UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUACÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES DC-SIGN
E L-SIGN COM A PROTEÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE A
TRANSMISSÃO VERTICAL DO HIV-1 E AO
DESENVOLVIMENTO DE TUBERCULOSE ATIVA NA
POPULAÇÃO PERNAMBUCANA
RONALDO CELERINO DA SILVA
RECIFE - PE 2011
RONALDO CELERINO DA SILVA
ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES DC-SIGN
E L-SIGN COM A PROTEÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE A
TRANSMISSÃO VERTICAL DO HIV-1 E AO
DESENVOLVIMENTO DE TUBERCULOSE ATIVA NA
POPULAÇÃO PERNAMBUCANA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Genética do Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco
como parte dos requisitos exigidos para obtenção do
título de Mestre em Genética.
Orientador: Prof. Dr. Sergio Crovella
Recife, PE
2011
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
Parecer da comissão examinadora da dissertação de:
RONALDO CELERINO DA SILVA
Intitulada:
Associação de Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN com a Proteção e
Susceptibilidade a Transmissão Vertical do HIV-1 e ao Desenvolvimento de
Tuberculose Ativa na População Pernambucana.
A comissão examinadora considera o presente trabalho
APROVADO
Portanto, cumpridas todas as exigências regimentais, Ronaldo Celerino da Silva
faz jus ao título de Mestre em Genética pela UFPE. Recife, 22 de fevereiro de 2011.
RECIFE, 2011.
iii
A Deus, pai e autor da vida.
À minha família, meu refúgio e fortaleza.
Aos meus amigos e companheiros de jornada.
E a todos aqueles que fizeram de suas dificuldades
pontes para a realização de seus sonhos...
Dedico.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a DEUS, por sempre me carregar nos braços,
conduzindo-me pelos caminhos da luz. Por me dar forças, para vencer as
dificuldades e contornar os obstáculos da jornada rumo ao dia de hoje: “Te ter é a
maior diferença em mim”.
Aos meus pais, Fernando e Leni, as minhas irmãs, Silvana e Juliana, e a
minha sobrinha, Amanda, por estarem comigo, proporcionando-me um amor
incondicional, dotando-me de força e coragem para persistir em meus ideais.
As minhas avós, Júlia e Maria, e ao meu avô José, pelo amor sem limites,
bem como, ao meu querido avô, Severino (in memoriam), que apesar de sua
ausência física, continua ao meu lado e vivo em meu coração.
À minha querida prima e madrinha Márcia, a minha querida Tia Lurdes, e
aos meus primos, Filipe e Betinho, pelo carinho, abrigo em seu lar e por acreditarem
que o sonho seria possível.
A todas as minhas tias (os) e primas (os), pelo carinho e por vibrarem
comigo a cada nova vitória.
Ao grande amigo e orientador, Prof. Dr. Sergio Crovella, pelo incentivo, pelos
ensinamentos, pela oportunidade de trabalhar ao seu lado, e principalmente, por
fazer dos meus sonhos, seus sonhos.
Aos queridos companheiros do setor de Virologia do LIKA: Andréia, Antonio
(Galego), Anselmo (Japa), Catarina, Fernanda, Fabrício, Jaqueline, Jean, Karina,
Lucas, Márcia, Nathália, Priscila, Rafael, Sterfanny e Sérgio Santos, pela ajuda
incondicional, pela amizade e companherismo de sempre. E de forma toda especial,
a Heide Lacerda e a Drª Paula Sandrin, por sua inestimável colaboração no
aprendizado das técnicas e por suas amizades.
Aos colegas de mestrado: Adriana, Amanda, André, Bruna, Cézar,
Fernanda, Isabelle, Marcus, Rochane, Rômulo e Santelmo, pelo companherismo,
pelos momentos de descontração e pelas palavras amigas nas dificuldades.
A minha eterna família científica e amigos do Departamento de Biofísica e
Radiobiologia, Dr. Francisco Fernandes Amâncio e Drª Ana M. Mendonça de
v
Albuquerque Melo, pelo incentivo e por serem essenciais no início de minha vida
acadêmica. Minha conquista, também pertence a vocês.
A todos os amigos da graduação pela torcida e incentivo, em especial
Luanna Ribeiro e Clarissa Sá, pelo amor sem limites, pela cumplicidade, pelas
trapalhadas e por serem elos transformadores de minha existência.
A todos os meus amigos, em especial: Ana Patrícia (Madrinha), Felipe
Paulino, Givago Almeida, Hugo Morais, pela amizade incondicional, pelo
companherismo, conselhos e momentos alegres vividos.
A Drª Haiana Schindler e a Drª Lilian Montenegro, bem como a todos que
fazem o Laboratório de Imunoepidemiologia do CpqAM, pela disponibilização do
banco de DNA de Tuberculose.
Ao Dr. Édson Kido e a Drª Valesca Pandolfi, pela colaboração e ajuda no
processo de sequenciamento.
A Drª Ludovica Segat, pelos ensinamentos, pelas sugestões e por sua
inestimável ajuda durante a execurção deste trabalho, bem como a Valentina Zanin.
A Coordenação do Programa de Pós-graduação em Genética, bem como
todos seus docentes, pelos ensinamentos e suporte científico.
Ao LIKA (Setores de Virologia e Biologia Molecular) e ao CpqAM
(Laboratório de Imunoepidemiologia e Núcleo de Integração Tecnológica), pelo
suporte físico e logístico.
Aos membros da banca examinadora: Drª Neide Santos, Drª Paula Sandrin,
Dr. Paulo Souza, Dr. Valdir Balbino e Dr. José Eduardo Garcia, por suas valorosas
contribuições e sugestões na melhoria deste trabalho.
Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para concepção,
execurção e conclusão deste trabalho, deixo minha eterna e sincera gratidão.
Muito obrigado a todos!
vi
“Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a vida com paixão, perder com classe e vencer com ousadia, pois o triunfo pertence a quem se atreve... A vida é muito para ser insignificante”.
(Charles Chaplin)
vii
RESUMO
Doenças infecciosas são consideradas as principais causas de morbidade e mortalidade entre as sociedades humanas. AIDS e Tuberculose (TB) têm recebido particular interesse em decorrência do grande contingente de pessoas afetadas, e por serem consideradas bons modelos para estudos de susceptibilidade genética, em genes relacionados à imunidade, como DC-SIGN e L-SIGN, que detêm a capacidade de se ligar ao HIV-1 e ao Mycobacterium tuberculosis. Neste sentido, foi avaliado o papel de polimorfismos genéticos em DC-SIGN e L-SIGN em crianças expostas ao HIV-1 via transmissão vertical (TV), em pacientes com TB ativa e controles saudáveis, a fim de identificar marcadores genéticos de proteção e susceptibilidade na população pernambucana. Para isso, foram utilizadas 250 crianças expostas ao HIV-1 (58 HIV- e 192 HIV+) e 96 crianças controles, bem como, 160 pacientes com TB ativa (116 TB pulmonar e 44 TB extrapulmonar) e 170 controles saudáveis. Todos os grupos foram genotipados para SNPs contidos no promotor de DC-SIGN (através de PCR em tempo real com sondas alelo-específicas e/ou sequenciamento) e para o éxon 4 de DC-SIGN e L-SIGN (através de PCR convencional e eletroforese em gel de agarose). Os resultados foram diferenciados através dos testes do X2 e do exato de Fisher, sendo consideradas associações significativas com p<0,05. Entre os indivíduos expostos ao HIV-1 via TV, cinco SNPs do promotor de DC-SIGN, foram avaliados, sendo que três foram associados à proteção (-201T, -201 G/T e -336 G/G) e um a susceptibilidade (- 871 G/G). Para o éxon 4 de DC-SIGN não foram verificadas diferenças significativas entre expostos e controles, já para L-SIGN, variantes foram associadas a proteção (genótipos heterozigotos) e a suscetibilidade (genótipo 5/5) a TV. Entre pacientes TB, quatros SNPs foram avaliados para o promotor de DC-SIGN, obtendo-se cinco associações, sendo três com a proteção (-336 G/A, -871 G e -871 G/A) e duas com a susceptibilidade (-871 A e -871 A/A). Também não foram observadas diferenças significativas para o éxon 4 de DC-SIGN, porém para L-SIGN, foram encontradas quatro associações com a proteção (alelos com 4, 5 e 6 repetições e genótipo 6/5) e duas com a susceptibilidade (alelo com 9 repetições e genótipo 9/9).Este trabalho foi o primeiro a associar os variantes -201 T, -201 G/T, -336 G/G e -871 G/G de DC-SIGN com a TV do HIV-1, e de polimorfismos no éxon 4 de L-SIGN ao desenvolvimento de TB em uma população brasileira, sugerindo que polimorfismos, nesses genes, podem influenciar na proteção e susceptibilidade a infecções promovidas por vírus e bactérias. Palavras-chave: Polimorfismos, DC-SIGN, L-SIGN, transmissão vertical do HIV-1, tuberculose.
viii
ABSTRACT
Infectious diseases are considered the main causes of morbidity and mortality among human societies. AIDS and Tuberculosis (TB) have received particular interest due to the large number of people affected and because they are considered good models for studies of genetic susceptibility in genes related to immunity, such as DC-SIGN and L-SIGN, which have the ability to bind to HIV-1 and Mycobacterium tuberculosis. In this sense, we evaluated the role of genetic polymorphisms in DC-SIGN and L-SIGN in children exposed to HIV-1 via vertical transmission (VT), in patients with active TB and healthy controls in order to identify genetic markers of protection and susceptibility in the population from Pernambuco. For this, we used 250 children exposed to HIV-1 (58HIV- and 192 HIV+) and 96 control children, as well as 160 patients with active TB (116 pulmonary TB and 44 extrapulmonary TB) and 170 healthy controls. All groups were genotyped for SNPs of the DC-SIGN promoter (by real-time PCR with allele-specific probes and/or sequencing) and the DC-SIGN and L-SIGN exon 4 (by PCR and agarose gel electrophoresis). Results were differentiated by means of the X2 test and Fisher exact test, considering significant associations with p <0.05. Among individuals exposed to HIV-1 via TV, five SNPs of DC-SIGN promoter, were evaluated, three were associated with protection (-201T, -201 G/T and -336 G/G) and one with susceptibility (-871 G/G). For DC-SIGN exon 4 polymorphisms did not demonstrate significant differences between exposed and controls, however, for L-SIGN, variants were associated with protection (heterozygotes genotypes) and susceptibility (genotype 5/5) to TV. Among TB patients, four SNPs were analyzed for DC-SIGN promoter, resulting in five associations, three with protection (-336 G/A, -871G and -871 G/A) and two with susceptibility (-871A and -871 A/A). There were also no significant differences for DC-SIGN exon 4 polymorphisms, but for L-SIGN, we found four associations with protection (alleles with 4, 5 and 6 repeat and genotype 6/5) and two with susceptibility (allele with nine repeat and genotype 9/9). This study is the first to associate the variants -201T, -201 G/T, -336 G/G and -871 G/G in DC-SIGN with HIV-1 TV, and polymorphisms of L-SIGN exon 4 with TB development, in a Brazilian population, suggesting that polymorphisms in these genes, may influence the protection and susceptibility to infections caused by viruses and bacteria.
Key words: Polymorphisms, DC-SIGN, L-SIGN, vertical transmission of HIV-1, tuberculosis.
ix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Em destaque as duas fitas de RNA, a enzima transcriptase reversa, a membrana lipídica, a matriz protéica, e as glicoproteínas do envelope viral (gp120 e gp41).
08
Figura 2. Ciclo Viral. Inicialmente os vírus entram na célula (1), em seguida a enzima trascriptase reversa produz a dupla fita de DNA viral (2), a partir do RNA genômico. A dupla fita de DNA move-se para dentro do núcleo, e se insere no DNA do hospedeiro tornando-se um provírus (3). A molécula de DNA hospedeiro com o DNA viral integrado é transcrita (4) e traduzida (5). As proteínas virais se unem ao RNA viral formando novos vírus (6), os quais deixam a célula hospedeira (7).
10
Figura 3. Incidência global da tuberculose para o ano de 2009.
17
Figura 4. Micrografia eletrônica do bacilo Mycobacterium tuberculosis.
18
Figura 5. Estrutura dos receptores DC-SIGN e L-SIGN.
26
Figura 6. Formas de transmissão do vírus HIV-1. A – Infecção in trans; B – Infecção in cis.
32
Figure 7. Estrutura esquemática da placenta e características envolvidas na transmissão transplacental do HIV-1. Existe uma íntima relação entre tecidos fetais e maternos na placenta. Populações de leucócitos residentes em ambos os lados são indicados. DC-SIGN é expresso em células Hofbauer fetalmente derivado em vilos coriônicos e em macrófagos da decídua materna. Essas populações de células estão muito próximas. L-SIGN é expresso no endotélio de capilares da placenta.
37
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estimativa Mundial da Epidemia da AIDS em 2009, segundo o Relatório Anual do UNAIDS 2010.
06
Tabela 2. Indicadores Epidemiológicos da Epidemia de HIV/AIDS no Brasil.
07
Tabela 3. Polimorfismos da região promotora do gene DC-SIGN e associações com a susceptibilidade e proteção a infecções.
42
Tabela 4. Polimorfismos no número de repetições do éxon 4 de DC-SIGN e L-SIGN e associações com a susceptibilidade e proteção a infecções.
43
Tabela 5. Frequências alélicas e genotípicas dos SNPs (-139, -201, -336) da região promotora do gene DC-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis.
56
Tabela 6. Frequências alélicas e genotípicas dos SNPs (-871 e -939) da região promotora do gene DC-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis.
57
Tabela 7. Frequências alélicas e genotípicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene DC-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis.
59
Tabela 8. Frequências alélicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene L-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis.
59
Tabela 9. Frequências genotípicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene L-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis.
60
Tabela 10. Principais resultados obtidos para os genes DC-SIGN e L-SIGN na população pernambucana exposta ao HIV-1, via transmissão vertical.
61
Tabela 11. Frequências alélicas e genotípicas de SNPs (-139 e -336) da região promotora do gene DC-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e controles saudáveis pernambucanos.
63
Tabela 12. Frequências alélicas e genotípicas de SNPs (-871 e -939) da região promotora do gene DC-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e controles saudáveis pernambucanos.
65
xi
Tabela 13. Frequências alélicas e genotípicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene DC-SIGN em pacientes com tuberculose e em controles saudáveis pernambucanos.
66
Tabela 14. Frequências alélicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene L-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e em controles saudáveis pernambucanos.
67
Tabela 15. Frequências genotípicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene L-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e em controles saudáveis pernambucanos.
69
Tabela 16. Principais resultados obtidos para os genes DC-SIGN e L-SIGN na população pernambucana com tuberculose ativa.
70
Tabela 17. Associações dos genes DC-SIGN e L-SIGN a infecção pelo HIV-1: diferentes populações mundiais x população pernambucana.
78
Tabela 18. Estudos de Associação do gene DC-SIGN (éxon 4) e tuberculose em diferentes populações mundiais.
80
Tabela 19. Associações dos genes DC-SIGN e L-SIGN a infecção pelo M. tuberculosis: diferentes populações mundiais x população pernambucana.
76
xii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
A Adenina a.C. Antes de Cristo AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Asn Asparagina BCG Bacilo Calmette-Guérin C Citocina Ca2+ Íon de Cálcio CCR5 Receptor C-C quemoquina tipo 5 CLR Receptores de ligadores de cálcio CRD Domínio de reconhecimento de carboidratos CXCR4 Receptor C-X-C quemoquina tipo 4 Da Daltons DCs Células dendríticas DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-
Grabbing Non-integrin ddNTPs Dideoxinucleotídeos trifosfato DNA Ácido Desoxiribonucléico dNTPs Desoxinucleotídeos EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético G Guanina Glu Glutamato Gp Glicoproteína HAART Terapia anti-retroviral altamente ativa HIV- Vírus da imunodeficiência humana negativo HIV+ Vírus da imunodeficiência humana positivo HIV-1 Vírus da imunodeficiência humana tipo 1 HIV-2 Vírus da imunodeficiência humana tipo 2 HTLV-1 Vírus T linfotrópico humano tipo 1 H-W Equilíbrio de Hardy-Weimberg IC95% Intervalo de confiança de 95% ICAM Molecula de adesão intercelular IFN-γ Interferon gama IL Interleucina Kb Quilo bases KCl Cloreto de Potássio LSECs Células endoteliais dos sinusóides hepáticos L-SIGN Liver/lymph node-specific intercellular adhesion molecule-
grabbing non integrin M. bovis Mycobacterium bovis M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis ManLAM Manosilato de liporabinomanana MgCl2 Cloreto de Magnésio MHC Complexo principal de histocompatibilidade mM/μL Milimolar por microlitro Mtb Mycobacterium tuberculosis
xiii
Nm Nanômetros OH Hidroxila OMS Organização Mundial de Saúde OR Razão de chances (do inglês “odds ratio”) ORF Quadro aberto de leitura P p-value PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos Pb Pares de base PCR Reação em Cadeia da Polimerase pH Potencial hidrogeniônico pmol/Μl Picomol por microlitro PRRs Receptores de reconhecimento de patógenos RNA Ácido Ribonucléico (do inglês: “Ribonucleic acid”) SARS-CoV SARS coronavírus SNP Polimorfismo de base única SP Estado de São Paulo T Timina T CD4+ Células T CD4 positivas TB Tuberculose TBE Tuberculose extrapulmonar TBP Tuberculose pulmonar Th1 Células T helper tipo 1 Th2 Células T helper tipo 2 TLR Receptores Toll-like TV Transmissão vertical UNAIDS Programa da Junta das Nações Unidas sobre HIV/AIDS USA Estados Unidos da América UTR Região Não-Traduzida V Volts X2 Teste qui-quadrado Μl Microlitro % Símbolo de percentual ºC Grau Celsius
xiv
SUMÁRIO
RESUMO vii
ABSTRACT viii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ix
LISTA DE TABELAS x
LISTAS DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
Xii
1 INTRODUÇÃO
01
2 REVISÃO DA LITERATURA 03
2.1 Doenças Infecciosas 03
2.1.1 Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) 04
2.1.1.1 Histórico 04
2.1.1.2 Epidemiologia 06
2.1.1.3 Agente Etiológico – Vírus da Imunodeficiência Humana 08
2.1.1.3.1 Estrutura do HIV-1 08
2.1.1.3.2 Ciclo Viral 09
2.1.1.3.3 Curso da Infecção pelo HIV-1 11
2.1.1.3.4 Transmissão do HIV-1 13
2.1.2 Tuberculose (TB) 14
2.1.2.1 Histórico 14
2.1.2.2 Epidemiologia 16
2.1.2.3 Agente Etiológico – Mycobacterium tuberculosis 17
2.1.2.3.1 Transmissão 19
2.1.2.4 Aspectos Imunopatológicos 20
2.2 Mecanismos Imunológicos Envolvidos na Resposta Hospedeira a Patógenos
23
2.2.1 Receptores DC-SIGN e L-SIGN 24
2.2.1.1 Papel dos Receptores DC-SIGN e L-SIGN na Infecção pelo HIV-1 31
2.2.1.1.1 Papel dos Receptores e L-SIGN na Transmissão Vertical do HIV-1
35
xv
2.2.1.2 Papel dos Receptores DC-SIGN e L-SIGN na Infecção pelo M. tuberculosis
38
2.3 Variabilidade Genética Humana 40
2.3.1 Polimorfismos nos Genes Codificadores de DC-SIGN e L-SIGN Relacionados com Infecções
41
2.4 Metodologias para Estudo de Variações Genéticas 43
2.4.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 43
2.4.1.1 PCR em Tempo Real 44
2.4.2 Sequenciamento de DNA
45
3 OBJETIVOS 47
3.1 Objetivo Geral 47
3.2 Objetivos Específicos
47
4 MATERIAL E MÉTODOS 48
4.1 Local e Desenho Experimental do Estudo 48
4.2 Considerações Éticas 48
4.3 Populações Estudadas 49
4.3.1 População Exposta ao HIV-1 via Transmissão Vertical 49
4.3.2 População de Pacientes com Tuberculose Ativa 49
4.3.3 População de Controles Saudáveis 50
4.4 Extração de DNA Genômico Humano 50
4.5 Genotipagem de Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN 51
4.5.1 Polimorfismos de Base Única (SNPs) da Região Promotora do Gene DC-SIGN
51
4.5.1.1 Genotipagem Utilizando Sondas Alelo-específicas (TaqMan®) 51
4.5.1.2 Genotipagem Utilizando Sequenciamento Direto 51
4.5.2 Polimorfismos no Número de Repetições do Éxon 4 do Gene DC-SIGN
52
4.5.3 Polimorfismos no Número de Repetições do Éxon 4 do Gene L-SIGN
53
4.6 Análises Estatísticas
54
xvi
5 RESULTADOS 55
5.1 Distribuição de Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN em Crianças Expostas ao Vírus HIV-1 (HIV+ e HIV-) via Transmissão Vertical e em Controles Saudáveis Pernambucanos
55
5.1.1 Polimorfismos da Região Promotora do Gene DC-SIGN 55
5.1.2 Polimorfismos no Número de Repetições no Éxon 4 do Gene DC-SIGN
58
5.1.3 Polimorfismos no Número de Repetições no Éxon 4 do Gene L-SIGN
59
5.2 Distribuição de Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN em Pacientes com Tuberculose Ativa e em Controles Saudáveis Pernambucanos
62
5.2.1 Polimorfismos da Região Promotora do Gene DC-SIGN 62
5.2.2 Polimorfismos no Número de Repetições no Éxon 4 do Gene DC-SIGN
66
5.2.3 Polimorfismos no Número de Repetições no Éxon 4 do Gene L-SIGN
67
6 DISCUSSÃO 71
6.1 Papéis dos Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN na Transmissão Vertical do HIV-1
71
6.2 Papéis dos Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN no Desenvolvimento da Tuberculose Ativa
78
7 CONCLUSÕES
83
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
84
9 ANEXO
ANEXO A – Manuscrito Publicado no Periódico Internacional Human Immunology - 2011
97
97
10 MEMORIAL 105
1
1 INTRODUÇÃO
As doenças infecciosas têm despertado particular atenção das autoridades
mundiais de saúde, visto que são as principais causas de morbidade e mortalidade
entre as sociedades humanas. Doenças, como a Síndrome da imunodeficiência
adquirida (AIDS), ocasionada pelo vírus HIV, e Tuberculose (TB), ocasionada pelo
bacilo Mycobacterium tuberculosis, são apontadas como as principais causas de
morte e morbidez por doenças infecciosas.
A interação entre o hospedeiro humano e microrganismos é crucial para a
construção de uma resposta imune e para eliminação de patógenos invasores.
Assim, o sistema imune inato atua como a primeira linha de defesa hospedeira em
resposta à patógenos, envolvendo o reconhecimento inicial e o englobamento de
microrganismos por fagócitos profissionais, que agem durante construção da
imunidade e na patogênese da doença.
A susceptibilidade e a resistência a doenças humanas são atribuídas a uma
complexa interação entre fatores ambientais e fatores genéticos do hospedeiro. No
contexto da AIDS e da TB, muitos genes relacionados à imunidade podem contribuir
para susceptibilidade e/ou proteção à doença.
Nos últimos anos, especial interesse tem sido demandado para dois
receptores celulares, envolvidos com a imunidade, os receptores DC-SIGN e L-
SIGN, codificados, respectivamente, pelos genes CD209 e CD209L. Esses
receptores detêm a capacidade de ligação a padrões moleculares associados à
patógenos (PAMPs), presentes no HIV-1 (gp120) e no M. tuberculosis (ManLAN), e
estão envolvidos na promoção da resposta imune. Estudos apontam que
polimorfismos nestes genes podem influenciar na capacidade de ligação a
patógenos e na promoção da resposta imune, fazendo com que indivíduos
portadores do HIV-1 e do M. tuberculosis, apresentem resistência e/ou
susceptibilidade, dependendo da população estudada.
Neste sentido, o presente trabalho visou avaliar o papel de polimorfismos
genéticos nos genes codificadores de DC-SIGN e L-SIGN em crianças expostas ao
vírus do HIV-1 (HIV+ e HIV-), via transmissão vertical, em pacientes com tuberculose
2
ativa e em controles saudáveis pernambucanos, a fim de identificar marcadores
genéticos associados à proteção e/ou susceptibilidade a essas doenças.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Doenças Infecciosas
As doenças infecciosas são consideradas, atualmente, como as principais
causas de morbidade e mortalidade entre as sociedades humanas. Aliado a esse
fato, ao longo do processo evolutivo essas doenças têm exercido consideráveis
pressões seletivas sobre genes humanos, principalmente os envolvidos na resposta
imune, garantindo vantagens evolutivas através de respostas imunológicas
diferenciadas, com o intuito de alcançar uma variada gama de patógenos
(BURGNER et al., 2006).
Neste cenário, duas doenças infecciosas têm despertado a atenção da
comunidade científica: a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS),
ocasionada pelo vírus HIV, e a Tuberculose (TB), causada pelo bacilo M.
tuberculosis, devido ao fato de se destacarem entre as doenças infecciosas como as
principais causas dos elevados índices de morbidade e mortalidade mundiais
(BARREIRO et al., 2005; SELVARAJ et al., 2009).
Alguns estudos relatam que tanto pacientes com AIDS, quanto pacientes com
TB, apresentam perfis distintos quanto à susceptibilidade e/ou resistência a infecção
e/ou desenvolvimento da doença (BELLAMY, 1998; LAMA; PLANELLES, 2007;
BORGGREN et al., 2008; SELVARAJ et al., 2009).
A susceptibilidade e/ou resistência para essas infecções e muitas outras
enfermidades humanas é atribuída a uma complexa interação entre fatores
ambientais e fatores genéticos do hospedeiro, onde algumas regiões do genoma
humano são consideradas como pontos quentes para susceptibilidade a doenças
infecciosas (BELLAMY, 1998; BURGNER et al., 2006).
Neste sentido, tais enfermidades vêm sendo utilizadas como modelos de
estudos genéticos para várias regiões do genoma humano, visando entender o
papel de polimorfismos genéticos, em genes da imunidade, na susceptibilidade e
resistência/proteção contra agentes invasores, tais como vírus e bactérias
(BELLAMY, 1998; LAMA; PLANELLES, 2007; KOIZUMI et al., 2007; BORGGREN et
al., 2008; VANNBERG et al., 2008; SELVARAJ et al., 2009).
4
2.1.1 Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)
A AIDS é uma doença infecciosa, caracterizada pela perda progressiva de
linfócitos T helper CD4+, que conduz a uma severa deficiência imune, doença
constitucional (sinais e sintomas com período de duração maior que um mês: febre,
diarréia e perda de peso), infecções oportunistas, agravos neurológicos e neoplasias
que normalmente não ocorrem em pessoas imunocompetentes (HUTCHINSON,
2001; WEISS, 2008).
2.1.1.1 Histórico
Os primeiros seres humanos a entrarem em contato com o vírus,
provavelmente viviam em florestas, praticando atividades silvícolas, como a caça, e
na maioria das vezes morriam sem nunca entrar em contato com outras pessoas. No
entanto, a disseminação viral para os centros urbanos, teve início, após a Segunda
Guerra Mundial, impulsionada pelo aumento do êxodo rural, e coincidentemente,
com o crescimento da prostituição e do uso de drogas injetáveis (GALLO, 2006).
Os primeiros registros oficiais de indivíduos com AIDS datam de 1981,
quando jovens homossexuais de Nova Iorque, São Francisco e Los Angeles (USA)
foram diagnosticado com pneumonia ocasionada por Pneumocystis carinii e
sarcoma de Kapose, apresentando uma forte depleção de células T helper CD4+.
No entanto, não se tinha conhecimento das causas dessa deficiência imune (WEISS,
2008).
Em 1982, a doença passou a ser denominada de Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS) e ficou clara a existência de um agente infeccioso
capaz de induzir a doença, visto que a mesma se fazia presente, entre usuários de
drogas e em indivíduos submetidos a transfusões sanguíneas. Com a manifestação
da doença em pacientes com Hemofilia, especulou-se que a AIDS era ocasionada
por algum tipo de vírus, sendo identificado o primeiro grupo de risco a infecção,
denominado de “Os quatro Hs” (hemofílicos, viciados em heroína, homossexuais e
haitianos) (GALLO, 2006; WEISS, 2008).
5
Em 23 de maio de 1983, Françoise Barré-Sinoussi e colaboradores,
conduzidos por Luc Montagnier, no Instituto Pasteur em Paris, publicaram a
descrição de um tipo viral desconhecido em pacientes com linfadenopatia,
denominado de LAV (Vírus associado à Linfadenopatia). No mesmo ano, Robert
Gallo e Max Essex, nos Estados Unidos, descreveram o outro tipo viral, o HTLV-III
(Vírus Linfotrópico Humano tipo III), como possível causa da AIDS (GALLO, 2006;
WEISS, 2008).
A partir de então, outros trabalhos foram publicados associando o HIV com a
AIDS, no entanto, com nomenclaturas diferentes. Após clonagem e sequenciamento
do material genético viral, percebeu-se que todos os vírus descritos se tratavam de
uma única espécie. Assim em 1986, um comitê internacional, liderado por Harold
Varmus recomendou o termo “Vírus da Imunodeficiência Humana – HIV” (WEISS,
2008).
Em 1984, os primeiros testes sorológicos anti-HIV se tornaram disponíveis
para o mundo, ajudando a esclarecer que a AIDS era ocasionada pelo vírus HIV e
que não estava restrita a países ocidentais (WEISS, 2008).
Em 1986, a primeira droga anti-retroviral, a azidotimidina, foi submetida a
ensaios clínicos, não obtendo resultados satisfatórios. Depois dessa, várias outras
drogas foram desenvolvidas e testadas, obtendo bons resultados. No entanto, em
1996, entrou em cena, a terapia anti-retroviral altamente ativa (HAART), um coquetel
de drogas anti-HIV, que promoveu uma verdadeira revolução no tratamento,
reduzindo em até 70%, as taxas de mortalidades pela doença (WEISS, 2008).
Em 1999, Gao e colaboradores, obtiveram evidências concretas que o
hospedeiro natural do vírus HIV era uma espécie de chimpanzé, Pan troglodytes
troglodytes (GAO et al., 1999).
Atualmente, dois tipos de vírus HIV são responsáveis pela promoção da
infecção, o HIV-1 e o HIV-2. O HIV-1 foi identificado em 1983, e acomete a maior
parte do mundo. Enquanto o que o HIV-2, isolado em 1986 pelo grupo de
Montagnier, foi primariamente detectado na África Ocidental, sendo
significativamente mais prevalentes nessa região e também em países como
Portugal e na Índia, com raros casos em países ocidentais, Coréia e Filipinas
(ARVIEUX, 2005; WEISS, 2008).
6
2.1.1.2 Epidemiologia
A AIDS é considerada a principal causa de morte por doenças infecciosas no
mundo. Desde o início da epidemia até os dias atuais, mais de 60 milhões de
pessoas foram infectadas e cerca de 30 milhões vieram a óbito em decorrência da
infecção pelo vírus HIV (UNAIDS, 2010).
Segundo o Relatório Anual do Programa da Junta das Nações Unidas para
HIV-AIDS (UNAIDS) divulgado em 2010, com base em dados do ano de 2009,
estima-se que em média 33,3 milhões de pessoas se encontram vivendo com
HIV/AIDS. Adicionalmente, foram estimadas 2,6 milhões de novas infecções e 1,8
milhões de óbitos em todo mundo (Tabela 1) (UNAIDS, 2010).
Tabela 1: Estimativa Mundial da Epidemia da AIDS em 2009, segundo o Relatório Anual do UNAIDS 2010.
Número de Pessoas que Convivem com o HIV em
2009
Total 33.3 milhões (31.4 – 35.3)
Adultos 30.8 milhões (29.2 – 32.6)
Mulheres 15.9 milhões (14.8 – 17.2)
Crianças < 15 anos 2,5 milhões (1.6 – 3.4)
Pessoas infectadas com HIV
Total 2.6 milhões (2.3 – 2.8)
Adultos 2.2 milhões (2.0 – 2.4)
Crianças < 15 anos 370 mil (230 – 510 mil)
Mortos em 2009
Total 1.8 milhões (1.6 – 2.1)
Adultos 1.6 milhões (1.4 – 1.8)
Crianças < 15 anos 250 mil (150 – 360 mil)
Fonte: UNAIDS (2010).
Apesar do grande contingente de indivíduos adultos convivendo com a
doença, um expressivo número de crianças reforçam os indicadores
epidemiológicos. Somente em 2009, 370 mil crianças nasceram portando o vírus
HIV, aumentando para 2,5 milhões o número total de crianças com menos de 15
anos vivendo com o vírus em todo mundo (Tabela 1) (UNAIDS, 2010).
No Brasil, estima-se que aproximadamente 630 mil pessoas vivam com o HIV,
representando um terço de todas as pessoas infectadas nas Américas Central e do
Sul. Desde o início da epidemia em 1980 até 30 de junho de 2010, foram
diagnosticados 559.914 casos e registradas 229.222 mortes em decorrência da
doença (Tabela 2). Adicionalmente, já foram notificados 13.061 casos de crianças
7
brasileiras que adquiriam o vírus HIV, via transmissão vertical (MINISTÉRIO DA
SAÚDE/BRASIL, 2010; UNAIDS, 2010;).
Dentre as regiões do país mais afetadas, a região Sudeste apresenta o maior
percentual de notificações (61,5%), com 323.069 registros da doença, seguida pelas
regiões Sul (20,6%) e Nordeste (13,3%). As regiões Centro-Oeste e Norte
concentram 6,1% e 4,4% dos casos, respectivamente. Dos 5.564 municípios
brasileiros, 87,5% (4.867) registram pelo menos um caso da doença (MINISTÉRIO
DA SAÚDE/BRASIL, 2010).
Tabela 2. Indicadores Epidemiológicos da Epidemia de HIV/AIDS no Brasil.
Indicadores Epidemiológicos
Brasil
Indicadores por Região do País
Norte
Nordeste
Sudeste
Sul Centro-Oeste
Casos diagnosticados 559.914 24.745 74.364 344.150 115.598 34.057 Incidência** 20,1 20,1 13,9 20,4 32,4 18,0
Óbitos* 229.222 7.218 24.086 149.298 37.772 10.848 Mortalidade** 6,2 5,7 4,1 6,7 8,8 4,8
Fonte: Ministério da Saúde * Registros de 1980 até 30/06/2010; ** A cada 100.000 habitantes - ano base de 2009
De acordo com o Boletim Epidemiológico HIV/AIDS 2010, em uma versão
preliminar, o estado de Pernambuco apresentou, no período de 11 anos (1998 a
2009), um crescimento de 113% no número de casos de AIDS. Apenas em 2009, em
Pernambuco, foram confirmados 1.651 casos de AIDS, alcançando o 2º lugar em
número de casos no Nordeste, bem como, o 1º e 12º lugar em incidência entre os
estados nordestinos e no Brasil, respectivamente, com 18,7 pessoas infectadas a
cada 100 mil habitantes. No acumulado da epidemia, o estado ocupa o 1º lugar no
Nordeste, em número de casos (18.019) e em número de óbitos (6.928) e o 2º lugar
em número de crianças infectadas menores que 5 anos de idade (405 casos), com
uma incidência de 2,7 casos a cada 100 mil habitantes (MINISTÉRIO DA
SAÚDE/BRASIL, 2010).
A cidade do Recife se destaca como a 4ª capital brasileira com maior taxa de
incidência da doença, com 58,4 indivíduos infectados para cada 100 mil habitantes,
segundo estimativas para 2009 (MINISTÉRIO DA SAÚDE/BRASIL, 2010).
8
2.1.1.3 Agente Etiológico – Vírus da Imunodeficiência Humana
2.1.1.3.1 Estrutura do HIV-1
O vírus da imunodeficiência humana (HIV), pertence à família Retroviridae,
sub-família Lentivirinae e ao gênero dos Lentívirus, o qual é responsável por uma
infecção crônica que, gradualmente danifica o sistema imunológico do hospedeiro
(BEER et al., 1999; HAHN et al., 2000; HUTCHINSON, 2001).
O HIV possui uma forma esférica, com cerca de 100 nm de diâmetro, estando
envolvido por uma bicamada lipídica, originária da célula hospedeira, e incrustadas
na membrana se encontram duas glicoproteínas: uma transmembranar (gp41) e
outra de superfície (gp120), as quais atuam na fusão da membrana e na ligação a
receptores celulares, respectivamente. Adicionalmente, outras proteínas de
membrana, originárias da célula hospedeira, também fazem parte da constituição da
membrana viral (Figura 1) (HAHN et al., 2000; HUTCHINSON, 2001) .
Figura 1. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Em destaque as duas fitas de RNA, a enzima transcriptase reversa, a membrana lipídica, a matriz protéica, e as glicoproteínas do envelope viral (gp120 e gp41). Fonte: www.stanford.edu/gruop/virus/retro/2005gongishmail/HIV.html
9
Sob a membrana viral, encontra-se uma matriz estrutural, constituída pela
associação de proteínas de matriz (p17), as quais são, igualmente, necessárias para
incorporação do complexo gp120-gp41 na formação de novos vírus (YU et al., 1992;
HUTCHINSON, 2001).
O RNA viral está localizado no centro da estrutura viral, inserido em um
capsídeo de forma cônica, formado por várias unidades da proteína p24. O genoma
viral é composto por duas moléculas de RNA de fita simples, com aproximadamente
9200 nucleotídeos (STINE, 2000; HUTCHINSON, 2001).
Além do RNA, o capsídeo viral, também possui nucleoproteínas
estabilizadoras de RNA (p7), enzimas virais e proteínas acessórias. As enzimas
virais como: a transcriptase reversa, proteases e integrases, relacionam-se com a
transcrição viral, processamento de proteínas virais e integração do material
genético viral ao genoma hospedeiro, respectivamente. Já as proteínas acessórias
como: Nef (p27), Rev (p19), Tat (p14), Vif (p23), Vpr (p18) e Vpu (p15), estão
relacionadas, respectivamente, com a estimulação da replicação, regulação da
repressão do mRNA viral, a transativação, infectividade viral, auxílio na replicação
viral e processamento de proteínas (LEVY, 1993; EMERMAN; MALIM, 1998;
TURNER; SUMMERS, 1999; HUTCHINSON, 2001).
Considerando que o HIV pertence à família do retrovírus, detém a capacidade
de reverter à direção usual da informação genética dentro da célula hospedeira,
visando produzir suas proteínas e promovendo a transcrição reversa do RNA viral,
através da enzima transcriptase reversa (TURNER; SUMMERS, 1999; STINE, 2000;
HUTCHINSON, 2001).
2.1.1.3.2 Ciclo Viral
O ciclo viral tem início com a ligação do HIV-1 a receptores CD4 e co-
receptores, como: CCR5 e CXCR4, resultando na fusão do envelope viral com a
membrana da célula hospedeira. À medida que ocorre a fusão entre membranas, o
material genético viral é liberado para o citoplasma, entrando em ação a
transcriptase reversa, que percorre a fita de RNA produzindo uma fita de DNA
complementar. Depois de construída a primeira fita de DNA, a transcriptase reversa,
dará início à formação da segunda fita de DNA, usando a primeira como molde
10
(GREENE, 1993; STINE, 2000; HUTCHINSON, 2001; FREED, 2001, GRINGHUIS et
al., 2010) (Figura 2).
A dupla fita de DNA viral recém-formada, é direcionada para o interior do
núcleo celular, onde através da ação da integrase, é inserida no genoma
hospedeiro, tornando-se um provírus, promovendo a infecção celular permanente. O
provírus pode permanecer em latência ou pode induzir a expressão de genes virais
pela maquinaria de transcrição da célula hospedeira (GREENE, 1993; EMERMAN;
MALIM, 1998; STINE, 2000; HUTCHINSON, 2001; FREED, 2001; GRINGHUIS et
al., 2010) (Figura 2).
Figura 2. Ciclo Viral. Inicialmente os vírus entram na célula (1), em seguida a enzima trascriptase reversa produz a dupla fita de DNA viral (2), a partir do RNA genômico. A dupla fita de DNA move-se para dentro do núcleo, e se insere no DNA do hospedeiro tornando-se um provírus (3). A molécula de DNA hospedeiro com o DNA viral integrado é transcrita (4) e traduzida (5). As proteínas virais se unem ao RNA viral formando novos vírus (6), os quais deixam a célula hospedeira (7). Fonte: http://www.ctv.es/USERS/fpardo/virus.htm
Após infecção da célula hospedeira, o HIV pode induzir a transcrição em duas
fases distintas. Na primeira fase, com duração aproximada de 24 horas, o vírus
induz a maquinaria da célula hospedeira a transcrever o DNA proviral em cópias
complementares de RNA, as quais passam por mecanismos de splicing, para
11
retirada de regiões não codificantes, gerando um RNA mensageiro maduro, que
posteriormente, será traduzido em proteínas regulatórias essenciais para produção
de novos vírus. Após a tradução, tais proteínas, são encaminhadas para o
citoplasma (EMERMAN; MALIM, 1998; STINE, 2000; HUTCHINSON, 2001; FREED,
2001; GRINGHUIS et al., 2010).
Na segunda fase de transcrição, o transcrito de RNA sem sofrer splicing,
torna-se uma nova fita viral, migrando para o citoplasma, onde duas novas classes
de RNA, com tamanhos diferenciados, são produzidas. As fitas longas, com
aproximadamente 9749 bases e sem processamento por splicing, constitui o
genoma viral. Por outro lado, os transcritos de comprimento médio de 4500 bases,
submetidos ao splicing, chamados de virions, serão responsáveis pela codificação
de proteínas estruturais e enzimáticas do vírus. Todo esse material, é encerrado no
interior de proteína do núcleo viral e formado, assim, novos vírus, posteriormente
direcionados para o exterior da célula (GREENE, 1993; STINE, 2000;
HUTCHINSON, 2001; FREED, 2001; GRINGHUIS et al., 2010).
Os principais alvos do HIV-1 são linfócitos T CD4+, macrófagos e células
dendríticas (DCs). A depleção de células T CD4+ pode ser ocasionada por danos
oriundos da infecção viral, que conduzem a morte celular programada ou a
processos apoptóticos, visto que o HIV detém a capacidade de burlar o sistema
imune. O sistema imune passa a atacar o próprio sistema imune, e também podem
formar sincícios, que são células saudáveis dispostas ao redor de uma célula T CD4
infectada com o vírus, conduzindo a perda da função imune (PANTALEO et al.,
1993; STINE, 2000; HUTCHINSON, 2001; FREED, 2001).
2.1.1.3.3 Curso da Infecção pelo HIV
A infecção primária pelo vírus HIV resulta em altos níveis de viremia (vírus no
sangue), podendo ser acompanhada por alguns sintomas, como: febre, diarréia e
linfadenopatia. Esta fase se caracteriza por altos níveis de replicação viral e alta
carga viral (HUTCHINSON, 2001; WEISS, 2008).
Na infecção aguda, a sintomatologia se assemelha a uma gripe, com febre e
dores musculares, que duram poucas semanas (STINE, 2000; HUTCHINSON, 2001;
WEISS, 2008).
12
Depois de 6 a 18 semanas da infecção primária, os anticorpos gerados contra
o vírus, começam ser detectados, aparecendo no soro sanguíneo, caracterizando a
soroconversão. A partir desse ponto, o isolamento do vírus do soro sanguíneo,
torna-se muito difícil (HUTCHINSON, 2001; WEISS, 2008).
O período assintomático é caracterizado por baixos níveis de replicação viral,
intercalados com períodos de elevação na viremia e pelo lento, porém, constante
decréscimo do número de células CD4+ (HUTCHINSON, 2001; WEISS, 2008).
O período de incubação (aproximadamente 10 anos) entre a infecção e o
desenvolvimento da AIDS é considerando longo e variável, estando intimamente
relacionado com o estado de latência da infecção, a qual pode ser ocasionada por
redução da quantidade de proteínas e RNA virais sob regulação de genes virais
(HUTCHINSON, 2001; SIVAPALASINGAM et al., 2005).
A latência pode estar relacionada, também, com a dicotomia existente entre
os níveis virais e a replicação viral em órgãos linfóides versus sangue periférico.
Estudos relatam a presença do HIV em tecidos linfóides durante a fase de latência
clínica, mesmo quando a atividade viral no sangue é mínima (PANTALEO et al.,
1993; HUTCHINSON, 2001).
Adicionalmente, DCs foliculares, em gânglios linfáticos, estão em contato com
o HIV desde o início da infecção, o que pode possibilitar a interação entre proteínas
do envelope viral e o sistema imune. Inicialmente, os linfonodos podem atuar na
contenção do vírus, no entanto, o vírus pode sofrer alterações que permitam sua
evasão da resposta imune, ocasionando a fase latente da doença (HUTCHINSON,
2001).
A AIDS caracteriza-se por ser o estágio final de um processo patogênico
progressivo e contínuo, envolvendo imunodeficiência profunda, infecções
oportunistas e neoplasias (HUTCHINSON, 2001; WEISS, 2008).
Durante a fase crônica, observa-se uma lenta e constante redução do número
de linfócitos T CD4+ ou de seus indutores, em indivíduos que desenvolveram AIDS.
O número de linfócitos T CD4 no sangue passa de 1000 por milímetro cúbico para
menos de 100 (GREENE, 1993; HUTCHINSON, 2001; WEISS, 2008).
Embora a patogênese do HIV seja semelhante em pacientes com HIV-1 e
HIV-2, a deficiência imunológica é menos grave, e a progressão da doença é mais
lenta em pacientes HIV-2 (HUTCHINSON, 2001; WEISS, 2008).
13
2.1.1.3.4 Transmissão do HIV-1
A transmissão do vírus HIV-1 ocorre por meio do contanto entre fluídos
corporais, oriundos de indivíduos infectados (sangue e sêmen), com regiões de
mucosas ou com ferimentos, através da exposição sexual (homossexual e
heterossexual), da exposição intravenosa entre usuários de drogas
(compartilhamentos de objetos pontiagudos e perfurantes) e durante procedimentos
de transfusões sanguíneas, ou mesmo, através da exposição vertical (transmissão
de mãe para filho) (SHWARTZ; NAIR, 1999; HUTCHINSON, 2001; NAARDING et
al., 2005).
Outras secreções corporais como: secreções vaginais e leite materno, são
mais efetivas em transmitir o vírus que fluídos deficientes em células, como: saliva,
urina e lágrima (SHWARTZ;NAIR, 1999; HUTCHINSON, 2001).
A transmissão de mãe para filho, também conhecida como transmissão
vertical, é responsável por mais de 40% de todas as infecções pelo HIV-1 em
crianças e pode ocorrer durante (SMITH et al., 2003; LUZURIAGA et al., 2007):
a gravidez (transmissão transplacentária ou intra-uterina), através da
placenta;
o parto (transmissão intraparto), através de líquidos amnióticos, sangue
contaminado e secreções do colo uterino;
a amamentação (transmissão pós-parto), através do leite materno.
Alguns fatores independentes têm sido associados com a transmissão vertical
do HIV-1, como: elevada carga viral materna, baixa quantidade de células T CD4+,
parto normal e baixa idade gestacional (NAARDIND et al., 2005; BOILY-LAROUCHE
et al., 2009).
Estimativas mundiais indicam que, sem intervenção medicamentosa
específica, a taxa de transmissão do HIV-1 de mãe para filho é de 15 a 45%
(LUZURIAGA et al., 2007), mas, o uso de terapias anti-retrovirais, reduz esse
percentual para 2%. Entretanto, o acesso limitado ao diagnóstico e a medicamentos
em países pobres, reduz o impacto potecial dessa estratégia (BOILY-LAROUCHE et
al., 2009).
14
2.1.2 Tuberculose (TB)
A Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada por um bacilo álcool-
ácido resistente, que inicialmente se localiza nos alvéolos pulmonares, e depois de
englobados por macrófagos, são transportados para linfonodos. Após a
multiplicação intracelular, desencadeia-se o processo de imunidade celular,
resultando em alterações inflamatórias com surgimento de lesão primária, que
envolve vasos linfáticos e linfonodos, formando granuloma de aspecto característico
(complexo de Gohn) que pode ser reconhecido radiologicamente (MÖLLER; HOAL,
2010).
2.1.2.1 Histórico
Inicialmente, pensava-se que o contato entre o bacilo e a espécie humana,
tinha ocorrido durante o processo de domesticação do gado, por volta de 8.000 a
4.000 a.C., onde a exposição do homem ao Mycobacterium bovis (bacilo que
também causa TB), através da ingestão de carne e leite, teria levado o agente
infeccioso a desenvolver estratégias de adaptação ao hospedeiro, evoluindo para
uma nova espécie, o M. tuberculosis (HASS; HASS, 1996). No entanto, evidências
moleculares demonstraram justamente o contrário, M. tuberculosis parece fazer
parte de um grupo relativamente diverso de bacilos, mais relacionados com uma
linhagem fundadora que ao M. bovis, demonstrando que ambas as espécies
evoluíram paralelamente de um ancestral comum, dotado da capacidade de infectar
tanto o homem quanto o gado (BROSCH et al., 2002; GUTIERREZ et al., 2005).
A baixa variabilidade genética apresentada pelo M. tuberculosis sugere que a
população pode ter resultado de uma expansão clonal, seguida de um efeito de
gargalo de garrafa, ocorrido entre 15.000 e 35.000 anos (BROSCH et al., 2002;
GUTIERREZ et al., 2005; ARNOLD, 2007). Neste sentido, nos pulmões humanos, o
M. tuberculosis, encontrou um micro-ecossistema favorável para sua sobrevivência,
adotando um nicho intracelular especializado em macrófagos e células fagocitárias
do sistema imunológico (DANIEL, 1997).
15
Um dos primeiros relatos da doença no mundo foi para a tuberculose
pulmonar, em textos indianos bastante antigos, conhecidos desde a época de
Hipócrates (BLOOM; MURRAY, 1992). Adicionalmente, traços da doença, como
deformidades ósseas, foram encontrados em esqueletos humanos datados de 8.000
a 5.000 a.C. em diversos países europeus, e em múmias egípcias (3.500 a 4.000
a.C.) (COBERLY; CHAISSON, 2001) e peruanas (Período Pré-Colombiano)
(BROSH et al., 2002).
Expecula-se que as viagens expansionistas européias atuaram de forma
significativa para a dispersão do bacilo pelo mundo. Aliado a esse fato, a revolução
industrial, alterou a dispersão da população, que deixou a vida no campo para
habitar as grandes cidades, onde as aglomerações humanas, as precárias medidas
sanitárias e o péssimo estágio nutricional da população, contribuíram para o
aumento da dispersão e da susceptibilidade a doença, conduzindo milhares de
pessoas à morte (CLARK-CURTISS; HAYDEL, 2003).
No Brasil, a TB provavelmente foi introduzida pelos portugueses e
missionários jesuítas, a partir do ano de 1500 (RUFFINO-NETO, 2002).
A primeira demonstração formal que a TB, era uma enfermidade contagiosa,
foi realizada em 1865 por Jean-Antoine Villemin, o qual executou sucessivas
transferências de pus e fluídos provenientes de lesões humanas e bovinas para
coelhos saudáveis, que, posteriormente, desenvolveram a doença (BLOOM;
MURRAY, 1992).
Em 1882, Robert Koch surpreendeu o mundo, com o isolamento e o cultivo do
M. tuberculosis, obtidos de macerados de tubérculos. Seus experimentos foram
responsáveis pela identificação da bactéria como agente etiológico da TB.
Adicionalmente, em 1890, Koch anuncia a descoberta da tuberculina, um estrato
purificado de proteínas do bacilo, que se tornou uma das principais ferramentas de
diagnóstico (BLOOM;MURRAY, 1992; BELLAMY, 1998; DUCATI et al., 2006).
Além destas importantes descobertas, Koch também desenvolveu
importantes métodos de coloração utilizados na identificação do bacilo, os quais
foram, subsequentemente, melhorados pelo bacteriologista Paul Ehrlich, dando
origem à coloração de Ziehl-Nielsen, empregada no diagnóstico de TB ativa
(DUCATI et al., 2006). As descobertas de Koch abriram caminho para o
desenvolvimento de terapias mais eficientes no tratamento da TB.
16
Em 1916, Albert Calmatte e Camille Guérin, conseguiram isolar uma linhagem
avirulenta de M. bovis, que após sucessivas repicagens foi inoculada em uma
criança cuja mãe havia morrido no parto por TB, criando assim, a vacina BCG
(Bacilo de Calmette-Guérin), a qual é amplamente utilizada no combate à TB de
maneira profilática em crianças até os dias atuais (BLOOM; MURRAY, 1992;
DUCATI et al., 2006).
No final dos anos 40, a introdução dos primeiros antibióticos como: a
estreptomicina (1947), a isoniazida e o ácido p-amino-salicílico, foi responsável por
uma considerável revolução nos tratamentos quimioterápicos para TB, promovendo
significativa redução das taxas de mortalidade pela doença no mundo
(BLOOM;MURRAY, 1992).
Com o decorrer dos anos, outros importantes fármacos foram desenvolvidos e
introduzidos no tratamento, como o etambutol e a rifampicina, no entanto, fatores
como: tempo de tratamento (seis meses), efeitos colaterais das drogas e a presença
de bacilos multirresistentes, têm dificultado a luta contra o bacilo (PETRINI;
HOFFNER, 1999).
2.1.2.2 Epidemiologia
A TB, apesar de ser uma doença milenar e de profilaxia com eficiência
considerável, é responsável pela infecção de um terço da população mundial,
destacando-se como a segunda causa de morte por doenças infecciosas no planeta
(WHO, 2010).
Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde, em 2009 foram
registrados cerca de 9,4 milhões de novos casos de TB, correspondendo a
incidência de 137 casos a cada 100 mil indivíduos (Figura 3), e uma mortalidade de
aproximadamente 1,3 milhões de mortes, equivalendo a 20 mortes a cada 100 mil
indivíduos. Em termos absolutos, 14 milhões de pessoas se encontram com a
doença, correspondendo a prevalência de 200 casos para cada 100 mil indivíduos
do planeta (WHO, 2010).
17
Figura 3. Incidência global da tuberculose para o ano de 2009. Fonte: World Health Organization, 2010.
O Brasil, apesar de avanços consideráveis no combate a doença, ainda
ocupa a 19ª posição entre as 22 nações que concentram 80% dos casos de TB no
mundo (WHO, 2010).
Apenas para o ano de 2009, foram estimados 87 (72-100) mil novos casos,
correspondendo a 45 casos a cada 100 mil indivíduos. Em termos absolutos, foram
estimados 96 (36 – 160) mil casos, equivalendo a uma prevalência de 50 casos a
cada 100 mil indivíduos. Quanto a mortalidade, 4 (2-7,5) mil óbitos foram registrados,
correspondendo a uma taxa de aproximadamente 2,1 mortes a cada 100.000
indivíduos, excluindo pacientes com co-infecção HIV/TB (WHO, 2010).
O estado de Pernambuco se destaca no cenário nacional, como a terceira
maior incidência, com 47,6 casos de TB a cada 100 mil habitantes, ficando atrás
apenas de estados como Rio de Janeiro (68,64 casos por 100 mil habitantes) e
Amazonas (67,88 por 100 mil habitantes). Apenas em 2010, foram confirmados mais
2.449 casos da doença em solo pernambucano (MINISTÉRIO DA SAÚDE/BRASIL,
2010).
2.1.2.3 Agente Etiológico – Mycobacterium tuberculosis
Atualmente são conhecidas mais de 120 diferentes espécies de
micobactérias, incluídas no gênero Mycobacterium. Este gênero taxonomicamente,
18
pertence à família Mycobacteriaceae e a ordem Actinomycetales (FRONTHINGHAM,
1995, TORTOLI, 2006).
O gênero Mycobacterium compreende espécies saprófitas de solo e uma
minoria de espécies patogênicas a espécie humana, causando enfermidades como:
a TB (M. tuberculosis, M. bovis e M. africannum) e lepra (M. lepra). Sua
nomenclatura foi inspirada nas características das culturas, que apresentam colônias
filamentosas semelhantes a culturas fúngicas. Ao microscópio, as micobactérias
formam bacilos típicos (TORTORA et al., 2005) (Figura 4).
Figura 4. Micrografia eletrônica do bacilo Mycobacterium tuberculosis.
Fonte: http://medicineworld.org/news/news-archives/infectiou-disease-news/March-9.2008.html
O M. tuberculosis é considerado uma forma de transição entre eubactérias e
os actinomicetos, medindo de 1 a 4 μm de comprimento por 0,3 a 0,6 μm de largura
e apresentado um complexo envelope celular e grande homogeneidade genética.
São bacilos imóveis, que não detêm a capacidade de produção de esporos e nem
de toxinas, sendo aeróbios estritos e possuindo como único reservatório, a espécie
humana. Por ser um parasita intracelular facultativo, pode sobreviver no interior de
células fagocitárias, estabelecendo sua infecção preferencialmente em pulmões,
onde em 90% dos casos se mantêm em estado de latência e sobre o controle do
sistema imunológico hospedeiro (KRITSKI et al., 2000).
As culturas micobacterianas são de coloração álcool-ácido resistentes, de
crescimento lento, com tempo de geração de 18 a 48 horas em meios artificiais e
modelos animais, com dependência de oxigênio, de nutrientes e do pH do meio
(KRITSKI et al., 2000; DUCATI et al., 2000).
A coloração álcool-ácido resistente, a resistência a drogas, a patogenicidade
e as taxas de crescimento lento das micobactérias, encontram-se relacionadas com
19
a estrutura lipídica de sua parede celular, a qual é constituída por uma porção
externa de ácido micólico que garante a formação de uma camada cérea,
hidrofóbica (TORTORA et al., 2005).
2.1.2.3.1 Transmissão
No transcurso da história, é clara a tendência humana em se reunir em
grupos populacionais, possibilitando uma associação direta com a transmissão do
bacilo M. tuberculosis (COBERLY; CHAISSON, 2001). Em condições naturais, é
transmitido pela expulsão de gotículas nasais de um indivíduo infectado para não
infectado, através das vias aéreas (KAUFINANN; SCHAIBLE, 2003; CLARK-
CURTISS; HAYDEL, 2003; HERNANDEZ-PANDO et al., 2009).
Pacientes com TB ativa apresentam um quadro típico de tosse, em
decorrência de uma inflamação crônica pulmonar, constituindo o principal
mecanismo de disseminação do bacilo para novos hospedeiros (COBERLY;
CHAISSON, 2001).
Ao tossir, espirrar ou falar, bacilos contidos na secreção pulmonar são
atomizados em gotículas microscópicas, que sofrem evaporação e permanecem em
suspensão no ar, sob a forma de um núcleo infeccioso compostos por um ou dois
bacilos. Este pequeno núcleo, medindo aproximadamente 2 a 10 μm de diâmetro,
pode ser aspirado e ultrapassar os mecanismos de defesa inespecíficos da árvore
respiratória, alcançando os alvéolos pulmonares, se instalando e dando início ao
processo patológico (BLOOM; MURRAY, 1992; CLARK-CURTISS; HAYDEL, 2003).
Embora os tecidos pulmonares representem a principal porta de entrada e um
importante local para instalação e manifestação da doença, a TB pode se manifestar
em diferentes tecidos, instalando uma lesão progressiva diretamente proporcional ao
número de bacilos inalados e a sua virulência, e inversamente proporcionais à
resistência natural e adquirida do hospedeiro (CLARK-CURTISS; HAYDEL, 2003;
HERRMANN; LAGRANGE, 2005; HERNANDEZ-PANDO et al., 2009).
20
2.1.2.4 Aspectos Imunopatológicos
Por se trata de uma doença crônica que essencialmente afeta os pulmões, a
TB ao longo de seu curso produz profundas alterações no sistema imunológico. Os
mecanismos imunológicos e patológicos atuam por meio de três tipos celulares:
células epiteliais, macrófagos e células dendríticas (DCs) (TAILLEUX et al., 2005;
NEYROLLES et al., 2006; HERNANDEZ-PANDO et al., 2009).
As células epiteliais alveolares se apresentam como fortes candidatas ao
posto de primeiro grupo celular a interagir com o patógeno, permitindo a replicação
do bacilo através da promoção de um ambiente pró-inflamatório, possibilitado pela
secreção da citocina interleucina-8 (IL-8) e pela produção de óxido nítrico
(HERNANDEZ-PANDO et al., 2009).
No entanto, a maioria dos estudos aponta os macrófagos alveolares como os
primeiros alvos para o M. tuberculosis (CLARK-CURTISS; HAYDEL, 2003;
HERRMANN; LAGRANGE, 2005; TAILLEUX et al., 2005; NEYROLLES et al., 2006).
Os macrófagos são responsáveis pelo englobamento de gotículas contendo o
bacilo. Uma vez internalizado em fagossomos, o M. tuberculosis promove a
liberação de fatores, bloqueiando a maturação dos fagossomos, impedindo o
processo de acidificação e a fusão com lisossomos, interferindo assim, na resposta
hospedeira (CLARK-CURTISS; HAYDEL, 2003; HERRMANN; LAGRANGE, 2005;
JÓZEFOWSKI et al., 2008).
O constante embate entre o bacilo, que tenta a todo custo sobreviver e se
multiplicar, e o sistema imune do hospedeiro, que visa conter e destruir o bacilo,
resulta em uma mudança constitucional do tecido no sítio da infecção, promovendo a
formação de tubérculos, que apresentam tecidos de característica sólida, com
inúmeros sítios de necrose, onde o bacilo pode se alojar e sobreviver, porém sem
prosperar (BLOOM; MURRAY, 1992; CLARK-CURTISS; HAYDEL, 2003).
Os macrófagos ativados promovem a destruição do bacilo, através do
recrutamento de células T, no limite externo do tubérculo. Se o tubérculo sofrer
necrose próximo a vasos sanguíneos, o bacilo pode adquirir a capacidade de se
disseminar para outras regiões do hospedeiro, continuando o ciclo de fagocitoses e
multiplicação em macrófagos. Mas, se o tubérculo necrosar na região dos
bronquíolos, o bacilo pode, potencialmente, ser transmitido para outros indivíduos
21
através das vias aéreas (BLOOM; MURRAY, 1992; CLARK-CURTISS; HAYDEL,
2003).
A dispersão do bacilo do sítio inicial de infecção nos pulmões para outros
órgãos como: pleura, órgãos linfáticos, ossos, sistema urogenital, meninges,
peritônio e pele, ocorre através de vasos linfáticos e sanguíneos, sendo a principal
rota para manifestação de TB extra-pulmonar, responsável por 15% dos casos de
TB (BLOOM; MURRAY, 1992).
O sucesso da infecção pelo M. tuberculosis depende, entre outros fatores, da
capacidade do bacilo sobreviver a diferentes mudanças ambientais e da capacidade
de subverter a função natural dos macrófagos pela inibição da maturação dos
mesmos e da fusão de fagossomos e lisossomos (CLARK-CURTISS; HAYDEL,
2003; JÓZEFOWSKI et al., 2008).
Alguns indivíduos infectados possuem a capacidade de controlar o
crescimento micobacteriano, através do recrutamento de grandes quantidades de
macrófagos ativados e de células T citotóxicas para região do tubérculo, visando à
reposição funcional dos macrófagos inativos. No entanto, alguns infectados
perderam essa capacidade, resultando em um ineficaz controle bacteriano, que
permite o crescimento do bacilo e uma reação hospedeira inespecífica em tecidos
pulmonares, conduzindo à fase progressiva e destrutiva da doença (CLARK-
CURTISS;HAYDEL, 2003).
Os processos patológicos e inflamatórios são responsáveis pela manifestação
dos principais sintomas da doença, como: fraqueza, febre, dor no peito, tosse e
erosão de vasos sanguíneos (BLOOM; MURRAY, 1992).
A partir desse ponto do ciclo, os indivíduos infectados e imunocompetentes
podem detectar a presença do patógeno e dar início a geração de uma resposta
imune, a qual, inicialmente, caracteriza-se por ser uma resposta inflamatória
inespecífica, promovida por componentes da imunidade natural do hospedeiro, que
visam à destruição de macrófagos infectados pelo bacilo e células vizinhas não
infectadas. Na medida em que os macrófagos sofrem lise, os bacilos, contidos em
seu interior, são processados e apresentados ao sistema imune, conduzindo a uma
resposta imune humoral e celular específicas contra o M. tuberculosis (CLARK-
CURTISS; HAYDEL, 2003).
22
A proteção a TB é efetuada, principalmente, através de dois mecanismos: a
ativação de macrófagos através de moléculas de interferon gama (IFN-γ) e da
interleucina 12 (IL-12), e da ativação da resposta celular através de células T helper
tipo 1 (Th1). Ademais, a destruição de M. tuberculosis por células T citotóxicas libera
uma combinação letal de perforinas e granulisinas, que podem contribuir para
proteção (KAUFINANN; SCHAIBLE, 2003; TAILLEUX et al., 2003; HERNANDEZ-
PANDO et al., 2009).
Juntamente com as células epiteliais e os macrófagos alveolares, as DCs têm
demonstrado desempenhar importante papel no contexto da TB (TAILLEUX et al.,
2005). Após a fase reativa inicial, onde a resposta imune inata é predominante e
direcionada a macrófagos ativados, entra em cena a resposta imune celular, a qual é
executada por DCs, visando restringir a infecção, conduzindo a uma fase crônica e
latente (GEIJTENBEEK et al., 2003; KOPPEL et al., 2004).
As DCs imaturas são observadas ao longo dos tecidos periféricos e na
mucosa do trato respiratório, atuando como sentinelas contra patógenos. A interação
entre o M. tuberculosis e as DCs imaturas, faz com que estas sofram maturação,
dando início assim, as suas primordiais funções: na captura, no processamento e na
apresentação de antígenos aos linfócitos T, por meio das proteínas do complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II e outras moléculas não
clássicas de MHC (KAUFINANN; SCHAIBLE, 2003; GEIJTENBEEK et al., 2003;
TAILLEUX et al., 2005; HERNANDEZ-PRADO et al., 2009).
Além desses importantes papéis, as DCs ainda possuem a capacidade de
migração do sítio inicial da infecção, juntamente com o patógeno capturado, para
órgãos linfóides periféricos, onde ativam células T naïve e iniciam a resposta imune
adaptativa (TAILLEUX et al., 2003; TAILLEUX et al., 2005; ARENTZ; HAWN, 2007;
HERNANDEZ-PRADO et al., 2009).
Assim, torna-se clara a existência de um balanço dinâmico entre a
persistência do bacilo e o desenvolvimento das defesas hospedeiras, implicando,
diretamente, no risco de desenvolvimento da forma ativa da doença, o qual é
estimado entre 1 a 10% durante toda vida, porém, episódios imunossupressivos
(como: co-infecção com HIV-1, processos quimioterápicos, estresse, desnutrição,
diabetes, etc) exacerba esse risco, para uma taxa anual de 1 a 10% no primeiro ano
após imunossupressão (CLARK-CURTISS; HAYDEL, 2003; HERRMANN;
LAGRANGE, 2005; HERNANDEZ-PANDO et al., 2009).
23
Enfim, o bacilo M. tuberculosis pode fazer uso de uma via supressiva,
desbalanceando a via pró-inflamatória (protetora), em favor de uma resposta anti-
inflamatória (supressiva), conduzindo o escape do patógeno a resposta imune
(KAUFINANN; SCHAIBLE, 2003).
2.2 Mecanismos Imunológicos Envolvidos na Resposta Hospedeira a
Patógenos
Ao longo do processo evolutivo, o organismo humano esteve
permanentemente exposto a uma grande diversidade de microrganismos, muitos
com características patogênicas. Essa exposição possibilitou o desenvolvimento de
um sistema de defesa dotado da capacidade de reconhecimento e combate a
agentes infecciosos, o sistema imunológico (MEDZHITOV; JANEWAY, 2002).
O sistema imunológico tem como função primordial, o reconhecimento e a
eliminação de agentes estranhos ao hospedeiro, seja pela remoção de células
mortas e/ou danificadas, e/ou pela destruição de células mutantes e cancerosas
(SIERRA et al., 2005; MAGNADÓTTIR, 2006).
O sistema imune humano, didaticamente, encontra-se subdividido em dois
ramos principais: a imunidade inata e a imunidade adquirida, ambas envolvidas em
respostas diferenciadas frente à patógenos, graças aos sistemas de
reconhecimento, tipos celulares e mecanismos de ação diferenciados, formando um
complexo sistema de interações e respostas com maior eficiência no controle e/ou
eliminação de patógenos (KIMBRELL; BEUTLER, 2001).
O sistema imune inato atua na primeira linha de defesa hospedeira, estando
envolvido no reconhecimento inicial e no englobamento de patógenos por células
fagocitárias profissionais tais como: DCs e macrófagos, através de receptores da
linhagem germinativa, conhecidos como receptores de reconhecimento padrões
(PRRs). Essas proteínas, presentes na superfície de células fagocitárias, ligam-se a
componentes microbianos conservados expressos por patógenos, denominados de
padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), desencadeando a resposta
imune (KIMBRELL; BEUTLER, 2001; SU et al., 2003).
24
Os PRRs se encontram envolvidos no processo de fagocitose e na
apresentação de antígenos, bem como, na sinalização intracelular e na secreção se
citocinas (KIMBRELL; BEUTLER, 2001).
A eficiência no reconhecimento inicial do patógeno pelo sistema imune inato,
é primordial para o desencadeamento de sinais endógenos que promovem a
indução da resposta imune adaptativa. Essa integração entre a resposta imune inata
e adaptativa pode resultar em importantes consequências na patogênese de
doenças infecciosas (KIMBRELL; BEUTLER, 2001; BEM-ALI et al., 2007).
Diversos trabalhos têm sugerido que alguns patógenos, como o vírus HIV-1 e
o bacilo M. tuberculosis, podem fazer uso de alguns PRRs para escapar da resposta
imunológica. Dentre os PRRs, destacam-se os receptores DC-SIGN (“Dendritic cell-
specific intercellular adhesion molecule-grabbing non-integrin”) e L-SIGN
(“Liver/lymph node-specific intercellular adhesion molecule-grabbing non integrin”),
os quais possuem a capacidade de ligação a ambos patógenos e atuam como uma
ponte entre a imunidade inata e adaptativa (KAUFMANN; SCHAIBLE, 2002; van
KOOYK; GEIJTENBEEK, 2003; van KOOYK, 2008).
2.2.1 Receptores DC-SIGN e L-SIGN
Os receptores DC-SIGN e L-SIGN descritos, respectivamente, por Curtis et al.
(1992) e Yokoyama-Kobayashi et al. (1999), são longas proteínas integrais trans-
membranas do tipo II, com pesos moleculares de aproximadamente 45.774 Da (DC-
SIGN) e 45.350 Da (L-SIGN), caracterizadas com lectinas tipo C, com forte
dependência de íons de cálcio e com alta afinidade de ligação em componentes
contendo carboidratos (STEINMAN, 2000; SOILLEUX, 2002; CHAUDHARY et al.,
2008; KHOO et al., 2008 A; WANG; PANG, 2008).
DC-SIGN e L-SIGN humanas são codificadas por genes pertencentes à
família CD209 (CD209 e CD209L, respectivamente), que juntamente com o gene
CD23, formam um agrupamento gênico, originado, provavelmente, de eventos de
duplicação gênica (SOILLEUX et al., 2000; MUMMIDI et al., 2001; BARREIRO et al.,
2005; ORTIZ et al., 2009).
25
Os genes CD209 e CD209L estão localizados no cromossomo 19p13.2-3 e
devido a sua grande proximidade física (~15 kb), encontram-se em equilíbrio de
ligação (SOILLEUX et al., 2000; BASHIROVA et al., 2001). Compartilham uma
mesma distribuição de introns e éxons (5 introns e 7 éxons) e apresentam,
aproximadamente, 77% de identidade entre suas sequências de aminoácidos
(BASHIROVA et al., 2001; PÖHLMANN et al., 2001; GEIJTENBEEK et al., 2001;
SOILLEUX, 2003; KHOO et al., 2008 A).
A principal diferença entre DC-SIGN e L-SIGN está em sua expressão em
diferentes tipos celulares (SOILLEUX et al., 2002; SOILLEUX, 2003).
DC-SIGN é altamente expresso em monócitos, em DCs derivadas de
monócitos, subconjuntos de DCs imaturas e maturas, e macrófagos; em vários
tecidos, como: derme, mucosa, baço, placenta (macrófagos especializados da
decídua e células de Hofbauer nos vilos coriônicos) e pulmões (macrófagos
especializados dos alvéolos pulmonares) (GEIJTENBEEK et al., 2000; SOILLEUX et
al., 2002; GUO et al., 2004; LIU et al., 2005; WU; KEWALRAMANI, 2006; van
KOOYK, 2008).
Em contraste, L-SIGN não é expresso em DCs in vivo, e/ou DCs derivadas de
monócitos in vitro. Sua expressão está limitada a células endoteliais presente em
tecidos como: linfonodos (células endoteliais no sinus subcapsular), fígado (células
endoteliais sinosoidais), placenta (células endoteliais de capilares), pulmão (células
alveolares e endoteliais) e intestino (capilares da lâmina própria e em placas de
Peyer) (SOILLEUX et al., 2000; BASHIROVA et al., 2001; PÖHLMANN et al., 2001;
SOILLEUX et al., 2002; SOILLEUX, 2003; GUO et al., 2004).
Estruturalmente, encontram-se organizados em três regiões distintas: um
domínio citoplasmático, um domínio transmembranar e um domínio extracelular
(GEIJTENBEEK et al., 2000; BASHIROVA et al., 2001; PÖHLMANN et al., 2001;
FIGDOR et al., 2003; KHOO et al., 2008 A) (Figura 5).
O domínio citoplasmático ou intracelular, codificado pelos éxons 1 e 2,
representa a parte N-terminal da proteína, a qual é composta por aproximadamente
40 aminoácidos, possuindo diversos motivos, como: motivos de di-leucina (LL),
YKSL e um grupamento triacídico (EEA), envolvidos no processo de internalização
de ligantes e transdução de sinais (GEIJTENBEEK et al., 2000; BASHIROVA et al.,
2001; PÖHLMANN et al., 2001; FIGDOR et al., 2003; van KOOYK; GEIJTENBEEK,
26
2003; ZHOU et al., 2006; KHOO et al., 2008 A). É nessa região também, que se
evidencia a maior divergência entre moléculas de DC-SIGN e LSIGN (BASHIROVA
et al., 2001).
Figura 5. Estrutura dos receptores DC-SIGN e L-SIGN
O domínio transmembranar, codificado pelo éxon 3, promove a interface entre
os domínios intra e extracelulares, sendo constituída por aproximadamente 18
aminoácidos (DC-SIGN) e 22 aminoácidos (L-SIGN) (SOILLEUX et al., 2000).
Após essa região, segue-se uma pequena sequência de aminoácidos N-
glicosilados, e posteriormente, o domínio extracelular, formado por uma região
repetida, correspondente ao pescoço da proteína (“neck”), e uma região de
reconhecimento de carboidratos (CRD) (GEIJTENBEEK et al., 2000; SOILLEUX et
al., 2000; BASHIROVA et al., 2001; PÖHLMANN et al., 2001; FIGDOR et al., 2003;
KHOO et al., 2008 A).
A região do pescoço ou “neck” da proteína, codificada pelo éxon 4, consiste
em uma estrutura em alfa-hélice, formada por sete repetições completa e uma
incompleta, organizadas em tandem, correspondentes a sucessão de 23
aminoácidos altamente conservados. Esta região, apresenta-se altamente
polimórfica no receptor L-SIGN, com o número de repetições variando de 4 a 10. Por
outro lado, no receptor DC-SIGN, o éxon 4 se apresenta menos polimórfico, com a
predominância de 7 repetições (FIGDOR, 2003; CHAUDHARY et al., 2008; KHOO et
al., 2008 A).
27
Estudos evolutivos sugerem que o gene codificador de DC-SIGN, encontra-se
sob forte pressão seletiva, que previne a acumulação de mudanças em aminoácidos.
Em contraponto, os polimorfismos em L-SIGN são atribuídos a uma seleção
balanceada. A região repetida do “neck” é considerada como alvo funcional dessas
forças seletivas, fazendo com que DC-SIGN apresente um número de repetições
constante na população mundial, e L-SIGN, um excesso de repetições em
populações não africanas (BARREIRO et al., 2005; ORTIZ et al., 2009).
A variação no número de repetições, entre as populações humanas, está
relacionada à ausência de repetições específicas no interior desta região, visto que
repetições próximas a região C e N terminal da proteína são altamente conservadas
(FEINBERG et al., 2005).
As regiões repetidas de DC-SIGN e L-SIGN desempenham um papel crucial
na afinidade de ligação de patógenos ao CRD, visto que, estão envolvidas na
orientação e na flexibilidade dos CRDs, e também, na estabilização das proteínas
em tetrâmeros (FEINBERG et al., 2005; SNYDER et al., 2005; GRANBERG et al.,
2006; BEM-ALI et al., 2007; KHOO et al., 2008 A; ORTIZ et al., 2009).
Proteínas com menos de 7 repetições resultam em uma dissociação parcial
do tetrâmero, enquanto proteínas com menos que 5 repetições apresentam uma
dramática redução na estabilidade total. Estas diferenças de estabilidade,
provavelmente, refletem em diferenças no empacotamento das 4 subunidades do
receptor, afetando a disposição dos CRDs e alterando a interação entre
componentes presentes na superfície de patógenos e os receptores (BARREIRO et
al., 2007; SNYDER et al., 2005; FEINBERG et al., 2005; YU et al., 2009).
Adicionalmente, as regiões repetidas de DC-SIGN e L-SIGN compartilham
altos níveis de identidade entre suas sequências, sugerindo a formação de homo-
tetrâmeros e hetero-tetrâmeros, os quais podem apresentar consequências
funcionais e alterações nos níveis de expressão da proteína, principalmente em L-
SIGN, em indivíduos heterozigotos para essa região (BASHIROVA et al., 2001;
SOILLEUX et al., 2002; SOILLEUX, 2003).
Na superfície das células, esses receptores se reúnem em tetrâmeros e essa
configuração parece ser necessária para interação de glicoproteínas com o CRD
(CHUNG et al., 2010).
28
O domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD), codificado pelos éxons
5, 6 e 7, em ambos os receptores, corresponde a porção C-terminal da proteína.
Encontra-se, flexivelmente, conectado a região repetida, formando uma estrutura
globular, constituída por 2 alfa-hélices, 12 cadeias beta e 3 pontes disulfito. Um
“loop” protrai da superfície da estrutura, permitindo a formação de sítios de ligação
para dois íons de Ca2+, os quais interagem com 4 aminoácidos (Glu347, Asn349,
Glu354 e Asn365) e garante o reconhecimento específico de carboidratos presentes
na superfície de patógenos (MUMMIDI et al., 2001; van KOOYK; GEIJTENBEEK,
2003; WU; KEWALRAMANI, 2006; ZHOU et al., 2006). Adicionalmente, o CRD
possui um motivo EPN, responsável pela alta afinidade de ligação de
oligossacarídeos, contendo manose (DC/L-SIGN) e/ou fucose (DC-SIGN)
(APPELMELK et al., 2003; GUO et al., 2004; GEIJTENBEEK et al., 2009).
Graças à capacidade de reconhecimento de oligossacarídeos, esses
receptores se encontram envolvidos no reconhecimento de uma vasta quantidade de
microrganismos de grande importância para saúde pública (KHOO et al., 2008).
O receptor DC-SIGN pode capturar vírus, como: o vírus do Ebola (ALVAREZ
et al., 2002), vírus da Hepatite C (HCV) (PÖHLMANN et al., 2003), vírus da Dengue
(TASSANEETRITHEP et al., 2003), Citomegalovírus (HALARY et al., 2002), SARS
Coronavírus (SARS-Cov) (JEFFERS et al., 2004; YANG et al., 2004); bactérias,
como: M. tuberculosis (TAILLEUX et al., 2003) e Helicobacter pylori (BERGMAN et
al., 2004); e parasitas como: Leishmania pifanoi (CAPARROS et al., 2005).
Já o receptor L-SIGN também, está envolvido na captura de vírus, como:
vírus de Ebola (ALVAREZ et al., 2002), vírus da Hepatite C (HCV) (PÖHLMANN et
al., 2003) e SARS Coronavírus (SARS-CoV) (JEFFERS et al., 2004), bem como,
bactérias, M. tuberculosis (KOPPEL et al., 2004) e parasitas, Leishmania infantum
(CAPARROS et al., 2005).
Também são atribuídos, aos receptores DC-SIGN e L-SIGN, o
reconhecimento e captura do vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), através
da interação desses receptores com a glicoproteína do envelope viral (gp120)
(GEIJTENBEEK et al., 2000; BASHIROVA et al., 2001; FEINBERG et al., 2001;
PÖHLMANN et al., 2001; SOILLEUX et al., 2002).
Uma característica central de patógenos que interagem com os receptores
DC-SIGN e L-SIGN é a capacidade de ocasionarem infecções crônicas que pode se
29
estender durante a vida do hospedeiro, e a manipulação do balanço entre células T
helper 1 e 2, cruciais para persistência do patógeno (van KOOYK; GEIJTENBEEK,
2003).
Além de componentes microbianos, DC-SIGN e L-SIGN detêm a capacidade
de reconhecer moléculas expressas em outros tipos celulares do hospedeiro como:
ICAM-2 e ICAM-3, capacitando-os a desempenhar inúmeras funções celulares de
extrema importância na resposta imune como: adesão, migração, sinalização celular,
ativação de células T, processamento e apresentação de antígenos, etc (ZHOU et
al., 2006).
A interação entre receptores DC-SIGN e moléculas de ICAM-2, expressa no
endotélio de vasos sanguíneos e linfáticos, permite o acoplamento e, posterior,
deslocamento do complexo ao longo do endotélio, atribuindo ao receptor
importantes papéis na adesão e deslocamento ao longo do endotélio, bem como na
migração celular (diapedese) do interior de vasos sanguíneos e linfáticos, para sítios
inflamatórios (BLEIJS et al., 2001; GEIJTENBEEK et al., 2002; SOILLEUX et al.,
2002; FIGDOR et al. 2003; GEIJTENBEEK; van KOOYK, 2003; SU et al., 2003;
SVAJGER et al., 2010).
Adicionalmente, o receptor DC-SIGN, também se encontra envolvido em
processos de internalização e processamento de antígenos. Após ligação de
moléculas solúveis oriundas do patógeno, procede-se a internalização, executada
por motivos presentes no domínio intracelular do receptor. A rápida internalização é
mediada por motivos de di-leucina, enquanto que motivos tri-acídicos marcam o
complexo ligado ao receptor e os encaminha para compartimentos lisossomais, onde
ocorre o processamento de antígenos, para posterior apresentação por moléculas
de MHC de classe II a células T (GEIJTENBEEK et al., 2002; GEIJTENBEEK; van
KOOYK, 2003; SVAJGER et al., 2010).
A eficiência destas lectinas, no reconhecimento e no, subsequente,
processamento, pode acarretar em importantes consequências na qualidade da
resposta imune hospedeira e no controle e/ou expulsão do patógeno (BARREIRO et
al., 2007).
O contato inicial entre DCs e células T também, é possibilitado por DC-SIGN,
através da ligação de alta afinidade com moléculas de ICAM-3. Essa interação
permite a estabilização do contato entre os dois tipos celulares, bem como, a
30
interação de células apresentadoras de antígenos com um vasto número de células
T em repouso, promovendo a ativação de receptores presentes nestas células, e
disparando a resposta imune (GEIJTENBEEK et al., 2000 A-B; BLEIJS et al., 2001;
SOILLEUX et al., 2002; FIGDOR et al., 2003; SU et al., 2003; van KOOYK;
GEIJTENBEEK, 2003; SVAJGER et al., 2010).
Vários patógenos que interagem com o receptor DC-SIGN parece explorar
vias de sinalização intracelular, visando subverter as funções naturais da célula, pela
inibição do processo de apresentação de antígenos ou pela alteração de vias de
sinalização mediadas por receptores “toll like” (TLRs), resultando em modificações
da resposta mediada por células T, conduzindo a sua ativação e/ou depressão
imune (ZHOU et al., 2006; SVAJGER et al., 2010).
As alterações na sinalização mediada por receptores TLRs, ocasionadas por
DC-SIGN, conduzem a ativação da serina/treonina cinase Raf-1, que dispara a
acetilação da subunidade p65 do fator de transcrição NF-kB, aumentando sua
atividade transcricional e a produção de interleucina-10 (IL-10), modulando a
resposta imune (ZHOU et al., 2006; den DUNNEN et al., 2009; GEIJTENBEEK et al.,
2009; GRINGHUIS et al., 2009).
A ligação de DC-SIGN a patógenos pode conduzir a inibição ou a promoção
da polarização de células T helper tipo 1 (Th1), da resposta por células Th2 e/ou da
indução da diferenciação de células T regulatórias (SVAJGER et al., 2010),
resultando, respectivamente, na ativação ou inibição da imunidade mediada por
célula contra patógenos intracelulares, da imunidade humoral contra patógenos
extracelulares e na supressão da resposta imune (GEIJTENBEEK et al., 2009).
No que se refere ao receptor L-SIGN, sua localização tecidual e afinidade de
ligação a patógenos, implicam em um papel fisiológico como receptor para limpeza e
eliminação de antígenos, bem como, de receptor de adesão entre células endoteliais
sinusoidais do fígado (L-SEC) e leucócitos (BASHIROVA et al., 2001;
GEIJTENBEEK et al., 2002).
Os altos níveis de expressão de L-SIGN no fígado podem possibilitar a
infecção de células hepáticas por determinados tipos virais (HIV-1), atuando como
reservatório para novos vírus e possibilitando o direcionamento destes para células
T, através de sinosóides hepáticos. Sua expressão em linfonodos, também sugere o
envolvimento na patogênese de algumas doenças, pela promoção da infecção de
31
células T nesse órgão, e um provável envolvimento na persistência de infecções
crônicas (FIGDOR et al., 2003; GEIJTENBEEK; VAN KOOYK, 2003).
A caracterização funcional aliada aos padrões de expressão em diferentes
tipos celulares sugere o envolvimento dos receptores DC-SIGN e L-SIGN no disparo
da resposta imune e em processo de escape imunológico por determinados
patógenos (GEIJTENBEEK et al., 2002; ZHOU et al., 2006; den DUNNEN et al.,
2009).
2.2.1.1 Papel dos Receptores DC-SIGN e L-SIGN na Infecção pelo HIV-1
DC-SIGN e L-SIGN são consideradas as primeiras lectinas associadas à
membrana com capacidade de aumentar a infecção pelo HIV-1. Embora não
considerados como receptores de entrada viral, trabalham eficazmente na captura
do HIV-1 da periferia, ajudando no transporte até órgãos linfóides secundários ricos
em células T, onde possibilitam a infecção de células T CD4+, atuando como pontes
entre a imunidade inata e a adaptativa (GEIJTENBEEK et al., 2000A;
GEIJTENBEEK et al., 2002; FIGDOR et al. 2003; SOILLEUX, 2003; van KOOYK et
al., 2003; WANG; PANG, 2008).
A interação de receptores DC-SIGN e L-SIGN com o vírus HIV-1 ocorre
através da conexão entre o CRD e a glicoproteína do envelope viral (gp120),
provavelmente através de sítios específicos para N-glicana, localizados no epitopo
2G12 (SOILLEUX, 2003; JI et al., 2006; HONG et al., 2007; KHOO et al., 2008;
WANG; PANG, 2008).
Essa ligação pode induzir mudanças conformacionais na proteína gp120,
capacitando uma interação mais eficiente com receptores CD4 e/ou chemocina, e
uma subsequente fusão de membrana com células T (GEIJTENBEEK; VAN KOOYK,
2003; van KOOYK et al., 2003; ZHOU et al., 2006).
A habilidade dos receptores DC-SIGN e L-SIGN em capturar e transmitir o
vírus HIV-1 para células T depende, em grande parte, da sua organização na
membrana e/ou capacidade de multimerização (GEIJTENBEEK et al., 2002).
Adicionalmente, eventos de splicings alternativos podem ocorrer em ambos os
genes, conduzindo a produção de um vasto repertório de isoformas solúveis e
32
associadas à membrana, afetando o progresso da transmissão do HIV-1 (MUMMIDI
et al., 2001; GEIJTENBEEK; VAN KOOYK, 2003; KHOO et al., 2008 A; BOILY-
LAROUCHE et al., 2009).
A afinidade de ligação da glicoproteína gp120 com receptores DC-SIGN e L-
SIGN, encontra-se diretamente associada ao estado de oligomerização e ao
comprimento da região repetida do “neck” em ambos receptores (SNYDER et al.,
2005). Receptores organizados em tetrâmeros apresentam maior afinidade de
ligação a gp120 que receptores organizados em monômeros (WU; KEWALRAMANI,
2006).
O vírus HIV-1 infecta células através de dois processos distintos: a infecção in
trans e a infecção in cis (Figura 6).
A infecção in trans ocorre quando o receptor DC-SIGN ou L-SIGN é expresso
em uma célula separada da que será infectada (BASHIROVA et al., 2001;
SOILLEUX, 2003; de WITTE et al., 2007). Por outro lado a infecção in cis acontece
quando receptores DC-SIGN são co-expressos com receptores CD4 e co-receptores
(CCR5 e CXCR4) em tipos celulares permissivos (LEE et al., 2001; SOILLEUX,
2003; van KOOYK et al., 2003; WU; KEWALRAMANI, 2006; de WITTE et al., 2007;
CHUNG et al., 2010).
Figura 6. Formas de transmissão do vírus HIV-1. A – Infecção in trans; B – Infecção in cis.
A co-expressão de receptores CD4, CCR5 e CXCR4, juntamente com DC-
SIGN, ocasiona aumento na eficiência da infecção promovida pelo HIV-1, sugerindo
seu envolvimento na transmissão viral in cis (LEE et al., 2001).
33
A infecção pelo HIV-1 in trans é compartilhada tanto por receptores DC-SIGN,
quanto por receptores L-SIGN. No entanto, a infecção in cis, até o momento, só foi
evidenciada para o receptor DC-SIGN (PÖHLMANN et al., 2001).
DC-SIGN, como receptor de adesão específico de DCs, está envolvido em
várias etapas da infecção pelo HIV-1. Sua expressão em DCs imaturas, em tecidos
periféricos, permite a rápida captura viral, processamento em antígenos e migração
para tecidos linfóides, onde ocorre a maturação deste tipo celular, permitindo a
apresentação eficiente de antígenos a células T CD4, as quais, sofrem ativação e
diferenciação, promovendo a resposta imune (van KOOYK et al., 2003).
O contato entre DCs e células T, mediado por receptores DC-SIGN, expresso
em DCs, e moléculas de ICAM-3, expressos em linfócitos T, possibilita também a
interação de partículas virais ligadas a receptores DC-SIGN com receptores de
entrada viral (CD4, CCR5) presentes na membrana dos linfócitos, permitindo uma
eficiente transmissão viral (STEINMAN, 2000; BARIBAUD et al., 2001;
GEIJTENBEEK; VAN KOOYK, 2003).
Após a ligação ao receptor DC-SIGN, o vírus pode seguir três rotas distintas.
Na primeira rota, o HIV-1 pode ser internalizado pela célula em compartimentos não
lisossômicos, onde fica protegido do processamento de antígenos e retém sua
infectividade por prolongados períodos. Posteriormente, podem ser reciclados para a
superfície celular, onde pode interagir e infectar linfócitos T CD4+ (GEIJTENBEEK et
al., 2000; BASHIROVA et al., 2001; GEIJTENBEEK et al., 2002; SOILLEUX et al.,
2002; GEIJTENBEEK; van KOOYK, 2003; van KOOYK et al., 2003; ZHOU et al.,
2006; SVAJGER et al., 2010).
Na segunda rota, uma produtiva infecção pelo HIV-1 pode ser estabelecida
em DCs e os vírus produzidos podem infectar células susceptíveis nos arredores,
como células T CD4+. Esse mecanismo é possibilitado pela redução na
internalização de DC-SIGN, que aumenta a adesão célula-célula e a infecção in
trans de células T CD4+ (GEIJTENBEEK et al., 2002; van KOOYK et al., 2003;
GARG et al., 2007).
Na terceira e última rota, o HIV-1 pode ser internalizado por DCs, sofrendo
processamento de antígenos pela maquinaria endossomal e/ou lisossômica, para
depois ser apresentado a células efetoras, via moléculas de MHC de classe I e II. No
34
entanto, o tráfego intracelular do vírus ligado a DC-SIGN, depende do status de
maturação das DCs (van KOOYK et al., 2003; GARG et al., 2007).
Receptores DC-SIGN também podem aumentar a infecção de células T, em
baixas concentrações virais, sugerindo este receptor como crucial para rápida e
eficiente infecção de células T em baixos níveis de HIV-1, como no início da infecção
in vivo (GEIJTENBEEK et al., 2000; GEIJTENBEEK et al., 2002; van KOOYK et al.,
2003; CHUNG et al., 2010).
Além das propriedades de adesão e reconhecimento de patógenos, DC-SIGN
pode ativar vias de transdução de sinais, conduzindo a modulação da resposta
imune através de receptores TLRs, resultando no aumento da produção de IL-10 e
na supressão da função estimulatória de células T, acarretando na supressão da
resposta imune adaptativa (GRINGHUIS et al., 2009; GRINGHUIS et al., 2010;
SVAJGER et al., 2010).
Similarmente ao DC-SIGN, L-SIGN atua na captura do HIV-1 através da
ligação de alta afinidade com a glicoproteína viral gp120, promovendo o aumento da
infecção de células T in trans (PÖHLMANN et al., 2001; KHOO et al., 2008). No
entanto, L-SIGN pode promover a internalização e a degradação viral, através de
mecanismos dependente de proteossomos, garantindo uma conotação diferenciada
quanto ao papel deste receptor, bem como no resultado da infecção pelo HIV-1
(BOILY-LAROUCHE et al., 2009). Sua atuação na infecção pelo HIV-1, pode ocorrer
mais tardiamente, provavelmente, após a entrada viral (SOILLEUX et al., 2002).
L-SIGN funciona como um receptor de ligação universal para lentivírus de
primatas e sua presença pode influenciar na transmissão vertical do HIV-1 e no
aumento da infecção de células alvos nos linfonodos (PÖHLMANN et al., 2001).
A expressão de L-SIGN nos linfonodos, em células endoteliais de sinosóides,
representa um mecanismo óbvio utilizado por vírus livres para infectar T CD4+. Este
tipo celular detém a capacidade de apresentação de antígenos a células T,
possibilitando que vírus livres interajam com receptores L-SIGN, e posteriormente,
seja apresentado a células T, mecanismo também compartilhado por células
endoteliais dos sinusóides hepáticos (LSECs) (BARIBAUD et al., 2001; PÖHLMANN
et al., 2001; SOILLEUX et al., 2002; FIGDOR et al., 2003).
No fígado, a expressão de receptores L-SIGN em LSECs, sugere o contínuo
contato destas células com leucócitos, possibilitando a captura do HIV-1 diretamente
35
do sangue, para posterior infecção de células T in trans. No entanto, estudos têm
indicado que LSECs, por si só, são susceptíveis a infecção pelo HIV-1, possibilitando
ao L-SIGN promover a infecção dessas células, estabelecendo assim um
reservatório para produção de novos vírus que podem ser direcionados a linfócitos T
através de sinosóides hepáticos (BASHIROVA et al., 2001; GEIJTENBEEK et al.,
2002).
Tecidos placentários e hepáticos abrigam células endoteliais, expressando L-
SIGN, nas proximidades de outros tipos celulares, expressando receptores de
entrada viral (CD4 e CCR5), permitindo a infecção dessas células in trans
(BARIBAUD et al., 2001; SOILLEUX et al., 2002; FIGDOR et al., 2003). Ademais,
tem sido atribuído aos receptores L-SIGN a função fisiológica de liberação de
antígenos virais, que pode garantir um papel protetor pela retirada do vírus da
circulação (BASHIROVA et al., 2001).
Alguns estudos sugerem que DC-SIGN e L-SIGN, efetivamente, bloqueiam o
brotamento do HIV-1 em células infectadas. Ensaios de co-transfecção
apresentaram uma redução na produção viral em células hospedeiras em torno de
99,5%, bem como, uma inibição de 90-95% na geração de HIV a partir de células
infectadas. Adicionalmente, DC-SIGN mostrou-se responsável pela redução na
quantidade de gp120 na membrana, e uma completa eliminação desta molécula em
vírus produzidos nas células hospedeiras, sugerindo que o bloqueio no brotamento
do HIV-1 ocorreu, provavelmente, pela internalização da gp120 induzida por DC-
SIGN (WANG; PANG, 2008).
2.2.1.1.1 Papel dos Receptores DC-SIGN e L-SIGN na Transmissão Vertical do
HIV-1
A placenta humana é responsável por uma justaposição fechada entre o
sangue fetal e o sangue materno. Essa aparente barreira se mostrar permeável ao
vírus HIV-1, possibilitando a exposição fetal a partículas virais (VELILLA et al.,
2008).
Alguns tipos celulares são apontados como prováveis alvos para o
espalhamento viral como: macrófagos da decídua e macrófagos especializados da
placenta, denominados células de Hofbauer. Tanto os macrófagos deciduais, quanto
36
as células de Hofbauer, desempenham importantes papéis na fisiologia placental,
promovendo o desenvolvimento e o controle do fluxo sanguíneo (macrófagos
deciduais) e agindo na defesa contra agentes infecciosos (células de Hofbauer)
(SOILLEUX et al., 2001).
As células de Hofbauer detêm a capacidade de suporte da infecção pelo HIV-
1, em ensaios in vitro e in vivo. Essa capacidade, provavelmente, encontra-se
associada à expressão de receptores celulares relacionados aos linfócitos T como:
CD4, CCR5 e CXCR4. Adicionalmente, outros receptores celulares, particularmente
DC-SIGN e L-SIGN, também parecem está envolvidos nesse processo (SOILLEUX;
COLEMAN, 2003).
A co-expressão de receptores CD4, CCR5 e CXCR4 com receptores DC-
SIGN, tem sido apontada como responsável pelo aumento na eficiência da infecção
pelo HIV-1 in cis, sugerindo a participação de DC-SIGN na transmissão viral em
circunstâncias onde os níveis de expressão de receptores para entrada do vírus são
baixos ou limitantes. Além de aumentar a eficiência da infecção in cis, DC-SIGN
também participa como mediador da infecção de linfócitos T CD4+ in trans
(SOILLEUX et al., 2001; SOILLEUX; COLEMAN, 2003).
Durante a gravidez, há um aumento da expressão de receptores DC-SIGN em
células Hofbauer nos vilos coriônicos, podendo refletir em aumento nas taxas de
transmissão viral de mãe para filho. DC-SIGN pode promover a interação entre HIV-
1 e células Hafbauer proporcionando um mecanismo eficaz pelo qual o vírus pode
ser transmitido para outros receptores virais in trans (SOILLEUX et al., 2001).
A principal barreira física entre as células Hofbauer e os fluídos maternos,
encontra-se na parede formada por células trofoblásticas. Esse tipo celular expressa
receptores de entrada para o HIV-1 que permitem a infecção. Além disso, brechas
na parede de trofoblastos, ocasionadas por processos espontâneos ou em
consequência de infecções (corioamniotite) e hábitos sociais (tabagismo e consumo
de drogas), possibilitam o contato direto entre células Hofbauer fetais (DC-SIGN+
CD4+ CCR5+ CXCR4+) com partículas virais adsorvidas a macrófagos da decídua
materna ou DCs (DC-SIGN+) presentes no sangue materno, possibilitando uma
eficiente disseminação viral em células fetais expressando receptores de ligação e
entrada ao HIV-1 (MOUSSA et al., 1999; SOILLEUX et al., 2001;
SOILLEUX;COLEMAN, 2003; NEWELL, 2006) (Figura 7).
37
Figure 7. Estrutura esquemática da placenta e características envolvidas na transmissão transplacental do HIV-1. Existe uma intima relação entre tecidos fetais e maternos na placenta. Populações de leucócitos residentes em ambos os lados são indicados. DC-SIGN é expresso em celulas Hofbauer fetalmente derivado em vilos coriônicos e em macrófagos da decídua materna. Essas populações de células estão muito próximas. L-SIGN é expresso no endotélio de capilares da placenta. Fonte: SILVA et al., 2011.
Estudos têm sugerido que o mecanismo de associação entre o HIV-1 e
células permissíveis ao vírus opera eficazmente em gestações onde a viremia
permanece baixa, devido à administração de terapias anti-retrovirais (SOILLEUX et
al., 2001). A ligação de partículas virais ao DC-SIGN permite concentrar essas
partículas na superfície das DCs, aumentando a probabilidade de entrada via ligação
a receptores CD4 e co-receptores em células-alvo. Adicionalmente, o vírus aderido a
DC-SIGN, pode permanecer viável por vários dias, possibilitando uma transferência
mais eficiente para células T, quando comparada a transferência executada por vírus
não associados à célula (BARIBAUD et al., 2001; GEIJTENBEEK; van KOOYK,
2002; SOILLEUX, 2003).
Três mecanismos foram propostos para explicar a transmissão trans-placental
do HIV-1 (SOILLEUX et al., 2001; SOILLEUX, 2003; SOILLEUX; COLEMAN, 2003):
O primeiro, sugere que as células Hofbauer infectadas pelo HIV-1 ou com o vírus
adsorvidos a receptores DC-SIGN, podem entrar no feto através da veia
umbilical;
38
O segundo, sugere que células Hofbauer infectadas pelo HIV-1 ou com o vírus
adsorvidos a receptores, permanece in situ nos vilos coriônicos, promovendo a
apresentação de antígenos e, posterior, infecção de linfócitos T. No entanto, este
mecanismo parece improvável, uma vez que os linfócitos T são imperceptíveis
nos vilos coriônicos;
O terceiro, sustenta que as células Hofbauer podem ser infectadas pelo HIV-1 e
liberarem partículas virais infecciosas, que podem ser adsorvidas aos receptores
L-SIGN expressos em células endotéliais, imediatamente adjacentes a capilares
placentários. O endotélio, por sua vez, pode mediar a infecção pelo HIV-1 em
linfócitos T receptores positivos circulantes no sangue. Os linfócitos T e/ou
células Hofbauer infectadas ou com vírus adsorvido em sua superficie pode se
deslocar entre a placenta e o feto através do sangue umbilical.
2.2.1.2 Papel dos Receptores DC-SIGN e L-SIGN na Infecção pelo M.
tuberculosis
O M. tuberculosis detém a capacidade de se ligar a diversos receptores
celulares e opsoninas, aumentando o contato entre as células hospedeiras
permissíveis a infecção (NEYROLLES et al., 2006). A ligação de PAMPs, como o
lipoarabinomanose (ManLAM) presente na parede celular do M. tuberculosis, aos
receptores ligadores de cálcio (CLRs) (DC-SIGN), presentes em macrófagos e em
DCs, garante o reconhecimento, a entrada e a regência da resposta inflamatória
(JÓZEFOWSKI et al., 2008).
O receptor DC-SIGN media a entrada do M. tuberculosis em DCs in vivo,
apresentando provável papel na persistência do patógeno e na imunidade
hospedeira. A interação entre DCs e o bacilo ou componentes de sua parede celular,
como ManLAM, é tida como chave para a atividade anti-microbiana da imunidade
(GEIJTENBEEK et al., 2003; KOPPEL et al., 2004).
A ligação do bacilo aos receptores DC-SIGN inibi a função imuno-
estimulatória das DCs, prevenindo a maturação e induzindo a produção da citocina
imune supressiva IL-10, resultando na sobrevivência e na persistência do bacilo no
hospedeiro (MAEDA et al., 2003; KOPPEL et al., 2004; HERRMANN; LAGRANGE,
2005; TAILLEUX et al., 2005), visto que a eficiência na apresentação de antígenos e
39
a construção da resposta imune são comprometidas (ARENTZ; HAWN, 2007;
TORRELES et al., 2008)
A defesa hospedeira a infecção por M. tuberculosis, através de DCs, envolve
a sinalização intracelular por meio de receptores TLR2 e TLR4, os quais afetam o
balanço entre células Th1 e células Th2, assegurando o disparo de diferentes vias
de sinalização em células apresentadoras de antígenos (GEIJTENBEEK et al., 2003;
JO, 2008; JÓZEFOWSKI et al., 2008; HERNANDEZ-PANDO et al., 2009).
A cooperação entre diferentes vias de sinalização inata induzida por PRRs,
em DCs, é crucial para construção da imunidade adaptativa ao patógeno. O receptor
DC-SIGN induz a resposta imune específica através da montagem de um
sinalossomo diferencial, após o reconhecimento específico de carboidratos
constituintes de patógenos (GRINGHUIS et al., 2009).
A estimulação de receptores DC-SIGN por ManLAM micobacteriano, faz com
que o complexo sinalossômico, formado por proteínas de arcabouço (LSP1, KSR1,
CNK), recrute proteínas efetoras da proteína serina-treonina quinase Raf-1, como
LARG e RhoA, formando o sinalossomo e ativando Raf-1, que por sua vez acetila a
subunidade p65 do fator NF-kB, prolongando a atividade transcricional e aumenta a
taxa de expressão de IL-10, IL-12 e IL16 (GRINGHUIS et al., 2009).
A regulação dinâmica da composição do sinalossomo de DC-SIGN,
provavelmente, trata-se da base molecular para a plasticidade que tal receptor
apresenta na formação da imunidade (GRINGHUIS et al., 2009). Assim, torna-se
clara a existência de um balanço dinâmico entre a persistência do bacilo e o
desenvolvimento das defesas hospedeiras, implicando diretamente no risco de
desenvolvimento da doença.
Alguns estudos, também sugerem o envolvimento do receptor L-SIGN no
escape da vigilância imunológica e na patogênese da TB, visto que possui a
capacidade de se ligar a ManLAM e rapidamente internalizar o bacilo em organelas
lisossômicas. Assim, L-SIGN pode estar envolvido na eliminação do bacilo, desde
que se encontra expresso em outros tecidos como: linfonodos e fígado, locais de
captura de antígenos e eliminação. Entretanto, também existe a possibilidade de
bacilo alvejar L-SIGN para invadir esses tecidos e estabelecer a doença (KOPPEL et
al., 2004).
40
2.3 Variabilidade Genética Humana
Fatores genéticos do hospedeiro desempenham um importante papel na
susceptibilidade e na proteção a infecção pelo HIV-1, bem como, no
desenvolvimento da TB. Embora vários genes tenham sido relacionados à
resistência e à susceptibilidade a essas infecções, o papel de variações genéticas
nestes genes, ainda permanece por ser desvendado (BELLAMY, 1998; BURGNER
et al., 2006; LAMA; PLANELLES, 2007; MÖLLER; HOAL, 2010).
O Projeto Genoma Humano, permitiu a descoberta de milhares de variações
genéticas, sendo o tipo mais comum, denominado de polimorfismos de base única,
ou simplesmente, SNP (do inglês: “single nucleotide polymorphism”). Estima-se que
a cada 1000 ou 2000 pares de base, exista um SNP (SACHIDANANDAM et al.,
2001).
Conceitualmente, SNPs são variações (substituição/supressão ou
deleção/inserção) de um único par de bases de um nucleotídeo em um loci
específico, normalmente, constituídos por dois alelos. São pontuais, estáveis e
distribuídos por todo genoma, bem como representam a maior fonte de variação
inter-individuais (GRAY et al., 2000; BRAY et al., 2001; FRAZER et al., 2009;
KUBISTOVA et al., 2009).
Normalmente, encontram-se associados à diversidade populacional, a
individualidade, susceptibilidade a doenças e resposta individual a medicamentos,
mostrando-se como uma extraordinária ferramenta na análise de marcadores
genéticos devido a sua abundância (SCHWRTZ et al., 1999).
Dentro de uma população, a frequência de um alelo pode ser atribuída à
relação entre os SNPs que a população carrega, estando o variante mais comum em
maior frequência na população, em relação aos variantes raros. Nas populações
humanas, existem acentuadas diferenças em relação à distribuição desses variantes
(GRAY et al., 2000).
Os SNPs mais comuns são os de transição (substituição de uma base púrica
por outra púrica) e os de transversão (substituição de uma base púrica por uma
pirimídica, ou vice-versa), apresentando papéis diferenciados de acordo com a
localização no genoma (WENZ, 1999).
41
SNPs localizados nas porções 5’-UTR e/ou 3’UTR (regiões não traduzidas) de
um gene podem ser responsáveis por alterações substanciais na síntese protéica,
interferindo na afinidade de ligação de fatores de transcrição, podendo ocasionar
aumento ou diminuição na quantidade de proteínas produzidas (NOWOTNY et al.,
2001; SACHIDANANDAM et al., 2001).
Por outro lado, SNPs localizados na ORF (quadro aberto de leitura) do gene,
podem induzir alterações na composição de aminoácidos da sequência protéica,
afetando o enovelamento da proteína ou, mesmo, aumentando, diminuindo ou
anulando a atividade protéica (NOWOTNY et al., 2001).
Os SNPs ganharam considerável espaço, junto aos geneticistas moleculares
na década de 90, principalmente, devido ao interesse em saber o papel dessas
variações em doenças multifatoriais, como câncer e diabetes. No entanto, a
importância de SNPs em genes envolvidos em infecções tem demandado amplo
interesse de diversos grupos de pesquisa em todo mundo (GREY et al., 2000).
Nesses experimentos, perfis genéticos de populações acometidas por
determinadas doenças são comparados com perfis de populações saudáveis,
visando associar as variações com a susceptibilidade e/ou proteção à doença, por
meio de ferramentas estatísticas (KLOTMAN; CHANG, 2006).
Assim, genes relacionados à codificação de proteínas do sistema imune inato
e adaptativo têm ganhado destaque na maioria dos estudos, devido a seus
consideráveis papéis na defesa hospedeira contra diversas infecções virais, fúngicas
e bacterianas (KLOTMAN; CHANG, 2006).
2.3.1 Polimorfismos nos Genes Codificadores de DC-SIGN e L-SIGN
relacionados com Infecções
Vários polimorfismos têm sido descritos para os genes codificadores de DC-
SIGN e L-SIGN, merecendo destaque: os polimorfismos de base única (SNPs) e
polimorfismos no número de repetições, muitos dos quais, associados com a
susceptibilidade e resistência a diversas doenças humanas.
Para o gene DC-SIGN, SNPs contidos na região promotora podem promover
alterações significativas nos processos transcricionais, visto que estão próximos a
42
sítios de ligação para fatores de transcrição (SAKUNTABHAI et al., 2005). Na tabela
3, encontram-se descritos os principais polimorfismos para essa região e suas
prováveis associações.
Tabela 3. Polimorfismos da região promotora do gene DC-SIGN e associações com a susceptibilidade e proteção a infecções.
SNPs Variante Infecção Associação Referência
- 139 (G/A)
-139 G HIV-1 Aceleração da doença Koizumi et al., 2007 -139 G Citomegavirus Reativação Viral Menzer et al., 2008 -139 A HTLV-1 Proteção Kashima et al., 2009
- 336 (A/G)
-336G HIV-1 Susceptibilidade ao HIV-1 Martin et al. 2004 -336G
Dengue
Proteção a forma clássica e
susceptibilidade a forma hemorrágica Sakuntabhai et al.,
2005
-336A Tuberculose Proteção Barreiro et al., 2006 -336G e -336GG
Tuberculose Proteção Vannberg et al., 2008
-336GG HIV-1/TB Proteção (HIV-1) e susceptibilidade (TB) Selvaraj et al., 2009 -336A HTLV-1 Susceptibilidade Kaschima et al., 2009
- 871 (A/G) -871G Tuberculose Proteção Barreiiro et al., 2006 - 939 (G/A) -939G Citomegalovírus Reativação viral e com a doença Menzer et al., 2008
Além da região promotora, SNPs foram identificados em regiões intrônicas
(In2+11) e na região 3’UTR de DC-SIGN, atuando de forma decisiva na expressão
gênica, através de uma variada gama de mecanismos envolvendo ligação diferencial
de fatores de transcrição, alterações no processamento, na estabilidade e na
transcrição em mRNA (SELVARAJ et al., 2009).
Tabela 4. Polimorfismos no número de repetições do éxon 4 de DC-SIGN e L-SIGN e associações com a susceptibilidade e proteção a infecções.
Gene Variante Infecção Associação Referência
DC-SIGN (Éxon 4)
Alelos < 5 HIV-1 Proteção Liu et al., 2004
Éxon4 Tuberculose Não associado Gómez et al. 2006 Éxon4 Tuberculose Não associado Barreiro et al., 2007 Éxon4 Tuberculose Não associado Bem-Ali et al., 2007
Genótipos Heterozigotos HIV-1 Proteção Wichurkchinda et al., 2007
Éxon4 HIV-1 Não associado Zhang et al., 2008 Éxon4 HIV-1-TB Não associado Alagarasu et al., 2009
L-SIGN (Éxon 4)
Genótipo Homozigoto SARS-CoV Proteção Chan et al., 2006 Genótipo 7/7 HI-1 Susceptibilidade Liu et al., 2006
Genótipo 7/5 Proteção Genótipos 9/5 e 7/5 HIV-1 Proteção Wichurkchinda et al.,
2007 Genótipo Homozigoto SARS-CoV Proteção Khoo et al., 2008
Genótipo 5/5 HIV-1 Proteção Rathore et al., 2008 Alelo 9 HIV-1 Susceptibilidade Xu et al., 2010
Adicionalmente, outros estudos associaram polimorfismos no número de
repetições do éxon 4 de DC-SIGN e L-SIGN com a susceptibilidade e resistência a
43
diversas enfermidades (GRAMBERG et al., 2006; WICHUKCHINDA et al., 2007;
CHAUDHARY et al., 2008; RATHORE et al., 2008; ZHANG et al., 2008), conforme a
tabela 4. Observa-se uma variada gama de efeitos das variações de DC-SIGN e L-
SIGN dentro de uma mesma doença, o que pode ser atribuído a diferenças na
distribuição de genótipos e alelos em diferentes populações.
2.4 Metodologias para Estudo de Variações Genéticas
2.4.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A tecnologia da PCR, desenvolvida por Kary Mullis nos anos 80, tornou-se
uma das principais ferramentas da biologia molecular e permitiu um enorme avanço
no sequenciamento do genoma humano, na expressão de genes recombinantes, na
determinação rápida e eficiente dos testes de paternidade e de doenças de cunho
genética e/ou infeccioso (NOVAIS et al., 2005).
A técnica de PCR consiste na amplificação de uma determinada região
genômica in vitro, estando baseada no princípio de complementariedade de bases
da molécula de DNA. Sabe-se que o DNA é formado por duas longas fitas de
nucleotídeos complementares, que através do estabelecimento de pontes de
hidrogênio permite a formação da dupla hélice, onde bases nitrogenadas adenina
(A) se pareiam com timina (T) e guanina (G) com citosina (C). Essa
complementariedade possibilita a replicação semiconservativa do DNA, onde uma
fita serve de molde para que a outra fita possa ser copiada através de enzimas,
como DNA polimerase (WILHELM; PINGOUD, 2003).
De forma similar, a PCR é composta por oligonucleotídeos (primers)
complementares a fitas de DNA, enzima DNA polimerase termoestável,
deoxinucleotídeos e outros fatores que atuam no curso da reação. Os
oligonucleotídeos sintéticos ou primers, permitem a demarcação da região de
interesse do material genético estudado, possibilitando a DNA polimerase promover
a cópia da região de interesse (MULLIS, 1990; WILHELM; PINGOUD, 2003).
Basicamente consiste, nas seguintes etapas:
44
Desnaturação, onde a dupla fita de DNA da amostra é aquecida a 95ºC,
permitindo a separação das fitas (desnaturação);
Anelamento, fase na qual, ocorre o pareamento dos oligonucleotídeos sintéticos
(primers) nas extremidades da região de interesse, requerendo a diminuição da
temperatura de reação para a faixa de 50 a 60ºC
Extensão, etapa onde sob temperatura ótima de 70-78ºC, a DNA polimerase se
acopla a fita, promovendo a cópia da região desejada.
Essas etapas são repetidas entre 35-40 vezes, sendo que o produto
resultante de cada ciclo pode ser usado como molde para o próximo, visto que a
DNA polimerase é termoestável e continua funcional, dobrando a quantidade de
DNA a cada ciclo. Ao fim da reação, a região estudada terá sido amplificada
milhares de vezes, facilitando a verificação da presença de variantes genéticas,
através de eletroforese em gel ou, mesmo, sequenciamento (MULLIS, 1990;
WILHELM; PINGOUD, 2003).
2.4.1.1 PCR em Tempo Real
Primeiramente descrita por Higuchi et al. (1992), a PCR em tempo real é uma
variante da PCR convencional utilizada para análises qualitativas (detecção de
polimorfismos) e quantitativas (quantificação de material genético, expressão, etc),
com a vantagem de não serem necessárias manipulações pós-reação, evitando
contaminações e/ou perdas de amostras (HIGUCHI et al., 1992; PONCHEL et al.,
2003; WILHELM; PINGOUD, 2003; NOVAIS et al., 2005).
Essa técnica baseia-se na detecção de moléculas fluorescentes, as quais
aumentam a emissão de fluorescência quando o produto da PCR se acumula em
cada ciclo da amplificação. A emissão da fluorescência é gravada durante cada ciclo
e representa a quantidade do produto amplificado. A plataforma da PCR em tempo
real requer um sistema ótico para excitação da fluorescência e outro para a
recepção da emissão. As informações adquiridas são transmitidas para softwares
que analisam e calculam os dados finais da reação (PONCHEL et al., 2003;
WILHELM; PINGOUD, 2003; NOVAIS et al., 2005; DUSSAULT et al., 2006).
45
A fluorescência emitida é produzida por fluoróforos específicos para DNA de
dupla fita (Sybr Green®) ou por fluoróforos sequência-específicos (TaqMan®)
(WILHELM; PINGOUD, 2003).
Fluoróforos específicos para DNA dupla fita (Sybr Green®) são moléculas
fluorescentes que se intercalam entre as fendas da dupla fita de DNA, permitindo um
aumento da fluorescência a cada ciclo de PCR, de maneira proporcional a
quantidade de produto gerado, permitindo a quantificação do material genético. Por
se ligar a dupla fita, pode gerar sinais inespecíficos (PONCHEL et al., 2003;
WILHELM; PINGOUD, 2003).
Diferentemente, fluoróforos alelo-específicos (TaqMan®) se ligam a um único
alvo, sendo amplamente utilizadas para detecção de SNPs. Consiste de um par de
primers e pelo menos um par de sondas. Cada sonda possui duas moléculas
acopladas em suas regiões 5’ e 3’: uma fluorescente (“reporter”) e outra que absorve
a fluorescência da primeira (“quencher”) (PONCHEL et al., 2003; WILHELM;
PINGOUD, 2003).
Durante a PCR, esta sonda se hibridiza na região do polimorfismo de
interesse, permitindo que os primers se anelem nas regiões vizinhas. A DNA
polimerase promove a extensão da cadeia até encontrar o local onde a sonda está
hibridizada, promovendo a hidrólise da sonda. Com o “reporter” livre do “quencher”,
há emissão de fluorescência específica para o alelo encontrado naquela região,
permitindo a genotipagem de acordo com a fluorescência emitida (HOLLAND et al.,
1991; PONCHEL et al., 2003; WILHELM; PINGOUD, 2003).
2.4.2 Sequenciamento de DNA
Descrita inicialmente por Sanger et al. (1977), consiste em uma reação muito
semelhante à PCR, constituída por um primer e uma mistura de dideoxinucleotídeos
(ddNTPs) e deoxinucleotídeos (dNTPs), em um proporção 1/100. Os ddNTPs são
análogos aos nucleotídeos, porém não possui 3’-OH, impedindo a extensão da fita
quando incorporados.
Durante a reação, a DNA polimerase promove a inserção, aleatória, de
ddNTPs na cadeia crescente, gerando fragmentos de DNA de tamanhos
46
diferenciados, cada um interrompido por um determinado nucleotídeo da sequência.
O acoplamento de ddNTPs a moléculas fluorescentes diferentes, permite a cada
fragmento, a geração de um sinal de fluorescência, que posteriormente, será
detectado por um sistema óptico do sequenciador (PROBER et al., 1987; DARNEL
et al.,1990).
Os fragmentos da reação são submetidos a uma eletroforese, através de
capilares de vidro contendo um polímero, permitindo a migração de acordo com o
tamanho. À medida que a fluorescência é captada, o sequenciador gera
eletroforetogramas correspondentes a sequência original da região amplificada por
PCR. A comparação com sequências consensos permite a identificação de
polimorfismos (PROBER et al., 1987; DARNEL et al.,1990).
47
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar o papel de polimorfismos nos genes codificadores de DC-SIGN e L-
SIGN em crianças expostas ao vírus HIV-1 (HIV+ e HIV-) via transmissão vertical,
em pacientes com tuberculose ativa e em controles saudáveis pernambucanos, a fim
de identificar marcadores genéticos associados à proteção e/ou susceptibilidade a
doenças infecciosas.
3.2 Objetivos Específicos
Verificar a distribuição de polimorfismos de base única (SNPs) na região
promotora do gene codificador de DC-SIGN em crianças expostas ao vírus HIV-
1 (HIV+ e HIV-) via transmissão vertical, em pacientes com tuberculose ativa e
em controles saudáveis através de sondas alelo-específicas (TaqMan) e
sequenciamento direto.
Verificar a distribuição de polimorfismos no número de repetições do éxon 4 dos
genes DC-SIGN e L-SIGN, em crianças expostas ao vírus do HIV-1 (HIV+ e
HIV-) via transmissão vertical, em pacientes com tuberculose ativa e em
controles saudáveis através de PCR convencional e eletroforese em gel de
agarose.
Identificar marcadores genéticos de proteção e susceptibilidade, nos genes
codificadores DC-SIGN e L-SIGN em crianças expostas ao vírus do HIV-1 (HIV+
e HIV-) via transmissão vertical, em pacientes com tuberculose ativa e em
controles saudáveis pernambucanos.
Associar as variantes genéticas em genes codificadores de DC-SIGN e L-SIGN
com a infecção pelo HIV-1 em crianças pernambucanas expostas ao vírus, via
transmissão vertical, e com as formas clínicas apresentadas pelos pacientes
com tuberculose ativa, através de ferramentas estatísticas.
48
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local e Desenho Experimental do Estudo
O presente estudo foi desenvolvido no setor de Virologia do Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE) em colaboração com o Laboratório de Imunoepidemiologia do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM) da Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ-PE) e
o setor de Genética do Hospital Materno Infantil Burlo Garofalo (Trieste – Itália).
Consistiu em um estudo de caráter analítico, de corte transversal com
comparação de grupos, direcionado a identificar variáveis genéticas dos genes DC-
SIGN e L-SIGN envolvidos na susceptibilidade e/ou proteção a infecções
promovidas pelo vírus HIV-1 (via transmissão vertical) e pelo bacilo M. tuberculosis
(tuberculose ativa) na população pernambucana.
Os experimentos, foram executados a partir de amostras de DNA,
previamente armazenadas no Laboratório de Imunoepidemiologia do CPqAM e no
Setor de Virologia do LIKA.
4.2 Considerações Éticas
Os procedimentos metodológicos utilizados, neste estudo, foram apreciados
pela Comissão de Ética (CEP) do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM-
FIOCRUZ) com o protocolo nº 55/02 e pela Comissão Nacional de Ética em
Pesquisa (CONEP) com protocolo nº 3127 e processo nº 25.000.127120/2001-73,
sendo considerados condizentes com a conduta ética norteadora de pesquisas
envolvendo seres humanos.
49
4.3 Populações Estudadas
4.3.1 População Expostas ao HIV-1 via Transmissão Vertical
A população de estudo foi constituída por 250 crianças pernambucanas,
sendo 58 expostas e não infectadas pelo HIV-1 e 192 expostas e infectadas pelo
HIV-1, oriundas de mães HIV-1 positivas, não submetidas a tratamentos anti-
retrovirais, e nascidas através de parto normal, atendidas no Hospital-Dia do Serviço
de Imunologia Clínica (SIC) do Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira
(IMIP), sendo as amostas de DNA, gentilmente cedidas pelo setor de Virologia do
LIKA.
O grupo de crianças HIV-1 negativas foi formado por 28 meninos e 30
meninas, com uma média de idade de 5,8 ± 3,7 anos. Já o grupo de crianças HIV-1
positivas foi composto por 94 meninos e 98 meninas, com média de idade de 6,6 ±
4,4 anos.
4.3.2 População de Pacientes com Tuberculose Ativa
A população de estudo foi composta por aproximadamente 160 pacientes
pernambucanos com tuberculose ativa, selecionados nos principais centros
hospitalares da cidade do Recife, com base nos seguintes critérios: evidência clínica
e/ou radiológica de tuberculose; história de contato com portador de tuberculose
confirmada laboratorialmente; teste tuberculínico positivo; diagnóstico confirmativo
de tuberculose ativa, através de baciloscopia e cultura; pacientes que iniciaram o
tratamento para tuberculose.
Todas as amostras de DNA foram, gentilmente, disponibilizadas pelo
Laboratório de Imunoepidemiologia do CPqAM, sendo estratificadas quanto a forma
de apresentação da patologia em pacientes com TB pulmonar e pacientes com TB
extrapulmonar.
O subgrupo de pacientes com TB pulmonar foi composto por 116 indivíduos,
sendo 70 do sexo masculino e 46 do sexo feminino, com idade média aproximada
de 25 anos. Já o subgrupo de pacientes com TB extrapulmonar foi formado por 44
50
indivíduos, sendo 25 do sexo masculino e 19 do sexo feminino, com idade média
aproximada de 30 anos.
4.3.3 População de Controles Saudáveis
Foram utilizadas duas populações controles saudáveis: uma população de
crianças e uma população de adultos, ambas pernambucanas, disponibilizadas pelo
setor de Virologia do LIKA.
A população de crianças saudáveis foi composta por 96 indivíduos, sendo 49
do sexo masculino e 47 do sexo feminino, com idade média de 7,1 ± 4,8 anos,
oriundas do estado de Pernambuco, HIV-1 negativas e sem histórico de contato com
o vírus. Esse grupo serviu como controle nos ensaios relacionados à transmissão
vertical do HIV-1.
A população de adultos saudáveis foi formada por aproximadamente 170
indivíduos pernambucanos, com idade média de 25 anos, de ambos os sexos, HIV-1
negativos, sem histórico prévio de tuberculose, sem parentesco com pessoas
acometidas pela doença e não usuários de medicação imunossupressora; servindo
como controle nos ensaios relacionados à TB ativa.
4.4 Extração de DNA Genômico Humano
A extração do DNA genômico foi executada a partir de amostras de sangue
periférico humano anti-coagulado com EDTA, através do kit comercial “Genomic
Prep Blood DNA Isolation kit®” (Promega), conforme especificações metodológicas
do fabricante.
51
4.4 Genotipagem de Polimorfismos nos Genes Codificadores de DC-SIGN e
L-SIGN humanos
4.5.1 Polimorfismos de Base Única (SNPs) da Região Promotora do Gene DC-
SIGN
4.5.1.1 Genotipagem Utilizando Sondas Alelo-específicas (TaqMan®)
A genotipagem através de sondas alelo-específícas (TaqMan®) foi
direcionada aos seguintes SNPs da região promotora: -139 A/G (rs2287886), -336
A/G (rs4804803), -871 A/G (rs735239) e -939 A/G (rs735240), selecionados de
acordo com a literatura, na população com tuberculose ativa e controles adultos.
As reações foram preparadas em um volume final de 5 e/ou 10μl, utilizando
alíquotas de DNA na concentração de 25 pg/μl, e sondas para cada polimorfismo na
concentração de 20x. Após preparo, as reações foram amplificadas através do
seguinte protocolo: 1 ciclo a 95ºC durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 92º
C por 15 segundos e 60º C por 1 minuto; utilizando plataformas de PCR em tempo
real como: Rotor Gene® 3000 (Uniscience-Cobert Researsh) e ABI® 7000 (Applied
Biosystems), disponibilizadas pelo Setor de Virologia do LIKA e pelo Núcleo de
Integração Tecnológica (NIT) do CPqAM-PE. A análise dos resultados foi executada
com o auxílio de softwares específicos acoplados as plataformas de PCR em tempo
real e, posteriormente, validados por sequenciamento direto.
4.5.1.2 Genotipagem utilizando Sequenciamento Direto
Os SNPs da região promotora do gene DC-SIGN, nos ensaios relacionados à
transmissão vertical do HIV-1, foram detectados por meio de sequenciamento direto.
Previamente, foram executas amplificações através de PCR convencional. As
reações foram preparadas para um volume final de 25 µl, sendo estas, constituídas
por 10x Taq Buffer com KCl (Fermentas – Life Sciences), Mix de dNTPs (0,08 mM/µl
de cada dNTP), um par de primers 5’-CAAAAATGAGGACAGCAGCA-3’ (forward)
52
(0,4 pmol/µl) e 5’-CTCCAAGGAACCAAGACTGC-3’ (reverse) (0,4 pmol/µl), MgCl2
(1,0 mM/µl), Taq DNA Polimerase (Fermentas – Life Sciences) (0,08 U/µl), água
Miliq e DNA (4 pg/µl).
Após preparo, as reações foram submetidas às seguintes condições térmicas:
desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a
95º por 30 segundos, anelamento a 60ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 1
minuto, e uma extensão final a 72ºC por 7 minutos, resultando em um amplicon de
aproximadamente 1117 pares de base (pb).
Ao final da PCR, retirava-se uma alíquota de 5 μl do volume final (25 μl) de
cada reação, procedia-se a purificação através de ExoSAP-IT®, segundo as
condições do fabricante (USB Corporation) e por fim, os amplicons purificados eram
submetidos ao sequenciamento direto, utilizando o kit Big Dye Terminator 3.1
(Applied Biosystems) através do sequenciador automático ABI 3130 Genetic
Analyzer (Applied Biosystems), em colaboração com o Serviço de Genética do
Hospital Burlo Garofalo (Trieste – Itália).
Os eletroforetogramas gerados, foram analisados com o auxílio do software
CodonCode Aligner (CodonCode Corporation), permitindo a identificação dos
polimorfismos.
4.5.2 Polimorfismos no Número de Repetições do Éxon 4 do Gene DC-SIGN
Para identificação dos polimorfismos existentes no número de repetições do
éxon 4 do gene DC-SIGN, foi utilizada a metodologia descrita por Rathore et al.
(2008), com algumas modificações.
As reações foram preparadas para um volume final de 25 µl, sendo estas,
constituídas por 10x Taq Buffer com KCl (Fermentas – Life Sciences), Mix de dNTPs
(0,08 mM/µl de cada dNTP), um par de primers 5’-CCACTTTAGGGCAGGAC-3’
(forward) (0,6 pmol/µl) e 5’-AGCAAACTCACACCACACAA-3’ (reverse) (0,6 pmol/µl),
MgCl2 (1,3 mM/µl), Taq DNA Polimerase (Fermentas – Life Sciences) (0,06 U/µl),
água Miliq e DNA (8 pg/µl).
Após preparo, as reações foram amplificadas seguindo as seguintes
condições térmicas: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido por 35 ciclos
53
de desnaturação 95ºC por 15 segundos, anelamento a 58ºC por 7 segundos, e
extensão a 72ºC por 30 segundos, seguido por um ciclo de extensão final a 72ºC por
7 minutos.
Terminada a fase de amplificação, retirava-se uma alíquota de 5 µl de cada
reação, misturava-se ao intercalante de DNA (Gel Red - Uniscience) e aplicava-se
em gel de agarose na concentração de 2%, procedendo a corrida eletroforética, por
aproximadamente 40 minutos a uma voltagem de 100 V. O tamanho esperado para
os amplicons foram: 854 pb (7 repetições) e 785 pb (6 repetições).
Após a corrida, os géis eram analisados com auxílio de transiluminador
acoplado a um fotodocumentador, sendo os fragmentos identificados e
diferenciados, baseando-se no padrão de peso molecular de 100 pb (Fermentas –
Life Sciences), com auxílio do software Phoretix 1D-Pro. Posteriormente, os
resultados foram validados por sequenciamento direto.
4.5.3 Polimorfismos no Número de Repetições do Éxon 4 do Gene L-SIGN
A identificação dos polimorfismos existentes no número de repetições do éxon
4 do gene L-SIGN, foi executada, semelhantemente a utilizada para o gene DC-
SIGN, baseada na metodologia descrita por Rathore et al. (2008), com algumas
modificações.
As reações foram preparadas para um volume final de 25 µl, sendo estas,
constituídas por 10x Taq Buffer com KCl (Fermentas – Life Sciences), Mix de dNTPs
(0,08 mM/µl de cada dNTP), um par de primers 5’-TGTCCAAGGTCCCCAGCTCCC-
3’ (forward) (0,4 pmol/µl) e 5’-GAACTCACCAAATGCAGTCTTCAAATC-3’ (reverse)
(0,4 pmol/µl), MgCl2 (0,7 mM/µl), Taq DNA Polimerase (Fermentas – Life Sciences)
(0,04 U/µl), água Miliq e DNA (8 pg/µl).
Após preparo das reações, procederam-se as amplificações de acordo com
as seguintes condições térmicas: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguida
por 35 ciclos de desnaturação 94ºC por 5 segundos, anelamento a 62ºC por 7
segundos, e extensão a 72ºC por 60 segundos, seguido por um ciclo de extensão
final a 72ºC por 7 minutos.
54
Terminada a fase de amplificação, retirava-se uma alíquota de 5 µl de cada
reação, misturava-se ao intercalante de DNA (Gel Red - Uniscience) e aplicava-se
em gel de agarose na concentração de 2%, procedendo a corrida eletroforética, por
aproximadamente 40 minutos a uma voltagem de 100 V. O tamanho esperado para
os amplicons, foram: 785 pb (10 repetições), 716 pb (9 repetições), 614 pb (8
repetições), 578 pb (7 repetições), 509 pb (6 repetições), 440 pb (5 repetições) e
371pb (4 repetições).
Após a corrida, os géis foram analisados com auxílio de transiluminador
acoplado a um fotodocumentador, sendo os fragmentos identificados e
diferenciados, baseando-se no padrão de peso molecular de 50pb e 100 pb
(Fermentas – Life Sciences), com auxílio do software Phoretix 1D-Pro.
Posteriormente, os resultados foram validados por sequenciamento direto.
4.6 Análises Estatísticas
As frequências alélicas e genotípicas foram calculadas a partir da contagem
direta e comparadas entre os grupos estudados. Posteriormente, foram tratadas pela
óptica estatística através do Teste Qui-quadrado (X2) e do Teste Exato de Fisher,
utilizando o programa R versão 2.11.1 (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2010).
As diferenças entre os grupos e a aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg
(H-W), foram executadas através do Teste Qui-quadrado (X2), utilizando programas,
como: o Genotype transposer versão 1.0 e o R versão 2.11.1 (R DEVELOPMENT
CORE TEAM, 2010). A associação das variantes gênicas a susceptibilidade e/ou
proteção as infecções promovidas pelo HIV-1 e pelo M. tuberculosis, foram
executadas através do Teste Exato de Fisher, utilizando o programa R versão 2.11.1
(R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2010).
55
5 RESULTADOS
5.1 Distribuição de Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN em Crianças
Expostas ao Vírus HIV-1 (HIV+ e HIV-) via Transmissão Vertical, e em Controles
Saudáveis Pernambucanos
5.1.1 Polimorfismos da Região Promotora do Gene DC-SIGN
Após sequenciamento da região promotora de DC-SIGN, foram estudados 5
SNPs, estando todos de acordo com o equílibrio de H-W, com exceção das
frequecias apresentadas para o SNP -336 em crianças HIV (+ e -), e as referentes
aos SNPs -871 e -939 em crianças HIV (+). As frequências alélicas e genotípicas
para cada SNP, encontram-se apresentadas nas tabelas 5 e 6.
O SNP (rs2287886), uma variação de guanina para adenina na posição –
139, apresentou o alelo G como mais frequente entre os grupos estudados,
principalmente em crianças HIV- (84,1%), enquanto o alelo A foi mais frequente em
controles (28,1%). Quanto aos genótipos, G/G foi mais frequente em todos os
grupos, especialmente, em crianças HIV- (73,2%). Os genótipos G/A e A/A, foram
mais frequentes nos controles e em crianças HIV+, respectivamente. Não foram
observadas diferenças significativas nas distribuições alélica e genotípica (Tabela 5).
Para o SNP (rs11465366), uma mudança de guanina para timina na posição -
201, o alelo G foi predominante nos grupos estudados, principalmente em crianças
HIV+ (98,2%). O alelo T foi mais frequente em crianças HIV- (12,2%), apresentado
diferenças estatísticas em relação aos controles (p=0,008; OR= 4,8; IC95%= 1,3-22)
e as crianças HIV+ (p=0,0002; OR=0,1; IC95%=0,04-0,4), sugerindo associação com
a proteção a TV do HIV-1. Quanto à distribuição genotípica, o genótipo G/G
predominou em todos os grupos, especialmente, entre crianças HIV+ (96,5%),
enquanto o G/T foi predominante em crianças HIV- (24,4%), apresentado diferenças
estatísticas em relação aos controles (5,0%; p= 0,007; OR= 4,8; IC95%= 1,3-22) e
as crianças HIV+ (3,5%; p=0,0004; OR= 0,1; IC95%= 0,04-0,4), sugerindo um efeito
protetor contra o vírus. Adicionalmente, na população em estudo não foi verificada a
presença do genótipo mutante T/T (Tabela 5).
56
Tabela 5. Frequências alélicas e genotípicas dos SNPs (-139, -201, -336) da região promotora do gene DC-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis
SN
Ps
Variantes
Crianças Expostas ao HIV-1
Controles Saudáveis
Comparação entre os grupos #
HIV (-)
HIV (+) HIV(-) vs
Controles HIV(+) vs Controles
HIV(+) vs
HIV(-)
n(%) n(%) n(%) p-value OR (IC-95%)
“-1
39 G
/A” (
rs2
28
788
6)
Alelos
G 69 (84,1) 241 (73,0) 115 (71,9) 0,475
1,2 (0,8-1,8)
0,941
1,0 (0,7-1,4)
0,460
0,9 (0,6-1,3)
A 13 (15,9) 89 (27,0) 45 (28,1) 0,116
0,6 (0,3-1,1)
0,836
1,0 (0,6-1,5)
0,117
1,7 (0,9-3,5)
n = 82 330 160
Genótipos
G/G 30 (73,2) 85 (51,5) 39 (48,8) 0,214
1,5 (0,8-2,9)
0,906
1,1 (0,6-1,7)
0,209
0,7 (0,3-1,2)
G/A 9 (22,0) 71 (43,0) 37 (46,2) 0,089
0,5 (0,2-1,1)
0,807
0,9 (0,6-1,5)
0,117
2,0 (0,9-4,8)
A/A 2 (4,9) 9 (5,5) 4 (5,0) 1,000
1,0 (0,1-7,1)
1,000
1,1 (0,3-5,0)
1,000
1,1 (0,2-11)
n = 41 165 80
“-2
01 G
/T” (
rs1
146
536
6)
Alelos
G 72 (87,8) 334 (98,2) 156 (97,5) 0,624
0,9 (0,6-1,3)
1,000
1,0 (0,8-1,3)
0,533
1,1 (0,8-1,6)
T 10 (12,2) 6 (1,8) 4 (2,5) 0,008*
4,8 (1,3-22)
0,734
0,7 (0,2-3,4)
0,0002*
0,1 (0,04-0,4)
n = 82 340 160
Genótipos
G/G 31 (75,6) 164 (96,5) 76 (95,0) 0,476
0,8 (0,4-1,4)
1,000
1,0 (0,7-1,5)
0,366
1,3 (0,7-2,2)
G/T 10 (24,4) 6 (3,5) 4 (5,0) 0,007*
4,8 (1,3-22)
0,732
0,7 (0,2-3,5)
0,0004*
0,1 (0,04-0,4)
T/T 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) NA
NA NA
n = 41 170 80
“-3
36 A
/G” (
rs4
80
480
3)
Alelos
A 47 (58,8) 215 (68,0) 107 (68,6) 0,509
0,9 (0,5-1,3)
1,000
1,0 (0,7-1,3)
0,482
1,2 (0,8-1,8)
G 33 (41,3) 101 (32,0) 49 (31,4) 0,349
1,3 (0,7-2,3)
1,000
1,0 (0,7-1,5)
0,275
0,8 (0,5-1,3)
n = 80 316 156
Genótipos § §
A/A 18 (45,0) 65 (41,1) 36 (46,1) 1,000
1,0 (0,5-2,0)
0,706
0,9 (0,5-1,5)
0,872
0,9 (0,5-1,8)
G/A 11 (27,5) 85 (53,8) 35 (44,9) 0,262
0,6 (0,2-1,4)
0,473
1,2 (0,7-2,0)
0,072
1,9 (0,9-4,4)
G/G 11 (27,5) 8 (5,1) 7 (9,0) 0,036*
3,0 (1,0-10)
0,277
0,6 (0,2-1,9)
0,0007*
0,2 (0,1-0,5)
n = 40 158 78 *p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; §= População fora do equilíbrio de H-W; NA= não analisada
57
Para o SNP (rs4804803), uma troca de adenina por guanina na posição -336,
foi observada a predominância do alelo A em todos dos grupos estudados,
principalmente entre os controles (68,6%). Já o alelo G foi mais frequente em
crianças HIV- (41,3%). Entre os genótipos, G/A apresentou maior frequência em
crianças HIV+ (53,8%), enquanto que A/A foi mais frequente em controles (46,1%) e
em crianças HIV- (45%). O genótipo G/G esteve presente em 27,5% das crianças
HIV-, diferindo estatisticamente dos controles (9,0%; p=0,036; OR= 3,0; IC95%= 1,0-
10) e das crianças HIV+ (5,1%; p= 0,0007; OR= 2,0; IC95%= 0,1-0,5), sugerindo um
efeito protetor contra o vírus, na população pernambucana (Tabela 5).
Tabela 6. Frequências alélicas e genotípicas dos SNPs (-871 e -939) da região promotora do gene DC-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis
SN
Ps
Variantes
Crianças Expostas ao HIV-1
Controles Saudáveis
Comparação entre os grupos #
HIV (-)
HIV (+) HIV(-) vs
Controles HIV(+) vs Controles
HIV(+) vs
HIV(-)
n(%) n(%) n(%) p-value OR (IC-95%)
“-8
71 A
/G” (
rs7
35
239)
Alelos
A 62 (72,1) 197 (62,7) 131 (71,2) 1,000
1,0 (0,7-1,5)
0,421
0,9 (0,6-1,2)
0,502
0,9 (0,6-1,3)
G 24 (27,9) 117 (37,3) 53 (28,8) 1,000
1,0 (0,5-1,7)
0,194
1,3 (0,9-1,9)
0,276
1,3 (0,8-2,3)
n = 86 314 184
Genótipos §
A/A 22 (51,2) 71 (45,2) 47 (51,1) 1,000
1,0 (0,5-1,9)
0,645
0,9 (0,5-1,4)
0,763
0,9 (0,5-1,7)
G/A 18 (41,9) 55 (35,0) 37 (40,2) 1,000
1,0 (0,5-2,1)
0,616
0,9 (0,5-1,5)
0,623
0,8 (0,4-1,7)
G/G 3 (7,0) 31 (19,8) 8 (8,7) 1,000
0,8 (0,1-3,6)
0,048*
2,3 (1,0-6,0)
0,104
2,8 (0,8-15)
n = 43 157 92
“-9
39 G
/A” (
rs7
35
240)
Alelos
G 63 (64,3) 214 (57,5) 114 (60,0) 0,764
1,1 (0,7-1,6)
0,770
1,0 (0,7-1,3)
0,581
0,9 (0,6-1,3)
A 35 (35,7) 158 (42,5) 76 (40,0) 0,722
0,9 (0,5-1,5)
0,742
1,1 (0,7-1,5)
0,456
1,2 (0,8-1,9)
n = 98 372 190
Genótipos §
G/G 22 (44,9) 71 (38,2) 31 (32,6) 0,403
1,4 (0,7-2,7)
0,623
1,2 (0,7-2,0)
0,656
0,9 (0,5-1,6)
G/A 19 (38,8) 72 (38,7) 52 (54,8) 0,350
0,7 (0,4-1,4)
0,119
0,7 (0,4-1,1)
1,000
1,1 (0,5-1,9)
A/A 8 (16,4) 43 (23,1) 12 (12,6) 0,622
1,3 (0,4-3,7)
0,084
1,8 (0,9-4,0)
0,447
1,4 (0,6-3,7)
n = 49 186 95 *p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; § = População fora do equilíbrio de H-W; NA = Não analisado.
58
Para o SNP (rs735239), uma variação de adenina para guanina na posição -
871, observou-se o alelo A como predominante em todos os grupos, especialmente
entre crianças HIV- (72,1%). Diferentemente, o alelo G obteve maior frequência
entre crianças HIV+ (37,3%). Quanto à distribuição genotípica, o genótipo A/A
predominou entre os grupos, especialmente em crianças HIV- (51,2%), enquanto os
genótipos G/A e G/G, foram predominantes em crianças HIV- (41,9%) e HIV+
(19,8%). Não foram evidencias diferenças estatísticas em relação à distribuição
alélica, no entanto, o genótipo G/A, apresentou-se mais frequente em crianças HIV+
(19,8%) em comparação aos controles (8,7%; p= 0,048; OR= 2,3; IC95%= 1,0-6,0),
sendo associado a susceptibilidade a TV do HIV-1 (Tabela 6).
Para o SNP (rs735240), uma troca de guanina por adenina na posição -939, o
alelo G predominou entre os grupos, principalmente entre crianças HIV- (64,3%),
enquanto o alelo A foi mais frequente em crianças HIV+ (42,5%). Na distribuição
genotípica, o genótipo G/G foi mais frequente em crianças HIV- (44,9%), enquanto
G/A e A/A foram os mais frequentes em controles (54,8%) e crianças HIV+ (23,1%),
respectivamente. Não foram observadas diferenças estatísticas em relação à
distribuição alélica e genotípica entre os grupos (Tabela 6).
5.1.2 Polimorfismos no Número de Repetições do Éxon 4 do Gene DC-SIGN
Após a genotipagem por eletroforese em gel de agarose e validação por
sequenciamento direto, constatou-se que todas as frequências estavam condizentes
com o equilíbrio de H-W. Os resultados obtidos se encontram apresentados na
Tabela 7.
Os resultados revelaram baixa variabilidade gênica para essa região na
população em estudo. Dois alelos foram observados, os alelos com 6 e 7 repetições.
O alelo 7 foi predominante em todos os grupos, com frequências superiores a 98%.
Quanto à distribuição genotípica, apenas dois genótipos foram identificados: 7/6 e
7/7. O genótipo 7/7 foi mais frequente, estando presente em aproximadamente 97%
dos indivíduos dos diferentes grupos, enquanto que o genótipo 7/6 esteve presente
em aproximadamente 2,5% dos controles, estando ausente em crianças HIV-
(Tabela 7).
59
Tabela 7. Frequências alélicas e genotípicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene DC-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV negativas e HIV positivas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis.
Variantes
Crianças Expostas ao HIV-1
Controles Saudáveis
Comparação entre os grupos #
HIV (-)
HIV (+) HIV(-) vs
Controles HIV(+) vs Controles
HIV(+) vs HIV(-)
n(%) n(%) n(%) p-value OR (IC-95%)
Alelos
6 0 (0,0) 4 (1,2) 2 (0,8) NA 1,000
1,3 (0,2-15)
NA
7 72 (100,0) 186 (98,8) 126 (99,2) 1,000
1,0 (0,7-1,6)
1,000
1,0 (0,7-1,4)
0,922
1,0 (0,6-1,5)
n = 72 190 128
Genótipos
“7/6” 0 (0,0) 2 (2,1) 1 (1,6) NA 1,000
1,3 (0,1-81)
NA
“7/7” 36 (100,0) 93 (97,9) 63 (98,4) 1,000
1,0 (0,5-1,9)
1,000
1,0 (0,6-1,6)
1,000
1,0 (0,6-1,8)
n = 36 95 64
*p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; § = População fora do equilíbrio de H-W; NA = Não analisado.
5.1.3 Polimorfismos no Número de Repetições do Éxon 4 do Gene L-SIGN
Diferentemente dos resultados apresentados para o éxon 4 do gene DC-
SIGN, o éxon 4 do gene L-SIGN apresentou considerável variabilidade em todos os
grupos estudados, conforme Tabelas 8 e 9.
Tabela 8. Frequências alélicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene L-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis
Alelos
Crianças Expostas ao HIV-1
Controles Saudáveis
Comparação entre os grupos #
HIV (-)
HIV (+) HIV(-) vs
Controles HIV(+) vs Controles
HIV(+) vs HIV(-)
n(%) n(%) n(%) p-value OR (IC-95%)
4 2 (2,2) 5 (1,7) 3 (1,7) 1,000
1,3 (0,1-12)
1,000
1,0 (0,2-6,6)
0,674
0,8 (0,1-8,3)
5 28 (31,1) 88 (30,6) 54 (30,6) 1,000
1,0 (0,6-1,8)
1,000
0,1 (0,7-1,5)
1,000
1,0 (0,6-1,7)
6 21 (23,3) 74 (25,7) 45 (25,7) 0,884
0,9 (0,5-1,7)
1,000
1,0 (0,7-1,6)
0,788
1,1 (0,6-2,0)
7 39 (43,3) 120 (41,7) 73 (41,7) 0,906
1,0 (0,6-1,7)
1,000
1,0 (0,7-1,6)
0,912
1,0 (0,6-1,5)
8 0 (0,0) 1 (0,3) 1 (0,3) NA 1,000
0,6 (0,01-48)
NA
n =
90
288
176
*p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; § = População fora do equilíbrio de H-W; NA = Não analisado.
60
Inicialmente, todas as frequências foram analisadas quanto à aderência ao
princípio de H-W, não sendo observados desvios.
Quanto a distribuição alélica, foram identificados 5 alelos, diferenciados de
acordo com o número de repetições, que variaram de 4 a 8 entre os controles
saudáveis e as crianças HIV+, e de 4 a 7 entre as crianças HIV-. O alelo com 7
repetições predominou em todos os grupos, especialmente entre crianças HIV-
(43,3%), enquanto o alelo com 8 repetições, apresentou a menor frequência entre os
grupos, estando presente em 0,3% das crianças HIV+ e controles, e ausente em
crianças HIV-. Apesar de diferenças percentuais, estas, não se confirmaram
estatisticamente (Tabela 8).
Tabela 9. Frequências genotípicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene L-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao vírus HIV-1 (HIV positivas e HIV negativas) via transmissão vertical, e em controles saudáveis.
Variantes
Crianças Expostas ao HIV-1
Controles Saudáveis
Comparação entre os grupos #
HIV (-)
HIV (+) HIV(-) vs
Controles HIV(+) vs Controles
HIV(+) vs HIV(-)
n(%) n(%) n(%) p-value OR (IC-95%)
“4/4” 0 (0,0) 2 (1,4) 1 (1,1) NA 1,000
1,2 (0,1-73)
NA
“5/4” 2 (4,4) 0 (0,0) 0 (0,0) NA NA NA
“5/5” 7 (15,5) 33 (22,9) 6 (6,8) 0,223
2,3 (0,6-8,7)
0,006*
3,3 (1,3-10)
0,533
1,5 (0,6-4,2)
“5/6” 6 (13,3) 7 (4,9) 8 (9,1) 0,560
1,5 (0,4-5,1)
0,278
0,5 (0,2-1,8)
0,097
0,4 (0,1-1,4)
“6/4” 0 (0,0) 1 (0,7) 4 (4,5) NA 0,076
0,1 (0,01-1,6)
NA
“6/6” 2 (4,4) 14 (9,7) 0 (0,0) NA NA 0,535
2,2 (0,5-20)
“7/5” 6 (13,3) 15 (10,4) 16 (18,2) 0,631
0,7 (0,2-2,1)
0,172
0,6 (0,3-1,3)
0,599
0,8 (0,3-2,6)
“7/6” 11 (24,4) 38 (26,4) 24 (27,3) 0,843
0,9 (0,4-2,1)
1,000
1,0 (0,5-1,8)
1,000
1,1 (0,5-2,5)
“7/7” 11 (24,4) 33 (22,9) 29 (32,9) 0,564
0,7 (0,3-1,7)
0,243
0,7 (0,4-1,3)
0,847
0,9 (0,4-2,2)
“7/8” 0 (0,0) 1 (0,7) 0 (0,0) NA NA NA
Homozigotos 20 (44,4) 82 (56,9) 36 (40,9) 0,867
1,1 (0,5-2,2)
0,194
1,4 (0,8-2,3)
0,463
1,3 (0,7-2,5)
Heterozigotos 35 (55,6) 62 (43,1) 52 (59,1) 0,390
1,3 (0,7-2,4)
0,200
0,7 (0,5-12)
0,037*
0,5 (0,3-1,0)
n =
43
157
92
*p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; § = População fora do equilíbrio de H-W; NA = Não analisado.
61
Quanto à distribuição genotípica, foram identificados 10 variantes, sendo o
genótipo 7/7, predominante em todos os grupos, principalmente em controles
(32,9%). Também foram identificados genótipos raros (4/4, 5/4, 6/4 e 7/8), com
frequências inferiores a 5% e ausentes em alguns grupos. De todos os genótipos
identificados, apenas o genótipo 5/5, mostrou-se estatisticamente significante, na
comparação entre crianças HIV+ (22,9%) e os controles saudáveis (6,8%; p=0,006;
OR=3,4; IC95%=1,3-10), sugerindo uma associação com a susceptibilidade a TV do
HIV-1 (Tabela 9).
A análise quanto à presença de genótipos homozigotos e heterozigotos,
constatou que genótipos heterozigotos foram mais frequentes entre controles
(59,1%) e crianças HIV- (55,6%), enquanto, os homozigotos foram predominantes
entre os indivíduos HIV+ (56,9%). Diferenças significativas foram observadas entre
crianças HIV- e HIV+ (p=0,037; OR=0,5; IC95%= 0,3-1,0), sugerindo um efeito
protetor a TV do HIV-1 em crianças com genótipos heterozigotos (Tabela 9).
Na tabela 10, observam-se os principais resultados obtidos para os genes
DC-SIGN e L-SIGN em crianças pernambucanas expostas ao HIV-1, via transmissão
vertical.
Tabela 10. Principais resultados obtidos para os genes DC-SIGN e L-SIGN na população pernambucana exposta ao HIV-1, via transmissão vertical
Gene/Região Variante Associado Associação
DC-SIGN
Promotor
-201 T Proteção
-201 G/T Proteção
-336 G/G Proteção
-871 G/G Susceptibilidade
DC-SIGN
Éxon 4
Região com baixa variabilidade, não sendo evidenciadas diferenças
significativas entre os grupos
L-SIGN
Éxon 4
5/5
Susceptibilidade
Heterozigoto
Proteção
62
5.2 Distribuição de Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN em Pacientes
com Tuberculose Ativa e em Controles Saudáveis Pernambucanos
5.2.1 Polimorfismos da Região Promotora do Gene DC-SIGN
Na população com TB ativa, as genotipagens para região promotora de DC-
SIGN, foram executadas através de sondas alelo-específicas (TaqMan), visando
identificar 4 SNPs (-139, -336, -871 e -939). Os resultados estão dispostos na Tabela
11 e 12.
Inicialmente, todas as frequências foram verificadas quanto ao equilíbrio de H-
W, estando todas condizentes com tal princípio, exceto as referentes aos SNPs -336
e -871 em pacientes com TB pulmonar.
Para o SNP-139 (rs2287886), constatou-se a predominância do alelo G em
todos os grupos, especialmente em controles (69,6%), enquanto, o alelo A
apresentou maior frequência entre pacientes TB (35,3%). Quanto à distribuição
genotípica, o genótipo G/G foi mais frequente entre controles (49,7%), enquanto que
G/A e A/A foram mais frequentes entre pacientes TB (48,4% e 11,1%,
respectivamente). Não foram observadas diferenças significativas quanto às
distribuições alélica e genotípica (Tabela 11).
Já para SNP-336 (rs48044803), o alelo A foi o mais frequente em todos os
grupos, especialmente em pacientes (84,2%), enquanto que o alelo G em controles
(24,5%). Entre os pacientes, o alelo A predominou nas formas extrapulmonares de
TB (84,4%), enquanto o alelo G, na forma pulmonar (18,2%) (Tabela 11).
Quanto à distribuição genotípica, o genótipo A/A predominou em todos os
grupos, principalmente, entre pacientes (78,3%). Por outro lado, os genótipos G/A e
A/A apresentaram maiores frequências nos controles (34,7%) e nos pacientes
(10,0%), respectivamente. Entre os pacientes, percebeu-se a predominância de
genótipos A/A (77,3%) e G/G (13,6%) na forma pulmonar de TB, e do genótipo G/A
nas formas extrapulmonares (31,3%). Adicionalmente, foram verificadas diferenças
significativas, entre pacientes TB totais (11,7%; p=0,015; OR= 0,3; IC95%= 0,1-0,8)
e TB pulmonar (9,1% p=0,012; OR= 0,3; IC95%= 0,06-0,8) com relação aos
63
controles (34,7%), quanto ao genótipo G/A, sugerindo um efeito protetor contra o
desenvolvimento da TB, especialmente na forma pulmonar da doença (Tabela 11).
Tabela 11. Frequências alélicas e genotípicas de SNPs (-139 e -336) da região promotora do gene DC-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e controles saudáveis pernambucanos.
S
NP
s
Variantes
Pacientes com Tuberculose
Controles
Comparação entre Grupos#
Total
TBp
TBe Total vs
Controles TBp vs
Controles TBe vs
Controles
n (%) n (%) n (%) n (%) p-value OR (IC95%)
“-1
39 G
/A” (
rs2
28
788
6)
Alelos
G 163 (64,7) 111 (62,4) 52 (70,3) 227 (69,6) 0,597
0,9 (0,7-1,2)
0,505
0,9 (0,7-1,2)
1,000
1,0 (0,7-1,5)
A 89 (35,3) 67 (37,6) 22 (29,7) 99 (30,4) 0,398
1,2 (0,8-1,6)
0,265
1,2 (0,8-1,8)
1,000
1,0 (0,5-1,70
n = 252 178 74 326
Genótipos
G/G 51 (40,5) 34 (38,2) 17 (46,0) 81 (49,7) 0,395
0,8 (0,5-1,3)
0,287
0,8 (0,5-1,3)
0,874
0,9 (0,5-1,8)
G/A 61 (48,4) 43 (48,3) 18 (48,6) 65 (39,9) 0,391
1,2 (0,8-1,9)
0,474
1,2 (0,7-2,0)
0,621
1,2 (0,5-2,4)
A/A 14 (11,1) 12 (13,5) 2 (5,4) 17 (10,4) 1,000
1,1 (0,5-2,4)
0,544
1,3 (0,5-3,0)
0,538
0,5 (0,05-2,3)
n = 126 89 37 163
“-3
36 A
/G” (
rs 4
80
480
3)
Alelos
A 101 (84,2) 72 (81,8) 27 (84,4) 148 (75,5) 0,544
1,1 (0,8-1,6)
0,700
1,1 (0,7-1,6)
0,776
1,1 (0,6-2,0)
G 19 (15,8) 16 (18,2) 5 (15,6) 48 (24,5) 0,162
0,65 (0,3-1,2)
0,369
0,74 (0,4-1,4)
0,450
0,64 (0,2-1,8)
n = 120 88 32 196
Genótipos §
A/A 47 (78,3) 34 (77,3) 11 (68,7) 57 (58,2) 0,251
1,3 (0,8-2,3)
0,323
1,3 (0,7-2,4)
0,830
1,2 (0,5-2,9)
G/A 7 (11,7) 4 (9,1) 5 (31,3) 34 (34,7) 0,015*
0,3 (0,1-0,8)
0,012*
0,3 (0,06-0,8)
1,000
0,9 (0,2-2,8)
G/G 6 (10,0) 6 (13,6) 0 (0,0) 7 (7,1) 0,567
1,4 (0,4-5,1)
0,352
1,9 (0,5-7,0)
NA
n = 60 44 16 98
*p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; §= População fora do equilíbrio de H-W; NA= não analisado; TBp= Tuberculose pulmonar; TBe= Tuberculose extrapulmonar.
Com relação ao SNP-871 (rs735239), observou-se a predominância do alelo
A em ambos os grupos, especialmente em pacientes (76,0%; p= 0,031; OR= 1,4;
64
IC95%= 1,0-1,9), diferindo significativamente dos controles (55,1%). Por outro lado,
o alelo G foi mais frequente em controles (44,9%), diferindo significativamente dos
pacientes (24,0%; p= 0,001; OR= 0,5; IC95%= 0,3-0,8). Entre os pacientes, o alelo A
foi mais frequente nas formas extrapulmonares de TB, enquanto que G predominou
na forma pulmonar. Ambos os pacientes pulmonar (25,0%; p= 0,004; OR= 0,5;
IC95%= 0,3-0,8) e extrapulmonar (19,6%; p= 0,026; OR= 0,4; IC95%= 0,2-0,9),
apresentaram diferenças significativas em relação aos controles (44,9%) quanto ao
alelo G. Os resultados sugerem a associação do alelo A com a susceptibilidade ao
desenvolvimento de TB e do alelo G com a proteção contra TB em suas formas
pulmonar e extrapulmonar (Tabela 12).
Quanto à distribuição genotípica, o genótipo A/A foi mais frequente em
pacientes (62,0%), enquanto que G/A e G/G foram predominantes em controles
(52,7% e 19,0%, respectivamente). Entre os pacientes, os genótipos A/A e G/A
foram mais frequentes nas formas extrapulmonares de TB (65,% e 30,4%,
respectivamente), enquanto genótipo G/G alcançou à maior frequência em pacientes
TB pulmonar (11,1%).
Adicionalmente, foram observadas diferenças significativas entre pacientes
TB totais (p= 0,001; OR= 2,2; IC95%= 1,3-3,7), com TB pulmonar (p= 0,003; OR=
2,2; IC95%= 1,3-3,7) e com TB extrapulmonar (p= 0,037; OR= 2,3; IC95%= 0,9-2,4)
em relação ao grupo controle quanto os genótipos A/A, sugerindo associações com
a susceptibilidade a TB na população pernambucana. Por outro lado, diferenças
significativas foram observadas entre pacientes TB totais (p= 0,014; OR= 0,5;
IC95%= 0,3-0,9) e com TB pulmonar (p= 0,023; OR= 0,5; IC95%= 0,3-0,9), em
relação ao grupo de controles quanto ao genótipo G/A, sugerindo um efeito protetor
contra o desenvolvimento da TB, especialmente TB pulmonar (Tabela 12).
Para o SNP-939 (rs735240), observou-se a predominância do alelo G em
todos os grupos, especialmente em controles (63,4%), enquanto, o alelo A se
mostrou mais frequente em pacientes (41,6%). Entre os pacientes, o alelo G
predominou na forma pulmonar (61,5%), enquanto, o alelo A nas formas
extrapulmonares (50,0%) (Tabela 12).
Quanto à distribuição genotípica, percebeu-se um predomínio de genótipos
G/A em pacientes (46,6%), enquanto G/G e A/A foram predominantes em controles
(45,2% e 19,1%, respectivamente). Entre os pacientes, o genótipo G/G predominou
na forma pulmonar (38,6%) e os genótipos G/A e A/A nas formas extrapulmonares
65
(48,5% e 25,7%, respectivamente). Adicionalmente, não foram observadas
diferenças significativas quanto às distribuições alélica e genotípica (Tabela 12).
Tabela 12. Frequências alélicas e genotípicas de SNPs (-871 e -939) da região promotora do gene DC-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e controles saudáveis pernambucanos.
S
NP
s
Variantes
Pacientes com Tuberculose
Controles
Comparação entre Grupos#
Total
TBp
TBe Total vs
Controles TBp vs
Controles TBe vs
Controles
n (%) n (%) n (%) n (%) p-value OR (IC95%)
“-8
71 A
/G” (
rs7
35
239)
Alelos
A 159 (76,0) 122 (75,0) 37 (80,4) 140 (55,1) 0,031*
1,4 (1,0-1,9)
0,055
1,4 (1,0-1,9)
0,134
1,5 (0,9-2,4)
G 49 (24,0) 40 (25,0) 9 (19,6) 144 (44,9) 0,001*
0,5 (0,3-0,8)
0,004*
0,5 (0,3-0.8)
0,026
0,4 (0,2-0,9)
n = 208 162 46 254
Genótipos §
A/A 65 (62,0) 50 (61,7) 15 (65,2) 36 (28,3) 0,001*
2,2 (1,3-3,7)
0,003*
2,2 (1,3-3,7)
0,037*
2,3 (1,0-5,1)
G/A 29 (28,0) 22 (27,2) 7 (30,4) 67 (52,7) 0,014*
0,5 (0,3-0,9)
0,023*
0,5 (0,3-0,9)
0,298
0,6 (0,2-1,5)
G/G 10 (10,0) 9 (11,1) 1 (4,4) 24 (19,0) 0,097
0,5 (0,2-1,2)
0,246
0,6 (0,2-1,4)
0,208
0,2 (0,01-1,6)
n = 104 81 23 127
“-9
39 A
/G” (
rs7
35
240)
Alelos
G 153 (58,4) 118 (61,5) 35 (50,0) 199 (63,4) 0,586
0,9 (0,7-1,2)
0,882
1,0 (0,7-1,3)
0,321
0,8 (0,5-1,3)
A 109 (41,6) 74 (38,5) 35 (50,0) 115 (36,6) 0,431
1,2 (0,8-1,6)
0,793
1,0 (0,7-1,5)
0,185
1,4 (0,8-2,2)
n = 262 192 70 314
Genótipos
G/G 46 (35,1) 37 (38,6) 9 (25,7) 71 (45,2) 0,271
0,8 (0,5-1,2)
0,552
0,8 (0,5-1,4)
0,205
0,6 (0,2-1,3)
G/A 61 (46,6) 44 (45,8) 17 (48,6) 56 (35,7) 0,229
1,3 (0,8-2,1)
0,334
1,3 (0,8-2,1)
0,388
1,4 (0,7-2,7)
A/A 24 (18,3) 15 (15,6) 9 (25,7) 30 (19,1) 1,000
1,0 (0,5-1,8)
0,618
0,8 (0,4-1,7)
0,504
1,3 (0,5-3,2)
n = 131 96 35 157
*p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; §= População fora do equilíbrio de H-W; NA= não analisado; TBp= Tuberculose pulmonar; TBe= Tuberculose extrapulmonar.
66
5.2.2 Polimorfismos no Número de Repetições do Éxon 4 do Gene DC-SIGN
Assim como observado no grupo de crianças expostas ao vírus HIV-1, a
população acometida pela TB, também apresentou ausência de variação para a
região repetida do éxon 4 de DC-SIGN. Os resultados se encontram apresentados
na Tabela 13.
Tabela 13. Frequências alélicas e genotípicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene DC-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e em controles saudáveis pernambucanos.
Variantes
Pacientes com Tuberculose
Controles
Comparação entre Grupos#
Total
TBp
TBe Total vs
Controles TBp vs
Controles TBe vs
Controles
n (%) n (%) n (%) n (%) p-value OR (IC95%)
Alelos 6 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 8 (2,4)
NA NA NA
7 208 (100,0) 158 (100,0) 50 (100,0) 332 (97,6)
1,000
1,0 (0,8-1,3)
1,000
1,0 (0,8-1,3)
1,000
1,0 (0,6-1,6)
n = 208 158 50 340
Genótipos 7/6 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 4 (2,4) NA NA NA
7/7 104 (100,0) 79 (100,0) 25 (100,0) 166 (97,6)
1,000
1,0 (0,7-1,4)
1,000
1,0 (0,7-1,5)
1,000
1,0 (0,5-1,9)
n = 126 89 37 163
*p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; §= População fora do equilíbrio de H-W; NA= não analisado; TBp= tuberculose pulmonar; TBe= tuberculose extrapulmonar.
O alelo com 7 repetições foi predominante em pacientes (100%) e controles
(97,6%), enquanto o alelo com 6 repetições, foi observado apenas em controles,
com frequência de 2,4%.
Quanto à distribuição genotípica, foram identificados dois genótipos: 7/6 e 7/7.
Como esperado, o genótipo 7/7 foi mais frequente em pacientes (100%) e controles
(97,6%) (Tabela 12). Adicionalmente, não foram observadas diferenças estatísticas
entre os grupos quanto às distribuições alélica e genotípica, e nem desvios do
equilíbrio de H-W.
67
5.2.3 Polimorfismos no Número de Repetições do Éxon 4 do Gene L-SIGN
Nos pacientes com TB ativa, a região repetida (éxon 4) do gene L-SIGN,
mostrou-se altamente variável, apresentando frequências em conformidade com o
princípio de H-W. Os resultados podem ser observados nas Tabelas 14 e 15.
Tabela 14. Frequências alélicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene L-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e em controles saudáveis pernambucanos.
Alelos
Pacientes com Tuberculose
Controles
Comparação entre Grupos#
Total
TBp
TBe Total vs
Controles TBp vs
Controles TBe vs
Controles
n (%) n (%) n (%) n (%) p-value OR (IC95%)
4
1 (0,4)
0 (0,0)
1 (1,5)
8 (2,9)
0,042*
0,1 (0,003-1,0)
NA
1,000
0,5 (0,01-4,0)
5
17 (6,9)
7 (3,9)
10 (14,7)
38 (13,6)
0,031*
0,5 (0,3-1,0)
0,002*
0,3 (0,1-0,7)
0,847
1,1 (0,5-2,4)
6
33 (13,4)
25 (14,0)
8 (11,8)
67 (23,9)
0,011*
0,6 (0,3-0,9)
0,034*
0,6 (0,3-1,0)
0,096
0,5 (0,2-1,1)
7
76 (30,9)
58 (32,6)
18 (26,5)
84 (30,0)
0,928
1,0 (0,7-1,5)
0,695
1,0 (0,7-1,6)
0,775
0,9 (0,5-1,6)
8
60 (24,4)
45 (25,3)
15 (22,1)
64 (22,9)
0,765
1,1 (0,7-1,6)
0,663
1,1 (0,7-1,7)
1,000
1,0 (0,5-1,8)
9
58 (23,6)
42 (23,6)
16 (23,5)
15 (5,4)
9,183e
-08*
4,4 (2,4-8,6)
7,129e
-07*
4,4 (2,3-8,8)
0,0002*
4,4 (1,9-10)
10
1 (0,4)
1 (0,6)
0 (0,0)
4 (1,4)
0,379
0,3 (0,01-2,9)
0,653
0,4 (0,01-4,0)
NA
n =
126
89
37
163
*p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; NA= não analisado; TBp= tuberculose pulmonar; TBe= tuberculose extrapulmonar.
Entre pacientes e controles, foram identificados 7 alelos, com número de
repetições, variando entre 4 a 10. O alelo com 7 repetições foi predominante em
ambos os grupos, com frequência igual e/ou superior a 30%. Por outro lado, alelos
com 10 e 4 repetições, foram observados com frequências inferiores a 3%, em
ambos os grupos (Tabela 14).
68
Adicionalmente, diferenças significativas foram observadas entre os grupos. O
alelo 4 apresentou maior frequência em controles (2,9%) em relação aos pacientes
TB (0,4%; p=0,042; OR=0,1; IC95%=0,003-1,0). Diferenças significativas, também,
foram observadas para o alelo 5, entre controles (13,6%) e pacientes TB no total
(6,9%; p=0,031; OR=0,5; IC95%= 0,3-1,0) e na forma pulmonar (3,9%; p=0,002;
OR= 0,3; IC95%=0,1-0,7). Semelhantemente, frequências para o alelo 6 nos
pacientes TB no total (13,4%; p=0,011; OR= 0,6; IC95%= 0,3-0,9) e na forma
pulmonar (14,0%; p=0,034; OR= 0,6; IC95%= 0,3-1,0) foram estatisticamente
inferiores as frequências apresentadas pelos controles (23,9%). Por outro lado, o
alelo 9, em pacientes TB no total (23,6%; p=9,183e-08; OR= 4,4; IC95%= 2,4-8,6) e
nas formas pulmonar (23,6%; p=7.129e-07; OR= 4,4; IC95%= 2,3-8,8) e
extrapulmonar (23,5%; p=0,0002; OR= 4,4; IC95%= 1,9-10), apresentou frequências
superiores as presentes em controles (5,4%) (Tabela 14).
Esses resultados revelam que os alelos 4, 5 e 6, provavelmente estão
associados a proteção contra o desenvolvimento da TB, e especialmente, com a TB
pulmonar, como observado para os alelos 5 e 6. Por outro lado, o alelo 9 foi
associado com a susceptibilidade ao desenvolvimento da TB, especialmente em
suas formas pulmonar e extrapulmonar.
Quanto à distribuição genotípica, foram identificados 21 diferentes genótipos,
sendo em sua maioria heterozigotos. O genótipo 7/7 foi predominante em pacientes
(17,1%) e controles (12,1%), enquanto outros genótipos (10/8, 10/7, 10/6, 10/5, 9/5,
7/4 e 6/4) foram raros, com frequências inferiores a 5 % (Tabela 15).
Diferenças significativas foram evidenciadas entre pacientes e controles para
os genótipos 6/5 e 9/9. A frequência para o genótipo 6/5 em pacientes TB (0,8%;
p=0,014; OR=0,1; IC95%= 0,002-0,8) foi significativamente inferior a apresentada
pelo grupo controle (7,1%). Contrariamente, a frequência apresentada para genótipo
9/9 no grupo controle (1,4%) foi inferior a apresentada pelos pacientes com TB geral
(13,0%; p=0,0004; OR= 9,0; IC95%= 2,1-83), tanto na forma pulmonar (13,5%;
p=0,001; OR= 9,3; IC95%= 2,0-88) quanto na extrapulmonar (11,8%; p=0,019; OR=
8,1; IC95%= 1,1-93) (Tabela 15).
Os resultados apresentados para população pernambucana sugerem que o
genótipo 6/5, possivelmente, esteja associado à proteção contra o desenvolvimento
da TB, enquanto que o genótipo 9/9, associa-se com a susceptibilidade a doença em
sua forma pulmonar e extrapulmonar.
69
Tabela 15. Frequências genotípicas de polimorfismos no número de repetições contidas no éxon 4 do gene L-SIGN em pacientes com tuberculose ativa e em controles saudáveis pernambucanos.
Genótipos
Pacientes com Tuberculose
Controles
Comparação entre Grupos#
Total
TBp
TBe Total vs
Controles TBp vs
Controles TBe vs
Controles
n (%) n (%) n (%) n (%) p-value OR (IC95%)
“5/5” 2 (1,6) 0 (0,0) 2 (5,9) 5 (3,6) 0,456
0,5 (0,04-2,8)
NA 0,627
1,6 (0,2-11)
“6/4” 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 3 (2,1) NA NA NA
“6/5” 1 (0,8) 0 (0,0) 1 (2,9) 10 (7,1) 0,014*
0,1 (0,002-0,8)
NA 0,693
0,4 (0,01-3,1)
“6/6” 4 (3,3) 3 (3,4) 1 (2,9) 13 (9,3) 0,079
0,3 (0,1-1,2)
0,180
0,4 (0,06-1,4)
0,474
0,3 (0,01-2,3)
“7/4” 1 (0,8) 0 (0,0) 1 (2,9) 5 (3,6) 0,222
0,2 (0,01-2,1)
NA
1,000
0,8 (0,02-7,7)
“7/5” 4 (3,3) 2 (2,2) 2 (5,9) 13 (9,3) 0,079
0,3 (0,1-1,2)
0,055
0,2 (0,03-1,1)
0,740
0,6 (0,06-3,0)
“7/6” 11 (8,9) 7 (7,9) 4 (11,8) 14 (10,0) 0,836
0,9 (0,4-2,2)
0,815
0,8 (0,3-2,2)
0,760
1,2 (0,3-4,1)
“7/7” 21 (17,1) 18 (20,2) 3 (8,8) 17 (12,1) 0,386
1,4 (0,7-3,0)
0,196
1,7 (0,8-2,6)
0,771
0,7 (0,1-2,7)
“8/5” 6 (4,9) 4 (4,5) 2 (5,9) 4 (2,9) 0,524
1,7 (0,4-8,4)
0,715
1,6 (0,3-8,7)
0,345
2,0 (0,2-15)
“8/6” 8 (6,5) 8 (9,0) 0 (0,0) 11 (7,9) 0,813
0,8 (0,3-2,3)
0,810
1,1 (0,4-3,3)
NA
“8/7” 13 (10,6) 10 (11,2) 3 (8,8) 14 (10,0) 1,000
1,1 (0,4-2,5)
0,828
1,1 (0,4-2,9)
1,000
0,9 (0,2-3,4)
“8/8” 9 (7,3) 6 (6,7) 3 (8,8) 14 (10,0) 0,520
0,7 (0,3-1,9)
0,4823
0,7 (0,2-2,0)
1,000
0,9 (0,2-3,4)
“9/5” 2 (1,6) 1 (1,1) 1 (2,9) 0 (0,0) NA NA NA
“9/6” 5 (4,1) 4 (4,5) 1 (2,9) 2 (1,4) 0,262
2,8 (0,5-30)
0,217
3,1 (0,4-35)
1,000
1,4 (0,02-18)
“9/7” 5 (4,1) 3 (3,4) 2 (5,9) 3 (2,1) 0,482
1,9 (0,4-12)
0,681
1,6 (0,2-12)
0,264
2,7 (0,2-25)
“9/8” 14 (11,4) 10 (11,2) 4 (11,8) 6 (4,3) 0,062
2,6 (0,9-8,7)
0,070
2,6 (0,8-9,1)
0,219
2,7 (0,5-12)
“9/9” 16 (13,0) 12 (13,5) 4 (11,8) 2 (1,4) 0,0004*
9,0 (2,1-83)
0,001*
9,3 (2,0-88)
0,019*
8,1 (1,1-93)
“10/5” 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,7) NA NA NA
“10/6” 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,7) NA NA NA
“10/7” 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,7) NA NA NA
“10/8” 1 (0,8) 1 (1,1) 0 (0,0) 1 (0,7) 1,000
1,1 (0,01-90)
1,000
1,6 (0,01-124)
NA
Homozigotos 52 (42,3) 39 (43,8) 13 (38,2) 51 (36,4) 0,561
1,2 (0,7-1,9)
0,526
1,2 (0,7-2,0)
1,000
1,0 (0,5-2,2)
Heterozigotos 71 (57,7) 50 (56,2) 21 (61,8) 89 (63,6) 0,687
0,9 (0,6-1,4)
0,657
0,9 (0,6-1,4)
1,000
1,0 (0,5-1,8)
n = 123 89 34 140 *p-value <0,05; # Teste Exato de Fisher; OR= Odds ratio; IC95%= Intervalo de Confiança de 95%; NA= não analisado; TBp= tuberculose pulmonar; TBe= tuberculose extrapulmonar.
70
Adicionalmente, os genótipos foram analisados quanto à presença de
homozigotos e heterozigotos. Genótipos heterozigotos foram predominantes em
todos os grupos, especialmente entre os controles (63,6%). Não foram observadas
diferenças significativas entre homozigotos e heterozigotos.
Na tabela 16, pode-se observar os principais resultados evidenciados para os
genes DC-SIGN e L-SIGN, na população pernambucana com TB ativa.
Tabela 16. Principais resultados obtidos para os genes DC-SIGN e L-SIGN na população pernambucana com tuberculose ativa
Gene Variante Associado
Associação
DC-SIGN Promotor
-336 G/A Proteção geral e para forma pulmonar -871 A Susceptibilidade geral e para forma pulmonar -871 G Proteção geral e para formas pulmonar e extrapulmonar
-871 A/A Susceptibilidade geral e para formas pulmonar e extrapulmonar -871 G/A Proteção geral e para formas pulmonar e extrapulmonar
DC-SIGN Éxon 4
Não foram evidenciadas diferenças significativas entre os grupos, devido à
pequena quantidade de polimorfismos.
L-SIGN Éxon 4
Alelo 4 Proteção geral Alelo 5 Proteção geral e na forma pulmonar Alelo 6 Proteção geral e na forma pulmonar Alelo 9 Susceptibilidade geral e na forma pulmonar e extrapulmonar
6/5 Proteção geral 9/9 Susceptibilidade geral e para formas pulmonar e extrapulmonar
71
6 DISCUSSÃO
A interação do hospedeiro humano com diferentes patógenos tem sido
acompanhada por adaptações genéticas e flutuações espaciais e temporais nas
pressões seletivas impostas por agentes infecciosos. Estudos têm sugerido a
presença de marcas genéticas da seleção natural, impostas por agentes infecciosos,
em genes humanos envolvidos na resposta imune e/ou interação hospedeiro-
patógeno (BARREIRO et al., 2005).
Adicionalmente, têm sido crescentes as evidências que fatores genéticos do
hospedeiro determinam as diferenças na susceptibilidade e/ou proteção a infecções
ocasionadas por agentes patogênicos, bem como, nos padrões clínicos de certas
doenças (BARREIRO et al., 2006).
Estudos da variabilidade de genes envolvidos na imunidade inata e
adaptativa, bem como na interação hospedeiro-patógeno, mostram-se
extremamente importantes. Neste sentido, o presente trabalho foi conduzido sob
duas diferentes ópticas, com o intuito de entender o papel de variações genéticas
nos genes DC-SIGN e L-SIGN, na susceptibilidade e/ou proteção a transmissão
vertical do HIV-1, e ao desenvolvimento de TB ativa na população de Pernambuco.
6.1 Papéis dos Polimorfismos nos Genes DC-SIGN e L-SIGN na Transmissão
Vertical do HIV-1
A transmissão vertical do HIV é responsável por mais de 40% de todas as
infecções em crianças, ocorrendo durante a gravidez, o parto e a amamentação
(SMITH et al., 2003; LUZURIAGA et al., 2007).
Alguns estudos têm sugerido que certos tipos celulares como: macrófagos da
decídua e células de Hofbauer, podem estar relacionados ao processo de
transmissão vertical (SOILLEUX et al., 2001; VELILLA et al., 2008).
Células de Hofbauer possuem a capacidade de suportar a infecção pelo HIV-
1, em decorrência da expressão de receptores celulares relacionados aos linfócitos
T (CD4, CCR5 e CXCR4) e de outros receptores, particularmente, DC-SIGN e L-
72
SIGN (SOILLEUX; COLEMAN, 2003), implicando a participação na transmissão
viral.
Os receptores DC-SIGN e L-SIGN, são conhecidos por promoverem o
reconhecimento e captura do HIV-1, através da interação com a proteína gp120 viral
(GEITENBEEK et al., 2000). Diferentes trabalhos têm demonstrado que
polimorfismos nesses genes podem conduzir a susceptibilidade e/ou proteção a
infecção pelo HIV-1, bem como outros patógenos.
A região promotora de DC-SIGN possui diversos sítios de ligação para fatores
transcricionais (AP-1, Sp-1, Ets-1 e NF-kb). A presença de polimorfismos nas
proximidades desses sítios, podem diretamente promover aumento e/ou diminuição
dos níveis transcricionais, influenciando na quantidade de proteína expressa na
célula (LIU et al., 2003).
O aumento na quantidade de receptores DC-SIGN, em DCs e macrófagos,
pode conduzir a uma maior interação entre a gp120 do HIV-1 e o CRD do receptor,
possibilitando a ligação de alta afinidade entre o vírus e o receptor, bem como, a
interação do vírus com células T, promovendo a transmissão in trans.
Adicionalmente, uma grande quantidade de DC-SIGN, também, poderia concentrar o
vírus, aumentando sua infectividade em situações onde a viremia é baixa, como na
transmissão vertical (GEIJTENBEEK et al., 2000; BASHIROVA et al., 2001;
GEIJTENBEEK et al., 2002; SOILLEUX et al., 2002).
Por outro lado, a diminuição da quantidade de receptores DC-SIGN, poderia
ser associada à diminuição da interação vírus-receptor, reduzindo a transferência in
trans e conduzindo a diminuição da susceptibilidade ao vírus (GEIJTENBEEK et al.,
2002; van KOOYK et al., 2003).
Na população pernambucana, SNPs presentes na região promotora do gene
DC-SIGN apresentaram importantes contribuições para a proteção (-201T; -201G/T;
-336 G/G) e susceptibilidade (-871G/G) a transmissão vertical do HIV-1.
Variantes no SNP (rs11465366), alelo -201T e o genótipo -201G/T,
mostraram-se associados a proteção contra a transmissão do vírus HIV-1, via TV.
Essa associação foi considerada inédita, sendo a primeira associação de uma
variante do SNP-201 a transmissão de um agente infeccioso, corroborando os
insipientes achados da literatura.
73
Kashima et al. (2009), evidenciaram em uma população de portadores e não
portadores do vírus HTLV-1, oriunda do Estado de São Paulo-Brasil, a ausência de
relação deste variente com a transmissão viral. Martin et al. (2004), estudando uma
população norte-americana (USA) exposta ao HIV-1, também chegaram a mesma
conclusão.
Pouco se sabe sobre o efeito desse polimorfismo na susceptibilidade e/ou
proteção a infecções. Estudos in silico, utilizando a ferramenta “Transfac Database
Search”, permitiram a identificação de sítios de ligação para o fator de transcrição c-
Myc, na presença do variante -201T, porém não se sabe o real significado biológico
deste sítio, na transcrição de DC-SIGN, requerendo investigações posteriores
(BOLIY-LAROUCHE et al., 2007).
Outra importante associação foi observada para o genótipo -336 G/G do
SNP(rs4804803) com a proteção a TV do HIV-1, corroborando os achados de Martin
et al. (2004), que estudando americanos (USA) com risco de aquisição do HIV-1, via
parenteral e através da mucosa, constataram a associação do alelo -336G com o
risco de aquisição parenteral. Selvaraj et al. (2009) estudando indivíduos HIV+TB-,
HIV+TB+, HIV-TB+ e controles saudáveis, oriundos do Sul da Índia, evidenciaram a
presença do genótipo -336 G/G com a proteção a infecção pelo HIV-1.
Adicionalmente, Sakuntabhai et al. (2005) estudando pacientes infectados e não-
infectados pelo vírus Dengue, oriundos da Tailândia, sugeriram o alelo -336G como
fator de proteção contra a dengue não-hemorrágica, e como fator de risco para
dengue hemorrágica.
Conforme exposto acima, as associações para essa região são diversas,
refletindo em diferenças entre as populações estudadas e alterações no padrão de
expressão do gene. O variante -336G, localiza-se a 214 pb do principal sítio de
transcrição da região promotora de DC-SIGN, afetando a ligação do fator de
transcrição Sp1 e modulando a atividade transcricional, pelo decréscimo de sua
expressão in vitro (SAKUNTABHAI et al., 2005).
A redução da expressão de DC-SIGN em células de Hofbauer e DCs, pode
ser usada em benefício do patógeno, visto que a capacidade de apresentação de
antígenos dessas células podem ser comprometidas (BOLIY-LAROUCHE et al.,
2007). No entanto, a diminuição da expressão, pode ser prejudicial ao patógeno,
pela diminuição dos alvos de escape (LEKKERKERKER et al.,2006; SOILLEUX et
al., 2000), e benéfica para o hospedeiro, visto que a quantidade de vírus ligado ao
74
receptor interagindo com células T in trans pode ser diminuída, sugerindo uma
explicação para os resultados evidenciados.
Também foi constatada a associação de variantes do promotor a
susceptibilidade a transmissão do vírus HIV-1 via TV, o genótipo -871 G/G.
Semelhantemente, aos variantes do SNP-201, este foi o primeiro trabalho a associar
variantes no SNP-871 com a infecção promovida pelo HIV-1 via transmissão vertical,
corroborando os achados de Barreiro et al. (2006), que sugeriram o alelo -871G e os
genótipos -871G/A e -871G/G, como fatores de proteção a TB em uma população
Sul africana. Variações nessa região, provavelmente, também atuam na modulação
da transcrição gênica, aumentando e/ou diminuinodo o nível de expressão do
receptor (SELVARAJ et al., 2009).
Adicionalmente, foram observados desvios do princípio de H-W, os quais
podem ser explicados devido à falta de poder estatístico, erros de genotipagem,
tamanho da população estudada e a reais associações, que podem atuar como
forças evolutivas promovendo desequilíbrio nas frequências gênicas (SELVARAJ et
al., 2009).
Outras regiões do gene DC-SIGN, como a região repetida do éxon 4, também
tem apresentado importantes papéis na susceptibilidade e proteção a infecções em
diferentes populações (LIU et al., 2004; BARREIRO et al., 2007; CHAUDHARY et al.,
2008; ZHANG et al., 2008). Na transmissão do HIV-1, ainda não existe um consenso
quanto o real papel de polimorfismos nesta região, na promoção da suscetibilidade
e/ou proteção contra o vírus (BOILY-LAROUCHE et al., 2007).
Estudos conduzidos entre indivíduos exposto ao HIV-1 e controles em
populações dos Estados Unidos (LIU et al., 2004), da Índia (CHAUDHARY et al.,
2008) e da China (ZHANG et al., 2008) apresentaram resultados semelhantes
quanto a baixa variabilidade de éxon 4 de DC-SIGN e discordaram quanto os efeitos
de polimorfismos nessa região. Na população americana, verificou-se a associação
de genótipos heterozigotos a uma baixa susceptibilidade a infecção pelo HIV-1 (LIU
et al., 2004), enquanto que entre os chineses, alelos com menos de 5 repetições
foram associados a proteção contra o vírus (ZHANG et al., 2008). Diferentemente,
na população indiana não foi observado envolvimento desta região com a
transmissão viral (CHAUDHARY et al., 2008), corroborando os resultados obtidos
entre pernambucanos.
75
Na população pernambucana, foi observada uma baixa variabilidade para o
éxon 4 de DC-SIGN, com predomínio de alelos com 7 repetições e genótipos
homozigotos 7/7, não sendo evidenciada participação na transmissão do HIV-1 via
TV.
O baixo nível de variação, observado nas populações mundiais e na
população pernambucana, deve-se a fortes pressões seletivas impostas ao gene
DC-SIGN, que previne o surgimento de variabilidade. Ao que parece, o éxon 4 deste
gene, tem sido o principal alvo dessas pressões, visto que possui um tamanho
constante em diferentes populações (BARREIRO et al., 2005; BOILY-LAROUCHE et
al., 2007; ORTIZ et al., 2009).
Diferentemente, o éxon 4 de L-SIGN, apresentou consideráveis níveis de
variabilidade na população pernambucana, corroborando com dados existentes na
literatura. Enquanto DC-SIGN se encontra sob forte pressão seletiva, L-SIGN está
sob a ação de uma seleção balanceada em populações não-africanas, garantindo
variabilidade. Essas forças evolutivas, parecem ser direcionadas a região do éxon 4
de L-SIGN, garantindo um excesso de variações (BARREIRO et al., 2006; ORTIZ et
al., 2009).
Alguns estudos sugerem que a grande variabilidade desta região gênica,
encontra-se relacionada com a susceptibilidade e a proteção a infecções (RATHORE
et al., 2008; SOILLEUX et al., 2000; LIU et al., 2006), corroborando os resultados
apresentados para a população pernambucana, onde polimorfismos foram
associados a susceptibilidade (genótipo 5/5) e a proteção (genótipos heterozigotos)
a transmissão vertical do HIV-1.
Rathore et al. (2008), através de estudo com indivíduos expostos ao HIV-1
(positivos e negativos), oriundos do Norte da Índia, constataram uma grande
variabilidade para o gene L-SIGN (éxon4), identificando 13 diferentes genótipos, dos
quais, o genótipo 5/5 foi considerado com fator de proteção a infecção pelo HIV-1,
discordando dos resultados apresentados no presente trabalho, onde genótipos 5/5
foram associados a susceptibilidade ao vírus.
Outros estudos sugerem que receptores L-SIGN com grande número de
repetições, garantem maior estabilidade ao tetrâmero, direcionando-os para longe
de glicanos e glicoproteínas da própria membrana celular, proporcionando um
contato eficiente com a superfície do patógeno (SOILLEUX et al., 2000), explicando,
76
em parte, o reduzido risco da infecção pelo HIV-1 do genótipo 5/5, apresentado por
Rathore et al. (2008). No entanto, outros autores sugerem que receptores L-SIGN
com 5 e 6 repetições, detêm a capacidade de formação de complexos com
glicoproteínas virais, aumentando a infecção pelo HIV-1 in cis e in trans, em ensaios
in vitro (GRAMBERG et al., 2006), explicando, em parte, a susceptibilidade viral
observada em indivíduos com genótipo 5/5, apresentada neste trabalho.
Adicionalmente, essa discrepância pode estar relacionada a diferenças
étnicas entre as populações estudadas, ao número de indivíduos analisados e aos
níveis de expressão dos receptores L-SIGN. Gramberg et al. (2006) sugerem que
células com reduzida expressão de L-SIGN pode ser menos competentes no
aumento da infectividade, podendo conferir alguma proteção contra a infecção por
vírus que utilizam esse receptor, sendo a recíproca verdadeira.
Genótipos heterozigotos para o gene L-SIGN (éxon 4) na população
pernambucana, mostraram-se também associados com proteção a transmissão do
HIV-1 de mãe para filho, corroborando os trabalhos de Liu et al. (2006) e
Wichukchinda et al. (2007).
Liu et al. (2006), estudando indivíduos americanos expostos ao HIV-1 (+ e -),
sugeriram a associação de genótipos homozigotos (7/7) e heterozigotos (7/5) com a
susceptibilidade e resistência a infecção pelo vírus, respectivamente. Similarmente,
Wichukchinda et al. (2007), estudando indivíduos expostos ao HIV-1 (+ e -) e
controles, oriundos da Tailândia, verificaram a presença de genótipos heterozigotos
(9/5 e 7/5) como fatores de proteção a infecção viral.
A heterozigosidade do éxon 4 de L-SIGN pode resultar na redução na
afinidade de ligação receptor-patógeno, podendo conferir proteção ao hospedeiro
(BASHIROVA et al., 2001; SOILLEUX et al., 2000; MITCHELL et al., 2001). Ensaios
in vitro, utilizando células de ovário de Hamister chinês transfectadas com L-SIGN,
mostraram que homozigotos para 7 repetições apresentavam alta capacidade de
ligação a patógenos, quando comparadas a heterozigotos 7/5 (CHAN et al., 2006),
corroborando os resultados aqui apresentados.
Adicionalmente, alguns trabalhos relatam que a susceptibilidade a infecções
virais, não se encontra relacionada com o número de repetições, mas sim com a
quantidade de receptores L-SIGN na célula. Zuo et al. (2010), através de
experimentos in vitro, visando verificar a transferência viral entre células Raji e
77
células MT4, verificaram que o número de vírus transferidos foi proporcional ao
número de moléculas de L-SIGN, implicando que genótipos polimórficos não estão
diretamente envolvidos com a eficiência da infecção in trans, mas que podem afetar
a quantidade de moléculas L-SIGN na superfície da célula, atuando na estabilização
do tetrâmero (ZHO et al., 2010).
Segundo Boily-Larouche et al. (2009), a presença de L-SIGN na superfície de
células endoteliais da placenta, garante a proteção contra a infecção pelo HIV-1,
pela captura do vírus e promoção de sua degradação e/ou apresentação de
antígenos. No entanto, em placentas com baixos níveis de L-SIGN, o HIV-1 interage
preferencialmente com receptores CCR5, em células endoteliais, resultando na
perca da integridade da barreira placentária, aumentando a passagem de células
infectadas pelo HIV-1 da mãe para circulação fetal, conduzindo a transmissão.
Na tabela 17, podem-se evidenciar as principais contribuições deste trabalho,
no contexto da transmissão do vírus HIV-1.
Tabela 17. Associações dos genes DC-SIGN e L-SIGN a infecção pelo HIV-1: diferentes populações mundiais x população pernambucana.
DADOS DA LITERATURA PARA DIFERENTES POPULAÇÕES
Gene Infecção Variante População Associação Referência
DC
-SIG
N
Pro
mo
tor
HIV-1
-139 G
Japonesa
Susceptibilidade
Koizume et al., 2007
HIV-1 -336 G Euro-Americana Susceptibilidade Martin et al., 2004
TB-HIV -336 G/G Sul Indiana Proteção para HIV-1 Selvaraj et al., 2009
TB-HIV -336 G/G Sul Indiana Susceptibilidade HIV-TB Selvaraj et al., 2009
L-S
IGN
Éxo
n 4
HIV-1
5/5
Norte Indiana
Proteção
Rathore et al., 2008
HIV-1 7/5 Americana Proteção Liu et al., 2006
HIV-1 7/5 Tailandesa Susceptibilidade Wichukchinda et al., 2007
HIV-1 7/7 Americana Susceptibilidade Liu et al., 2006
HIV-1 9/5 Tailandesa Susceptibilidade Wichukchinda et al., 2007
HIV-1 Alelo 9 Chinesa Susceptibilidade Xu et al., 2010
CONTRIBUIÇÕES DO PRESENTE TRABALHO
Gene Infecção Variante População Associação Referência
DC
-SIG
N
Pro
mo
tor
HIV-1
-201 T
Pernambucana
Proteção
Presente trabalho
HIV-1 -201 G/T Pernambucana Proteção Presente trabalho
HIV-1 -336 G/G Pernambucana Proteção Presente trabalho
HIV-1 -871 G/G Pernambucana Susceptibilidade Presente trabalho
L-S
IGN
Éxo
n 4
HIV-1
5/5
Pernambucana
Susceptibilidade
Presente trabalho
HIV-1 Heterozigoto Pernambucana Proteção Presente trabalho
78
Análise da influência de polimorfismos presentes nos genes DC-SIGN e L-
SIGN sobre a transmissão vertical do HIV-1 em crianças pernambucanas, apresenta
uma abordagem inovadora, sendo um dos primeiros trabalhos realizados no Brasil e
no mundo a sugerir a associação dos polimorfismos -201T, -201 G/T e -871 G/G
presentes no gene DC-SIGN, bem como de genótipos heterozigotos e homozigotos
(5/5), para o exón 4 do gene L-SIGN com a proteção e a susceptibilidade,
respectivamente, a transmissão de mãe para filho do HIV-1, contribuindo
significativamente para o entendimento do papel de polimorfismos nestes genes em
infecções ocasionadas por vírus.
6.2 Papéis dos Polimorfismos nos genes DC-SIGN e L-SIGN no
Desenvolvimento de Tuberculose Ativa
A TB, apesar de existir a milênios e de possuir tratamento eficiente, ainda é
considerada como a segunda causa de morte por doenças infecciosas, só perdendo
para a AIDS. Trata-se de uma doença infecto-contagiosa crônica, ocasionada pelo
bacilo M. tuberculosis, que essencialmente atinge os pulmões, promovendo
profundas alterações no sistema imunológico (TAILLEUX et al., 2005; NEYROLLES
et al., 2006; HERNANDEZ-PANDO et al., 2009).
O M. tuberculosis detém a capacidade de se ligar a diversos receptores
celulares, conduzindo a infecção de células permissíveis (NEYROLLES et al., 2006).
Receptores DC-SIGN e L-SIGN podem se ligar ao bacilo através de componentes de
sua parede celular (ManLAM), podendo desempenhar importantes papéis na
entrada, na persistência e na resposta hospedeira ao patógeno (GEIJTENBEEK et
al., 2003; KOPPEL et al., 2004). Além de fatores imunológicos, fatores genéticos do
hospedeiro podem exercer influência sobre a susceptibilidade e proteção ao
desenvolvimento da doença (MARQUET; SCHURR, 2001).
SNPs presentes na região promotora do gene DC-SIGN e polimorfismos no
número de repetições do éxon 4 de DC-SIGN e L-SIGN, têm sido associados a TB,
conduzindo respostas diferenciadas entre pacientes e controles.
79
A susceptibilidade e/ou proteção a TB exercida por DC-SIGN, parece ser
dependente dos níveis de expressão desse receptor em células alvos. Polimorfismos
exercem influência direta na expressão da proteína. Variantes, como o genótipo -336
G/G, conduzem a baixos níveis de expressão de DC-SIGN (SAKUNTABHAI et al.,
2005), influenciado no sucesso de infecção de células alvos, corroborando os
resultados evidenciados aqui apresentados.
Na população pernambucana, o genótipo G/A foi associado à proteção contra
o desenvolvimento da TB, especialmente na forma pulmonar, corroborando os
trabalhos de Barreiro et al. (2006), Vannberg et al. (2008) e Selvaraj et al. (2009).
Barreiro et al. (2006), em estudo realizado entre pacientes TB e controles sul
africanos, associaram o alelo -336 A com a proteção a doença. Vannberg et al.
(2008), estudando pacientes TB e controles oriundos da África Sub-Saara (Gâmbia,
República da Guiné e Malawi), associaram o alelo -336 G e o genótipo -336 G/G
com reduzido risco de desenvolvimento de TB pulmonar. O genótipo -336 G/G,
também foi associado à susceptibilidade a co-infecção HIV-TB em pacientes do sul
da Índia (SELVARAJ et al., 2009). Por outro lado, estudos realizados com pacientes
TB e controles, na Colômbia (GÓMEZ et al.,2006), na Tunísia (BEM-ALI et al.,
2007), e na China (ZHENG et al., 2010), não observaram associações com a
doença.
Considerando que o alelo G, relaciona-se a uma baixa expressão gênica,
para genótipos -336 G/A, espera-se uma expressão equilibrada de DC-SIGN, em
macrófagos e DCs, permitindo a apresentação de antígenos a células T, resultando
na resposta imune direcionada a eliminação do patógeno (GEIJTENBEEK et al.,
2003).
Além de variantes do SNP-336, variantes na posição -871, também se
apresentaram associados ao desenvolvimento da TB, na forma pulmonar e
extrapulmonar, exercendo papéis na proteção (-871G e -871G/A) e na
susceptibilidade (-871A e -871 A/A), corroborando os achados de Barreiro et al.
(2006), que sugeriram o alelo -871G e os genótipos -871G/A e -871G/G, como
fatores de proteção a TB. Por outros lado, Zheng et al. (2010) estudando uma
população da China com TB, não verificaram associação do SNP-871 a doença.
80
Variações no SNP-871, provavelmente, atuam na modulação da transcrição
gênica, aumentando e/ou diminuindo o nível de expressão do receptor (SELVARAJ
et al., 2009).
Além da região promotora, outras regiões do gene DC-SIGN, particularmente
o éxon 4, têm sido pesquisadas no contexto da TB. No entanto, diversos trabalhos
sugerem a inexistência de diferenças entre pacientes TB e controles (Tabela 18),
corroborando os resultados aqui apresentados. A maioria dos estudos, relatam a
baixa variabilidade do éxon 4 de DC-SIGN e confirmam a predominância do alelo
com 7 repetições e de genótipos 7/7, descartando o envolvimento com a doença
(BARREIRO et al., 2007; BEM-ALI et al., 2007; ALAGARASU et al., 2009).
Tabela 18. Estudos de Associação do gene DC-SIGN (éxon 4) e tuberculose em diferentes populações mundiais
Origem da População
Infecção Número de Envolvidos Resultado Referência
Casos Controles
Colômbia TB 110 TB 299 Não associado Gómez et al., 2006 Africa do Sul TB 351 TB 360 Não associado Barreiro et al., 2007
Tunísia TB 138 TB 140 Não associado Bem-Ali et al., 2007
Índia
HIV-TB
81 HIV+TBP+ 61 HIV+TBE+ 150 HIV-TBP+
206
Não associado
Alagarasu et al., 2009
TB – Tuberculose HIV+TBP+ – Indivíduos soropositivos com tuberculose pulmonar HIV+TBE+ - Indivíduos soropositvos com tuberculose extrapulmonar HIV-TBP+ - Indivíduos soronegativos com tuberculose pulmonar
Diferentemente, o éxon 4 do gene L-SIGN na população pernambucana,
apresentou-se associado a proteção (alelos 4, 5 e 6 e genótipo 6/5) e a
susceptibilidade (alelo 9 e genótipo 9/9) ao desenvolvimento da TB, corroborando o
trabalho de Barreiro et al. (2006), que evidenciaram a presença de elevadas
frequências dos alelos 6 e 7, e dos genótipos 7/7 e 7/6 em pacientes TB sul
africanos, porém, sem associações com a doença.
Associações significativas foram evidenciadas para outras infecções. Xu et al.
(2010), estudando pacientes HIV+ e controles chineses, sugeriram a associação do
alelo 9 a susceptibilidade viral e aos elevados níveis de RNA viral, em comparação
aos alelos com 5 repetições, corroborando os dados evidenciados na população
pernambucana com TB. Por outro lado, Nattermann et al. (2006), analisando
portadores europeus do vírus da hepatite C (HCV), constataram a associação dos
alelos 5, 6 e 7 com aumento da carga de RNA viral, comparados aos alelos 4 e 9,
81
sugerindo que alelos com número de repetições igual ou inferior a 7, podem ser
relacionados a susceptibilidade ao HCV.
O aumento da região do “neck” de L-SIGN, garante a estabilidade dos
receptores, permitindo uma interação hospedeiro-patógeno mais eficiente
(SOILLEUX et al., 2000), possibilitando a entrada do bacilo na célula hospedeira,
onde o bacilo pode escapar da ação de enzimas lisossômicas, multiplicando-se e
afetando novas células, estabelecendo a TB (CLARK-CURTISS; HAYDEL, 2003).
No entanto, estudos in vitro, demonstram que L-SIGN com número de
repetições igual ou inferior a 5, em homozigose ou heterozigose, podem apresentar
instabilidade, promovendo mudanças na afinidade de ligação do receptor ao bacilo
(GUO et al., 2006), esclarecendo, em parte, a susceptibilidade a TB observadas para
os alelos 4, 5 e 6 e do genótipo 6/5 na população pernambucana.
Adicionalmente, Gramberg et al. (2006) sugeriram que alelos com 5 e 6
repetições são eficientemente expressos, promovendo o aumento da infecção, de
forma similar aos alelos selvagens (7 repetições), enquanto que Zhu et al. (2010),
sugerem que genótipos polimórficos de L-SIGN podem afetar a eficiência da
infecção, devido ao aumento na quantidade de receptores na superfície celular, que
afetam diretamente a avidez de ligação receptor-patógeno.
Assim, a expressão de L-SIGN em células endoteliais alveolares, com alta
afinidade por ManLAM presente no bacilo, permite a rápida internalização do
patógeno em lisossomos, conduzindo-os a eliminação (BASHIROVA et al., 2001;
PÖHLMANN et al., 2001; SOILLEUX et al., 2002; SOILLEUX, 2003). Adicionalmente,
L-SIGN também pode ser expresso em linfonodos e células LSECs do fígado, locais
sugestivos para captura e eliminação de antígenos microbianos (KOOPEL et al.,
2004).
Na tabela 19, pode-se evidenciar as principais contribuições dos genes DC-
SIGN e L-SIGN no desenvolvimento da TB ativa em diferentes populações.
A abordagem dos genes DC-SIGN e L-SIGN, no contexto da TB, mostrou-se
relevante para o esclarecimento dos papéis de polimorfismos genéticos, no
desenvolvimento da doença. Apesar de SNPs na região promotora já serem
associados a TB, em outras populações mundiais, esse foi o primeiro trabalho a
associar SNPs, nesta região, a TB em uma população brasileira. Similarmente, trata-
se da primeira descrição de variações do éxon 4 de L-SIGN associados a
82
susceptibilidade e a proteção a TB, em uma população mundial, conferido um
caráter inédito e contribuindo para o conhecimento acerca da influência de fatores
genéticos em infecções promovidas por bactérias.
Tabela 19. Associações dos genes DC-SIGN e L-SIGN a infecção pelo M. tuberculosis: diferentes populações mundiais x população pernambucana.
DADOS DA LITERATURA PARA DIFERENTES POPULAÇÕES
Gene Infecção Variante População Associação Referência
DC
-SIG
N
Pro
mo
tor
TB -336 A Sul Africana Proteção Barreiro et al., 2006
TB -336 G
-336 G/G
Sub- Saariana
Proteção
Vannberg et al., 2008
TB-HIV
-336 G/G
Sul Indiana Proteção para HIV-1
Selvaraj et al., 2009 Susceptibilidade HIV-TB
TB
-871 G -871 G/G -871 G/A
Sul Africana
Proteção
Barreiro et al., 2006
L-S
IGN
Éxo
n 4
Nenhum trabalho associando essa região com tuberculose
CONTRIBUIÇÕES DO PRESENTE TRABALHO
Gene Infecção Variante População Associação Referência
DC
-SIG
N
Pro
mo
tor
TB -336 G/A Pernambucana Proteção Geral e Pulmonar Presente trabalho TB -871 A Pernambucana Susceptibilidade Presente trabalho
TB
-871 G
Pernambucana Proteção Geral, Pulmonar
e Extrapulmonar
Presente trabalho
TB
-871 A/A
Pernambucana Susceptibilidade Geral,
Pulmonar e Extrapulmonar
Presente trabalho
TB
-871 G/A
Pernambucana Proteção Geral, Pulmonar
e Extrapulmonar
Presente trabalho
L-S
IGN
Éxo
n 4
TB Alelo 4 Pernambucana Proteção Proteção Presente trabalho TB Alelo 5 Pernambucana Proteção Presente trabalho TB Alelo 6 Pernambucana Proteção Presente trabalho
TB
Alelo 9
Pernambucana Susceptibilidade Geral e
Pulmonar
Presente trabalho
TB 6/5 Pernambucana Proteção Presente trabalho
TB
9/9
Pernambucana Susceptibilidade Geral,
Pulmonar e Extrapulmonar
Presente trabalho
83
7 CONCLUSÕES
O estudo dos papéis de polimorfismos genéticos em genes codificadores de
DC-SIGN e L-SIGN na população pernambucana, utilizando como modelos crianças
expostas ao HIV-1 via transmissão vertical (TV) e pacientes com tuberculose (TB)
ativa, apresentou um caráter inovador, identificando marcadores genéticos de
proteção e susceptibilidade à infecção pelo HIV-1 via TV e ao desenvolvimento da
TB ativa, inéditos em populações mundiais.
1. Polimorfismos de base única (SNPs) na região promotora de DC-SIGN,
provavelmente, atuaram na modulação dos níveis de expressão do receptor,
conduzindo:
À proteção (-201T, -201G/T e -336 G/G) e a susceptibilidade (-871G/G) à TV
do HIV-1 na população pernambucana, sendo as associações das variantes
(-201T, -201 G/T e -871 G/G) à infecção, inétidas em populações mundiais.
À proteção (-336 G/A, -871 G, -871 G/A) e a susceptibilidade (-871 A e -871
A/A) ao desenvolvimento de TB ativa, nas formas pulmonar (-336 G/A, -871
A, -871 G, -871 A/A e -871 G/A) e extrapulmonar (-871 A e -871 A/A) na
população pernambucana.
2. Polimorfismos no número de repetições do éxon 4 de DC-SIGN, provavelmente,
não atuaram na TV do HIV-1 e nem no desenvolvimento de TB ativa na
população pernambucana.
3. Polimorfismos no número de repetições do éxon 4 de L-SIGN, provavelmente,
atuaram na afinidade de ligação receptor-patógeno, conduzindo:
À proteção (genótipos heterozigotos) e a susceptibilidade (genótipo 5/5) a
TV do HIV-1, na população pernambucana.
À proteção (alelos com 4, 5 e 6 repetições e genótipo 6/5) e a
susceptibilidade (alelo com 9 repetições e genótipo (9/9) ao
desenvolvimento de TB ativa, nas formas pulmonar (alelos com 5, 6 e 9
repetições e genótipo 9/9) e extrapulmonar (alelo com 9 repetições e
genótipo 9/9), na população pernambucana, sendo essas associações
descritas pela primeira vez em uma população acometida por TB.
84
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97
9 ANEXOS
ANEXO A - Manuscrito Publicado no Periódico Internacioanal Human
Immunology (2011)
Fator de Impacto (JCR®published by Thomson Reuters - 2010) – 2.550
98
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10 MEMORIAL
Nome: Ronaldo Celerino da Silva
Data de Nascimento: 14 de abril de 1984.
E-mail: [email protected]
Formação Acadêmica: Bacharelado em Ciências Biológicas – Universidade Federal
de Pernambuco (UFPE) – 2004 a 2008.
Ronaldo Celerino nasceu na cidade de Limoeiro - PE, mas vive, desde então,
na cidade de Passira–PE, a qual considera sua terra natal. Desde os primeiros anos
escolares até o último ano do Ensino Médio, frequentou escolas públicas de Passira,
demostrando grande aptição e profundo interesse pelas ciências da vida.
Em 2004, ingressa Universidade Federal de Pernambuco no Curso de
Bacharelado em Ciências Biológicas, dando os primeiros passos em sua carreira
acadêmica. Nesse período, foi monitor da disciplina Análise Bacteriológica da Água,
e aluno de Iniciação Científica (PIBIC-UFPE) do Departamento de Biofísica e
Radiobiologia, desenvolvendo, por três anos consecutivos, trabalhos na área de
Mutagênese Ambiental, sob orientação da Profª Drª Ana Maria de Albuquerque
Melo.
Em 2008, conclui a graduação, apresentado a monografia intitulada: “Ação
Genotoxicológica do Herbicida Oxifluorfen sobre Células Germinativas e
Embrionárias do Molusco Biomphalaria glabrata”, recebendo nota máxima de todos
os componentes da banca examinadora, publicando seu primeiro artigo científico
intitulado: “Efeitos do Oxifluorfen na Fecundidade e no Teor de Proteínas do
Caramujo Biomphalaria glabrata”.
Em 2009, seu profundo interesse em pesquisa na área genética, possibilitou o
ingresso no Programa de Pós-graduação em Genética (Mestrado) sob a orientação
do Prof. Dr. Sergio Crovella, onde passa a desenvolver trabalhos na área de
imunogenética humana. Durante o mestrado publica o artigo de revisão intitulado
“The Role of DC-SIGN and L-SIGN Receptors in HIV-1 Vertical Transmission”, no
periódico Human Immunology e participou de importantes eventos científicos, como:
56º Congresso Brasileiro de Genética.
Ao chegar ao término de mais um ciclo em sua formação, o desejo em
expandir seus conhecimentos na área genética, ainda é imenso, e será dando
continuidade através do seu Doutorado em Genética, a partir de março de 2011.