis, em dois níveis. Todos os cálculos estatísticos envolvidos nesta

etapa da pesquisa foram realizados utilizando o pacote computacional StatisticaTM99 for

Windows®, versão 7.0.

Os experimentos de biodegradação foram conduzidos por um período de 60 dias em

reatores de polietileno (Plasmont 408, Pedreira, Brasil), com capacidade para 4 L e dimensões

de 0,22 m de largura, 0,22 m de comprimento e 0,09 m de profundidade, os quais receberam 2

kg de solo tratado por dessorção térmica, pesados em balança semianalítica (Gehaka

BG2000).

Foram estudados os efeitos de três variáveis sobre a biodegradação dos HPA, a saber:

suplementação com fertilizante comercial, adição de cossubstrato e bioaumento. Para

suplementar os solos com fertilizante foram utilizados 100 mg/kg de fertilizante comercial

N:P:K 10:10:10 (Vitaplan, Capitão Leônidas Marques , Brasil). Este valor foi escolhido a

partir dos resultados da caracterização do solo tratado na UDT.

O glicerol (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) foi utilizado como cossubstrato e para tal,

empregou-se o volume de 0,5 mL/kg, equivalente a 0,63 mg/kg do composto (MOORTHI;

DEECARAMAN e KALACHELVAN, 2008). A razão C:N:P obtida foi de 25:1:1.

A variável bioaumento foi representada pela adição de um consórcio microbiano

misto, cujo critério adotado de seleção e de preparação visou garantir a qualidade e

reprodutibilidade dos ensaios, isto é, ser composto por bactérias e fungos autóctones e ter uma

elevada concentração celular. A cultura mista foi preparada sob a forma de suspensão a partir

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de um pré-inóculo e era composta por oito espécies de micro-organismos, sendo quatro

bactérias, Bacillus cereus (Frankland e Frankland 1887) CW-4, Gordonia amicalis (Kim et al.

2000) CW-7, Pantoea agglomerans (Beijerinck 1888) CW-18 e Serratia marsescens (Bizio

1823) CW-20 e quatro fungos filamentosos, Aspergillus fumigatus (Fresenius 1863) CW-10;

Aspergillus terreus (Thom 1918) CW-11; Aspergillus carneus (Blochwitz 1933) CW-12 e

Syncephalastrum racemosum (Cohn 1886) CW-14. O volume da suspensão contendo a

cultura mista foi de 100 mL, correspondendo a 5% (v/v) do volume do reator

(PALITTAPONGARNPIM et al. 1998).

O pré-inóculo foi confeccionado a partir dos cultivos puros das bactérias e dos fungos,

mantidos em estoque. Para tanto, alíquotas de 10 mL dessas suspensões de estoque foram

transferidas para dois frascos cônicos com capacidade para 500 mL contendo 90 mL de Meio

Bushnell-Haas, adicionado da fonte de carbono, óleo árabe leve. O primeiro frasco reuniu

todos os isolados bacterianos e o segundo frasco todos os isolados fúngicos. A incubação foi

conduzida sob agitação de 150 rpm por 48 h à 30°C (Tecnal TE920).

Após o período de incubação, cerca de 60 a 70 mL de cada frasco, contendo as células

desenvolvidas do pré-inóculo, foram separados da fase oleosa, com o auxílio de um funil de

separação, sendo posteriormente tratados por centrifugação a 959 g por 15 minutos (Fanem

206MP). As células foram lavadas por três vezes em solução fisiológica estéril. O inóculo foi

preparado através da ressuspensão dessas células, em Meio Bushnell-Haas estéril, de modo a

se obter uma leitura de 0,5 de absorbância a 540 nm (Hach, Odessey). Os valores do

comprimento de onda e da leitura da absorbância e foram obtidos da literatura (GHAZALI et

al. 2004).

A Figura 4.5 apresenta o esquema da confecção do inóculo adicionado ao solo. Em um

frasco contendo Meio Bushnell-Haas estéril foram transferidas alíquotas das novas

suspensões contendo as células fúngicas e as células bacterianas, nesta ordem, de modo que

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correspondessem a 5% e 1%, respectivamente, do volume final da suspensão contendo o

inóculo (MISHRA et al. 2001). Tal suspensão, após todas as diluições necessárias durante o

processo de sua confecção, continha 4,6±0,7x107 UFC/mL de células viáveis de Bactérias

Heterotróficas Aeróbias (BHA) e 2,0±0,1x106 UFC/mL de Fungos Filamentosos (FF),

responsáveis pela obtenção de uma concentração celular de 5,0±0,4x108 UFC/mL e

4,2±0,1x106 UFC/mL de BHA e FF, respectivamente, após a adição do inóculo ao solo.

Figura 4.5 - Confecção do inóculo

A razão do maior volume da suspensão dos fungos, cinco vezes o volume da

suspensão das bactérias, é justificada por: 1- ser o grupo responsável pela degradação inicial

dos HPA, dada a inespecificidade de suas enzimas; 2- porque mesmo adaptados ao óleo, os

fungos podem estar inativos metabolicamente e 3- pelo tempo mais lento da fase exponencial

(D’ANIBALLE et al. 2006).

Cabe ressaltar que em função das condições do cultivo do pré-inóculo bem como da

confecção do inóculo, um teste de atividade antagônica foi realizado para assegurar que

fenômenos de antibiose entre indivíduos do mesmo grupo ou de grupos diferentes não

comprometessem a eficácia do consórcio misto. Foi empregada a técnica dos blocos de gelose

5 mL 1 mL

94mL

Pré-inóculo Incubação 48h 30°C - 150rpm

Centrifugação

Confecção da suspensão

Inóculo

reator

Suspensão dos fungos

Suspensão das bactérias

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descrita por Vasconcelos, Lima e Calazans (2010). Uma alíquota de 10 µL da suspensão de

cada micro-organismo teste (≈108 UFC/mL) foi inoculada na superfície de discos de 7 mm de

diâmetro e 2 mm altura de Agar Müeller-Hinton (Merk, Darmstadt, Alemanha), sendo

posteriormente transferidas para placas de Petri estéreis e incubadas por 24 h à 30±1°C.

Após o período de incubação, foi confeccionada uma suspensão dos oito micro-

organismos teste (≈108 UFC/mL), espalhando-as por sobre a superfície do agar Müeller-

Hinton em placas de Petri estéreis. Com a superfície seca, os discos de gelose contendo as

culturas de 24 h foram transferidos para a placa e incubação por mais 24 h à 30±1°C. A

seguir, as placas foram verificadas quanto a formação de halos de inibição. O maior tamanho

desses halos, medido em milímetros, correspondia à maior susceptibilidade microbiana.

A perda abiótica foi determinada através de experimentos paralelos conduzidos sob as

mesmas condições e com adição de solução 10% (m/v) de nitrato de prata (Vetec, Rio de

Janeiro, Brasil) empregada como biocida (VASUDEVAN e RAJARAM, 2001).

Durante a fase do planejamento experimental, a umidade do solo nos reatores foi

mantida entre 70 e 80% da capacidade de retenção de água, o pH foi monitorado e a aeração

foi realizada a cada três dias, através de revolvimento do solo com o auxílio de bastão de

vidro (OLIVEIRA e DE FRANÇA, 2004).

A temperatura do local do experimento foi monitorada com termômetro de mercúrio

com bulbo de vidro (Konus 6201) e a temperatura do solo com termômetro digital tipo espeto,

para uso em laboratório (Equitherm TM879H). Dados oficiais de temperatura média e

umidade relativa do ar na cidade do Rio de Janeiro foram obtidos nos arquivos eletrônicos do

Instituto Nacional de Meteorologia, INMET.

Para cada determinação quantitativa foram retiradas três subamostras em diferentes

pontos do reator. As subamostras foram homogeneizadas e quarteadas até comporem uma

única amostra, a qual foi submetida às análises. A concentração dos HPA no solo foi

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determinada nos tempos de processo 0, 30 e 60 dias. Para as análises microbiológicas foram

tomadas amostras, sob condições assépticas, nos tempos 0, 7, 15, 30 e 60 dias de bioprocesso.

4. 5. 2 Experimentos com aplicação dos dados obtidos no planejamento experimental

Foi verificado o efeito das seguintes concentrações de glicerol (Vetec, Rio de Janeiro,

Brasil) sob a degradação dos HPA residuais, 0,63; 0,32 e 0,16 mg/kg. Um reator controle, isto

é, sem adição de glicerol, também foi confeccionado. As demais condições de operação

permaneceram iguais às adotadas na fase de seleção das variáveis importantes. As

determinações quantitativas de umidade, pH em água, HPA foram executadas, como descritas

na seção 4.6 deste capítulo. Os dados oficiais de temperatura média e umidade relativa do ar

na cidade do Rio de Janeiro foram obtidos nos arquivos eletrônicos do INMET. As

concentrações de Bactérias Heterotróficas Aeróbias e Fungos Filamentosos foram

determinadas a partir de amostras coletadas nos tempos: 0, 7, 15, 30 e 60 dias. Para garantir o

suprimento de oxigênio, o solo foi regularmente aerado através de revolvimento a cada 72h,

com auxílio de um bastão de vidro.

4. 5. 3 Experimentos utilizando glicerol bruto

As três condições do experimento anterior foram repetidas utilizando glicerol bruto

como cossubstrato. O composto foi gentilmente cedido pelo professor Luiz Guilherme da

Costa Marques, da Planta Piloto de Produção de Biodiesel, do Instituto Virtual Internacional

de Mudanças Globais, IVIG-COPPE/UFRJ. O glicerol bruto foi coproduzido durante o

processo de obtenção do biodiesel de soja (Glycina max, L. Merril), por meio de reação de

transesterificação via rota etílica, utilizando hidróxido de potássio como catalisador. O

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composto recebe tal denominação, dadas as impurezas acumuladas durante o processo de

produção do biodiesel. Amostras do glicerol bruto e do glicerol PA utilizado nos

experimentos aplicando os dados obtidos do planejamento experimental foram submetidos a

análises de caracterização, cujos teores dos principais constituintes estão apresentados na

Tabela 4.2. As determinações quantitativas nos dois tipos de glicerol foram realizadas pelo

Laboratório ASG do Brasil, no Rio de Janeiro e pelo Laboratório de Espectrometria Atômica

da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), em Florianópolis.

Tabela 4.2 – Caracterização das amostras de glicerol bruto e glicerol PA

Resultados

Analitos Glicerol bruto Glicerol PA Metodologia

Densidade (g/L) 1,05 1,26 ASTM D4052

pH 9,9 5,9 ASTM E70-07

Teor de etanol [% (m/m)] 2,8 NR EN 14110

Água [% (m/m)] 9,3 NR EN 12937

Teor de KOH [% (m/m)] 2,0 NR BS 5711-5

Teor de glicerol [% (m/m)] 84,4 99,9 BS 5711-3

Diglicerídeos [% (m/m)] 1,0 NR EN 14105

Triglicerídeos [% (m/m)] < 0,5 NR EN 14105

Alumínio [% (m/m)] 0,0015 < 0,6 ASTM D5185-09

Cálcio (µg/g) < 0,2 < 0,2 ASTM D5185-09

Cromo (µg/g) < 0,1 < 0,1 ASTM D5185-09

Cobre (µg/g) 0,52 < 0,006 ASTM D5185-09

Ferro (µg/g) 12,6 < 0,5 ASTM D5185-09

Magnésio (µg/g) < 0,2 < 0,2 ASTM D5185-09

Manganês (µg/g) 0,11 < 0,02 ASTM D5185-09

Sódio (mg/g) 0,94 < 0,004 ASTM D5185-09

Chumbo (µg/g) 0,12 < 0,006 ASTM D5185-09

Zinco (µg/g) 1,08 0,20 ASTM D5185-09

Potássio (mg/g) 50,7 < 0,2 ASTM D5185-09 NR – não realizado

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4. 6 Análises quantitativas

4. 6. 1 Umidade em base seca

O ensaio foi baseado na metodologia 1.3 da EMPRAPA (1979). Amostras do solo

foram transferidas para becker de teflon com capacidade de 25 mL, de peso conhecido. Após

a pesagem inicial, os sistemas foram levados para estufa (Tecnal TE-395) à 105°C por 24 h.

Passado o período, os sistemas foram resfriados em dessecador com sílica gel ativa e o peso

seco do solo foi determinado. A umidade foi calculada como a diferença entre o peso úmido e

o peso seco e expressado em percentual de acordo com a seguinte fórmula:

100

mimfmiU

Onde: U- umidade; mi- massa inicial da amostra, em gramas e mf- massa final da

amostra, em gramas, após a secagem. O ensaio foi conduzido em triplicata e as pesagens

realizadas em balança analítica (TDS FA2104N).

4. 6. 2 Capacidade de Retenção de Água (CRA)

O ensaio foi conduzido como descrito por Watwood, White e Dahn (1991). Uma

massa conhecida de solo foi transferida e compactada em um funil de vidro coberto com papel

de filtro qualitativo (massa inicial seca). O funil de vidro foi então transferido para um becker

de capacidade de 500 mL, ao qual foi adicionada água destilada até pouco acima do nível do

papel de filtro.

Posteriormente ao umedecimento da amostra, mais água foi adicionada até o topo do

funil. Após o período de repouso de 30 minutos, o funil de vidro foi retirado do becker e

esperou-se mais 30 minutos para o escoamento da água. Em seguida, a amostra foi transferida

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para becker de teflon com capacidade de 50 mL, previamente tarado (massa inicial úmida).

Realizada a pesagem final, o sistema foi levado para estufa (Tecnal TE-395) à 105°C por 24h.

Após o período, o sistema foi resfriado em dessecador contendo sílica gel ativa e o

peso seco do solo foi determinado. A capacidade de retenção de água foi calculada como a

diferença entre o peso úmido e o peso seco sendo expressa em percentual de acordo com a

seguinte fórmula:

1003

21

mmmCRA

Onde: CRA- Capacidade de Retenção de Água; m1- massa inicial seca, em gramas;

m2- massa final, em gramas e m3- massa inicial úmida, em gramas. O ensaio foi conduzido

em triplicata e as pesagens realizadas em balança analítica (TDS FA2104N).

4. 6. 3 pH em água

O ensaio foi baseado na metodologia 2.1.1 da EMPRAPA (1979). Em um becker com

capacidade para 50 mL, foram adicionados 10 g de solo e 25 mL de água. A mistura foi

homogeneizada durante 30 minutos com auxílio de agitador magnético revestido de teflon.

Após o período de repouso para separação das fases, o decantado foi transferido para um

becker com capacidade de 25 mL e o pH foi determinado em potenciômetro (Digimed DM-

20), previamente calibrado com soluções tampão padronizadas de pH = 4,0 e pH = 7,0. O

ensaio foi conduzido em triplicata.

4. 6. 4 Textura do solo

O ensaio foi gentilmente realizado no Laboratório de Geotecnia do Instituto Alberto

Luiz Coimbra de Pós-Graduação e Pesquisa em Engenharia (COPPE) da Universidade

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Federal do Rio de Janeiro, segundo a metodologia de peneiramento e sedimentação (ABNT,

1984).

4. 6. 5 Teores de Carbono Orgânico Total, Nitrogênio Total e Fósforo Total

Para a determinação de Carbono Orgânico Total foi utilizado o método USEPA 9060,

fundamentado na oxidação da matéria orgânica pelo dicromato de potássio, em meio ácido. A

determinação do Nitrogênio Total foi realizada por colorimetria de acordo com o método

USEPA 315.2, Kjeldahl. O Fósforo Total foi quantificado por colorimetria e complexação

com ácido ascórbico, de acordo com o método USEPA 365.3. Os ensaios foram realizados no

Laboratório Analytical Technology, em São Paulo.

4. 6. 6 Hidrocarbonetos Totais do Petróleo (TPH)

Para a determinação do TPH e suas faixas foi empregada a metodologia USEPA 8015,

que determina compostos orgânicos não halogenados através de cromatografia gasosa

acoplada a um detetor de ionização de chama. Foi utilizado um cromatógrafo a gás (HP 5990)

e coluna DB-5 (30 m x 0,25 mm). Os extratos foram obtidos seguindo o método USEPA

3540C (Soxhlet extraction) empregando o diclorometano seco com solvente. A pré-

concentração das amostras foi realizada em atmosfera inerte, N2. A preparação dos extratos

(clean-up) anterior à cromatografia seguiu o método USEPA 3630C, com uso de cartuchos

descartáveis de sílica gel. Os valores de TPH consideraram os resultados das faixas de

gasolina, querosene, diesel e óleo combustível, assim como a fração não resolvida no

cromatograma, também denominada mistura complexa não resolvida. Os ensaios foram

realizados no Laboratório Analytical Technology, em São Paulo.

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81

4. 6. 7 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA)

Os dezesseis HPA prioritários listados pela Agência de Proteção Ambiental dos

Estados Unidos, naftaleno, acenafteno, acenaftileno, fluoreno, fenantreno, antraceno,

fluoranteno, pireno, benzo[a]antraceno, criseno, beno[b]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno,

benzo[a]pireno, dibenzo[a,h]antraceno, benzo[g,h,i]perileno e indeno[1,2,3-c,d]pireno, foram

determinados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa, conforme o

método USEPA 8270C. Foi utilizado um cromatógrafo a gás (HP 5880), coluna DB-5 (30 m

x 0,25 mm) e um espectrômetro de massa (EM 5987). Antes da injeção, os extratos foram

obtidos seguindo o método USEPA 3540C (Soxhlet extraction) empregando o diclorometano

seco com solvente. A pré-concentração das amostras foi realizada em atmosfera inerte, N2. A

preparação dos extratos (clean-up) anterior à cromatografia seguiu o método USEPA 3630C,

com uso de cartuchos descartáveis de sílica gel. Os ensaios foram realizados no Laboratório

Analytical Technology, em São Paulo.

4. 6. 8 Dioxinas e Furanos

O ensaio foi gentilmente realizado pelo Laboratório Ipex, no Rio de Janeiro. Foi

empregado o método USEPA 1613, que determina a concentração de sete dibenzo-p-dioxinas

Tetra a Octacloradas (PCDD) e dez dibenzofuranos Tetra a Octaclorados (PCDF), por

cromatografia gasosa de alta resolução, acoplada à espectrometria de massa de alta resolução.

Os extratos foram obtidos seguindo o método USEPA 8290A. Os resultados foram calculados

a partir de fatores de toxicidade equivalente (TEF) regulamentadas pela OTAN (Organização

do Tratado do Atlântico Norte) e pela OMS (Organização Mundial da Saúde).

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4. 6. 9 Ensaios microbiológicos das amostras

As quantificações de Bactérias Heterotróficas Aeróbias (BHA) e Fungos Filamentosos

(FF) nas amostras de solo contaminado pelo resíduo de vácuo, tratado na UDT e do

tratamento microbiológico sequencial foram realizadas empregando a técnica de

plaqueamento Pour Plate, como descrita na seção 4.3 deste capítulo. A metodologia adotada

para contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC) e expressão dos resultados em

Unidades Formadoras de Colônia por grama de solo (UFC/g) baseou-se na Instrução

Normativa n° 62 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2003).

4. 6. 10 Ensaios de fitotoxicidade

Os ensaios de fitotoxicidade tiveram como objetivo verificar o impacto do

contaminante do solo, dos compostos residuais após tratamento na UDT e dos metabólitos

presentes após o tratamento microbiológico sequencial. Foram realizados testes de

germinação da semente e de alongamento da raiz para a determinação da Germinação

Relativa das Sementes, da Elongação Relativa da Raiz e do Índice de Germinação, como

descrito por Tiquia, Tam e Hodgkiss (1996). Foram utilizadas sementes claras (Ouro flora,

São Paulo, Brasil), adquiridas em estabelecimento comercial, seguindo o critério de tamanho,

fotoblastismo e número do cotilédone, conforme apresentado na Tabela 4.3.

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Tabela 4.3 – Características das sementes do teste de fitotoxicidade

Planta (sinonímia) Tamanho

(mm) Fotoblastismo Cotilédone TG (dias)

Allium porrum (alho-porró) 3,9 ± 0,3 Negativo Um 3

Cucumis anguria (maxixe-do-norte) 6,0 ± 0,4 Negativo Dois 3

Cucumis sativus (pepino-caipira) 9,9 ± 0,6 Neutro Dois 2

Cucumis melo (melão-caipira) 12,5 ± 0,5 Negativo Dois 2 TG – tempo de germinação da semente no controle

Antes do ensaio de fitotoxicidade, as sementes sofreram três lavagens sucessivas com

água destilada, com o intuito de eliminar excessos de corantes e conservantes. Durante a

lavagem, as sementes com morfologia irregular foram prontamente separadas das sementes

íntegras. O processo de secagem foi realizado em papel de filtro, à temperatura ambiente por

três horas.

Os extratos do solo foram obtidos a partir de uma amostra de 10 g, transferida para um

frasco cônico com capacidade para 250 mL contendo 90 mL de água destilada. Após agitação

de 250 rpm por 10 minutos (Tecnal TE920), a suspensão foi filtrada. Em seguida, o volume

de 5 mL do filtrado foi transferido para placas de Petri com diâmetro de 90 mm, embebendo-

se suavemente o papel filtro n° 1 (Whatman, 90 mm de diâmetro) disposto dentro da placa,

contendo dez sementes distribuídas sobre a superfície do papel. Para cada planta foram

confeccionadas três placas. O controle foi realizado com água destilada, substituindo o extrato

de solo. A incubação ocorreu à 22 ±1°C, em ausência de luz, por 5 dias (Nova Ética, 411D) e

após este período, as sementes germinadas foram contadas e o tamanho das raízes mensurados

com auxílio de um paquímetro.

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A Germinação Relativa das Sementes foi determinada de acordo com o seguinte

cálculo:

10021

SSGRS

Onde: GRS- Germinação Relativa das Sementes; S1- o número de sementes

germinadas no extrato de solo e S2- o número de sementes germinadas no controle.

A Elongação Relativa da Raiz foi determinada de acordo com o seguinte cálculo:

10021

RRERR

Onde: ERR- Elongação Relativa da Raiz; R1- a média do comprimento da raiz no

extrato de solo, em milímetros e R2- a média do comprimento da raiz no controle, em

milímetros.

O Índice de Germinação foi determinado de acordo com o seguinte cálculo:

%100ERRGRSI G

Onde: IG- Índice de Germinação; GRS- Germinação Relativa das Sementes e ERR-

Elongação Relativa da Raiz.

Uma vez que o teste foi realizado em ausência de luz, a exclusão das sementes com

fotoblastismo positivo foi conduzida como descrito por Cordazzo e Aracama (1998). Para

cada planta foram preparadas duas placas de Petri como descrito anteriormente, contendo em

cada uma, dez sementes distribuídas sobre o papel filtro n° 1 (Whatman, 90 mm de diâmetro),

embebido com 5 mL de água destilada. As placas foram incubadas à 22 ±1°C por 5 dias

(Nova Ética, 411D), em ausência de luz e na presença de luz artificial. Após o período, as

sementes germinadas foram contadas, aplicando-se o seguinte cálculo:

c

e

SSFTB

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Onde: FTB- fotoblastismo; Se- o número de sementes germinadas no escuro e Sc- o

número de sementes germinadas no claro.

O fotoblastismo da semente foi classificado como positivo se FTB > 1, negativo se

FTB < 1 e neutro quando o valor de FTB = 1. Foram selecionadas apenas as plantas cujas

sementes apresentaram fotoblastismo negativo ou neutro.

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86

CAPÍTULO 5

RESULTADOS E DISCUSSÃO

5. 1 Características do contaminante do solo

O resíduo oleoso de fundo da coluna de destilação a vácuo, também denominado

resíduo de vácuo, contaminou o solo utilizado no presente estudo, por um período superior a

55 anos.

O contaminante apresentou concentrações variadas de HPA e TPH, conforme a

Tabela 5.1.

Tabela 5.1 – Teores de HPA e TPH do resíduo oleoso de fundo

da coluna de destilação a vácuo

Analitos Concentração (mg/kg) Valores orientadores*

Naftaleno 34,0 90,0

Acenaftileno 2,0 _____

Acenafteno 0,6 _____

Fluoreno 9,7 _____

Fenantreno 148,2 95,0

Antraceno 8,8 0,0

Fluoranteno 7,3 _____

Pireno 381,0 _____

Benzo[a]antraceno 54,6 65,0

Criseno 46,2 0,0

Benzo[b]fluoranteno 6,3 _____

Benzo[k]fluoranteno 5,9 0,0

Benzo[a]pireno 71,5 3,5

Indeno[1,2,3-cd]pireno 3,2 130,0

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Dibenzo[a,h]antraceno 31,8 1,3

Benzo[g,h,i]perileno 93,9 0,0

TPH 4.274,0 _____ * Valores orientadores (mg/kg) para solos de áreas industriais (BRASIL, 2009) HPA – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos TPH – Hidrocarbonetos Totais do Petróleo

Verificaram-se no contaminante, elevados teores de HPA e TPH, na razão HPA:TPH

de 1:5. Estes teores elevados foram condizentes com a fonte de geração, revelando o caráter

persistente do resíduo oleoso de fundo da coluna de destilação a vácuo.

Nos meados do século XX, as tecnologias existentes no Brasil empregavam para o

refino de petróleo, apenas a destilação em colunas à pressão atmosférica e a destilação em

colunas a vácuo. Estas operações eram executadas após as etapas de dessalgação e de

remoção de água. Até os dias de hoje, o resíduo de fundo da destilação atmosférica é

transferido e processado como carga do sistema de destilação a vácuo, sendo empregadas

pressões entre 50 e 75 mmHg e temperaturas de aproximadamente 370°C, as quais separam

as frações de gasóleo, resinas e óleos lubrificantes pesados. Cerca dos 15 a 25% da carga

processada são convertidas em resíduo da coluna de destilação a vácuo, o qual pode

apresentar uma elevada viscosidade.

Na década de 1950, o processamento dos resíduos de fundo das colunas de destilação

a vácuo era economicamente inviável, pois demandava temperaturas ainda mais altas para o

refino e tecnologia de craqueamento, não disponível à época, no Brasil. Por esta razão, tais

resíduos eram descartados, por exemplo, em cavas nos solos ou em aterros nas áreas

industriais, promovendo eventos de contaminação ambiental e demandando ações futuras

para o tratamento dos locais contaminados. Atualmente, várias misturas de hidrocarbonetos

podem ser obtidas do resíduo de fundo da coluna de destilação a vácuo, através de operações

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que incluem, por exemplo, o craqueamento térmico e o craqueamento fluido catalítico

(CUNHA, 2009, MURTA VALLE, 2007).

O histórico de contaminação antiga e os elevados valores de concentração dos

hidrocarbonetos no solo incrementaram as dificuldades de tratamento biotecnológico do

local. Como alternativa de intervenção, o solo foi escavado e retirado do local da

contaminação, sendo em seguida, tratado por operação térmica, no caso, com uso de uma

Unidade de Dessorção Térmica (UDT), em escala industrial.

5. 2 Características do solo antes do tratamento por dessorção térmica

A Tabela 5.2 apresenta as características do solo contaminado amostrado no local

impactado. A composição granulométrica revelou que o estudo foi conduzido em uma areia

silto-argilosa com capacidade de retenção de água em torno de 30%, características de solos

tropicais.

Segundo Falciglia, Giustra e Vagliasindi (2011), mesmo nos casos de baixos teores de

partículas finas, o material pode apresentar propriedades adsorventes ativas, uma vez que

possuem elevadas áreas superficiais e cargas parciais que favorecem o processo de sorção dos

contaminantes e a formação de agregados. Dessa forma, o material fino do solo pode

influenciar significativamente sua vulnerabilidade a um evento de contaminação,

incrementando desta forma, a dificuldade de tratamento.

Vale ressaltar que o solo em questão era do tipo vertissolo, caracterizado pelo alto teor

de esmectina, grupo de minérios que incluem a montmorilonita. Tais minérios são formados

por partículas, cujo arranjo em folhas confere importantes propriedades ao vertissolo, por

exemplo, elevada superfície específica, densidade e capacidade de troca iônica, de 800 m2/g,

113 Å2/íon e 100 me/100g, respectivamente (LAMBE e WHITEMAN, 1979).

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Tabela 5.2 – Características físico-químicas e microbiológicas do solo

contaminado com resíduo oleoso de fundo da coluna de destilação a vácuo

Ensaios Resultados

Textura (%)

Argila

Silte

Areia fina

Areia média

Areia grossa

Pedregulho

3±2

27±1

29±2

22±1

15±4

4±3

Carbono Orgânico Total (mg/kg) 75.500±1.000

Nitrogênio Total (mg/kg) 1.591±10

Fósforo Total (mg/kg) 914±10

16 HPA USEPA (mg/kg) 193,4±1,1

TPH (mg/kg) 58.047±1.000

16 HPA:TPH 1:300

Densidade de sólidos (kg/dm3) 2,58±0,01

pH (H2O) 5,7±0,1

Umidade (%) 12,7±0,1

Capacidade de Retenção da Água (%) 30,2±0,1

C:N:P 100:2:1

Bactérias Heterotróficas Aeróbias (UFC/g) 35±1x104

Fungos Filamentosos (UFC/g) 50±1x101 HPA – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos USEPA – United States Environmental Protection Agency TPH – Hidrocarbonetos Totais do Petróleo UFC/g - Unidades Formadoras de Colônia por grama de solo

O solo apresentou elevados teores de carbono orgânico, assim como nitrogênio e

fósforo, permitindo o desenvolvimento de micro-organismos, embora determinados em

concentrações inferiores ao padrão natural de solos, estimados entre 106 e 1010, possivelmente

em função do alto teor de hidrocarbonetos presentes.

A Tabela 5.3 apresenta as concentrações de dezesseis HPA nas amostras de solo.

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Tabela 5.3 – Concentração dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) no solo

contaminado com resíduo oleoso de fundo da câmara de destilação a vácuo (p<0,05)

HPA (n° de anéis) Concentração (mg/kg) Valores orientadores*

Naftaleno (2) <5,73±0,08 90,0

Acenafteno (3) <5,73±0,08 _____

Acenaftileno (3) <5,73±0,08 _____

Fluoreno (3) <5,73±0,08 _____

Fenantreno (3) 29,25±0,08 95,0

Antraceno (3) 7,77±0,07 0,0

Fluoranteno (4) 6,53±0,08 _____

Pireno (4) 83,00±0,44 _____

Benzo[a]antraceno (4) 7,24±0,07 65,0

Criseno (4) 9,37±0,07 0,0

Benzo[b]fluoranteno (5) 5,93±0,08 _____

Benzo[k]fluoranteno (5) 5,73±0,08 0,0

Benzo[a]pireno (5) 10,47±0,10 3,5

Dibenzo[a,h]antraceno (5) 5,83±0,08 1,3

Benzo[g,h,i]perileno (6) 14,93±0,13 0,0

Indeno[1,2,3-c,d]pireno (6) 7,09±0,08 130,0

Total 193,40±1,13 _____ * Valores orientadores (mg/kg) para solos de áreas industriais (BRASIL, 2009)

No solo estudado, a soma das concentrações dos 10 HPA padrões da Lista holandesa

de valores de qualidade do solo, naftaleno, antraceno, fenantreno, fluoranteno,

benzo[a]antraceno, criseno, benzo[a]pireno, benzo[g,h,i]perileno, benzo[k]fluoranteno e

indeno[1,2,3-c,d]pireno, totalizou 104,11 mg/kg. Este valor foi superior cerca de duas vezes e

meia o limite permitido, 40 mg/kg, indicando a necessidade de intervenção na área estudada

(NEDERLAND, 2006).

Diferente da legislação holandesa, os valores orientadores para o solo da Resolução nº

420/09 do Conselho Nacional do Meio Ambiente, CONAMA, são determinados

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individualmente para dez HPA padrões, antraceno, benzo[a]antraceno, benzo[k]fluoranteno,

benzo[g,h,i]perileno, benzo[a]pireno, criseno, dibenzo[a,h]antraceno, fenantreno,

indeno[1,2,3-c,d] e naftaleno (BRASIL, 2009). Foram verificadas concentrações acima dos

valores de intervenção em seis desses compostos, antraceno, benzo[k]fluoranteno,

benzo[g,h,i]perileno, benzo[a]pireno, criseno e dibenzo[a,h]antraceno, confirmando a

necessidade de tratamento e identificando o risco para a saúde humana neste cenário de

exposição, em área industrial.

O pireno foi o HPA com a concentração mais elevada nas amostras, representando

43% do total. Esta molécula foi descrita como o mais ou um dos mais abundantes HPA em

solos impactados por óleo, pelo fato do pireno constituir um de seus principais componentes

(GALLEGO et al. 2006, MOON et al. 2006, DEL PANNO et al. 2005, GONG et al. 2005,

VIÑAS et al. 2005, KAZUNGA e AITKEN, 2000). Entretanto, diversas outras razões podem

justificar sua presença, tais como, a baixa solubilidade e a persistência no solo por mais

tempo que outros HPA, por exemplo, o antraceno e o naftaleno (OLESZCZUK, 2009,

ALEXANDER e ALEXANDER, 2000, SCHNEIDER et al. 1996).

5. 3 Identificação dos contaminantes remanescentes e propriedades do solo tratado na

UDT

Para a identificação e quantificação dos compostos remanescentes, bem como de

algumas características do solo tratado na UDT, foram coletadas amostras na área de

quarentena, isto é, o local reservado para estocagem de solo remediado e resfriado, até sua

liberação pelo laboratório de controle de qualidade, finalizando o processo com a disposição

definitiva do solo na área de reaterro.

As características do solo tratado na UDT estão apresentadas na Tabela 5.4.

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Tabela 5.4 – Características físico-químicas do solo tratado na UDT

Ensaios Resultados Solo

contaminado

Textura (%)

Argila

Silte

Areia fina

Areia média

Areia grossa

Pedregulho

9±5 3±2

33±1 27±1

22±2 29±2

19±1 22±1

12±4 15±4

5±5 4±3

Carbono Orgânico Total (mg/kg) 23.000±1.000 75.500±1.000

Nitrogênio Total (mg/kg) 1.397±30 1.591±10

Fósforo Total (mg/kg) 777±11 914±10

16 HPA USEPA (mg/kg) 8,43±0,59 193,4±1,1

TPH (mg/kg) 699±50 58.047±1.000

16 HPA:TPH 1:82 1:300

Densidade de sólidos (kg/dm3) 2,49±0,01 2,58±0,01

pH (H2O) 7,8±0,1 5,7±0,1

Umidade (%) 10,0±0,1 12,7±0,1

Capacidade de Retenção da Água (%) 21,4±0,1 30,2±0,1

C:N:P 100:6:3 100:2:1

Dioxinas ND NR

Furanos ND NR UDT – Unidade de Dessorção Térmica HPA – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos USEPA – United States Environmental Protection Agency TPH – Hidrocarbonetos Totais do Petróleo ND - Não detetado NR – Não realizado

Verifica-se que a ação do calor promoveu um aumento no percentual de finos do solo.

De acordo com Araruna Jr. et al. (2004), os solos contaminados por óleo possuem partículas

com diâmetros maiores, quando comparados aos solos tratados por dessorção térmica. Tal

fato pode ser observado pela redução do número das partículas mais grossas, como também

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pelo aumento cerca de 20% no percentual de silte e mais de 60% no percentual de argila,

entre o solo impactado e o solo tratado na UDT. A capacidade de retenção de água pelo solo,

outro importante parâmetro físico, sofreu alterações significativas após o tratamento térmico,

sendo observada uma redução de 29%. Esta alteração é comum em solos tratados por

operações de dessorção térmica, estando associada à aplicação de temperaturas elevadas no

processo, as quais resultam em mudanças na microestrutura do solo, provavelmente por conta

da destruição da matéria orgânica, um agente de coesão nesses materiais. Esses resultados

concordaram aos apresentados por Abu-Zreig, Al Akhas e Attom (2001) ao estudarem o

comportamento de solos sob a influência de diferentes temperaturas empregadas no

tratamento de solos por dessorção térmica.

O tratamento na UDT promoveu o aumento do pH dos solos para faixa levemente

alcalina, o qual pode estar relacionado ao consumo de compostos ácidos presentes no

contaminante, como também à incorporação de cinzas, originadas durante a queima dos gases

dessorvidos.

O processo térmico promoveu a remoção de cerca de 70% do carbono orgânico do

solo, com significativa redução do TPH, 98,8%, cujo resultado representou um bom indicador

da eficiência na remoção de compostos voláteis e semivoláteis pelo processo.

As amostras apresentaram teores HPA residuais de baixa e de alta massa molecular,

como apresentam as Tabelas 5.5 e 5.6. Considerando os critérios estabelecidos pela resolução

420/09 do CONAMA e pela Lista holandesa, do ponto de vista físico-químico, o solo foi

considerado tratado, por apresentar baixas concentrações destes contaminantes.

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Tabela 5.5 – Concentração de HPA de baixa massa molecular no solo

tratado na UDT (p<0,05)

HPA (n° de anéis) Concentração

(mg/kg)

Valores

orientadores*

% de

redução

Naftaleno (2) <0,10±0,02 90,0 >98,3

Acenafteno (3) <0,10±0,02 ____ >98,3

Acenaftileno (3) <0,10±0,02 ____ >98,3

Fluoreno (3) 0,10±0,02 ____ >97,7

Fenantreno (3) 0,20±0,02 95,0 99,3

Antraceno (3) 0,10±0,02 0,0 98,7

Total 0,40±0,03 ____ 98,9

*Valores orientadores (mg/kg) para solos de áreas industriais (BRASIL, 2009) HPA – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos UDT – Unidade de Dessorção Térmica

Tabela 5.6 – Concentração de HPA de alta massa molecular no solo

tratado na UDT (p<0,05)

HPA (n° de anéis) Concentração

(mg/kg)

Valores

orientadores*

% de

redução

Fluoranteno (4) 0,26±0,02 ____ 96,0

Pireno (4) 1,40±0,09 ____ 98,3

Benzo[a]antraceno (4) 0,48±0,02 65,0 93,4

Criseno (4) 0,72±0,03 0,0 92,3

Benzo[b]fluoranteno (5) 0,82±0,03 ____ 86,2

Benzo[k]fluoranteno (5) 0,40±0,02 0,0 93,0

Benzo[a]pireno (5) 0,93±0,04 3,5 91,1

Dibenzo[a,h]antraceno (5) 0,22±0,02 1,3 96,2

Benzo[g,h,i]perileno (6) 1,70±0,06 0,0 88,6

Indeno[1,2,3-c,d]pireno (6) 1,10±0,04 130,0 84,5

Total 8,03±0,03 ____ 94,9 * Valores orientadores (mg/kg) para solos de áreas industriais (BRASIL, 2009) HPA – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos UDT – Unidade de Dessorção Térmica

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Remmler e Kopinke (1995) observaram a vaporização completa de todos os HPA de

até quatro anéis no solo, após tratamento por dessorção térmica. No entanto, acima de 272°C,

isto é, uma temperatura inferior à temperatura mínima do processo estudado, diversas reações

promovem o aumento das cadeias ou formam isômeros dos HPA, tanto de baixa quanto de

alta massa molecular, possivelmente explicando a presença dos HPA residuais de até quatro

anéis (POPE; PETERS e HOWARD, 2000).

No presente estudo, foi verificado que a concentração total dos HPA de alta massa

molecular, após o tratamento na UDT, 8,03 mg/kg, encontrava-se cerca de vinte vezes maior

que a concentração total dos HPA de baixa massa molecular, 0,40 mg/kg. Tal observação

pode ser explicada pela menor pressão de vapor e maior temperatura de ebulição desses

compostos. Além disso, os HPA de seis anéis foram removidos em grau ligeiramente menor

de eficiência que os HPA com cinco anéis e isso pôde estar relacionado aos fenômenos de

reforma, isto é, quando moléculas complexas são formadas a partir de precursores simples

como os HPA de baixa massa molecular (ALAPPAT et al. 2007).

O menor percentual de remoção entre todos os HPA monitorados foi o do

indeno[1,2,3-c,d]pireno, 84,5%, possivelmente relacionado à maior estabilidade térmica do

composto, bem como aos fenômenos de ruptura de ligações e reforma (POPE; PETERS e

HOWARD, 2000).

A razão entre os HPA de baixa e de alta massa molecular diminuiu de 0,24 no solo

impactado para 0,05 no solo tratado na UDT. Esta diminuição indicou que houve uma

mudança na distribuição dos HPA, com o consumo preferencial dos compostos de baixa

massa molecular durante o processo de dessorção térmica. Este fenômeno também foi

observado em um estudo recente sobre a eficiência da metodologia (BIACHE et al. 2009).

As concentrações de nitrogênio e fósforo tiveram variação muito pequena quando

comparadas ao teor de carbono orgânico, de 914 a 777 mg/kg e de 1591 para 1397 mg/kg,

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respectivamente. Isso indicou que o nitrogênio e o fósforo contidos nos solos estavam

provavelmente associados às matrizes inorgânicas, uma vez que o contaminante era muito

pobre de compostos nitrogenados e compostos de fósforo. A redução da concentração de

carbono orgânico e a manutenção dos teores de nitrogênio e fósforo implicaram no aumento

da relação C:N:P para 100:6:3 no solo tratado na UDT, enquanto no solo contaminado essa

relação era 100:2:1.

Em todas as amostras analisadas, não foi detetada a presença de dioxinas e furanos,

embora a temperatura média do forno de 350°C e a possível presença de íons cloreto

favorecessem condições para a formação desses contaminantes. Isto pode ser justificado pela

eficiência do tratamento dos gases vaporizados, pois dioxinas e furanos são produzidas nas

correntes gasosas, durante o resfriamento. Cabe enfatizar que o baixo limite de deteção do

método analítico empregado, menor que 20 ng/kg, sustenta a hipótese de alta eficiência do

tratamento térmico.

Em um estudo recente foi verificada a formação de dioxinas e furanos em uma UDT,

operando com temperaturas variando de 315 a 426°C. Observou-se que os tratamentos da

amostra antes da admissão no forno, tais como, moagem e secagem, auxiliaram na eliminação

de 98,9% desses compostos, posteriormente removidos através de um eficiente sistema de

tratamentos de efluentes gasosos (REINER, 2009). Ressalta-se que a moagem e a secagem

foram procedimentos rotineiros durante a etapa de blendagem do solo contaminado para

admissão na UDT, cujas amostras utilizadas neste trabalho são oriundas, revelando a

importância da fase de pré-admissão na eficiência do processo.

Kulkarni, Crespo e Afonso (2008) e Weber et al. (2001) afirmam que dioxinas e

furanos se formam em temperaturas entre 300 e 500°C, através de dois mecanismos:

combustão incompleta e reforma. Com uma temperatura de trabalho da UDT na faixa entre

300 e 350°C e máximo de 800°C, possivelmente houve a formação de dioxinas e furanos no

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forno. Entretanto, a unidade era dotada de um sistema de tratamento de efluentes, no qual

incluía uma Câmara de Pós-Combustão (CPC) capaz de atingir até 1200°C. De acordo com

Pereira (2004), dioxinas e furanos se decompõem a partir de 600°C e são totalmente

eliminados com o dobro desta temperatura. Sendo assim, dado o risco para a saúde ambiental

e humana que dioxinas e furanos representam, a não determinação de tais compostos nas

amostras de solo tratado provou mais uma vez, a eficácia do processo de dessorção térmica,

servindo também como indicativo da excelência de qualidade da UDT.

Diante do exposto, do ponto de vista físico-químico, o processo de dessorção térmica,

em escala industrial, atingiu o objetivo de reduzir o teor de contaminantes orgânicos. No

entanto, enfatiza-se que não foi verificada a remoção total dos HPA e TPH, contrariando o

reportado pela literatura (ROBINSON et al. 2008, LEE et al. 1998, GEORGE et al. 1995).

A soma dos 16 HPA prioritários da USEPA revelou uma concentração residual de

8,43 mg/kg no solo tratado. Os fenômenos ligados à dinâmica dos processos térmicos, a

resistência térmica dos agregados solo-óleo, as oscilações intrínsecas aos procedimentos em

escala industrial, o tipo de solo, a quantidade e a idade da contaminação, entre outros fatores,

podem servir de exemplos para justificar a presença de compostos remanescentes, bem como

indicar a necessidade de ações de polimento, uma vez que se conhece o potencial

carcinogênico e genotóxico dessas moléculas.

Desta forma, a presença de moléculas residuais constitui um problema para o processo

e o baixo poder calorífico dos solos tratados via UDT torna a realimentação desses materiais

ao forno economicamente inviável, pois requer incremento substancial no consumo de GLP,

limitante econômico do processo térmico. Logo, justificam-se os estudos sobre alternativas

de baixo custo e ambientalmente seguras para o tratamento sequencial de polimento dos solos

oriundos de UDT.

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5. 4 Microbiota do solo tratado na UDT

Na unidade industrial, após a saída da UDT, o solo era deixado em um local ao ar

livre, denominado de área de quarentena, por semanas, antes do descarte final, na área de

reaterro. As análises microbiológicas do solo coletado na área de quarentena confirmaram

que o tratamento térmico criou um meio, no qual condições para o desenvolvimento da

microbiota foram estabelecidas, revelando que as concentrações de hidrocarbonetos presentes

no solo contaminado apresentavam propriedades bacteriostáticas e fungistáticas. Foram

observadas diferenças significativas na quantificação celular entre as amostras de solo

contaminado com as do solo tratado na UDT, cem vezes na população de Bactérias

Heterotróficas Aeróbias e mil vezes no teor de Fungos Filamentosos, conforme apresentado

na Tabela 5.7.

Tabela 5.7 – Comparação e quantificação dos teores de micro-organismos do solo

contaminado com resíduo de fundo da câmara de destilação a vácuo e do solo tratado na

UDT, armazenado na área de quarentena

Micro-organismos Concentração (UFC/g)

Solo contaminado Solo tratado

Bactérias Heterotróficas Aeróbias 35±1x104 34±1x106

Fungos Filamentosos 50±1x101 22±1x104 UDT – Unidade de Dessorção Térmica UFC/g - Unidades Formadoras de Colônia por grama de solo

O efeito negativo do incremento da concentração de hidrocarbonetos sobre a

microbiota vem sendo observado desde os primeiros estudos de degradação desses compostos

entre os anos de 1908 e 1919 (BUSHNELL e HAAS, 1941). Del’Arco e de França (1999)

verificaram uma significativa redução nas taxas de biodegradação de óleo árabe leve em solo

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arenoso, quando se aumentava a concentração de óleo no solo de 7 para 14 g/kg, enquanto

Meysami e Baheri (2003) observaram ação fungistática para valores de TPH no solo acima de

14 g/kg. Assim, pode-se inferir que a redução da concentração de hidrocarbonetos no solo em

estudo constituiu uma condição favorável à microbiota.

Dado que os solos foram tratados na UDT à 350°C, por 12 minutos, o solo na saída do

forno se encontrava estéril. Entretanto, no pátio de armazenamento, local da amostragem, os

solos tiveram contato com o ambiente, sendo recolonizados por micro-organismos, os quais

puderam se multiplicar, justificando as concentrações observadas de Bactérias Heterotróficas

Aeróbias e Fungos Filamentosos.

Outra hipótese para o aumento da concentração microbiana nos solos tratados pela

UDT é a redução da concentração de compostos persistentes e intemperizados ao longo dos

55 anos, desde a disposição até a intervenção. O tratamento térmico pôde ter possibilitado as

concentrações de hidrocarbonetos alcançarem níveis abaixo dos valores inibitórios, tanto para

os fungos, quanto para as bactérias. Além disso, o pH do solo tratado via UDT e a relação

C:N:P obtida se encontravam na faixa considerada adequada para o crescimento de micro-

organismos em solos, às custas de hidrocarbonetos (FRANCO et al. 2004, RAHMAN et al.

2002).

5. 5 Ensaios de fitotoxicidade do solo contaminado e do solo tratado na UDT

A maioria dos estudos discutindo a eficiência de processos térmicos para o tratamento

de solos contaminados por hidrocarbonetos do petróleo foi demonstrada apenas sob o ponto

de vista físico-químico. Tal fato é explicado pela constatação da redução dos contaminantes,

para padrões considerados aceitáveis ou de risco aceitável pelas legislações vigentes

(BIACHE et al. 2009, KULKARNI et al. 2008). Por outro lado, pouca informação foi

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100

divulgada com respeito ao impacto da operação sobre a recuperação do funcionamento do

habitat natural do solo, sendo o teste de fitotoxicidade uma das mais simples formas de

diagnóstico da fertilidade de solos tratados por dessorção térmica (DAZY; FÉRARD e

MASFARAUD, 2009).

Nas amostras de solo impactado por hidrocarbonetos de petróleo e no solo tratado por

dessorção térmica, o efeito fitotóxico foi observado utilizando-se os vegetais: Cucumis

anguria (maxixe-do-norte), Allium porrum (alho-porró) e Cucumis melo (melão-caipira).

Os dois tipos de solo não mostraram efeito fitotóxico para Cucumis sativus (pepino-

caipira). Os resultados da Germinação Relativa das Sementes (GRS) para os outros vegetais

estão apresentados na Figura 5.1.

Figura 5.1 – Germinação Relativa das Sementes (GRS)

A determinação da GRS compara o número de sementes germinadas na amostra com

o número de sementes germinadas no controle e por esta razão, os valores podem ser

superiores a 100%. No solo contaminado, a GRS foi de 3,4 a 69,2±1,1% (p<0,05) enquanto

que no solo tratado por dessorção térmica foi de 72,2 a 107,7±1,1% (p<0,05). Os resultados

revelaram que as altas concentrações do contaminante no solo exerceram um efeito

0

20

40

60

80

100

120

C. melo C. anguria A. porrum

GR

S (%

)

Solo contaminado Solo tratado na UDT

Cucumis melo Cucumis anguria Allium porrum

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101

significativamente negativo para a germinação de C. anguria e A. porrum. Sob a germinação

de C. melo, este efeito foi mais sutil.

O processo de germinação, isto é, o conjunto de eventos que antecedem o rompimento

do tegumento e finalizam com a emergência da radícula, depende em maior grau, de fatores

internos do que de fatores externos. Isto significa que em condições apropriadas de luz e

umidade, o embrião requer mais dos nutrientes armazenados, enquanto os nutrientes

disponíveis no meio são absorvidos mais tarde, quando da formação da raiz (ARAÚJO e

MONTEIRO, 2005).

Tal fato pode explicar a coincidência nos tempos de germinação, ocorridos entre 48 e

72 h do início do teste, nas sementes expostas ao extrato do solo e ao controle com água

destilada. Considerando que os HPA e os nutrientes dissolvidos na água destilada, utilizada

em ambos os casos, não foram absorvidos como uma fonte complementar de energia, a

inibição da germinação pode ter sido causada por outros fatores, como por exemplo, a

diferença de pressão osmótica, formada pelo gradiente de concentração dos HPA no meio ou

pelo tamanho da semente (REYNOSO-CUERVAS et al. 2008, FORTUNATO e

NICOLOSO, 2004).

Sob a influência dos compostos tóxicos do solo, mais de 70% das sementes de C.

melo germinaram, porém os contaminantes impediram significativamente a germinação de C.

anguria e A. porrum. Com a redução da concentração dos contaminantes após a dessorção

térmica, a diferença entre o número de sementes germinadas de C. anguria e A. porrum do

número de sementes germinadas de C. melo foi superior a 30%.

Isto implica no fato da quantidade de reservas de energia nas sementes exercer

influência direta sob a germinação de sementes na presença de compostos tóxicos, ou seja, as

sementes pequenas como C. anguria e A. porrum são mais sensíveis, por serem constituídas

de menos reservas que as sementes maiores como C. melo (TIQUIA; TAM e HODGKISS,

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102

1996). Alguns exemplos na literatura reforçam esta hipótese, tais como, Rhynchelytrum

repens (capim-gafanhoto) (REYNOSO-CUERVAS et al. 2008), Lactuca sativa (alface)

(HAMDI et al. 2007), Festuca arundinacea (festuca) (SMITH et al. 2006) e Lepidium

sativum (mastruço) (McCLURE; FRY e WEIGHTMAN, 1991).

A utilização de sementes claras garantiu que nenhuma delas apresentasse

fotoblastismo positivo, permitindo que a ausência da luz não constituísse um fator de inibição

da germinação, concordando com os achados de Cordazzo e Aracama (1998). De acordo com

dos Santos e Cardoso (2001), C. anguria é um vegetal cujas sementes compostas por dois

cotilédones, germinam em temperaturas na faixa de 16,0 a 35,5°C. Uma vez que o ensaio foi

conduzido à 22,0°C, descartaram-se todas os vieses importantes, confirmando o papel do

tamanho das sementes sobre os resultados.

O teste de elongação relativa da raiz é considerado um dos métodos mais importantes

no monitoramento de compostos tóxicos no meio. Os resultados do teste estão mostrados na

Figura 5.2.

Figura 5.2 – Elongação Relativa da Raiz (ERR)

0

20

40

60

80

C. melo C. anguria A. porrum

ER

R (%

)

Solo contaminado Solo tratado na UDT

Cucumis melo Cucumis anguria Allium porrum

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103

A Elongação Relativa da Raiz (ERR) no teste com solo antes do tratamento térmico

variou de 4,9 a 68,2±1,1% (p<0,05). C. anguria foi o vegetal mais sensível e C. melo o mais

resistente. No solo tratado na UDT, a ERR ficou entre 56,2 e 68,2±1,1% (p<0,05), tendo C.

melo mantido o mesmo resultado.

Quando comparado ao teste de germinação relativa, a ERR se mostrou mais sensível,

confirmando as observações de Araújo e Monteiro (2005). Ao contrário da germinação, a

elongação da raiz pode ser influenciada por diversos fatores externos, tais como, pH,

temperatura, salinidade, presença de metais e concentração dos HPA. As raízes são os órgãos

responsáveis pela absorção e bioacúmulo dos HPA nos vegetais e por conta das

características destes compostos, as raízes compreendem a parte mais afetada da planta,

superando inclusive as partes aéreas (ARAÚJO e MONTEIRO, 2005).

As raízes das espécies estudadas apresentaram-se visualmente brancas em todos os

testes. Além disso, foi observado o desenvolvimento de raízes secundárias no C. melo e C.

anguria (Figura 5.3). De acordo com Inderjit, Saini e Kaur (2005) e Fortunato e Nicoloso

(2004), o surgimento de raízes secundárias pode ser indicativo de estresse osmótico, bem

como pode marcar a diminuição da taxa de alongamento da raiz.

Figura 5.3 – Elongação das raízes de Cucumis anguria (maxixe-do-norte) no extrato do solo

contaminado com resíduo oleoso de fundo da câmara de destilação a vácuo, apresentando

desenvolvimento de raízes secundárias (destaque, aumento: 4X). Foto: Ulrich Vasconcelos

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104

O mecanismo de ação dos HPA nas plantas foi descrito como a redução da habilidade

da raiz em absorver água e nutrientes (DEBIANE et al. 2008). No solo tratado na UDT, os

percentuais de elongação das raízes foram similares em todas as plantas testadas. No entanto,

A. porrum obteve uma ERR cerca de 20% menor que C. anguria e C. melo. Tal observação

contrariou os resultados de Tiquia, Tam e Hodgkiss (1996). Geralmente, neste tipo de teste,

as monocotiledôneas, grupo ao qual A. porrum pertence, são mais resistentes do que as

dicotiledôneas, representadas por C. anguria e C. melo. A sensibilidade de A. porrum

possivelmente está relacionada ao tamanho de sua semente, cerca de três vezes e uma vez e

meia menor que as sementes de C. melo e C. anguria, respectivamente.

O Índice de Germinação das sementes (IG) foi o parâmetro analisado mais sensível do

teste (Figura 5.4). A razão da maior sensibilidade é justificada pelo fato deste índice

combinar os valores de germinação das sementes com os da elongação da raiz.

Figura 5.4 – Índice de Germinação das sementes (IG)

Nas amostras de solo contaminado, os IG variaram de 0,2 a 47,2±1,1% (p<0,05). O

efeito tóxico mais pronunciado foi observado com C. anguria, ao passo que C. melo obteve o

0

20

40

60

80

C. melo C. anguria A. porrum

IG (%

)

Solo contaminado Solo tratado na UDT

Cucumis melo Cucumis anguria Allium porrum

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105

maior IG. A presença dos contaminantes residuais no solo após o tratamento na UDT

promoveu o aumento significativo do IG nos vegetais estudados, variando de 40,6 a

73,5±1,1% (p<0,05).

O aumento do IG resulta de um número semelhante de sementes germinadas no

extrato de solo e no controle, em uma maior taxa de elongação da raiz. Para qualquer vegetal,

quando o IG varia de 50 a 80%, a fitotoxicidade dos constituintes do solo é considerada

moderada, abaixo de 50%, a fitotoxicidade é considerada alta e acima de 80%, não existe

efeito fitotóxico (ANASTASI et al. 2009).

Os resultados do teste de ecotoxicidade contribuíram para comprovar que a

diminuição do efeito inibitório nas plantas coincidiu com a redução significativa da

concentração de hidrocarbonetos do petróleo do solo, após o tratamento por dessorção

térmica. Ainda assim, a presença de 8,43 mg/kg de HPA residuais promoveu uma toxicidade

de moderada (C. anguria e C. melo) à alta (A. porrum), resultado em desacordo com Debiane

et al. (2008), cujo efeito fitotóxico dos hidrocarbonetos foi detetado em concentrações acima

de 10 mg/kg. Desta forma, concluiu-se que do ponto de vista biológico, o tratamento térmico

não foi eficiente, justificando o emprego de uma etapa para tratamento sequencial desses

solos.

5. 6 Ensaios de biorremediação

5. 6. 1 Micro-organismos utilizados no bioaumento

Os ensaios de bioaumento foram conduzidos utilizando uma cultura mista preparada

com micro-organismos autóctones, isolados através de técnicas tradicionais de cultivo,

adotando-se o critério de predominância nas placas nas diferentes diluições. De acordo com

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106

Supaphol et al. (2006), os indivíduos isolados de áreas impactadas por óleo, quando

predominantes nas placas podem ser considerados agentes biorremediadores em potencial.

Partindo-se desta premissa, vinte micro-organismos foram isolados, sendo onze bactérias

(CW-1, CW-2, CW-3, CW-4 e CW-5 do solo contaminado e CW-6, CW-7, CW-8, CW-9,

CW-18 e CW-20 do solo tratado na UDT) e nove fungos filamentosos (CW-10, CW-11, CW-

12, CW-13, CW-14 e CW-15 do solo contaminado e CW-16, CW-17 e CW-19 do solo

tratado na UDT).

Os isolados foram aclimatados em meio mineral utilizando óleo cru como única fonte

de carbono e apenas oito culturas puras restaram ao final desta fase, sendo quatro bactérias e

quatro fungos filamentosos. Dentre as bactérias, duas eram Gram-negativas, Pantoea

agglomerans CW-18 e Serratia marsescens CW-20 e duas outras, Gram-positivas, Bacillus

cereus CW-4 e Gordonia amicalis CW-7, esta última uma actinobactéria. As bactérias Gram-

negativas juntamente com as actinobactérias são consideradas grupos importantes no

processo de biodegradação de hidrocarbonetos, por serem mais numerosas em solos

contaminados por óleo (FRANCO et al. 2004).

Dentre os fungos filamentosos, três linhagens pertenciam ao filo Ascomycota,

Aspergillus fumigatus CW-10, Aspergillus terreus CW-11 e Aspergillus carneus CW-12. Um

quarto isolado foi identificado como Syncephalastrum racemosum CW-14 inc. sed.2. Todos

os micro-organismos são espécies reconhecidamente ligninolíticas, as quais apresentam

inespecificidade enzimática como uma vantagem metabólica, favorecendo a quebra dos anéis

dos HPA (ROMERO et al. 2010).

2 Incertae sedis - há incertezas quanto a posição do gênero Syncephalastrum no filo Zycomycota, sendo atualmente incluído na ordem Mucorales do subfilo Mucoromycotina.

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107

5. 6. 2 Biorremediação com uso de planejamento experimental

Considerando que o solo tratado na UDT apresentou compostos remanescentes e

efeitos fitotóxicos, planejou-se uma implantação de estratégias de tratamento microbiológico

sequencial às operações de dessorção térmica. O baixo custo foi o principal critério de

escolha dessas metodologias. Dado o número de variáveis nos processos biológicos, optou-se

por ferramentas de planejamento experimental, com fins de reduzir o tempo e selecionar

variáveis importantes.

Sabendo que múltiplas interações podem agir no solo, os planejamentos fatoriais

constituem uma das ferramentas mais úteis durante a fase preliminar em estudos de

biorremediação, pois diminuem o número de experimentos, ganham em tempo e reduzem os

custos (PHOA; XU e WONG, 2009, VICENTE et al. 1998). Vale ressaltar que o

planejamento fatorial não compreende uma ferramenta meramente acadêmica. Recentemente,

Khan et al. (2011) apresentaram vários exemplos desta prática empregada em diversos

segmentos da indústria, tais como automotiva, naval e eletrônica.

A Tabela 5.8 apresenta a matriz estendida do planejamento de experimentos

empregado e os respectivos resultados, considerando as perdas abióticas. Sobre o percentual

de redução dos HPA, foi estudado o efeito das variáveis fertilizante comercial NPK

(bioestímulo), cossubstrato (adição de glicerol PA) e cultura mista (bioaumento), codificadas

por X1, X2 e X3, respectivamente. Os símbolos + e – indicam, respectivamente, o nível

superior e o nível inferior, para cada variável de entrada. Os valores reais das variáveis X1 e

X2 também estão apresentados. No caso da variável X3, os símbolos + e – estão associados à

adição ou não da cultura mista.

A variação das condições experimentais promoveu mudanças no percentual de

biodegradação dos HPA no solo e as perdas abióticas, determinadas em 10%, foram

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108

consideradas baixas, estando em acordo com dados reportados na literatura (PERFUMO et al.

2007, OLIVEIRA e DE FRANÇA, 2005, McNALLY; MIHELCIC e LUEKING, 1998).

Tabela 5.8 – Matriz estendida do planejamento fatorial 23

Reatores

Fertilizante

NPK, X1

Cossubstrato,

X2

Bioaumento,

X3

Redução dos

HPA (%)*

1 + (100 mg/kg) + (0,63 mg/kg) + (presença) 35,0±0,4

2 – (0 mg/kg) + (0,63 mg/kg) + (presença) 49,0±0,1

3 + (100 mg/kg) + (0,63 mg/kg) – (ausência) 45,0±0,2

4 – (0 mg/kg) + (0,63 mg/kg) – (ausência) 68,0±0,1

5 + (100 mg/kg) – (0,00 mg/kg) + (presença) 64,0±0,1

6 – (0 mg/kg) – (0,00 mg/kg) + (presença) 43,0±0,1

7 + (100 mg/kg) – (0,00 mg/kg) – (ausência) 71,0±0,2

8 – (0 mg/kg) – (0,00 mg/kg) – (ausência) 58,0±0,1

9 Perdas abióticas 10,0±0,1 HPA - Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos * Considerando as perdas abióticas, após 60 dias de experimentos

Apesar da Tabela 5.8 apresentar os melhores resultados na ausência do bioaumento e

que na presença do cossubstrato, a adição do fertilizante reduziu a variável de resposta, tais

valores não puderam ser interpretados de forma direta, dada a necessidade de uma avaliação

da significância dos parâmetros estudados, considerando também os efeitos das interações

dos fatores. Assim, os resultados de biodegradação dos HPA foram usados para construção

de um modelo empírico, com vistas à descrição dos dados experimentais, obtendo-se a

Equação 5.1 (Eq. 5.1).

Y = b0+b1X1 + b2X2+ b3X3 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 + b123X1X2X3 (Eq. 5.1)

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Tratamento Microbiológico Sequencial de solo... Vasconcelos, U. (nome para citação)

109

Onde: Y é a variável resposta; X1, X2 e X3 são as variáveis de entrada, uso de

fertilizante comercial NPK, uso de 0,63 mg/kg de cossubstrato (glicerol PA) e bioaumento; e

b0, b1, b2, b3 e b123 são constantes.

Uma regressão hierárquica foi aplicada, implicando na eliminação de forma

sequencial dos termos não significativos, para um nível de significância de 95% e na

manutenção dos termos mais significados, obtendo-se a Equação 5.2 (Eq. 5.2).

Y = 54,13 – 9,75X2 – 12,75X3 – 17,75X1X2 + 4,25X1X3 (Eq. 5.2)

Onde: Y é o percentual de biodegradação dos HPA e X1, X2 e X3 são, respectivamente,

uso de fertilizante comercial NPK, uso de 0,63 mg/kg de cossubstrato (glicerol PA) e

bioaumento. Os valores das constantes b0, b2, b3, b12 e b13 apresentados na Tabela 5.9 estão

relacionados com os termos lineares da Eq. 2. Todos esses valores foram considerados no

modelo matemático, baseando-se os valores obtidos nos Testes t e p.

Tabela 5.9 – Coeficientes de regressão

Fator Coeficiente de

regressão

Desvio

padrão Teste t Valor p

b0 54,13 0,13 443 0,0015

b1 - 0,75 0,25 - 3 0,2048

b2 - 9,75 0,25 - 39 0,0163

b3 - 12,75 0,25 - 51 0,0125

b12 - 17,75 0,25 - 71 0,0090

b13 4,25 0,25 17 0,0374

b23 - 1,75 0,25 - 7 0,0903

A avaliação do modelo empírico foi realizada com auxílio da análise da variância,

apresentada na Tabela 5.10.

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110

Tabela 5.10 – Tabela ANOVA e de parâmetros estimados

Fator Soma

quadrática

Grau de

liberdade

Média

quadrática F p

X1 1,1 1 1,1 9 0,2048

X2 190,1 1 190,1 1521 0,0163

X3 325,1 1 325,1 2601 0,0125

X1X2 630,1 1 630,1 5041 0,0090

X1X3 36,1 1 36,1 289 0,0374

X2X3 6,1 1 6,1 49 0,0903

Erro 0,1 1 0,1

Soma quadrática total 1.188,9 7

A análise de regressão múltipla foi usada para avaliar as variáveis estudadas. A Tabela

5.10 apresenta a análise estatística dos parâmetros estimados. Os valores F e p, num intervalo

de confiança de 95%, foram usados como ferramenta para verificar a significância das

variáveis de entrada e das suas interações. Os valores obtidos nos testes F e p demonstram

que a variável X1X2, interação do fertilizante e cossubstrato, foi a mais significativa sobre a

biodegradação dos HPA.

A medida de correlação usada para testar o ajuste da Eq. 5.2 foi o coeficiente de

correlação múltipla r e o coeficiente de determinação r2. O fato do valor de r (0,9993), para o

modelo estatístico, ser muito próximo de 1, indica um alto nível da correlação entre os

valores observados e previstos. O valor do coeficiente de determinação, r2 = 0,9999, indica

que menos de 1% das variações do processo não são explicadas pelo modelo. Os baixos

valores do Teste p indicaram que os termos associados foram significativos.

Uma ferramenta que também pode ser empregada para interpretar os dados da Tabela

ANOVA é o Diagrama de Pareto, apresentado na Figura 5.5.

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111

-3,

-7,

17,

-39,

-51,

-71,

p=,05

X1

X2X3

X1X3

X2

X3

X1X2

X1- Fertilizante NPK; X2- Cossubstrato; X3- Bioaumento

Figura 5.5 – Diagrama de Pareto

Observa-se na Figura 5.5, que com um nível de confiança de 95%, o termo

relacionado com o efeito da adição de fertilizante, X1, e o termo relacionado à interação das

variáveis: cossubstrato e bioaumento, X2 e X3, respectivamente, não foram estatisticamente

significativos sobre a variável de resposta. O termo associado ao bioaumento, X3 e aquele

associado ao uso do glicerol PA, X2, apresentaram-se significativos. No entanto, o termo mais

significativo entre todos, sobre a degradação dos HPA foi a interação das variáveis X1 e X2. A

interação das variáveis X1 e X3 também foi estatisticamente significativa, porém de forma

marginal. As variáveis bioaumento e cossubstrato foram as mais importantes, isoladamente.

A variável fertilizante não foi importante ao bioprocesso. No entanto, a interação deste fator

com os demais variáveis estudadas mostraram-se relevantes.

As curvas de contorno foram usadas para estudar os efeitos de sinergia e antagonismo

das variáveis de entrada sobre a biodegradação dos HPA. Na Figura 5.6 verifica-se que o uso

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112

de fertilizante, (+1), promoveu um pequeno aumento no percentual de redução dos HPA no

solo, passando de 55% para 65%, concordando as observações do Diagrama de Pareto, no

qual a variável X1 não foi estatisticamente significativa sobre o processo. Provavelmente, o

fato do solo já apresentar teores de nitrogênio (≈ 1400 mg/kg) e fósforo (≈ 780 mg/kg)

requeridos para a biodegradação explique esta observação. Anterior aos experimentos do

planejamento fatorial, a relação C:N:P era de 100:6:3, faixa considerada adequada para

biorremediação de solos (MANCERA-LÓPEZ et al. 2008, GALLEGO et al. 2006, KING et

al. 2005, EVANS et al. 2004). Com a adição do fertilizante (100 mg/kg) não ocorreu uma

mudança significativa na relação C:N:P, bem como a diminuição na degradação dos HPA.

Figura 5.6 – Curva de contorno demonstrando o efeito da utilização do fertilizante comercial

NPK e de glicerol sobre o percentual de biodegradação dos HPA no solo

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Oliveira e de França (2005) estudaram o efeito da relação C:N na degradação de

hidrocarbonetos, provenientes de óleo árabe leve, em solo arenoso, e verificaram que relações

C:N elevadas; 100:1 e 100:2 foram menos favoráveis à biodegradação dos hidrocarbonetos.

Nas relações C:N mais baixas estudadas, 100:5 e 100:10 foram obtidos maiores percentuais

de biodegradação dos compostos orgânicos, indicando a necessidade de suplementação de

nutrientes para a biorremediação.

Considerando a condição de uso de fertilizante, (+1), o uso do cossubstrato (glicerol

PA) possibilitou uma redução significativa na biodegradação dos HPA, de 65% para valores

inferiores a 50%, em acordo ao observado no Diagrama de Pareto, demonstrando que a

variável uso do glicerol foi muito importante para a biodegradação dos HPA. Os resultados

sugerem que provavelmente houve degradação preferencial do composto como fonte de

carbono. Na condição de não uso de fertilizante, (-1), a variável glicerol não influenciou

significativamente a biodegradação dos hidrocarbonetos, revelando a importância da

interação entre essas duas variáveis.

A concentração de glicerol PA empregada nos experimentos resultou em uma relação

mássica HPA:glicerol de 100:8. Convém salientar que, mesmo nesse valor de relação

mássica, os resultados de biodegradação dos HPA demonstram que houve consumo

preferencial do glicerol, concordando às observações feitas por Zhang et al. (2005), que

estudaram a biodegradação de óleo cru por linhagem de Pseudomonas aeruginosa em meio

líquido, bem como as observações de Duquenne et al. (1999), em um estudo da utilização

preferencial do glicerol por linhagens de Bradyrhizobium japonicum e Pseudomonas

fluorescens. Logo, ficou clara a necessidade de um estudo complementar sobre a influência

da concentração de glicerol na biorremediação dos solos estudados, considerando relações

mássicas ainda mais baixas entre esse cossubstrato e os hidrocarbonetos.

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A motivação do uso de glicerol foi lançar mão do potencial tensoativo desse

composto, dado que o solo estudado possui um elevado teor de finos, isto é, materiais de

elevada área superficial e que tendem a reter hidrocarbonetos em seus micro e mesoporos,

dificultando a degradação (SEMPLE et al. 2007, JONER et al. 2004, MULLIGAN, 2004).

Na Figura 5.7 verifica-se que, na ausência de fertilizante, (-1), o bioaumento

promoveu diminuição significativa no percentual de biodegradação dos HPA. Tal redução na

degradação partiu de 65% para valores inferiores a 45%, correspondendo a um decréscimo de

eficiência de processo em aproximadamente 30%. Na presença de fertilizante, (+1), a adição

dos micro-organismos também exerceu um efeito negativo sobre a biodegradação dos HPA.

Nessa condição, a eficiência de biodegradação dos HPA foi reduzida cerca de 20%, passando

de 60% para 50%. Assim, foi possível concluir que a presença do consórcio microbiano

resultou nas alterações mais drásticas do processo.

Figura 5.7 – Curva de contorno demonstrando o efeito da utilização de fertilizante comercial

NPK e da cultura mista sobre o percentual de biodegradação dos HPA no solo

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O bioaumento é uma técnica amplamente empregada e diversos estudos concluíram

que a adição de micro-organismos foi uma ferramenta favorável à biorremediação de solos

contaminados com HPA (JACQUES et al. 2008, SUPAPHOL et al. 2006, MISHRA et al.

2001, KOMUKAI-NAKAMURA et al. 1996). Entretanto, cabe ressaltar que a maioria desses

estudos ocorreu em sistemas confinados e sob condições controladas, as quais segundo El

Fantrossi e Agathos (2005), podem prolongar a vida da microbiota.

Em contrapartida, alguns relatos na literatura apontaram que o bioaumento não

favoreceu a degradação dos HPA em solos, causados por alguns fatores, como a natureza e a

concentração do poluente, o uso de culturas axênicas e fatores nutricionais (GREEWOOD et

al. 2009, LIANG et al. 2009, MACHÍN-RAMÍREZ et al. 2008, POTIN; VIEGNIE e RAFIN,

2004, SATOH et al. 2003, CANET et al. 2001, HAY; DEES e SAYLER, 2001, entre outros).

A utilização de indivíduos autóctones na composição da cultura mista foi baseada nos

relatos que atribuem a estes isolados o melhor desempenho, justificando tal característica à

excelente adaptação às condições oferecidas no ambiente de origem (HESSELSOE et al.

2008, SATOH et al. 2003).

Diversos estudos demonstraram a capacidade de biodegradação dos HPA pelos micro-

organismos utilizados na cultura mista: enterobactérias P. agglomerans (IYER; MODY e

JHA, 2006) e S. marsescens (WILSON et al. 1999); Gram-positivas B. cereus (SAMANTHA

et al. 2002) e G. amicalis (SHEN et al. 2010) e pelos fungos filamentosos A. fumigatus (YE

et al. 2011), A. terreus (ANASTASI et al. 2009), A. carneus (ESCALANTE-ESPINOSA et

al. 2005) e S. racemosum (BOONCHAN et al. 2000).

Tais estudos identificaram diferentes genes envolvidos na síntese de proteínas

relacionadas na degradação dos HPA, por exemplo, mono-oxigenases, dioxigenases,

peroxidases, lacases e desidrogenases, revelando o potencial degradador de cada micro-

organismo, cultivado sob a forma de culturas axênicas. Por esta razão, antes do início do

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experimento foram realizados ensaios in vitro com o objetivo de verificar o antagonismo

entre as espécies integrantes do consórcio, não sendo demonstrada a existência significativa

desta relação.

É necessário destacar que o óleo utilizado na aclimatação da microbiota continha um

teor de 32,3% de hidrocarbonetos aromáticos e 21,3% de compostos polares (SILVA et al.

2009). O teor de HPA presente no contaminante do solo, resíduo de fundo da câmara de

vácuo, representou 20,0% do TPH determinado, tornando ilegítimas as interferências

promovidas pelo óleo durante o enriquecimento das linhagens.

A concentração do inóculo inicialmente fixada entre 106 e 107 UFC/mL garantiu um

crescimento de 14,7 vezes na população microbiana do solo, contudo, observou-se um efeito

negativo no bioaumento. O mesmo não foi obtido por Teng et al. (2010), cujo incremento na

população foi de 16,6 vezes e o bioaumento se mostrou como a melhor alternativa na

biorremediação de HPA no solo.

De acordo com a literatura, diversos fatores podem contribuir no baixo rendimento do

bioaumento, tais como, problemas na adaptação relacionados ao aumento da fase lag

(BOUCHEZ et al. 2000), a presença de inibidores do crescimento no solo, como metais

pesados (DUA et al. 2002), motilidade do micro-organismo (McCLURE; FRY e

WEIGHTMAN, 1991) e interações ecológicas negativas (MILLE-LINDBLOM; FISCHER e

TRANVIK, 2006). Nesses casos, a competição entre a microbiota inoculada e a microbiota do

solo pode desencadear um processo que culmina com a morte celular sem que sejam gerados

descendentes, fenômeno conhecido por die-off (MOHAN et al. 2009, POTIN; VEIGNIE e

RAFIN, 2004).

Possivelmente, as falhas do bioaumento neste estudo podem ser atribuídas a fatores

nutricionais. O pré-inóculo foi confeccionado utilizando o caldo Bushnell-Haas como

veículo, cuja formulação foi desenvolvida para estudos de degradação de hidrocarbonetos,

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contudo, o caldo Bushnell-Haas apresenta ausência de cofatores, tais como oligoelementos e

vitaminas, essenciais para a síntese de algumas enzimas (BUSHNELL e HAAS, 1941). Este

cenário de pressão seletiva expôs um problema bastante recorrente neste tipo de investigação,

isto é, quando sob baixas concentrações de nutrientes, o consórcio elege outra fonte

preferencial de carbono no solo, que não os HPA (MOHAN et al. 2009, MACHÍN-

RAMÍREZ et al. 2008, MOORTHI; DEECARAMAN e KALAICHELVAN, 2008,

FERENCI, 2001, HAY; DEES e SAYLER, 2001, SATOH et al. 2003). Neste contexto,

sugere-se a possível existência de micro-organismos hidrocarbonoclásticos com estado

nutricional deficiente no momento da adição do inóculo ao solo.

Cabe ressaltar que outros substratos estavam disponíveis no solo, tais como, as

frações leves do óleo e o glicerol, podendo os mesmos, terem servido de fonte de carbono

para uma biomassa em crescente desenvolvimento. Hesselsoe et al. (2008) compararam a

atuação de diferentes culturas mistas compostas por indivíduos sobre a degradação de HPA

em solos e observaram que tais consórcios preferiram e se mantiveram utilizando fontes de

carbono de mais fácil assimilação.

Embora registrando o menor percentual de biodegradação dos HPA, o uso do

bioaumento também permitiu a remoção desses compostos do solo. Ainda que alguns autores

reconheçam as limitações dessa metodologia, considerando-a “controversa” e “imprevisível”

(MOHAN et al. 2006, RINGELBERG et al. 2001), o bioaumento ainda é bastante utilizado e

diversas estratégias são empregadas visando diminuir seus efeitos adversos, tais como, o

encapsulamento de bactérias, hifas e esporos com alginato, a combinação com agentes

emulsificantes e o emprego de organismos geneticamente modificados (EL FANTROUSSI e

AGATHOS, 2005, LEŠTAN e LAMAR, 1996, GOLDSTEIN; MALLORY e ALEXANDER,

1985).

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A Figura 5.8 ilustra que um efeito negativo também foi observado para o caso do

bioaumento com ou sem uso de glicerol PA. A cultura mista promoveu uma redução na

biodegradação dos HPA, de 65% para aproximadamente 50%. Na presença do cossubstrato, a

introdução do inóculo promoveu uma redução significativa na biodegradação dos HPA, de

60% para aproximadamente 45%, enquanto que na ausência do glicerol, observou-se uma

redução mais atenuada, de 60% para aproximadamente 55%. Nesse caso, a redução pôde ter

relação com a degradação preferencial do glicerol, que atuaria em sinergismo ao efeito

negativo do bioaumento.

Figura 5.8 – Curva de contorno demonstrando o efeito da utilização do glicerol e da cultura

mista sobre o percentual de biodegradação dos HPA no solo

O conjunto dos dados apresentados permitiu concluir que as variáveis, bioaumento e

glicerol, agiram de forma negativa sobre a biodegradação dos HPA do solo. Destaca-se que,

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em todas as condições experimentais testadas houve biodegradação dos HPA, e os valores

obtidos apresentaram-se, aproximadamente, entre 40 e 65%. Foi também verificado um

pequeno incremento da biodegradação dos HPA com o uso do fertilizante, no solo estudado,

revelando a maior necessidade de nutrientes, pela microbiota para a biodegradação dos HPA.

Embora de origem comercial, o fertilizante representa uma parcela positiva nos custos da

biorremediação e considerando o decréscimo na remoção dos HPA no solo com o uso do

bioaumento e do glicerol PA, concluiu-se que o bioprocesso nas condições investigadas

ocorreu de forma viável, eficaz e economicamente atrativa, sem a necessidade de intervenção

por bioaumento, por bioestímulo ou pela adição de 0,63 mg/kg do cossubstrato.

5. 6. 3 Monitoramento da biorremediação

As temperaturas do ambiente e do solo, bem como valores de umidade relativa do ar e

umidade e pH do solo não foram tomados como variáveis de entrada do planejamento

experimental, uma vez que tais parâmetros não se mantêm constantes em campo.

Durante os experimentos foi observada em média, 24,0±0,3°C e 23,5±0,3°C (p<0,05),

para as temperaturas do solo e do ambiente, respectivamente. A variação de temperatura é

dada principalmente pelas passagens de frentes frias pela cidade do Rio de Janeiro, no

entanto, dentro da faixa registrada, o processo de degradação não foi dificultado, em função

da atividade metabólica dos micro-organismos mesófilos (MOHAMED et al. 2006).

A umidade do solo foi mantida numa faixa que compreendeu entre 70 e 80% da

capacidade de retenção de água, ou seja, entre 15,0 e 17,2±0,3% (p<0,05), sendo verificada a

média de 16,4±0,2% (p<0,05). A correção da umidade nos reatores se fez mais necessária nos

dias em que a umidade relativa do ar estava abaixo de 70 g/m3, entretanto, foi possível

observar durante todo o processo que a umidade do solo esteve inserida na faixa ideal de

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biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo, isto é, com valores entre 15 e 20% (KOTER;

WHITE e KELSEY, 2001).

O pH do solo diminuiu ao longo dos 60 dias, registrando a média de 7,4±0,1 (p<0,05),

valor considerado ótimo para este tipo de bioprocesso (FRANCO et al. 2004). A oxidação

microbiana das frações leves e pesadas do óleo produzem diversos tipos de ácidos orgânicos,

entre C10 e C20, em média, que reduzem o pH do solo e revelam evidências de uma microbiota

metabolicamente ativa (WATSON et al. 2002).

A Figura 5.9 expõe ao longo dos 60 dias de bioprocessos, a quantificação das

Bactérias Heterotróficas Aeróbias (BHA) nos experimentos de biorremediação. Aos reatores

1, 2, 5 e 6 foi adicionado o consórcio microbiano e o reator 8 corresponde ao sistema sem

tratamento sequencial.

Figura 5.9 – Quantificação das Bactérias Heterotróficas Aeróbias do solo durante 60 dias de

experimento nos diferentes tratamentos sequenciais: 1- fertilizante + cossubstrato +

bioaumento; 2- cossubstrato + bioaumento; 3- fertilizante + cossubstrato; 4- cossubstrato; 5-

fertilizante + bioaumento; 6- bioaumento; 7- fertilizante; 8- sem tratamento

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

1 2 3 4 5 6 7 8

UF

C/g

de

solo

Reatores

0 7 15 30 60Tempo (dias)

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O solo anteriormente a qualquer tratamento microbiológico sequencial apresentou

uma população de BHA por volta de 107 UFC/g (reator 8). Em solos contendo

hidrocarbonetos do petróleo, considera-se elevada uma população bacteriana nesta

concentração e valores similares aos observados no presente estudo podem ser encontrados

na literatura (CHEN et al. 2005, ZUCCHI et al. 2003, MISHRA et al. 2001).

Foi verificado que no início do experimento, a adição do consórcio microbiano

promoveu o aumento, em uma ordem de grandeza, na concentração de bactérias nos reatores

cuja variável bioaumento foi empregada (1, 2, 5 e 6), entretanto, ao longo do experimento, o

desenvolvimento celular apresentou um perfil similar em todas as condições testadas.

O maior incremento da população foi observado com 7 dias, em uma ordem de

grandeza nos sistemas com bioaumento (1, 2, 5 e 6) e em duas ordens de grandeza, nos

reatores sem esta variável (3, 4 e 7), revelando o estabelecimento de fenômenos de

antagonismo entre a microbiota do solo e o consórcio. Esta competição nos momentos

iniciais do teste possivelmente adiou a velocidade de degradação dos HPA, influenciado nos

resultados obtidos com a variável bioaumento, como já discutido anteriormente.

Observou-se ainda que o suplemento de 100 mg/kg de fertilizante não formou um

gradiente inibitório para os micro-organismos, uma vez que o teores de nitrogênio (≈1400

mg/kg) e fósforo (≈780 mg/kg) no solo eram considerados ideais para a biorremediação.

Sabe-se que esses elementos são importantes para produção de biomassa e quando em altas

concentrações, principalmente o nitrogênio, pode ocorrer estase em função da alteração da

salinidade e do pH (LEYS et al. 2005).

No intervalo de 15 dias, a concentração celular reduziu cerca de dez vezes em todos

os reatores, iniciando um processo de reestabelecimento das concentrações microbianas

próprias do solo, alcançadas por volta de 30 dias e mantidas até o final do experimento. Este

comportamento é comum neste tipo de estudo e está relacionado ao esgotamento de

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nutrientes (BAEK et al. 2007, MORELLI et al. 2005, McCLURE; FRY e WEIGHTMAN,

1991).

O reestabelecimento da densidade celular possivelmente esteve relacionado à

adaptação da microbiota ao contaminante e metabólitos, formados a partir do incremento da

atividade microbiana promovido pelo emprego do bioaumento e do bioestímulo. Esta

observação foi sugestiva da presença do fenômeno de tolerância. As estratégias para

manutenção das populações é uma das propriedades mais importantes dos micro-organismos

do solo. De uma forma geral, os estresses ambientais, tais como, a contaminação por

hidrocarbonetos do petróleo, promovem efeitos compensatórios, levando a microbiota ao

equilíbrio e à estabilidade (FERNÁNDEZ et al. 1999).

Essas mesmas considerações podem ser feitas para os Fungos Filamentosos. Na

Figura 5.10 estão apresentadas as médias da quantificação nos solos ao longo dos 60 dias do

bioprocesso. Nos reatores 1, 2, 5 e 6 foi adicionado o consórcio microbiano e o reator 8

corresponde ao sistema sem tratamento sequencial.

A população inicial dos Fungos Filamentosos (FF) foi de aproximadamente 105

UFC/g (reator 8), valor condizente aos obtidos em solos contendo hidrocarbonetos do

petróleo (CARMICHAEL e PFAENDER, 1997).

Da mesma forma como observado na quantificação anterior, a adição da cultura mista

(reatores 1, 2, 5 e 6) promoveu o aumento da concentração de fungos em uma ordem de

grandeza e ao longo do experimento, o desenvolvimento celular apresentou um perfil similar

em todos as condições testadas. O maior incremento da população ocorreu no intervalo de 7

dias, cerca de dez vezes nos reatores adicionados com a cultura mista e cem vezes nos

sistemas sem a variável bioaumento (3, 4 e 7), indicando que fenômenos de antagonismo

também ocorreram entre os fungos adicionados e a microbiota do solo.

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Figura 5.10 – Quantificação dos Fungos Filamentosos do solo durante 60 dias nos diferentes

tratamentos sequenciais: 1- fertilizante + cossubstrato + bioaumento; 2- cossubstrato +

bioaumento; 3- fertilizante + cossubstrato; 4- cossubstrato; 5- fertilizante + bioaumento; 6-

bioaumento; 7- fertilizante; 8- sem tratamento

No intervalo de 15 dias a concentração fúngica começou a diminuir, atingindo os

valores quantificados no solo sem tratamento aos 60 dias de experimento. Comparando-se o

intervalo, no qual a redução da concentração de bactérias foi observada, verificou-se que os

FF necessitaram apenas da metade desse tempo. Tal comportamento foi igualmente

observado por Ballaminut e Matheus (2007), sendo sua causa atribuída à maior sensibilidade

dos fungos com relação ao esgotamento dos nutrientes. Além disso, a redução da

concentração de FF pode ser também conferida à ausência de material ligninocelulósico no

solo e do valor do pH do meio (MEYSAMI e BAHERI, 2003).

As perdas abióticas foram determinadas na ordem de 10%. Nas condições

estabelecidas nesta investigação, isto é, à temperatura ambiente, com variações de luz e na

presença de oxigênio, possivelmente resultaram de fenômenos de volatilização, foto-

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1 2 3 4 5 6 7 8

UFC

/g d

e sol

o

Reatores

0 7 15 30 60Tempo (dias)

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oxidação, auto-oxidação e complexação, como reportado pela literatura (IMFELD et al. 2009,

FRASER et al. 2008, BORRACINO et al. 2001, TIEDJE et al. 1999).

O nitrato de prata como alternativa de substituição de substâncias tóxicas como azida

de sódio e sais de mercúrio, se mostrou um potente bactericida e fungicida, concordando com

diversos estudos de atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas, Gram-

negativas, bem como esporos e formas vegetativas de leveduras e fungos filamentosos

(WRIGHT et al. 1999, HIDALGO et al. 1998, FURR et al. 1994). As propriedades

antimicrobianas da prata são conhecidas há mais de 7000 anos e seu mecanismo de ação

envolve ligação com as proteínas e posterior coagulação. A liberação dos íons Ag+ também

promove combinações com radicais sulfidrilas, fosfato e amina, levando à precipitação de

proteínas, inativação de enzimas e ligações com o DNA microbiano, culminando na morte

celular (SILVER; PHUNG e SILVER, 2006, SPACCIAPOLI et al. 2001, TAVARES, 2001,

KLASEN, 2000).

5. 7 Aplicação dos resultados do planejamento experimental

A análise dos resultados do planejamento experimental revelou que a melhor condição

para a remoção dos HPA remanescentes no solo seria obtida com o estímulo da microbiota

utilizando concentrações menores que 0,63 mg/kg do glicerol, concordando com o estudo

recente de Mohajeri et al. (2010). Assim, foi investigado o efeito do suplemento de glicerol

nos teores de 0,32; 0,16 mg/kg e sem a adição do cossubstrato. Nessas condições, as relações

mássicas entre o carbono dos HPA e o carbono do glicerol foram de 100:20 e 100:10,

respectivamente. Os percentuais de biodegradação dos HPA estão apresentados na Figura

5.11.

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125

55

60

65

70

75

0,00 0,16 0,32 0,63Concentração de glicerol PA (mg/kg)

Biod

egra

daçã

o (%

)

Figura 5.11 – Biodegradação dos HPA durante 60 dias de processo

(concentração inicial de HPA = 8,43 mg/kg)

A redução do teor de glicerol aumentou significativamente a remoção dos HPA,

apoiando resultados obtidos em estudos prévios utilizando o composto como cossubstrato

durante a biodegradação de compostos tóxicos (EASTERLING et al. 2009, CHEN; CHEN e

CHANG, 2007).

Em todas as concentrações testadas houve degradação dos HPA. Apesar do glicerol

provavelmente ter servido como fonte preferencial de carbono, a adição de 0,63 mg/kg do

composto promoveu a redução de 64,1±0,5% (p<0,05) dos HPA. A concentração que mais

estimulou o processo foi 0,32 mg/kg do cossubstrato, resultando um aumento de 12% da

biodegradação, 71,8±0,2 (p<0,05) e um incremento de 20% sobre o percentual verificado no

reator controle. A tentativa de reduzir a concentração de glicerol para 0,16 mg/kg não

produziu efeito significativo, obtendo-se uma remoção de 58,3±0,5 (p<0,05), valor bastante

próximo ao observado no reator controle, 58,1±0,1% (p<0,05). Tal resultado possivelmente

se deve ao menor crescimento microbiano das linhagens responsáveis pela biodegradação dos

HPA. A remoção via biorremediação intrínseca é reportada na literatura como sendo um

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processo lento. Contudo, ressalta-se que a dessorção térmica pode redistribuir os

contaminantes no solo, justificando o fato do percentual de remoção dos HPA obtido tenha

sido superior aos observados por outros estudos em solos não tratados previamente em UDT

(AYOTAMUNO et al. 2006, XU e OBBARD, 2004).

O resultado da quantificação de Bactérias Heterotróficas Aeróbias (BHT) e de Fungos

Filamentosos (FF) no solo estão mostradas nas Figuras 5.12 e 5.13, respectivamente.

Figura 5.12 – Bactérias Heterotróficas Aeróbias no solo

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

0 7 15 30 60

UFC

/g

Tempo (dias)

0,63 0,32 0,16 0,00Concentração de glicerol PA (mg/kg)

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127

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

0 7 15 30 60

UFC

/g

Tempo (dias)

0,63 0,32 0,16 0,00Concentração de glicerol PA (mg/kg)

Figura 5.13 – Fungos Filamentosos no solo

Os teores de nitrogênio e fósforo presentes no solo foram suficientes para garantir os

nutrientes necessários para a microbiota, verificado pela estabilidade da população microbiana

no reator sem cossubstrato. A presença de glicerol nas concentrações de 0,32 e 0,63 mg/kg

estimulou o crescimento microbiano, registrando-se o maior incremento da população nos

primeiros sete dias do experimento, atingindo cerca de duas ordens de grandeza a partir do

valor inicial, cerca de 106 e 104 UFC/g, para BHA e FF, respectivamente. No reator contendo

0,16 mg/kg de glicerol, observou-se um discreto aumento da microbiota no mesmo período.

Tal fato é claramente justificado pela baixa concentração do composto.

Ao longo do tempo, a população microbiana diminuiu e reestabeleceu uma

concentração semelhante à determinada no início do experimento, para todas as condições de

glicerol testadas. O tempo necessário para o reestabelecimento de BHA foi entre 30 a 60 dias,

enquanto para os FF, de 15 a 30 dias. A redução da microbiota neste tipo de investigação é

um evento normalmente previsto, podendo estar relacionada tanto ao esgotamento de

nutrientes, como à presença de metabólitos tóxicos e posteriormente ao fenômeno de

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128

tolerância, promotor da estabilidade da população diante do contaminante e metabólitos, os

quais são removidos através de vias cometabólicas (IGWO-EZIKPE et al. 2010,

AYOTAMUNO et al. 2007).

O cometabolismo se caracteriza pelo aumento da taxa de transformação específica de

um substrato, por unidade de biomassa, na presença de um composto não utilizado durante o

crescimento celular, isto é, um cossubstrato (BABOSHIN; FINKELSTEIN e GOLOVLEVA,

2003). O cometabolismo é a via metabólica preferencial durante a degradação microbiana dos

HPA, tendo a concentração do cossubstrato, um envolvimento direto com os efeitos

sinérgicos ou antagônicos ao processo (BAGGI, 2000).

De acordo com Spratt e Pratten (2005), diferentes formas e padrões de biodegradação

dos HPA podem acontecer no solo e o número de anéis está diretamente implicado nisso, isto

é, quanto maior for o número de anéis, mais difícil será a remoção e por esta razão, a

biodegradação dos HPA com quatro ou mais anéis pode ocorrer através de cometabolismo

(PIZZUL et al. 2007).

A Tabela 5.11 apresenta a degradação de cada um dos 16 HPA prioritários da USEPA

após 60 dias, nas diferentes concentrações de glicerol investigadas.

Dentre os HPA de baixa massa molecular (HPA-BMM), isto é, com dois e três anéis,

houve praticamente 100% de remoção do naftaleno, acenafteno e acenaftileno em todas as

condições testadas. No reator sem glicerol, o mesmo percentual foi obtido também com o

antraceno e fluoreno. Isto se deve em função da simplicidade do arranjo molecular desses

compostos, bem como as baixas concentrações presentes no solo. Em contrapartida,

observou-se que a presença do glicerol influenciou negativamente a biodegradação do

antraceno e do fluoreno, concordando com os achados de Bengtsson e Zerhouni (2003). Além

disso, a degradação do fluoreno foi inversamente proporcional à concentração de glicerol, tal

como observado por Baboshin, Finklstein e Golovleva (2003), entretanto, a não remoção

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129

destes HPA discordou dos resultados obtidos por Richnow et al. (1995), cujo estudo

identificou uma biodegradação preferencial, do fluoreno e do antraceno, nesta ordem, dentre

outros contaminantes testados.

Tabela 5.11 – Percentual de biodegradação dos 16 HPA prioritários da USEPA (p<0,05)

HPA (n° de anéis) Ti (mg/kg)

Concentração de glicerol PA (mg/kg)

0,00 0,16 0,32 0,63

Naftaleno (2) <0,10±0,02 >99,9±0,1 >99,9±0,1 >99.9±0,1 >99,9±0,1

Acenafteno (3) <0,10±0,02 >99,9±0,1 >99,9±0,1 >99,9±0,1 >99,9±0,1

Acenaftileno (3) <0,10±0,02 >99,9±0,1 >99,9±0,1 >99,9±0,1 >99,9±0,1

Fluoreno (3) 0,10±0,02 >99,9±0,1 92,0±0,1 90,0±0,1 80,0±0,1

Antraceno (3) 0,10±0,02 >99,9±0,1 50,0±0,1 40,0±0,1 40,0±0,1

Fenantreno (3) 0,20±0,02 20,0±0,1 32,0±0,1 45,0±0,1 40,1±0,1

Fluoranteno (4) 0,26±0,02 53,8±0,1 53,8±0,1 61,7±0,1 61,5±0,1

Pireno (4) 1,40±0,09 62,9±0,1 35,7±0,1 71,4±0,1 56,4±0,1

Benzo[a]antraceno (4) 0,48±0,02 54,2±0,1 58,3±0,1 79,2±0,1 68,8±0,1

Criseno (4) 0,72±0,03 47,2±0,1 48,6±0,1 72,2±0,1 58,3±0,1

Benzo[b]fluoranteno (5) 0,83±0,03 67,1±0,1 69,5±0,1 81,7±0,1 75,6±0,1

Benzo[k]fluoranteno (5) 0,40±0,02 72,5±0,1 75,0±0,1 95,0±0,1 92,5±0,1

Benzo[a]pireno (5) 0,93±0,04 54,8±0,1 57,0±0,1 87,1±0,1 83,9±0,1

Dibenzo[a,h]antraceno (5) 0,22±0,02 45,5±0,1 54,5±0,1 72,7±0,1 68,2±0,1

Benzo[g,h,i]perileno (6) 1,70±0,06 87,1±0,1 87,6±0,1 87,1±0,1 76,5±0,1

Indeno[1,2,3-c,d]pireno (6) 1,10±0,04 87,3±0,1 92,7±0,1 86,4±0,1 86,4±0,1

Biodegradação (%) _______ 58,1±0,1 58,3±0,5 71,8±0,2 64,1±0,5

ΔHPA-A MM:BMM - 0,19±0,1* 0,02±0,1 0,02±0,1 0,06±0,1 0,02±0,1 Ti – teor inicial dos HPA no solo tratado por dessorção térmica ΔHPA-AMM:BMM – Variação da razão HPA de alta massa molecular e HPA de baixa massa molecular USEPA - United States Environmental Protection Agency * calculado após a dessorção térmica

Gramss et al. (1999), investigando a degradação de HPA por 58 linhagens de fungos,

concluíram que estes micro-organismos obtiveram mais afinidade pelos HPA com três anéis.

Considerando que a diminuição da densidade de Fungos Filamentosos iniciou na primeira

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130

metade dos experimentos de biorremediação, revelando a maior sensibilidade do grupo,

possivelmente esta condição pode ter contribuído negativamente sobre a degradação do

fluoreno e do antraceno.

O fenantreno apresentou um baixo percentual de remoção em todos os reatores,

incluindo no controle. Isto pode ser atribuído ao fato do HPA não se encontrasse

biodisponível. Viñas et al. (2005) investigaram a suplementação de nutrientes sobre a

degradação do diversos HPA e verificaram uma degradação incompleta do fenantreno,

relacionando o achado, à baixa biodisponibilidade do composto. Na situação inversa, isto é,

quando o fenantreno pôde ser assimilado, a literatura reporta que a adição de cossubstratos ao

meio, favoreceu a obtenção de elevadas taxas de remoção pelas células microbianas (TAO et

al. 2007, TOLEDO et al. 2006).

Com relação aos HPA de alta massa molecular (HPA-AMM), isto é, com quatro a seis

anéis, o percentual de biodegradação ficou estabelecido entre 35,7 e 95,0±0,1%. A redução

de seis dos dez HPA deste grupo, benzo[a]antraceno, criseno, bezo[b]fluoranteno,

benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno e dibenzo[a,h]antraceno, ocorreu em função da

concentração empregada de glicerol. O sucesso da biodegradação dos HPA-AMM

possivelmente pode ser atribuído à maior biodisponibilidade desses compostos no solo,

favorecida pela propriedade emulsificante do glicerol (BOGAN; TRBOVIC e PATEREK,

2003). Os valores mais expressivos foram verificados nos HPA com cinco e seis anéis,

resultados significativamente superiores aos descritos na literatura (LEI et al. 2005, JONER

et al. 2004, XU e OBBARD 2004).

Além do glicerol, outros HPA podem realizar o papel de cossubstratos durante a

remoção de alguns HPA-AMM, sendo esta estratégia metabólica discutida por diversos

autores (RENTZ; ALVAREZ e SCHNOOR, 2008, SARMA et al. 2004). A biodegradação do

pireno, segundo contaminante mais abundante no solo tratado na UDT, foi investigada

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131

através de estudos de cinética, nos quais foi comprovada a remoção deste HPA na presença

de fluoranteno e fenantreno (HWANG e CUTRIGHT, 2003, DEAN-ROSS; MOODY e

CERNIGLIA, 2002). Isto pode explicar a razão do maior percentual de remoção do pireno,

71,4±0,1%, ter coincidido com o maior percentual de remoção do fluoranteno, 61,7±0,1% e

do fenantreno, 45,0±0,1%, no reator adicionado com 0,32 mg/kg de glicerol. Contudo, o

segundo maior percentual de degradação do pireno foi observado no reator sem adição de

glicerol, tornando evidente que pelo menos na remoção do pireno, a microbiota se valeu de

duas classes de cossubstratos distintas, isto é, glicerol e HPA-BMM.

Dean-Ross, Moody e Cerniglia (2002) observaram que alguns HPA podem promover

a inibição da biodegradação de outros HPA, através da competição pelo mesmo sítio de

ligação da enzima, resultando diferenças significativas nos percentuais de biodegradação

entre moléculas semelhantes. Um claro exemplo deste fenômeno pôde ser verificado entre o

benzo[k]fluoranteno sobre seu isômero, benzo[b]fluoranteno.

Por outro lado, a atividade enzimática pode ser induzida pelo surgimento de produtos

da oxidação dos HPA-AMM e tais reações requerem interações metabólicas mais complexas

entre fungos e bactérias no solo (MARGESIN et al. 2007, DE BOER et al. 2005,

MEULENBERG et al. 1997).

Cabe ressaltar que no reator sem adição de glicerol, foi observado um elevado

percentual de biodegradação de HPA-AMM, entre 45,5 e 87,3±0,1%, registrando-se as

maiores reduções no benzo[g,h,i]perileno e indeno[1,2,3-c,d]pireno, HPA de caráter

altamente persistentes. Tal observação pode ser explicada pela redistribuição dos HPA no

solo, ocorrida em função do tratamento por dessorção térmica. Dados obtidos por Bonten,

Grotenhuis e Rulkens (1999) reforçam essa hipótese. Os autores verificaram que o aumento

da disponibilidade dos HPA-AMM no solo aquecido à 120°C por 1 h, resultou no incremento

do percentual de biodegradação desses compostos de 9,5 para 27,0%. Sendo assim, a

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132

redistribuição dos HPA-AMM após o tratamento térmico, a solubilização pelo glicerol dos

HPA com Kw/o elevados ou ainda o conjunto desses dois fatores, podem ter favorecido ao

bioacesso e melhorado a biodisponibilidade, tendo como resultado, a remoção preferencial

dos HPA-AMM.

Bengtsson e Zerhouni (2003) estudaram o efeito do glicerol na biorremediação de um

solo também contaminado por 8 mg/kg dos 16 HPA e observaram uma degradação

preferencial dos HPA-AMM, a maioria entre 20 e 40%, alguns acima de 50% e nenhum

menor que 10%. Neste estudo, na melhor condição do processo, com a adição de 0,32 mg/kg

de glicerol, nenhum HPA-AMM foi removido menos do que 60%, revelando a importância

do composto como cossubstrato no tratamento microbiológico sequencial dos HPA residuais

no solo.

A determinação da razão das concentrações dos HPA de alta e baixa massa molecular

(HPA-AMM:HPA-BMM) consiste uma importante ferramenta para a avaliação da

biodegradação desses compostos. Através do cálculo da variação da razão HPA-AMM:HPA-

BMM, inicial e final do bioprocesso (ΔHPA-AMM:BMM) é possível determinar qual a classe de

HPA foi preferencialmente consumida pelos micro-organismos, sendo o valor positivo dessa

variação, o indicativo da utilização dos HPA-AMM (ZHANG et al. 2009, TOLUN et al.

2006, KOHLMEIER et al. 2005).

Em solos, as comunidades microbianas estão estruturadas de uma forma que por si só,

podem eliminar os compostos xenobióticos, através de mecanismos que envolvem

cooperação metabólica, quimiotaxia e cometabolismo. Entretanto, o suplemento do meio,

com uma fonte de carbono solúvel, em concentração não inibitória, influencia diretamente o

bioprocesso através da indução do crescimento e do aumento da velocidade do metabolismo

(PIZZUL et al. 2007, GRABOWSKI; BLANCHET e JEANTHON, 2005, ORTEGA-

CALVO et al. 2003, GARLAND e MILLS, 1991).

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133

A Tabela 5.12 apresenta a taxa de biodegradação diária dos HPA, calculada em

função da diferença da concentração desses compostos ao longo do tempo.

Tabela 5.12 – Taxa de redução diária dos HPA (mg/kg x dia-1) (p<0,05)

Concentração de glicerol PA (mg/kg)

Tempo (dias) 0,00 0,16 0,32 0,63

30 0,05±0,01 0,10±0,01 0,18±0,10 0,15±0,11

60 0,04±0,01 0,02±0,01 0,04±0,11 0,03±0,10

Baseado nas análises das concentrações dos HPA nas amostras coletadas nos

intervalos de 0, 30 e 60 dias, verificou-se que as maiores taxas de biodegradação nos sistemas

adicionados com glicerol, ocorreram na primeira metade do bioprocesso, coincidindo com o

período, no qual a maior densidade microbiana foi determinada. Em função do esgotamento

do cossubstrato, a taxa de degradação registrou uma diminuição significativa, revelando a

contribuição do glicerol no processo e concordando com resultados obtidos por Baboshin,

Finklstein e Golovleva (2003).

Em um estudo sobre o efeito de diversas fontes de carbono no desenvolvimento da

microbiota do solo, Duquenne et al. (1999) observaram que o glicerol foi capaz de estimular

o crescimento em uma concentração de 0,07% e após 24 h, mais de 80% do composto havia

se difundido no solo, trazendo vantagens para as células próximas das regiões de difusão. É

possível que com o esgotamento do glicerol, outras moléculas possam ter sido utilizadas

como cossubstratos, por exemplo, HPA-BMM e as frações leves do óleo, justificando a

diminuição significativa da taxa de redução diária dos HPA, entretanto não marcando o final

do bioprocesso, como pôde ser verificado no reator sem glicerol.

A Figura 5.14 apresenta as temperaturas e a umidade relativa do ar durante os

experimentos.

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15

20

25

30

1 15 30 45 60

Tempo (dias)

Tem

pera

tura

(°C

)

30

45

60

75

90

Um

idade Relativa do A

r (g/m3)

Ambiente Solo Umidade relativa do ar

Figura 5.14 – Variação da temperatura média do ambiente e do solo

e da umidade relativa do ar durante o experimento

Foram observadas médias nas temperaturas do ambiente e do solo de 24,1±0,5 °C e

26,0±0,4 °C (p<0,05), respectivamente, bem como uma média de 62,0±2,1 g/m3 (p<0,05) da

umidade relativa do ar. Explica-se a pequena diferença entre as temperaturas pelo fato dos

experimentos terem sidos conduzidos em um ambiente coberto e confinado. Entretanto, o

processo de degradação não foi dificultado, em função da atividade de micro-organismos

mesófilos.

O pH do solo registrou a média de 7,6±0,1 (p<0,05), semelhante ao valor obtido nos

testes que utilizaram ferramentas de planejamento de experimentos, 7,4±0,1 (p<0,05),

ressaltando que o pH estava dentro da faixa considerada ótima para a biorremediação.

A umidade do solo continuou mantida dentro da faixa entre 70 e 80% da capacidade

de retenção de água, correspondendo valores entre 15,0 e 17,2±0,3% (p<0,05). O valor médio

da umidade observada nos experimentos foi de 17,0±0,2% (p<0,05). Como na fase anterior, a

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135

faixa entre 15 e 20%, considerada ideal na biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo, foi

mantida.

O papel da umidade foi muito importante para a biodegradação dos HPA. A adição de

água estimula a microbiota e amplia a interface sólido/líquido, aumentando a difusão de

oxigênio e a razão de transferência de massa. Além disso, a água compete pelo mesmo sítio

de adsorção dos HPA no solo, permitindo um incremento no grau de remoção dos HPA

(BENGTSSON e ZERHOUNI, 2003).

5. 7. 1 Testes de fitotoxicidade nos solos biorremediados

O tratamento microbiológico sequencial promoveu uma redução significativa do

efeito fitotóxico nas espécies testadas, Cucumis anguria, Allium porrum e Cucumis melo. A

Tabela 5.13 apresenta os resultados do teste da Germinação Relativa das Sementes (GRS).

Tabela 5.13 – Germinação Relativa das Sementes após biorremediação (p<0,05)

Plantas

Solo

tratado na

UDT

Solo biorremediado

Concentração de glicerol PA (mg/kg)

0,16 0,32 0,63

Allium porrum 72,2±7,9% 71,1±7,8% 76,0±8,4% 70,7±7,8%

Cucumis anguria 75,9±8,3% 70,9±7,8% 65,7±7,2% 82,5±9,1%

Cucumis melo 107,7±11,8% 108,8±12,0% 105,8±1,2% 103,0±11,3% UDT – Unidade de Dessorção Térmica

O teste da GRS revelou um perfil similar ao obtido com o solo tratado na UDT. Tal

fato pode ser justificado pelas baixas concentrações dos HPA presentes no solo. Chouychai et

al. (2007) verificaram que baixos teores de HPA não constituem um limitante externo sobre o

processo da germinação, logo, a concentração residual dos HPA remanescentes ao tratamento

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136

térmico proporcionou o estabelecimento de um meio, no qual, independentemente da

manutenção ou redução da concentração dos HPA, a germinação das sementes não foi

alterada.

Os resultados do teste da Elongação Relativa das Raízes (ERR) estão apresentados na

Tabela 5.14.

Tabela 5.14 – Elongação Relativa das Raízes após biorremediação (p<0,05)

Plantas

Solo

tratado na

UDT

Solo biorremediado

Concentração de glicerol PA (mg/kg)

0,16 0,32 0,63

Allium porrum 56,2±5,7% 60,3±6,6% 168,5±18,5% 148,2±16,3%

Cucumis anguria 66,3±7,3% 74,6±8,2% 128,0±14,0% 84,0±9,2%

Cucumis melo 68,2±7,5% 69,4±7,6% 126,8±13,9% 86,7±9,5% UDT – Unidade de Dessorção Térmica

Houve um aumento significativo da ERR após o emprego da biorremediação nos

solos tratados na UDT. O teste confirmou que a elongação da raiz pôde seguramente ser

utilizada como indicador do efeito fitotóxico dos HPA. O aumento da ERR coincidiu com a

redução da concentração desses compostos. Os índices elevados do ERR após tratamentos

microbiológicos são bastante divulgados na literatura e confirmam a sensibilidade do teste

como um indicativo da redução dos hidrocarbonetos no solo (JUHASZ et al. 2010, HAMDI

et al. 2007, DORN e SALANITRO, 2000, DORN et al. 1998).

De acordo com Heitkamp, Franklin e Cerniglia (1988), os metabólitos da oxidação

dos HPA podem ter características químicas e toxicológicas únicas, implicando na

necessidade de critérios seguros serem escolhidos para o diagnóstico de toxicidade desses

contaminantes. Neste contexto, o cálculo do Índice de Germinação (IG), por combinar dados

sobre a germinação das sementes com a elongação da raiz, serve como um parâmetro

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137

decisivo. Segundo Paradelo et al. (2008), baseados no valor do IG, a fitotoxicidade de um

composto pode ser classificada em três tipos: alta (IG < 50%), moderada (IG = 50-80%) e

nenhuma (IG > 80%).

A Tabela 5.15 apresenta os valores de IG nas condições testadas e os compara com as

amostras de solo contaminado e tratado pela UDT.

Tabela 5.15 - Índice de Germinação das sementes nas amostras de solo (p<0,05)

Plantas

Dessorção térmica Solo biorremediado

Concentração de glicerol PA (mg/kg)

Antes

Depois 0,16 0,32 0,63

Allium porrum 16,7±18,3 40,6±4,5 42,9±4,7 128,0±14,0 104,8±11,5

Cucumis anguria 0,2±0,1 50,3±5,5 52,9±5,8 84,1±9,3 69,3±7,6

Cucumis melo 47,2±5,2 73,5±8,1 75,5±8,3 134,2±14,7 89,3±9,8 Classificação da fitoxicidade: (■) alta, (■) moderada e (■) nenhuma.

Uma observação da Tabela 5.15 fica evidente a necessidade de um tratamento

sequencial, após a operação de dessorção térmica. Apesar do aumento significativo do IG nas

plantas testadas depois do tratamento térmico, a fitotoxicidade dos compostos residuais ainda

se encontrava, de moderada (C. anguria e C. melo) à alta (A. porrum). Na melhor condição

de tratamento microbiológico sequencial, 0,32 mg/kg de glicerol PA, foi observada a

eliminação do efeito fitotóxico. Em alguns casos, o IG alcançou valores acima de 100%,

indicativo da presença de nutrientes no extrato do solo (PARADELO et al. 2008).

Por outro lado, na menor concentração de substrato testada, 0,16 mg/kg, observou-se

um resultado similar ao verificado na amostra de solo tratado por dessorção térmica. Este

resultado provavelmente está relacionado à baixa concentração do cossubstrato, o qual não

produzindo efeito significativo sobre a microbiota e consequentemente, sobre a degradação

dos HPA, manteve as condições similares às estabelecidas após o tratamento do solo na UDT.

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138

No outro extremo, com a concentração de glicerol em 0,63 mg/kg, apenas C. anguria

apresentou IG menor que 80%. C. anguria foi o vegetal mais sensível nos testes, sendo assim,

o melhor bioindicador neste trabalho.

A concentração de 0,63 mg/kg de glicerol pode ter contribuído para a toxicidade

moderada, verificada no teste com C. anguria. Esta hipótese pode ser sustentada nos

resultados obtidos por Maila e Cloete (2002). Os autores observaram um efeito negativo na

redução do teor dos HPA-BMM durante o tratamento de solos contaminados por HPA

quando 0,60 mg/kg de agentes emulsificantes foram adicionados. Tal resultado foi atribuído

ao fato do emulsificante ter bloqueado a absorção de luz pelo HPA, impedindo as reações de

foto-oxidação. Esta afirmação complementa os achados de Henner et al. (1999), que ao

estudarem o efeito fitotóxico relacionado à massa molecular dos HPA, concluíram que a

toxicidade pode ser aumentada quando os compostos com até três anéis não são removidos.

Por serem mais voláteis, essas moléculas podem contribuir para o aumento da inibição da

germinação e do crescimento das plantas, diferente dos HPA-AMM, compostos menos

voláteis. É importante destacar que o fenantreno e o antraceno, HPA de três anéis,

apresentaram baixos percentuais de biodegradação neste estudo, entre 20,1 e 50,0±0,1%.

5. 8 Biorremediação utilizando glicerol bruto

Uma das rotas para obtenção de glicerol é a fabricação de biodiesel. No processo em

escala industrial, esse composto é produzido em grande quantidade e considerando a situação

do mercado mundial, bem como a presença de íons potássio, sódio e cloreto, o material tem

sido tratado como resíduo. No entanto, o emprego do composto em diversos processos

industriais vem aumentando ao longo dos anos (DA SILVA; MACK; CONTIERO, 2009).

Dessa forma, buscou-se uma rota biotecnológica para o reuso desse resíduo com o intuito de

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139

agregar valor ao glicerol bruto, realizando testes para estudar a possível substituição do

glicerol PA, na biorremediação de solo contaminado com HPA.

Os percentuais de biodegradação dos HPA com uso de glicerol bruto e com uso de

glicerol PA estão apresentados na Figura 5.15.

Figura 5.15 – Biodegradação dos HPA em presença de glicerol de diferentes origens

durante 60 dias de processo (concentração inicial de HPA = 8,43 mg/kg)

A adição de 0,16, 0,32 e 0,63 mg/kg de glicerol bruto facilitou a remoção dos HPA

em 59,4±0,1, 68,0±0,1% e 63,9±0,1%, respectivamente (p<0,05). Observou-se um perfil de

degradação dos HPA semelhante ao obtido com o glicerol PA.

Ao longo de 60 dias, o pH do solo foi de 7,4±0,1 (p<0,05), enquanto a umidade do

solo foi mantida em uma média de 17,0±0,1% (p<0,05).

A quantificação das populações microbianas está apresentada nas Figuras 5.16 e 5.17.

55

60

65

70

75

0,16 0,32 0,63

Biod

egra

daçã

o (%

)

Glicerol PA Glicerol Bruto

Cossubstrato (mg/kg)

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140

Figura 5.16 – Bactérias Heterotróficas Aeróbias no solo

Figura 5.17 – Fungos Filamentosos no solo

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

0 7 15 30 60

UFC

/g

Tempo (dias)GL 0,32 mg/kg GB 0,32 mg/kg 0,00 mg/kg GL 0,16 mg/kg GB 0,16 mg/kg

Glicerol PA (GL) e Glicerol bruto (GB)

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

0 7 15 30 60

UFC

/g

Tempo (dias)GL 0,32 mg/kg GB 0,32 mg/kg 0,00 mg/kg GL 0,16 mg/kg GB 0,16 mg/kg

Glicerol PA (GL) e Glicerol bruto (GB)

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141

A presença de glicerol bruto estimulou a microbiota, cujo desenvolvimento apresentou

um perfil semelhante ao observado quando da utilização do glicerol PA, isto é, um maior

incremento da população nos primeiros sete dias do experimento, o desenvolvimento celular

em função da concentração do cossubstrato e o reestabelecimento da população aos valores,

em média, obtidos no solo sem tratamento sequencial, 60 dias para as BHA e 30 dias para FF.

O uso de glicerol bruto impediu que a densidade celular atingisse os valores obtidos com

glicerol PA, ao longo de 30 dias de experimento, mantendo-se cerca de até 10 vezes inferior e

sendo mais perceptível nas BHA.

De acordo com Bajpai e Tyagi (2006), a inibição de crescimento, mesmo que de

forma sutil, ocorre em função das impurezas do glicerol bruto. Em um recente estudo, o sódio

foi identificado como o principal responsável do efeito negativo sobre a taxa de crescimento

da biomassa durante a produção de bioplásticos (CAVALHEIRO et al. 2009).

Em certos casos, a inibição por sódio pode ser maior do que a promovida pelo

potássio, metal utilizado como catalisador da reação de transesterificação, na qual o glicerol

bruto deste estudo foi obtido. As concentrações de sódio e potássio determinadas neste

composto foram de 0,94 e 50,7 mg/g, respectivamente, dessa forma, foi atribuído ao potássio,

a possível causa da redução do crescimento microbiano, cuja concentração encontrava-se 54

vezes superior ao sódio. É importante ressaltar que, apesar da inibição da microbiota pelas

impurezas do glicerol bruto, não houve alterações significativas sobre o percentual de

biodegradação dos HPA, justificado pelo pequeno volume de cossubstrato adicionado aos

reatores.

A utilização do glicerol bruto também contribuiu para a redução da fitotoxicidade

após o tratamento microbiológico sequencial. A Tabela 5.16 apresenta o IG obtido com as

plantas testadas.

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Tabela 5.16 - Índice de Germinação das sementes nas amostras de solo (p<0,05)

Plantas Dessorção térmica Solo biorremediado

Antes Depois Glicerol PA* Glicerol bruto*

Allium porrum 16,7±18,3 40,6±4,5 128,0±14,0 121,9±13,4

Cucumis anguria 0,2±0,1 50,3±5,5 84,1±9,3 85,1±9,4

Cucumis melo 47,2±5,2 73,5±8,1 134,2±14,7 101,9±11,2 Classificação da fitoxicidade: (■) alta, (■) moderada e (■) nenhuma.

* Concentração = 0,32 mg/kg

Observando a Tabela 5.16 é possível perceber similaridades do tratamento com a

adição de glicerol PA como cossubstrato, isto é, a adição de 0,32 mg/kg de glicerol bruto,

seguida da biodegradação dos HPA residuais, resultou na eliminação do efeito fitotóxico.

Vale ressaltar que apesar do alto teor de potássio e de outras impurezas no glicerol bruto,

foram obtidos valores do IG acima de 100% em duas das três plantas testadas, A. porrum e C.

melo.

A utilização do glicerol bruto como cossubstrato garantiu uma estratégia eficiente

para a remoção dos HPA, bem como da redução dos efeitos tóxicos do solo sobre os vegetais

estudados. A atribuição de funcionalidade para o glicerol bruto reflete na questão de

valorização do produto e contribui positivamente para o equacionamento de uma importante

problemática contemporânea, relacionada ao reuso de resíduos de novos processos

industriais.

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143

CAPÍTULO 6

CONCLUSÕES

A partir dos resultados verificados nas condições experimentais estabelecidas por este

estudo, foram obtidas as seguintes conclusões:

O contaminante do solo, resíduo oleoso de fundo da câmara de vácuo, aliado ao longo

histórico de contaminação provocaram a inibição da microbiota autóctone e desta

forma, dificultaram o processo natural de remoção do poluente, legitimando a escolha

da dessorção térmica como estratégia para a remediação do solo contaminado.

Apenas do ponto de vista físico-químico, a dessorção térmica foi um tratamento

eficiente. Além disso, não foram detetadas dioxinas e furanos nas amostras de solo

tratado na Unidade de Dessorção Térmica (UDT), indicativo da eficácia do sistema

de tratamento de efluentes gasosos da unidade.

A remoção do resíduo oleoso de fundo da câmara de vácuo no solo revelou a

propriedade bacteriostática e fungistática do contaminante. A comparação da

quantificação de bactérias heterotróficas aeróbias e dos fungos filamentos no solo

impactado e no solo tratado na UDT apontou diferenças significativas na

concentração celular nos grupos microbianos estudados.

Embora observada no solo uma redução significativa dos teores do contaminante,

após o tratamento na UDT, o solo apresentou concentrações residuais de

Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA), as quais promoveram um efeito

fitotóxico de moderado a alto, sobre Cucumis anguria, Cucumis melo e Allium

porrum, revelando que do ponto de vista biológico, o solo não estava tratado.

Cucumis anguria foi o melhor bioindicador entre as espécies vegetais testadas.

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144

A verificação do efeito fitotóxico dos compostos residuais, presentes em baixas

concentrações no solo tratado pela UDT, indicam a necessidade da investigação de

padrões biológicos durante avaliação da qualidade de solos remediados por dessorção

térmica. Os resultados do teste de fitotoxicidade ressaltam esta carência e propõem

um debate para a inclusão de tal parâmetro em futuras legislações.

O tratamento microbiológico sequencial por bioestímulo foi eficiente e a melhor

estratégia de remoção biológica dos HPA residuais foi obtida com a adição de 0,32

mg/kg de glicerol PA.

Resultados similares foram obtidos com a adição de 0,32 mg/kg de glicerol bruto.

Neste contexto, o reuso desse resíduo da indústria do biodiesel agrega valor ao

composto e torna o processo economicamente viável. A não remoção das impurezas

originadas durante o processo de transesterificação, em razão do pouco volume

demandado do cossubstrato, evidencia tal afirmação. Além disso, futuros impactos ao

solo em função do acúmulo de potássio proveniente do catalisador, podem ser

evitados ao empregar-se glicerol produzido em operações ditas ecologicamente

corretas da fabricação do biodiesel.

Observou-se uma biodegradação preferencial pelos HPA de alta massa molecular

quando utilizados ambos os cossubstratos, glicerol PA e glicerol bruto.

O bioaumento não surtiu efeito significativo na biodegradação de HPA residuais.

Após o tratamento microbiológico secundário o efeito fitotóxico dos extratos do solo

sob Cucumis anguria, Cucumis melo e Allium porrum foi eliminado.

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Tratamento Microbiológico Sequencial de solo... Vasconcelos, U. (nome para citação)

180

ANEXO A – Produção bibliográfica

Trabalho publicado

VASCONCELOS, U.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Evaluación de la eficacia del

tratamiento por deserción térmica de un suelo contaminado con residuos aceitosos. Revista

Ingineria Sanitaria y Ambiental. Buenos Aires. v. julio-agosto, n. 110, p. 59-63, 2010.

Trabalho aceito para publicação

VASCONCELOS, U.; DE FRANÇA, F. P.; OLIVEIRA, F. J. S. Removal of high-molecular

weight polycyclic aromatic hydrocarbons. Química Nova. São Paulo. In Press, 2011.

Trabalhos completos em eventos

VASCONCELOS, U.; OLIVEIRA, F. J. S.; DE FRANÇA, F. P. Potencialidade do glicerol na

biorremediação de fluoreno e benzo[a]pireno presentes em solo pré-tratado por dessorção

térmica. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA QUÍMICA, 18., 2010, Foz do

Iguaçu. Anais... São Carlos: Cubo Multimidia, p. 9277-9285, 2010.

VASCONCELOS, U.; DA SILVA, L. J.; DE FRANÇA, F. P. Obtenção de linhagens de

microorganismos hidrocarbonoclásticos. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE

ENGENHARIA QUÍMICA, 17., 2008, Recife. Anais… Recife : ABEQ, 2008.

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EvaluacióndeIaeficaciadeItratamientopordesorcióntérmicadeun sueIocontaminadoconresiduosaceitosos

Ulrich Vasconcelos, Fernando J. S. Oliveira y Francisca P.de França

RESUMEN

Se investigó Ia eficiencia deI proceso de tratamiento de suelos

contaminados con residuos aceitosos, por desorción térmica, a

través de ensayos ffsico-químicos y de pruebas de ecotoxicidad.

La operación de tratamiento térmico, a escala industrial, remo-

vió 98% de los Hidrocarburos Totales de Petróleo (HTP)y e197%deI total de Ias concentraciones de los 16 Hidrocarburos Policí-

clicos Aromáticos (HPA),prioritarios listados por Ia EPA.Las pro-

piedades importantes deI suelo como textura, pH y capacidad de

retención de agua sufrieron alteraciones significativas con elpro-

ceso de tratamiento. Se seleccionó Cucumis anguria, entre tres

vegetales sometidos a prueba, como Ia especie más sensible a Ia

presencia de los contaminantes, debido a que presentó germina-ción relativa nula en Ias muestras deI suelo contaminado. EItra-

tamiento térmico hizo aumentar en 41 :t 1% el fndice de Germi-

naciónRelativo(lGR)y en60:t 1%eldeElongamientoRelativodeIas Raíces (ERR),de Ias semillas de C. anguria.

Palabras clave

Tratamiento desuelos,desorcióntérmica,residuosaceitosos,fitotoxicidad

AIDls ARGENTINA . Ingenlerfa Sanitariay Amblental . N°110

INTRODUCCIÓN

Los residuos aceitosos generados en operaciones indus-triales son peligrosos y su gestión correcta representa undesafío para Ia industria. Estos residuos comprenden unamezcla de sustancias hidrófobas, recalcitrantes en distintos

grados y,a veces, carcinogénicas. EItratamiento y Ia dispo-sición final incorrectos de estos materiales pueden ocasio-nar impactos adversos importantes, principalmente a sue-los y cuerpos hídricos diversos (Das y Mukherjee, 2007).Una de Ias técnicas para el tratamiento de residuos aceito-sos es Ia disposición o incorporación en suelos para propi-ciar una degradación natural controlada. Sin embargo, enmuchos casos, Ia ejecución de esa técnica es equivocada oinsegura causando danos ai ambiente. En algunos casos, Iaacción dei tiempo puede potenciar impactos negativos enel acceso de Ia micro biota nativa dei suelo y en Ia biodis-ponibilidad de ciertas moléculas (Sempie et aI.,2007). EItra-tamiento de suelo contaminado con aceites tiene como

objetivo Ia reducción dei volumen dei contaminante y Iadesintoxicación. Considerando que en algunos casos elbiotratamiento no puede ser eficiente, los tratamientos tér-micos vienen a ser Ias técnicas más utilizadas y disponiblescomercialmente para Ia remoción de contaminantes ensuelos impactados por aceites. En función de Ia temperatu-ra utilizada, los tratamientos térmicos se clasifican en dos

tipos: (1) técnicas de desorción, operando en un rango detemperatura entre 100 - 500°C, Ias cuales promueven el

secado dei suelo y Ia separación física por transferencia demasa hacia Ia fase gaseosa; y (2) técnicas de destrucción,operando a temperaturas mayores de 500°C, promovien-do el grado elevado de modificación química de los conta-minantes (Merino y Bucalá,2006).La desorción térmica es un proceso de remoción de molé-culas, basado en el fenómeno de volatilización de los cons-

tituyentes adheridos a Ia superficie, contenidas en los mi-croporos y mesoporos de los sólidos, a través de Ia aplica-ción de energía térmica. EItratamiento de suelos contami-nados utilizando el proceso de desorción térmica es consi-derado una de Ias técnicas de remediación mas popularesy versátiles, entre Ias existentes, debido ai amplio espectrode contaminantes orgánicos y algunos metales que pue-den ser convertidos a sus formas volátiles (Dazyet aI.,2009).Dentro dei horno de desorción, el proceso ocurre en tresetapas: (1) liberación de compuestos orgánicos volátiles yagua; (2) liberación lenta dei aceite con el aumento gradualde Ia temperatura y, (3) pérdida de masa representada porIa pérdida de agua, hidrocarburos, humus, metales y algu-

Tratamlentodesuelos I 59

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nos minerales como carbonatos (Lee et ai., 1998). Luego deitratamiento de suelos por desorción, en general, dichosmateriales son reubicados en su lugar de origen, dado queya poseen concentración reducida de los contaminantesaceitosos.

Las oscilaciones intrínsecas aios procedimientos en escalaindustrial, el tipo de suelo, grado y antigüedad de Ia conta-minación pueden figurar, entre otros factores, como Ias cau-sas directas de Ia presencia de compuestos remanentes,influenciando Ia eficiencia de remoción de los contami-

nantes. Considerando Ias parUculas finas de suelos y elgradiente de temperatura, pueden ocurrir algunas reaccio-nes químicas de forma marginal y eso, también, puede in-fluenciar Ia eficacia de Ia reducción de Ia toxicidad. Estos

factores resaltan Ia necesidad de estudios para verificar Iacapacidad de remoción de los compuestos de petróleo asícomo Ia reducción de Ia toxicidad de los suelos tratados

por desorción térmica.EIobjetivo de este trabajo fue el de evaluar Ia eficacia deitratamiento térmico de suelos contaminados con residuos

aceitosos en relación a Ia remoción de los contaminantes yIa fitotoxicidad de los suelos.

MATERIALESY MttODOS

Unidad de Desorción Térmica (UDT)

La UDTautomatizada industrial estaba compuesta de cua-tro sistemas: preparación y adición de suelos contamina-dos, desorción de los compuestos orgánicos, tratamientode los efluentes gaseosos y, control e intertrabamiento deIa planta. EIequipo con lIama directa alimentada por GLp,tenía un volumen de trabajo de 200 m3/d, en un rango detemperatura de 300 - 350 °CYcon un tiempo de residenciade Ia mezcla de 12 minutos.

Suelos y ensayos físico-quimicos de Ias muestrasSe tomaron muestras de suelo preparado para su entradaai horno de Ia UDTy también de suelo considerado comotratado. EIsuelo a ser tratado estaba altamente impactadocon residuo de fondo de columna de destilación ai vado

en un evento que ocurrió hace más de 50 aflos. Cada unade Ias muestras contenía 50 kg de suelo y fueron recolecta-das con Ia ayuda de palas, acondicionadas en bólsas plás-ticas, selladas y transportadas para ellaboratorio bajo refri-geración. Una vez que Ias muestras fueron homogeneiza-das en el laboratorio, se usaron parte de Ias mismas, acon-dicionadas en recipientes de vidrio para realizar análisisfísico-químicos. La caracterización de Ias muestras de suelocomprendió análisis físico-químicos determinados a tra-vés de ensayos, aplicando metodologías estándar de IaAgencia de Protecdon Ambiental de los Estados Unidos(EPA),de Ia Asociación Brasileflade RegiasTécnicas (ABNT)yde Ia Empresa Brasilefla de Investigadon Agroganadera(EMBRAPA),Ias cuales se encuentran listadas en Ia secciónde referencias. Para determinación de Ias concentracionesde HPAen Ias muestras suelos, alicuotas fueron extraídas

60 I Tratamlento de suelos

en Soxhlet y Ia purificadon de los extractos fue hecha usan-do columna de silica gel, como descrito en Ias metodolo-gías EPA3540 YEPA 3630, respectivamente.

Ensayo de fitotoxicidadEIprimer objetivo de Ias pruebas de fitotoxicidad fue el deidentificar una especie muy sensible a Ia presencia de loscontaminantes de los suelos. Para esto, se utilizaron espe-cies de los vegetales Allium porrum, Cucum;sangur;a, Cucu-m;s sat;vus e Cucum;smeio, Ias cuales fueron cultivadas enestratos obtenidos a partir dei suelo contaminado, tal comofue descrito por Tiquia et ai., (1996).Se cuantificaron ellndi-

ce de Germinación Relativo (lGR)de Ias semillas y el deElongamiento Relativo de Ias Raíces (ERR).A partir de Iaselección de Ias especies más sensibles ai contaminante, serealizaron pruebas de fitotoxicidad utilizando estratos desuelo tratado, con el objetivo de verificar Ia eficacia deitratamiento térmico en cuanto a Ia desintoxicación. Todas

Ias pruebas fueron ejecutadas por triplicado, con el uso dediez semillas de cada especie y con tiempo de incubación de5 días a 22 :t 1 De.Los resultados de IGRy de ERRtoman enconsideración ensayos en blanco usando agua destilada.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La caracterización físico-química de Ias muestras de sueloantes y después dei tratamiento térmico se presenta en IaTabla 1. Lacomposición granulométrica reveló que el estu-dio fue realizado con suelo con contenido elevado de ma-

terial fino, tratándose de sueios intemperizados. Las partí-culas finas de los suelos poseen áreas superficiales eleva-das y cargas parciales que favorecen los procesos de ad-sorción de los contaminantes y Ia formación de agregadosque dificultan Ia acción de Ia mayoría de los agentes deremediación de suelos.

Se verificó que Ia acción dei calor en el suelo promovió elaumento de, aproximadamente, 20% en el contenido delimo y de 60% en el contenido de arcilla con Ia conse-

cuente reducción dei porcentaje de partículas más grue-sas. De hecho, Ia presencia de aceites en los suelos favore-ce fenómenos de aumento de finos con generación deagregados estables y con diámetros mayores, dificultan-do Ia biodegradación de los compuestos adsorbidos (Ara-runa Jr.et ai.,2004).

La capacidad de retención de agua dei suelo tambiénsufrió alteraciones significativas debido ai procesamien-to térmico. La acción dei calor promovió una reducciónmedia dei 29% en ese parámetro, probablemente, relacio-nada con variaciones en Ia micro estructura dei suelo, des-trucción de parte de Ia materia orgánica y de Ia conver-sión dei suelo hacia partículas sin cohesión. Estos resulta-

dos corroboran aios presentados por Abu-Zreig et ai.,(2001)que estudiaron el comportamiento de suelos bajoIa influencia de diferentes temperaturas utilizadas en eltratamiento de suei os por desorción térmica.Nótese que Ia acción dei calor promovió Ia reducción en

AIDISARGENTINA. Ingenierfa Sanitarla y Ambiental . N°110

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Tabla 1. Caracteristicas fisico-quimicas delsuelo (1995),quienes reportan Ia eli-minación total de TPH y HPAde suei os que pasaron pordesorción térmica, probable-mente debido a Ias diferen-

cias de textura y composiciónquímica de los suelos y en losequipos utilizados. Por otraparte, Remmler y Kopinke(1995) observaron Ia vaporiza-ción completa de todos losHPAde hasta cuatro anillos en

el suelo, luego dei tratamien-to mediante desorción térmi-

ca. Sinembargo, por encima de270°C, diversas reaccionespueden promover el aumen-to de Ias cadenas o Ia forma-

ción de isómeros de HPA,tan-

to de baja como de alta masamolecular (Pope et aI., 2000).Estos hechos resaltan Ia nece-

sidad de estudios especificospara el tratamiento adecuadode suelos impactados y expli-

can Ia presencia de compuestos orgánicos residuales en elsuelo estudiado.

La presencia de compuestos remanentes en el suelo yotras modificaciones de algunas de sus propiedades im-pulsaron Ia realización de estudios de fitotoxicidad con eluso de especies sensibles aios contaminantes. Se escogióIa prueba de ecotoxicidad con uso de plantas basado enIa premisa de que Ias plantas constituyen una de Ias rutasde Ia remoción de hidrocarburos de los suelos. Estos com-

puestos orgánicos pueden ser, aún, bioacumulados y bio-magnificados y, por eso, algunas especies son bastantesensibles a Ia presencia de esos compuestos (Juhasz et aI.,2010). La sensibilidad aios contaminantes de algunas es-pecies de vegetales puede ser expresada de varias formas,destacándose el porcentaje de germinación de Ias semi-lias y el elongamiento de Ias raíces.Los resultados de Ias pruebas ecotoxicológicas para Iaselección de especies vegetales sensibles aios contami-nantes demostraron los efectos adversos de estos mate-

riales sobre Ias tres especies estudiadas, Figura 1. Quedaverificado que Ia presencia dei contaminante hace reducirtanto el IGRde Ias semillas como el ERR,siendo, de esta

forma, C.anguria Ia especie más sensible ai contaminante,pues el IGRde Ias semillas fue prácticamente nulo, moti-vando Ia selección de ese vegetal como indicador para elanálisis dei grado de desintoxicación dei suelo.EItratamiento térmico dei suelo promovió Ia reducción delos efectos fitotóxicos sobre todos Ias especies vegetalessometidas a prueba, Figura 2. Comparando Ias Figuras 1 y 2,se destaca, sin embargo, que hubo aun aumento significa-tivo dellGR de Iassemillas de C.anguria, 41 :t 1% (p<0,05), y

*COT = Carbono Orgánico Total, "*CRA = Capacidad de retención de agua

Ias concentraciones de N y P.de 7% e 15%,respectivamen-te. Esto indica que el N y el P contenidos en los suelosestaban probablemente asociados a Ias matrices inorgá-nicas, dado que el contaminante, residuo de vacío, eramuy pobre en compuestos nitrogenados y/o fosforados.La reducción de Ia concentración de carbono orgánico ymantenimiento de tenores de nitrógeno y fósforo impli-caron un aumento de Ia relación C:N:Pde los suelos trata-

dos en Ia UDT.Se observó también, un aumento dei pH deIas muestras dei suelo tratado y eso puede estar relacio-nado con el consumo de compuestos ácidos presentesen el contaminante y a Ia propia incorporación de ceni-zas, originadas en Ia quema de los gases.EIproceso térmico promovió Ia remoción de cerca dei 70%dei carbono orgánico dei suelo con Ia reducción significa-tiva de losTPH,98% Yde los HPA,97%.Cabe destacar que, elmétodo utilizado para Ia cuantificación de los TPH usa Iacombustión de los compuestos extraídos en presencia delIama y cromatografía gaseosa; y, que los resultados fue-ron expresados considerando tanto 'Ia fracción resueltadei cromatograma (hidrocarburos lineales) como Ia mezclacompleja no resuelta (hidrocarburos y otros compuestosorgánicos apoiares extraíbles con diclorometano) y, sien-do así, es un buen indicador para materiales orgánicos.Entonces, el proceso a escala industrial de desorción térmi-ca cumplió el objetivo de reducir el contenido de hidrocar-buros de petróleo en el suelo impactado, permaneciendo

compuestos orgánicos pesados que no fueron extraídosde Ias matrices o identificados por los métodos analíticosutilizados. Cabe destacar que estos resultados no corrobo-ran a Robinson et aI., (2008);Leeet aI.,(1998)y George et aI.,

AIDIS ARGENTINA . Ingenierlll Sllnltarlll y Amblentlll . N° 110 Tratamientodesuelos I 61

ResultadoParámetro Suelo Suelo Referenda

contaminado tratado

Granulometría ABNT (1984)

Arcilla (%) 3:t2 9:t5

Silte (%) 27 :t 1 33 :t 1

Arena fina (%) 29 :t 2 22 :t 2

Arena media (%) 22:t 1 19:tl

Arena gruesa (%) 15:t4 12:t4

Grava (%) 4:t3 5:t5

COT*(mg/kg) 75.500:t 1000 23.000:!: 1000 EPA9060

Nitrógeno Total (mg/kg) 1.591 :t 110 1.397 :t 130 EPA351.2

Fósforo Total (mg/kg) 914:t 10 777 :t 11 EPA351.3

16 HPA(mg/kg) 193,4:t 1,13 8,43 :t 0,59 EPA8270C

TPH (mg/kg) 58.047:t 1000 699 :t 50 EPA8015B

pH (en HP) 5,9 :t 0,1 7,8:t0,1 EMBRAPA(1979)

Humedad (%) 12,7:t 0,1 10,0 :!:0,1 EMBRAPA(1979)

CRA**(%) 30,2:t0,1 21,4:!:0,1 Watwood etal., (1991)

C:N:P 100:2:1 100:6:3 EPA9060, 351.2 Y351.3

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-----

60

I~ I"- I::! 40 I... Ioi.!2

20

.-

A.porrvm C arrgllria C wwlo

Vegetal

Figura 1. Pruebas de fitotoxicidad de 10suelo contamina-do con residuos aceitosos. (O)Indice de Germinación Rela-tivo de Ias semillas (lGR).([::oIndice de Elongamiento Rela-tivo de Ias Ralces (ERR).

80 r -----.--.--.

Figura 2. Pruebas de fitotoxicidad de 10suei o tratadopor desorción térmica. (O) Indice de Germinación Rela-tivo de Ias semlllas (lGR). (O)Indice de Elongamiento Re-lativo de Ias Ralces (ERR).

promoción dei ERR,60 :t 1% (p<O,OS),indicadores muy po-sitivos dei tratamiento. De esta manera, queda claro queIa disminución dei efecto inhibidor sobre C.anguria coin-cidió con Ia reducción significativa de Ia concentración delos contaminantes dei suelo.

EIestudio comprobó, por 10tanto, que Ia evaluación deigrado de eficiencia de Ia operación de desorción térmicarealizada depende de Ia manera como se ab<?rda Ia eva-luación, bien mediante el uso de ensayos físico-quimicoso mediante el uso de ensayos biológicos. Además, esteestudio contribuyó a apoyar Ia prueba de fitotoxicidadcomo una pe Ias formas más simples y rápidas dei diag-nóstico de Ia recuperación dei funcionamiento naturaldei suelo, luego dei tratamiento. EIconjunto de los resul-tados indica Ia necesidad de estudio de alternativas parael tratamiento secuencial de los suelos con el objetivo demejorar su calidad.

CONCLUSIONES

La desorción térmica puede remover 98% dei conteni-

62 I Tratamlentodesuelos

do de TPH dei suelo y 97% de Ia suma de Ias masas delos 16 HPA prioritarios, listados por Ia EPA.A pesar deque este resultado sea significativo, el suelo tratadopropició el incremento dei 41 % de Ias semillas de C.anguria. De esa manera, es evidente Ia necesidad de tra-tamiento secuencial de los suelos para su rehabilita-ción y que el análisis de Ia eficiencia de operaciones detratamiento de suei os impactados necesita de una eva-luación cuyo enfoque considere tanto pruebas fisico-químicas como biológicas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Petróleo Brasilelio S.A. (PETRO-BRAS),Coordinación ai Personal de Nivel Superior (CAPES),Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico(CNPq) y a Ia Fundación de Apoyo a Pesquisa dei Estadode Riode Janeiro (FAPERJ).]

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Sobre Ias autores:

Ulrich Vasconcelos es Magister en Ciendas, egresado de Ia Uni-

versidad Federal de Pernambueo, Brasil.Alumno de Ia Carrera de

Doetorado en Teenologia de Proeesos Quimicos y Bioquimieos

en Ia Universidad Federal de Rio de Janeiro, Brasil. Se 10puede

eontaetaren Ia dirección eleetróniea <[email protected]>

FernandoJ. S. Oliveira es Doetor en Ciendas en Teenologia de

Proeesos Quimicos y Bioquimicos, egresado de Ia Universidad

Federal de Rio de Janeiro, Brasil. Se desempena en Petróleo Bra-

sileiro S.A., Gerencia Corporativa de Medio Ambiente, Rio de

Janeiro. Se 10 puede eontaetar en Ia dirección eleetrónica

<[email protected]>

Francisca P. de França es Doetora en Ciencias, egresada deI

Instituto de Microbiologia de Ia Universidad Federal de Rio de

Janeiro, Brasil. Se desempena en Ia Escuela de Quimiea de Ia Uni-

versidad Federal de Rio de Janeiro, Brasil. Se Ia puede eontaetar

en Ia dirección eleetrónica <[email protected]>

~RECONAlDIS

RIiCi:($,ljRQ ~t; ~Q.N~.t)LTQRES~Q,~.~,:t~:t~~R.G.ENTINA

IàAIDISARGENTINA

BENEFICIOPARALOSSOCIOSDEAIDISARGENTINA

Como parte de su permanente quehacer en Ia promoción y difusiónde temas sanitariosy

ambientales y ante el permanente requerimiento dei mercado en búsqueda de profesionales

especializados en Iastemáticas manejadas por nuestra Asociación,el Consejo Directivode AIDIS

ARGENTINAha creado un Registro de Consultores (RECONAIDIS)para congregar a todos sus

profesionales socios que deseen incorporarse voluntariamente ai mismo.

Esnuestra intención brindar a Iasociedad una base de información que identifique especialis-

tas con antecedentes amplios y actualizados en Iasdiversas especialidades dei sector.

Portodo 10expuesto,AIDISARGENTINAconvocaaios sociosquedeseenintegrarIaRECONAI-

DIS (Registro de Consultores de AIDISARGENTINA),a que ingresen a nuestra página

www.aidisar.org.ar. donde encontrarán detalles y Ias instrucciones para registrarse.

AIDISARGENTINA. Ingenierla Sanitarla y Amblental . N° 110

Ing. Juan Pablo Schifini

Presidente de AIDISArgentina

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