UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
BRUNA HAWERROTH
AVALIAÇÃO IN SÍLICO E IN VIVO DO POTENCIAL
ANTICONVULSIVANTE E TOXICOLÓGICO DE
DERIVADOS TIAZOLIDINODIÔNICOS
Itajaí (SC)
2017
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
BRUNA HAWERROTH
AVALIAÇÃO IN SÍLICO E IN VIVO DO POTENCIAL
ANTICONVULSIVANTE E TOXICOLÓGICO DE
DERIVADOS TIAZOLIDINODIÔNICOS
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profª. Drª. Fátima de
Campos Buzzi Co-orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria de Souza
Itajaí (SC)
Julho, 2017
À Deus que é meu refúgio e me faz vitoriosa pelo simples fato de me dar uma nova oportunidade todos os dias. Seu fôlego de vida em mim me tornou capaz e me deu coragem para enfrentar um novo mundo de possibilidades.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, que me presenteou com o dom da vida e me ensinou a
lutar pelas conquistas dos meus ideais. A Ele que foi minha fortaleza para enfrentar todas as
dificuldades e iluminou todos os passos da minha caminhada.
A Nossa Senhora por me segurar em seu colo santo e acolhedor. Por interceder e levar
minhas orações ao seu filho Jesus.
Aos meus pais, Vilson e Jussara, que sempre acreditaram que eu era capaz. Mãe, seu
cuidado, carinho e dedicação me fortaleceram e me deram esperança para seguir. Pai, sua
presença me oferece segurança e certeza de que não estou sozinha nunca.
Ao meu irmão, William, pela paciência e por torcer pelo meu sucesso.
Ao meu namorado, Danilo, pessoa com quem amo partilhar os dias. Com você a vida
ganhou cor. Sou grata a Deus pela sua vida, por dedicar todo seu amor por mim, por suas
orações e por sonhar junto comigo.
Aos amigos dos grupos de oração jovem Obra Nova e Javé Nessi, que muitas vezes me
estenderam a mão e me mostraram o valor da minha fé. Valeu a pena toda distância, todo
sofrimento e toda renúncia. Obrigada por cada momento e por cada rezar, hoje colho frutos da
vida em oração.
As professoras orientadoras Fátima e Márcia pela paciência, compreensão e convívio.
Estendo os agradecimentos aos avaliadores Eduardo Dalmarco, Luisa Mota e Rivaldo Niero.
Aos companheiros de laboratório por todo apoio e aprendizado compartilhados. Em
especial agradeço a Bianca e a Aline, minhas parceiras de bancada e café da tarde. Sentirei
falta das nossas conversas e da parceria.
A minha única e companheira amiga de orações pelo laboratório, Juliana, por todo
carinho e aconselhamento. Obrigada por partilhar a sua fé comigo e por servir a Deus como eu.
A minha companheira de disciplinas Daniele, por toda parceria e consolo. Sua
presença foi muito importante na correria de cada semestre.
As pesquisadoras Elaine, Maria Tereza e Cristiani, que iniciaram os estudos e
proporcionaram a conclusão deste trabalho.
As alunas Ana Paula Dalmagro, Luisa Bolda e Priscila Zimath, por todo auxílio
durante os experimentos no laboratório de farmacologia. Sem a dedicação de vocês não conseguiria
concluir esta etapa de formação.
A CAPES/PROSUP pelo apoio financeiro.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente na construção deste trabalho.
AVALIAÇÃO IN SÍLICO E IN VIVO DO POTENCIAL
ANTICONVULSIVANTE E TOXICOLÓGICO DE
DERIVADOS TIAZOLIDINODIÔNICOS
Bruna Hawerroth
Julho/2017
Orientadora: Fátima de Campos Buzzi, Drª.
Co-orientadora: Márcia Maria de Souza, Drª.
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.
Núero de páginas: 178.
A epilepsia é uma doença neurológica que afeta aproximadamente 1% da população, caracterizada por crises convulsivas recorrentes, decorrentes de descargas elétricas anormais causadas principalmente pelo desequilíbrio dos sistemas de neurotransmissão GABAérgica, glutamatérgica e oxidonitrérgica. O tratamento é realizado com fármacos antiepilépticos (FAEs) que reduzem a ictogênese e apresentam efeitos adversos como alterações comportamentais, hepáticas e renais, no qual, 30% dos pacientes não são responsivos ao tratamento disponível. Portanto, se faz importante a descoberta de novas
substâncias com potencial anticonvulsivante. As tiazolidinodionas (TZDs) são fragmentos que possuem esta atividade. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial anticonvulsivante e toxicológico in vivo e in sílico de derivados tiazolidinodiônicos. Uma série de 5 derivados TZDs, nomeados como A1, D1, D2, D3 e D4, foi avaliada in sílico por métodos computacionais como Molinspiration, PreADMET e OSIRIS, para investigação de suas propriedades físico-químicas e bioatividade. Posteriormente, os compostos foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) na dose de 10 mg/Kg, e avaliados em testes farmacológicos in vivo, utilizando camundongos Swiss Webster machos e fêmeas, a partir de testes de convulsão induzida quimicamente por
pentilenotetrazol (PTZ) (85 mg/Kg, i.p.) e estricnina (STR) (4 mg/Kg, i.p.); e eletricamente, sendo seus efeitos comparados com veículo, gabapentina (20 mg/Kg, i.p.), fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.), e carbamazepina (20 mg/Kg, i.p.). Testes como o labirinto em cruz elevado (LCE), esquiva inibitória (EI), sono induzido por barbitúricos (MSB) e campo aberto (CA) foram utilizados para avaliar o efeito do composto de melhor atividade anticonvulsivante no comportamento dos animais. O composto que apresentou atividade anticonvulsivante nos testes de triagem também foi avaliado na dose de 100 mg/Kg, v.o. A investigação do mecanismo de ação da propriedade
anticonvulsivante do composto D4 a partir do teste de convulsão induzida por PTZ, foi realizado utilizando antagonistas como flumazenil, para avaliação da via GABAérgica, ketamina, para via glutamatérgica, e L-arginina, éster metílico de N-nitro-L-arginina (L-NAME) e 7-nitroindazol (7-NI), para a via oxidonitrérgica. Os animais foram avaliados após tratamento de 21 dias com D4 para investigação de efeitos tóxicos e comportamentais. O plasma dos animais foi coletado para análise de parâmetros hepáticos (aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, fosfatase alcalina e proteínas totais), renais (ureia e creatinina), glicose e creatinofosfoquinase. O tecido
cerebral foi analisado em testes ex vivo. Para isto, foi realizada a quantificação de glutationa reduzida (GSH), hidroperóxidos lipídicos (LOOH) e a determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD). Os animais foram submetidos a controle de
peso corporal e seus órgãos foram pesados para verificação de alterações morfológicas. Os resultados mostraram que nenhum dos compostos violou os parâmetros de Lipinski, não apresentaram perfil tóxico indicado pelo OSIRIS, indicaram a capacidade de os compostos atravessarem a barreira hematoencefálica (BHE) e terem boa absorção intestinal (AIH). Os compostos D1, D2, D3 e D4 apresentaram atividade anticonvulsivante no teste de convulsão induzida por STR e os compostos A1, D1 e D4 apresentaram ação anticonvulsivante no teste de convulsão induzida por eletrochoque. O composto que aumentou o limiar convulsivo dos animais nos testes de indução de
convulsão química por PTZ (51,98%) e STR (51,67%), e elétrica (65%) foi o composto D4, sendo escolhido para a continuidade dos experimentos. Este composto não produziu déficit motor no CA e de memória na EI, apresentou efeito ansiolítico observado no LCE e efeito hipnótico no MSB. O composto D4 aumentou o limiar convulsivo em 24,31% em relação ao grupo controle por v.o. O efeito anticonvulsivante foi revertido significativamente com o pré-tratamento com 7-NI, sugerindo o envolvimento da via oxidonitrérgica. No teste CA os animais não demonstraram alterações motoras e comportamentais. O composto D4 aumentou significativamente o limiar convulsivo após
tratamento subcrônico, observado no teste de convulsão induzida por PTZ. O composto D4 não alterou significativamente os níveis de aspartato aminotransferase, fosfatase alcalina, ureia e creatinofosfoquinase, mas alterou outros parâmetros bioquímicos, como glicose, creatinina, proteínas totais e alanina aminotransferase, portanto, são necessários estudos mais aprofundados para a confirmação de possível hepatotoxicidade e nefrotoxicidade em tratamento subcrônico. Os níveis de GSH e SOD não foram significativos, mas houve aumento de LOOH no hipocampo, compatível com o envolvimento da pontencialização de longa duração (LTP). Não foi observada alterações
morfológicas nos órgãos e no desenvolvimento ponderal dos animais. Os resultados sugerem que o composto D4 pode ser útil no manejo de crises epilépticas (CEs), embora estudos adicionais são importantes para garantir a sua segurança.
Palavras-chave: Anticonvulsivantes. Epilepsia. Tiazolidinodionas.
IN SÍLICO AND IN VIVO EVALUATION OF
ANTICONVULSANT AND TOXICOLOGICAL
POTENTIAL OF THIAZOLIDINEDIONE DERIVATIVES
Bruna Hawerroth
July/2017
Advisor: Fátima de Campos Buzzi, Drª.
Co-advisor: Márcia Maria de Souza, Drª.
Concentration area: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances.
Number of pages: 178.
Epilepsy is one of the most common neurological disorders, and affects about 1% of the population. It is characterized by recurrent seizures, due to abnormal electrical discharges caused mainly by an imbalance of the GABAergic, glutamatergic and oxide nitrogenic neurotransmission systems. Treatment involves antiepileptic drugs (AEDs) that reduce ictogenesis but have adverse effects such as behavioral, hepatic and renal changes. Given that 30% of patients are unresponsive to the available treatment, it is important to discover new substances with anticonvulsant potential. Thiazolidinediones (TZD) are fragments that possess this activity. The aim of this study was to synthesize
and evaluate the in silico and in vivo anticonvulsant and toxicological potential of TZD derivatives. A series of 5 TZD derivatives, namely A1, D1, D2, D3 and D4, were evaluated in silico by computational methods such as Molinspiration, PreADMET and OSIRIS, for investigation of their physicochemical properties and bioactivity. The compounds were then administered intraperitoneally (i.p.) at a dose of 10 mg/Kg, and evaluated in in vivo pharmacological tests using male and female Swiss Webster mice, by seizures chemically induced by pentylenetetrazole (PTZ) (85 mg/Kg, i.p.) and strychnine (STR) (4 mg/Kg, i.p.); and electrically induced convulsions, comparing their
effects with vehicle, gabapentin (20 mg/Kg, i.p.), phenobarbital (50 mg/Kg, i.p.), and carbamazepine (20 mg/Kg, i.p.). Tests such as the Elevated plus-maze (EPM), Inhibitory Avoidance (IA), Barbiturate-induced Sleeping test (MSB) and the Open-Field test (OF) were used to evaluate the effect of the compound with the best anticonvulsant activity on the animal’s behavior. The compound that showed anticonvulsant activity in both screening tests was also evaluated at a dose of 100 mg/Kg, v.o. The evaluation of the mechanism of action of the anticonvulsant property of compound D4 through the PTZ-induced seizure test was performed using antagonists such as flumazenil, for
GABAergic pathway evaluation, ketamine, for glutamatergic pathway, and L-arginine, N-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and 7-nitroindazole (7-NI), for the oxide nitrergic pathway. Mice were evaluated after 21 days with D4 to investigate the toxic and behavioral effects. Blood plasma was collected from the animals for analysis of hepatic parameters (aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase and total proteins) and renal parameters (urea and creatinine). Brain tissue was analyzed in ex vivo tests. For this purpose, the quantification of reduced glutathione (GSH), lipid hydroperoxides (LOOH) and determination of superoxide dismutase (SOD)
activity was performed. The animals were submitted to body weight control and their organs were weighed to determine morphological changes. The results showed that none of the compounds violated Lipinski’s rule or presented a toxic profile indicated by
OSIRIS; they indicated the ability of the compounds to cross the blood-brain barrier (BBB) and good intestinal absorption (IA). Compounds D1, D2, D3 and D4 showed anticonvulsant activity in STR-induced seizure test, and compounds A1, D1 and D4 presented anticonvulsant action the electroshock-induced seizure test. The compound that increased the seizure threshold of the animals in the PTZ (51.98%) and STR (51.67%) seizure induction tests, and in the electrical induction test (65%) was compound D4, which was therefore chosen for the remaining experiments. This compound did not produce motor deficit in the OF or memory deficit in the IA, and
demonstrated anxiolytic effect in EPM and hypnotic effect in MSB. Compound D4 increased the seizure threshold by 24.31% in relation to the control group per v.o. The anticonvulsant effect was significantly reversed with pre-treatment with 7-NI, suggesting the involvement of the oxidonitrergic pathway. In the OF test, the animals did not demonstrate any motor or behavioral changes. Compound D4 also increased the seizure threshold by 28.82% in the PTZ-induced test after subchronic treatment. This compound did not significantly alter the aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase and urea levels, but did alter other parameters, such as alanine
aminotransferase, total proteins and creatinine. More in-depth studies are therefore needed to confirm possible hepatotoxicity and nephrotoxicity in subchronic treatment. GSH and SOD levels were not significant, but there was an increase in LOOH level in the hippocampus, compatible with the involvement of long-term potentialization (LTP). No morphological changes were observed in the organs or weight development of the animals. The results suggest that compound D4 may be useful in the management of epileptic seizures, though additional studies are important to ensure their safety.
Keywords: Anticonvulsants. Epilepsy. Thiazolidinodiones.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Classificação das crises epilépticas de acordo com a área cerebral
afetada. ................................................................................................. 39 Figura 2. Figura ilustrativa da sinapse glutamatérgica e dos tipos de receptores
glutamatérgicos. .................................................................................... 46 Figura 3. Classificação dos receptores glutamatérgicos. ................................. 47 Figura 4. Imagem ilustrativa da estrutura do receptor GABAA. ...................... 48 Figura 5. Exemplos de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio
(EROs/ERNs). ...................................................................................... 52 Figura 6. Formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e o impacto
do estresse oxidativo e nitrosativo na função proteica............................. 53 Figura 7. Reações bioquímicas envolvidas na geração de espécies reativas de
oxigênio e mecanismos de defesa antioxidantes. .................................... 56 Figura 8. Período de introdução de fármacos antiepilépticos no mercado
farmacêutico entre 1857 e 2012. ............................................................ 58 Figura 9. Estimativa de crescimento e gastos globais com medicamentos até
2021. .................................................................................................... 68 Figura 10. Medicamentos globais em fase avançada de desenvolvimento em
2016. .................................................................................................... 69 Figura 11. Média de prazos para as fases clínicas e aprovação de entidades
terapêuticas entre 2005 e 2009. .............................................................. 70 Figura 12. Taxa de sucesso de aprovação clínica. .......................................... 70 Figura 13. Esquema estrutural da barreira hematoencefálica e capilares
periféricos. ............................................................................................ 74 Figura 14. Principais descritores utilizados para a predição da permeabilidade
da barreira hematoencefálica segundo Geldenhuys et al., 2015. .............. 75 Figura 15. Modelos estruturais de heterociclos de interesse biológico. ........... 78 Figura 16. Estrutura molecular da tiazolidina (A) e seu derivado tiazolidina-2,4-
diona (TZD) (B). ................................................................................... 79 Figura 17. Agentes antihiperglicêmicos contendo o núcleo TZD. ................... 80 Figura 18. Rota sintética para a obtenção dos derivados sulfonamídicos
benzilidenotiazolidinodionas. ................................................................ 83 Figura 19. Foto ilustrativa do aparato de campo aberto (Open Field).............. 89 Figura 20. Foto ilustrativa do aparato e esquema do teste de esquiva inibitória.
............................................................................................................. 90 Figura 21. Foto ilustrativa do aparato do labirinto em cruz elevado (Plus-maze).
............................................................................................................. 91 Figura 22. Partes do cérebro de camundongos utilizadas para obtenção das
amostras. .............................................................................................. 94 Figura 23. Estrutura química do pentilenotetrazol (PTZ). ............................. 107
Figura 24. Efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo (10 mg/Kg, i.p.),
da gabapentina (20 mg/Kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste
de convulsão induzida por pentilenotetrazol. ........................................108 Figura 25. Estrutura química do ácido gama-aminobutírico (GABA), da
gabapentina e do fenobarbital. ..............................................................109 Figura 26. Efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo (10 mg/Kg, i.p.),
da gabapentina (20 mg/Kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste
de convulsão induzida por estricnina. ...................................................110 Figura 27. Efeito dos compostos A1, D1, D2, D3 e D4 (10 mg/Kg, i.p.) e da
carbamazepina (20 mg/Kg, i.p.) sobre a porcentagem de crise (A) e
duração da extensão clônica dos membros posteriores dos animais (B)
submetidos ao teste de convulsão ECM. ...............................................112 Figura 28. Efeito do composto D4 nas doses de 3, 10 e 30 mg/Kg, i.p., sobre a
latência da crise convulsiva no teste de convulsão induzida por PTZ. ....113 Figura 29. Efeito anticonvulsivante do composto D4 (100 mg/Kg, v.o.) e do
fenobarbital (100 mg/Kg, v.o.) no teste de convulsão induzida por
pentilenotetrazol. .................................................................................115 Figura 30. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) sobre a consolidação da
memória no teste de esquiva inibitória. .................................................118 Figura 31. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e diazepam (DZP) (0,75
mg/Kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais: (A) frequência de entradas nos braços abertos; e (B) tempo de permanência nos braços
abertos, de animais submetidos ao plus-maze. ......................................120 Figura 32. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) sobre: (A) latência do sono e
(B) tempo total de sono, no teste de sono induzido por barbitúrico. .......121 Figura 33. Influência da via GABAérgica sobre o efeito anticonvulsivante do
composto D4 (10 mg/Kg, i.p.)...............................................................123 Figura 34. Influência da via glutamatérgica sobre o efeito anticonvulsivante do
composto D4 (10 mg/Kg, i.p.). .............................................................126 Figura 35. Influência da via oxidonitrérgica sobre o efeito anticonvulsivante do
composto D4 (10 mg/Kg, i.p.)...............................................................129 Figura 36. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital
(50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros comportamentais avaliados no teste
Open Field. .........................................................................................131 Figura 37. Efeito anticonvulsivante subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg,
i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste de convulsão induzida por
PTZ. ....................................................................................................132 Figura 38. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital
(50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros hepáticos avaliados no plasma. ........136 Figura 39. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital
(50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros renais avaliados no plasma...............137
Figura 40. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital
(50 mg/Kg, i.p.) sobre glicose e creatinofosfoquinase avaliados no plasma.
........................................................................................................... 139 Figura 41. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital
(50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis de glutationa reduzida (GSH). ............ 141 Figura 42. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital
(50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis de hidroperóxidos lipídicos (LOOH). .. 143 Figura 43. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital
(50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis da atividade de superóxido dismutase (SOD). ................................................................................................ 144
Figura 44. Porcentagem do aumento de peso dos animais submetidos ao
tratamento subcrônico com o composto D4. ......................................... 146
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades físico-químicas de compostos e valores relacionados à
penetração da barreira hematoencefálica. ............................................... 77 Tabela 2. Estrutura, rendimento, R.f. e p.f. dos compostos em estudo. ........... 97 Tabela 3. Parâmetros de Lipinski e extensão da regra dos 5 dos compostos
tiazolidinodiônicos e fenobarbital, calculados pelo software
Molinspiration. ................................................................................... 100 Tabela 4. Valores de druglikeness, drugscore e LogS dos compostos
tiazolidinodiônicos e fenobarbital, calculados pelo software OSIRIS. ... 101 Tabela 5. Parâmetros farmacocinéticos (ADMET) dos compostos
tiazolidinodiônicos calculados pelo software PreADMET..................... 103 Tabela 6. Parâmetros farmacocinéticos considerados para boa permeabilidade
no sistema nervoso central. .................................................................. 106 Tabela 7. Efeitos do composto D4 avaliados no teste do Open Field. ............ 116 Tabela 8. Valores de referência de parâmetros bioquímicos plasmáticos em
camundongos Swiss............................................................................. 133 Tabela 9. Peso dos órgãos dos animais submetidos a tratamento subcrônico
com o composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.). ... 147
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Classificações das crises epilépticas. ............................................. 41 Quadro 2. Fármacos antiepilépticos, mecanismos de ação e efeitos adversos. . 60 Quadro 3. Compostos tiazolidinodiônicos em estudo. .................................... 84 Quadro 4. Parâmetros toxicológicos dos compostos tiazolidinodiônicos
calculados pelo software OSIRIS......................................................... 102
LISTA DE ABREVIATURAS
5-HT – Serotonina
Ach – Acetilcolina ADMET – Absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade
AIH – Absorção Intestinal Humana
ALT – Alanina aminotransferase
AMPA – Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico
AP-1 – Proteína ativadora 1
AST – Aspartato aminotransferase
ATC – Ácido tricloroacético
BD – Bilirrubina direta
BHE – Barreira hematoencefálica
BI – Bilirrubina Indireta
BT – Bilirrubina Total
BTZD – Benzilideno-1,3-tiazolidino-2,4-diona BTZDCl – Cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-lideno)-
metil]benzeno-sulfonila
CA – Campo aberto
cAMP – AMP cíclico
CAT – Catalase
CE/CEs – Crise epiléptica/Crises epilépticas
CEUA – Comitê de Ética no Uso de Animais
CoQH2 – Citocromo C redutase
COX-2 – Ciclooxigenase 2
CPK – Creatinofosfoquinase CRE – Creatinina
DA – Dopamina
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DSM-V – Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders
DZP – Diazepam
ECM – Teste de Eletrochoque Máximo
EEG – Eletroencefalograma
EH – Esclerose hipocampal
EI – Esquiva inibitória
eNOS – Enzima óxido nítrico sintase endotelial
EPM – Erro padrão da média
ERNs – Espécies reativas de nitrogênio EROs – Espécies reativas de oxigênio
FAE/FAEs – Fármaco antiepiléptico/Fármacos antiepilépticos
FDA – Food and Drug Administration
FALC – Fosfatase alcalina
GABA – ácido-γ-aminobutírico
GAT1 – Transportador GABAérgico
GC – Guanilato ciclase
GLI – Glicose
GLU – Glutamato
GMPc – Guanosina monofosfato cíclica
GPx – Glutationa peroxidase
GSH – Glutationa reduzida
GSR – Glutationa redutase GST – Glutationa S-transferase
GSSG – Glutationa oxidada
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
IL-1β, IL-6 – Interleucinas 1β e 6
ILAE – Liga Internacional Contra a Epilepsia
iNOS – Enzima óxido nítrico sintase induzível
i.p. – Via intraperitoneal
IP3 – Inositoltrifosfato
IV – Infravermelho
KA – Cainato
LCE – Labirinto em cruz elevado (plus-maze) LEAC – Laboratório Escola de Análises Clínicas
L-NAME – Éster metílico de N-nitro-L-arginina
LogP – Coeficiente octanol/água
LogD – Coeficiente de distribuição
LOOH – Hidroperóxidos lipídicos
LPO – Peroxidação lipídica
MDA – Malonaldeído
MM – Massa molecular
MEG – Magnetoencefalografia
mGluR – Receptores metabotrópicos de glutamato
MSB – Teste do sono induzido por barbitúricos NA – Noradrenalina
NCEs – Novas entidades químicas
NF-kB – Fator nuclear kappa B
NMDA – N-metil-D-aspartato
NO – Óxido nítrico
NOS – Enzima óxido nítrico sintase
nNOS – Enzima óxido nítrico sintase neuronal
O2- – Ânion superóxido
OH- – Radical hidroxila
ONOO- – Ânion peroxinitrito
PCP – Fenilciclidina P&D – Pesquisa e desenvolvimento
PET – Tomografia por emissão de pósitrons
p.f. – Ponto de fusão
PLC – Fosfolipase C
PPARs – Receptores ativadores proliferadores de peroxissoma
PPREs – Elementos de resposta do proliferador de peroxissoma
PT – Proteínas totais
PTZ – Pentilenotetrazol
QSAR – Quantitative Structure Activity Relationships (Relação estrutura-
atividade) Rf – Fator de retenção
RM – Ressonância magnética
RMN 1H - Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN 13C - Ressonância magnética nuclear de carbono 13
RNAm – RNA mensageiro
RXRs – Receptores X-retinóides
SNC – Sistema Nervoso Central
SOD – Superóxido dismutase
SPECT – Tomografia computadorizada de emissão de um único fóton
STR – Estricnina
TNF-α – Fator de necrose tumoral α TPSA – Área de superfície polar
TZD/TZDs – Tiazolidinodiona/Tiazolidinodionas
URE – Ureia
VNS – Estimulação nervosa vagal
v.o. – Via oral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 33
2 OBJETIVOS ............................................................................................ 35
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................... 35
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 35
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................ 37
3.1 Epilepsia ................................................................................................ 37
3.1.1 Classificação das crises .................................................................... 38
3.1.2 Etiologia ........................................................................................... 41
3.1.3 Diagnóstico ...................................................................................... 43
3.1.4 Manifestações clínicas ...................................................................... 44
3.1.5 Hipóteses neuroquímicas envolvidas na epilepsia ............................. 45
3.1.5.1 Neurotransmissão glutamatérgica na epilepsia .................................. 45
3.1.5.2 Neurotransmissão GABAérgica na epilepsia ...................................... 48
3.1.5.3 Outras vias de neurotransmissão envolvidas na epilepsia .................. 49
3.1.5.4 Estresse oxidativo e estresse nitrosativo na epilepsia ......................... 50
3.1.6 Tratamento da epilepsia.................................................................... 57
3.1.6.1 Fármacos antiepilépticos (FAEs) ....................................................... 57
3.1.6.2 Antioxidantes como adjuvantes na terapia antiepiléptica ................... 63
3.2 Testes animais em epilepsia .................................................................. 63
3.3 Química medicinal e a descoberta de fármacos .................................... 66
3.4 Desenvolvimento de fármacos anticonvulsivantes ................................ 67
3.5 Planejamento de fármacos e ferramentas computacionais .................. 71
3.5.1 Parâmetros físico-químicos para a permeação e biodisponibilidade
por via oral in sílico ..................................................................................... 71
3.5.2 Parâmetros físico-químicos para a permeação no SNC in sílico ....... 74
3.6 Heterociclos ........................................................................................... 77
3.6.1 Tiazolidinodiona (TZD) .................................................................... 78
4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 83
4.1 Química................................................................................................. 83
4.1.1 Compostos tiazolidinodiônicos em estudo ......................................... 83
4.1.1.2 Relação Estrutura-Atividade: análise in sílico ................................... 85
4.2 Atividade anticonvulsivante ................................................................. 86
4.2.1 Drogas e reagentes ........................................................................... 86
4.2.2 Via de administração ........................................................................ 86
4.2.3 Animais ............................................................................................ 87
4.2.4 Avaliação dos efeitos dos compostos em estudo nos testes de convulsão
induzida por pentilenotetrazol e estricnina .................................................. 87
4.2.5 Avaliação dos efeitos dos compostos em estudo nos testes de convulsão
induzida eletricamente ................................................................................. 88
4.2.6 Avaliação do efeito do composto D4 sobre os parâmetros
comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field) ............. 88
4.2.7 Avaliação do efeito do composto D4 sobre a memória através do teste
da esquiva inibitória (EI) ............................................................................. 89
4.2.8 Avaliação do efeito ansiolítico do composto D4 através do teste do
labirinto em cruz elevado (LCE) (Plus-maze) .............................................. 90
4.2.9 Avaliação do efeito do composto D4 sobre o sono através do teste da
indução do sono por barbitúricos (MSB) ..................................................... 91
4.3 Análise do mecanismo de ação do composto D4 ................................... 91
4.3.1 Investigação da via GABAérgica sobre o mecanismo de ação da
propriedade anticonvulsivante do composto D4............................................ 91
4.3.2 Investigação da via glutamatérgica sobre o mecanismo de ação da
propriedade anticonvulsivante do composto D4............................................ 92
4.3.3 Investigação da via oxidonitrérgica sobre o mecanismo de ação da
propriedade anticonvulsivante do composto D4............................................ 92
4.4 Avaliação do tratamento subcrônico com o composto D4 .................... 92
4.4.1 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 sobre os parâmetros
comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field) ............. 93
4.4.2 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 no teste de convulsão
induzida por PTZ ......................................................................................... 93
4.4.3 Investigação de alterações fisiológicas pelo tratamento com o
composto D4 através de análise laboratorial de plasma ................................ 93
4.4.4 Avaliação de parâmetros oxidativos no tecido cerebral ..................... 94
4.4.4.1 Preparação das amostras .................................................................. 94
4.4.4.2 Quantificação dos níveis de GSH ....................................................... 94
4.4.4.3 Determinação de LOOH .................................................................... 95
4.4.4.4 Determinação da atividade de SOD ................................................... 95
4.4.4.5 Mensuração da concentração de proteínas ........................................ 96
4.4.5 Análises complementares: avaliação do peso em tratamento
subcrônico com o composto D4 e peso dos órgãos isolados ........................... 96
4.4.6 Análise estatística ............................................................................. 96
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 97
5.1 Avaliação química ................................................................................. 97
5.1.1 Compostos tiazolidinodiônicos em estudo: caracterização e
identificação ................................................................................................ 97
5.1.2 Relação Estrutura-Atividade: análise in sílico .................................. 98
5.1.2.1 Molinspiration - Análise de Lipinski (Regra dos cinco) ...................... 98
5.1.2.2 OSIRIS ............................................................................................ 100
5.1.2.3 PreADMET ..................................................................................... 102
5.1.2.4 Descritores físico-químicos e farmacocinéticos utilizados na
predição da permeabilidade no SNC dos compostos TZDs ......................... 103
5.2 Atividade anticonvulsivante ................................................................ 106
5.2.1 Avaliação dos efeitos dos compostos em estudo nos testes de convulsão
induzida por pentilenotetrazol e estricnina................................................. 106
5.2.2 Avaliação do efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo no
teste de convulsão induzida eletricamente ................................................. 111
5.2.3 Escolha do composto efetivo nos testes de convulsão induzida
quimicamente e eletricamente ................................................................... 113
5.2.4 Avaliação do efeito anticonvulsivante do composto D4 no teste de
convulsão induzida quimicamente por pentilenotetrazol administrado por via
oral ............................................................................................................ 114
5.2.4 Avaliação do efeito do composto D4 sobre os parâmetros
comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field). .......... 115
5.2.4 Avaliação do efeito do composto D4 sobre a memória através da
esquiva inibitória (EI) ............................................................................... 116
5.2.5 Avaliação do efeito do composto D4 sobre parâmetros de ansiedade
através do teste do labirinto em cruz elevado (LCE) (Plus-maze) ............... 118
5.2.6 Avaliação do efeito do composto D4 sobre o sono através da indução
do sono por barbitúricos (MSB) ................................................................ 120
5.3 Mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4
.................................................................................................................. 121
5.3.1 Influência da via GABAérgica sobre a propriedade anticonvulsivante
do composto D4 .......................................................................................... 122
5.3.2 Influência da via glutamatérgica sobre a propriedade
anticonvulsivante do composto D4 ............................................................. 124
5.3.3 Influência da via oxidonitrérgica sobre a propriedade
anticonvulsivante do composto D4 ............................................................. 126
5.4 Avaliação do tratamento subcrônico com o composto D4 .................. 130
5.4.1 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 sobre os parâmetros
comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field) ........... 130
5.4.2 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 no teste de convulsão
induzida por PTZ....................................................................................... 131
5.4.3 Análise do plasma de animais tratados subcronicamente com o
composto D4 ............................................................................................... 132
5.4.3.1 Avaliação de parâmetros hepáticos ................................................. 133
5.4.3.2 Avaliação de parâmetros renais ...................................................... 136
5.4.3.3 Outros parâmetros .......................................................................... 138
5.4.4 Estresse oxidativo ........................................................................... 139
5.4.4.1 Quantificação dos níveis de GSH ..................................................... 140
5.4.4.2 Determinação de LOOH .................................................................. 141
5.4.4.3 Determinação da atividade de SOD ................................................. 143
5.4.5 Acompanhamento do desenvolvimento ponderal e efeito sobre o peso
dos órgãos dos animais submetidos ao tratamento subcrônico com o
composto D4 ............................................................................................... 144
5.4.5.1 Efeito do tratamento subcrônico com o composto D4 sobre o peso
corporal dos animais .................................................................................. 145
5.4.5.2 Avaliação do peso dos órgãos dos animais tratados subcronicamente
com o composto D4. .................................................................................... 146
6 CONCLUSÃO ....................................................................................... 149
REFERÊNCIAS ....................................................................................... 151
ANEXO 1 .................................................................................................. 177
33
1 INTRODUÇÃO
A epilepsia é uma doença caracterizada por crises convulsivas
recorrentes, resultantes de descargas elétricas excessivas e anormais no sistema
nervoso central (SNC). É uma doença mental que apresenta alterações
sensitivas, motoras e/ou de consciência (VAURIO; KARANTZOULIS; BARR,
2017). Trata-se de uma das condições neurológicas mais comuns no mundo,
afetando aproximadamente 1% da população, ou seja, cerca de 65 milhões de
pessoas (MOSHÉ et al., 2015; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017),
com um custo de aproximadamente US$ 15,5 bilhões anuais nos Estados
Unidos (WALSH et al., 2015). A doença é diagnosticada por exames clínicos,
eletrofisiológicos e de neuroimagem. As crises epilépticas (CEs) são
classificadas pela Liga Internacional Contra a Epilepsia (ILAE) em crises
generalizadas, que envolvem ambos os hemisférios e crises focais, que são
limitadas a um dos hemisférios cerebrais (MOSHÉ et al., 2015; SILVA;
CARDOSO; MACHADO, 2013; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).
A epilepsia não tem cura e a forma mais comum de tratamento é baseada na utilização de fármacos antiepilépticos (FAEs). Estes fármacos
atuam na modificação do potencial de descarga elétrica no SNC, reduzindo a
atividade convulsiva. Diversos mecanismos de ação parecem estar envolvidos
na fisiopatologia da epilepsia, mas a hipótese mais estudada está relacionada ao
desequilíbrio entre a hiperexcitação glutamatérgica e a hipoatividade
GABAérgica, relacionada com a geração de crises, isto é, a ictogênese (SILVA;
CABRAL, 2008; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017; WERNER;
COVEÑAS, 2015). A terapia com os FAEs é indispensável no controle das
crises, mas apresentam efeitos adversos e/ou colaterais, como: ganho de peso, cansaço, tonturas, reações alérgicas, depressão e psicoses, que podem ser
incapacitantes e diminuir a adesão ao tratamento (FERNANDES, 2013;
REMÍGIO, 2014; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).
Segundo alguns autores, 30% dos pacientes diagnosticados não são
responsivos ao tratamento, chamados de refratários, ou seja, quando não
respondem adequadamente as terapias (MOSHÉ et al., 2015; NAGAE et al.,
2016; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017). A indústria farmacêutica é
a responsável pela pesquisa e desenvolvimento (P&D) de novos fármacos
potenciais que satisfaçam as necessidades dos pacientes epilépticos, mas o
número de fármacos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA),
durante várias décadas, foi pouco significante. No entanto, em 2014, 41 novas entidades químicas (NCEs) foram aprovadas, indicando uma possível melhoria
no setor de P&D. Por isso, a indústria farmacêutica continua pesquisando e
investindo em desenvolvimento de novas moléculas bioativas (MIGNANI et
al., 2016a).
34
Neste aspecto, a indústria farmacêutica tem incessantemente buscado a
produção de fármacos mais seletivos e com menor latência de ação, toxicidade
e efeitos adversos, na tentativa de melhorar a adesão ao tratamento (MIGNANI
et al., 2016a). Na última década, uma prática adotada pela indústria farmacêutica na
obtenção de novas substâncias ativas, é o planejamento racional, identificação e
otimização dos compostos, capazes de atuarem em diversos alvos terapêuticos
(BARREIRO, 2009).
Para a obtenção de novos fármacos, são fundamentais as estratégias
moleculares in sílico, como a regra de Lipinski (LIPINSKI et al., 2001), pois
permitem a análise de características físico-químicas dos compostos em estudo,
além da predição de parâmetros farmacocinéticos, ou seja, que influenciam a
absorção, distribuição, metabolização, excreção e toxicidade (ADMET)
(NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).
Na grande maioria dos fármacos, os heterociclos são fragmentos
farmacologicamente ativos que apresentam diferentes heteroátomos no anel. As TZDs, derivadas da tiazolidina, são consideradas umas das classes mais
promissoras e desempenham papel fundamental na química medicinal
(SHYAM; DEBNATH; DEVBHUTI, 2016). Atualmente são atribuídas
diversas atividades biológicas ao núcleo TZD, entre elas a anticonvulsivante
(KORMANN, 2013; TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016).
Com base nestes trabalhos, o presente estudo objetivou estudar o
potencial anticonvulsivante e toxicológico in vivo e in sílico de derivados
tiazolidinodiônicos em camundongos, contribuindo para o desenvolvimento de
novos fármacos que possam ser utilizados no tratamento da epilepsia.
35
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar o potencial anticonvulsivante e toxicológico in vivo e in
sílico de derivados tiazolidinodiônicos.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar o perfil farmacocinético de compostos tiazolidinodiônicos,
nomeados A1, D1, D2, D3 e D4, a partir da técnica in sílico, segundo as regras de Lipinski;
Avaliar os parâmetros de absorção intestinal humana (AIH) e
penetração pela barreira hematoencefálica (BHE) dos compostos,
através da ferramenta computacional PreADMET;
Predizer o potencial de mutagenicidade e carcinogenicidade dos
compostos pelos softwares PreADMET e OSIRIS;
Avaliar valores de druglikeness, drugscore, propriedades físico-
químicas e perfil toxicológico dos compostos;
Avaliar os efeitos da série de compostos nos testes de convulsão
induzida quimicamente por PTZ e STR e, no teste de convulsão
induzida por eletrochoque; Selecionar a substância efetiva em todos os testes de triagem;
Estudar o composto mais promissor quanto a possíveis efeitos
hipnótico, motor, sobre a memória e ansiedade, observados em
anticonvulsivantes comerciais;
Avaliar a propriedade anticonvulsivante do composto selecionado por
via oral;
Determinar o possível mecanismo de ação do composto, nos testes de
convulsão induzida quimicamente por PTZ, investigando a influência
das vias glutamatérgica, GABAérgica e oxidonitrérgica;
Avaliar a influência da administração subcrônica do composto D4
sobre o desenvolvimento ponderal dos animais e sobre os órgãos:
fígado, rins e coração; Avaliar parâmetros bioquímicos hepáticos, renais, glicose e
creatinofosfoquinase, após tratamento subcrônico com o composto
mais ativo na dose mínima efetiva;
Avaliar possíveis parâmetros oxidativos em tecido cerebral de animais
submetidos a tratamento subcrônico com o composto D4.
36
37
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Epilepsia
A epilepsia atualmente é definida como uma desordem cerebral
crônica, de várias etiologias, caracterizada por CEs recorrentes não provocadas
(crises que aparecem sem um desencadeante óbvio), conseqüentes de descargas
neuronais excessivas e síncronas. Uma CE por sua vez, é um evento clínico
definido como uma alteração paroxística de função neurológica causada por despolarização síncrona, rítmica, de neurônios corticais (TRINKA,
KÄLVIÄINEN, 2016).
A epilepsia é uma doença neurológica descrita desde os primeiros
escritos da história. Nos papiros babilônicos (cerca de 1050 aC) acreditava-se
que a epilepsia era causada por demônios e fantasmas. Estas primeiras crenças
sobrenaturais em relação à doença, provavelmente, foram fomentadas pelos
sinais e sintomas clínicos presentes nas manifestações. O mito da epilepsia
como uma maldição dos deuses tem sido largamente vencido, mas a doença
continua a ser um estigma social para muitos pacientes (MASIA; DEVINSKY,
2000).
O primeiro argumento contra as ideias ligadas à aspectos espirituais
foi do médico grego Hipócrates, autor do primeiro livro sobre epilepsia entitulado “Sobre a Doença Sagrada”, que, por volta de 400 aC, reconheceu a
doença como uma disfunção cerebral (MASIA; DEVINSKY, 2000).
Segundo a DSM-V (Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders (DSM-V, 2013), estima-se que existam cerca de 65 milhões de
pacientes com epilepsia no mundo. Estudos mais recentes continuam
mostrando que a epilepsia é um problema de saúde pública, onde a estimativa
de prevalência foi relatada em 8,4 casos por 1.000 habitantes em países
desenvolvidos, segundo Helmers e colaboradores (2015). De acordo com os
mesmos autores, as estimativas de incidência de epilepsia mostram que a
doença acomete, na maioria dos casos, pacientes entre 5 ou 60 anos de idade e
atinge pessoas de todas as raças, sexo, e condições socioeconômicas (WALSH et al., 2015). O risco de morte prematura em pessoas com epilepsia é de duas a
três vezes maior do que para a população em geral (WHO, 2017).
Dados dos Estados Unidos revelam que os custos da doença no país
gira em torno de US$ 15,5 bilhões anuais (WALSH et al., 2015). No Brasil, não
há dados concretos sobre a epidemiologia e/ou gastos com a doença. A grande
maioria dos trabalhos referenciados na literatura não permite generalizações,
quanto a dados epidemiológicos precisos, pois foram realizados em pequenas
populações, e a disparidade entre os resultados pode ser atribuída às variações
na metodologia e à estrutura da população. Baseado no último censo
38
demográfico e na prevalência mundial de epilepsia, supõe-se que 1.907.327
pessoas sejam acometidas pela doença no Brasil (SILVA, 2013).
A epilepsia foi caracterizada conceitualmente em 2005, como uma
predisposição duradoura do cérebro para gerar CEs, com conseqüências neurobiológicas, cognitivas, psicológicas e sociais. Esta definição pode ser
difícil de ser aplicada na prática clínica, portanto, a ILAE redefiniu os conceitos
relacionados à epilepsia em 2010. Conforme definição prática, a epilepsia pode
ser considerada quando: (a) há pelo menos duas convulsões não provocadas (ou
reflexo) ocorrendo com mais de 24 horas de intervalo; (b) há uma convulsão
não provocada (ou reflexo) e uma probabilidade de novas convulsões
semelhantes ao risco de recorrência geral (pelo menos 60%) após duas
convulsões não provocadas, ocorrendo nos próximos 10 anos; e (c) diagnóstico
de uma síndrome de epilepsia. O termo "não provocada" implica a ausência de
um fator temporário ou reversível que diminua o limiar e que produza uma
crise nesse momento (MOSHÉ et al., 2015), ou seja, indica que a CE não foi
causada por febre, traumatismo crânio-encefálico, alteração hidroeletrolítica ou doença concomitante (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013). Entretanto, na
grande maioria das vezes, os clínicos se baseiam nos critérios do DSM-V para
seu diagnóstico (DSM-V, 2013).
3.1.1 Classificação das crises
Antigamente, a classificação das CEs era baseada em observações e
opiniões de especialistas. Em 1960, a classificação foi publicada pela primeira
vez e atualizada oficialmente em 1981, pela Comissão Sobre Classificação e
Terminologia da ILAE, que se baseou em conceitos mais modernos de
neuroimagem, tecnologias genômicas e biologia molecular. As CEs são classificadas de acordo com a área cerebral afetada, de
acordo com informações obtidas a partir do eletroencefalograma (EEG) (Figura
1) (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013). De forma prática, as CEs podem
ser classificadas segundo dois grandes eixos: topográfico e etiológico. No eixo
topográfico, são classificadas em generalizadas e focais (BRASÍLIA, 2013).
39
Figura 1. Classificação das crises epilépticas de acordo com a área cerebral afetada.
Fonte: TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016.
As CEs generalizadas são originárias de alterações de uma ou mais
funções cerebrais, em algum ponto do encéfalo, com envolvimento simultâneo
de ambos os hemisférios cerebrais. Distribuídas bilateralmente, as descargas
podem afetar estruturas corticais e subcorticais, mas não necessariamente
afetam todo o córtex (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013; MOSHÉ et al.,
2015; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017). Em geral, são
geneticamente determinadas e acompanhadas de alteração da consciência e
ausência de aura. Seus principais exemplos são as crises de ausência, crises
mioclônicas, clônicas e crises tônico-clônicas generalizadas (BRASÍLIA, 2013;
REMÍGIO, 2014).
As crises tônico-clônicas são as crises mais conhecidas. Normalmente tem início com uma fase tônica em que há perda de consciência e de postura,
extensão das costas, pescoço e pernas, flexão dos antebraços, desvio ocular
cefálico, respiração ruidosa e cianose. Em seguida, a crise segue para uma fase
clônica, que continua com espasmos musculares violentos e generalizados, em
que persiste a cianose e pode haver perda de esfíncteres. No período pós-ictal
(pós crise), o paciente pode apresentar cefaleia, dor muscular, fadiga,
sonolência e confusão mental (BEM et al., 2016).
A crise de ausência (ou pequeno-mal) é mais comum na infância e é
caracterizada por perda súbita da consciência, sem perda da postura, com
fixação do olhar e sem resposta a estímulos. Geralmente costumam durar entre
2 a 20s e podem se repetir várias vezes durante um dia. Alguns fenômenos motores breves, como piscamento e mastigação podem ocorrer. Podem ser
40
típicas, quando ocorrem descargas em espícula e paragem súbita e transitória,
ou atípicas, quando tem início e término menos abrupto, com consciência,
frequência cardíaca e tônus muscular menos afetados (BEM et al., 2016;
REMÍGIO, 2014). Remígio (2014) nos fornece uma caracterização mais simplificada das
CEs: as mioclônicas apresentam breves contrações musculares dos membros
com intensidade regular e sonolência; as clônicas se caracterizam por espasmos
musculares rápidos, evolui com movimentos dos membros, apneia e mordedura
de língua. Há perda de consciência. Perda súbita de consciência, endurecimento
tônico muscular seguido de espasmos de fase clônica, evolução com apneia,
cianose, mordedura de língua são características das crises tônico-clônicas.
Podem apresentar confusão, cansaço e abatimento profundo; crises atônicas são
muito raras, não apresentam perda de consciência, mas caracterizam-se por
perda rápida do tônus muscular.
As CEs focais são originárias de redes limitadas a um hemisfério
cerebral, portanto são parciais (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013). Elas podem ser discretamente localizadas ou mais amplamente distribuídas.
Também podem ser originadas em estruturas subcorticais (MOSHÉ et al.,
2015). Suas manifestações clínicas dependem do local de início do foco
epiléptico e da velocidade com que ocorre a propagação da descarga
epileptogênica.
Conforme reportado por Kim, Lee e Lee (2016), as CEs focais são
divididas em focais simples (CE sem comprometimento da consciência) e
focais complexas (CE com comprometimento ao menos parcial da consciência
durante o episódio). Uma CE focal pode terminar numa crise tônico-clônica
generalizada, quando há a propagação das descargas para todo córtex cerebral,
sendo então denominada crise focal secundariamente generalizada. As crises focais simples se iniciam com manifestações motoras
(movimentos súbitos nas mãos, pés ou face), sensoriais (dormência,
formigamento), autonômicas (palidez, sudorese, palpitação) ou psíquicas
(medo, transtorno transitório da compreensão da realidade), sem perda de
consciência (BEM et al., 2016; REMÍGIO, 2014). As crises focais complexas
são mais comuns em pacientes adultos e auras podem antecedê-las, com
perturbação da consciência. Normalmente há a fixação do olhar e dispersão,
sem resposta a estímulos ou comandos. Pacientes em crises focais também
podem apresentar movimentos repetitivos (mastigação, movimentos manuais) e
no período pós-ictal há sonolência e/ou confusão mental prolongada. Ocorre
amnésia de todo período de duração da crise (BEM et al., 2016; REMÍGIO,
2014). No quadro 1, encontram-se as classificações reconhecidas das CEs
mais comuns na clínica.
41
Quadro 1. Classificações das crises epilépticas.
Classificações das crises epiléticas
Crises generalizadas
Tônico-clônicas (em qualquer combinação)
Ausências
Típicas
Atípicas
Ausências com características especiais
Ausências mioclônicas
Mioclonias palpebrais
Mioclônicas
Mioclônica atônicas
Mioclônica tônicas
Clônicas
Tônicas
Atônicas
Crises focais/parciais
Desconhecidas
Espasmos epilépticos
Fonte: adaptado de MOSHÉ et al., 2015.
3.1.2 Etiologia
Sabe-se que as CEs são ocasionadas pelo comportamento anormal de
grupos de neurônios cerebrais, mas ainda são desconhecidos todos os aspectos
causais específicos da epilepsia em si. Já são reconhecidas algumas possíveis causas, mas sua fisiopatologia continua a ser um foco de pesquisa
(BALESTRINI; SISODIYA, 2017).
No eixo etiológico, as epilepsias são, previamente, divididas em
idiopáticas (quando não há lesão estrutural subjacente), sintomáticas (quando
há lesão) ou criptogênicas (quando apresentam sintomas, mas nenhuma lesão
aos exames de imagem disponíveis no momento) (BRASÍLIA, 2013).
Em 2010, a ILAE substituiu as classificações pelas seguintes
categorias:
- Genética: epilepsias com fatores genéticos importantes e em que
os genes causadores ou de suscetibilidade são herdados ou resultam de
42
mutações que podem ou não ser herdadas. Nestes casos a epilepsia é resultado
direto de um defeito genético conhecido, podendo haver modificações da
expressão da doença por fatores ambientais. A influência da genética na
epilepsia tem sido amplamente avaliada (BALESTRINI; SISODIYA, 2017; MOSHÉ et al., 2015; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013; WALSH et al.,
2015;);
- Estrutural/metabólica: convulsões resultantes de lesões cerebrais
ou condições associadas a anomalias estruturais ou metabólicas que favoreçam
o surgimento de CE, como: acidente vascular cerebral, trauma, tumor cerebral,
malformações corticais, aminoacidopatias, isquemia, infecções, entre outros
(MOSHÉ et al., 2015; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013; WALSH et al.,
2015;);
- Desconhecida: causa não pode ser presumida (MOSHÉ et al.,
2015; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013; WALSH et al., 2015;).
Em 2013, a Comissão de Classificação da ILAE emitiu um relatório sobre a classificação e terminologia das epilepsias após o surgimento de
diversas críticas quanto à proposta de 2010. Assim, revisões foram realizadas
recentemente e neste documento alguns termos foram melhores definidos
(YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014). As síndromes
epilépticas anteriormente classificadas como genética, estrutural/metabólica e
desconhecida, são agora subdivididas em:
- Genética: a epilepsia é resultado direto de um defeito genético
conhecido ou presumido (BALESTRINI; SISODIYA, 2017; YACUBIAN;
CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014);
- Estrutural: quando uma lesão estrutural (genética ou adquirida) é visível na neuroimagem e concordante com os achados eletroclínicos,
sugerindo uma relação direta entre lesão e epilepsia. Ex: polimicrogirias
(relacionadas à mutação do gene GPR56 ou secundárias a um insulto isquêmico
ou infeccioso intraútero) (YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-
POHL, 2014);
- Metabólica: defeito metabólico com sintomas sistêmicos que
levam também ao desenvolvimento de epilepsia (YACUBIAN; CONTRERAS-
CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014);
- Imunológica: quando há evidência de um processo autoimune
ocasionando inflamação do SNC, como encefalite antirreceptor glutamatérgico
do tipo NMDA e anti-LGI1 (YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014);
- Infecciosa: desencadeada por um processo infeccioso, como
neurocisticercose, toxoplasmose, HIV. Neste caso, não seriam consideradas as
crises desencadeadas por infecção aguda como meningite ou encefalite
(YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014).
43
- Desconhecida: causa não determinada (YACUBIAN;
CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014).
Existem também substâncias que tornam o SNC vulnerável a
descargas elétricas exageradas e, por isso, conhecidas como substâncias epileptogênicas, podem induzir o surgimento de CEs. São exemplos o álcool, a
cocaína e as anfetaminas (TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016).
3.1.3 Diagnóstico
O diagnóstico da epilepsia é bastante complexo e envolve critérios
multidimensionais e investigações importantes sobre o paciente com suspeita
dessa patologia. Normalmente é baseado em anamnese e exame neurológico.
Exames complementares dependem da individualidade de cada caso (NAGAE
et al., 2016; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013).
Histórico pessoal e familiar, idade de início e tipo de crise, estado cognitivo e neurológico são critérios primordiais para caracterizar os supostos
episódios como verdadeiras CEs (NAGAE et al., 2016; SILVA; CARDOSO;
MACHADO, 2013).
Exames o EEG, principalmente nas primeiras 24 horas da crise, é
importante na diferenciação das CEs ou eventos não-epilépticos psicogênicos.
Além disso, auxilia na caracterização da atividade cerebral elétrica anormal e
dos tipos de crise (focais ou generalizadas). Em geral, o EEG é capaz de
responder a três questões importantes diagnósticas nos pacientes com suspeita
de epilepsia: 1) o paciente tem epilepsia? 2) onde está localizada a zona
epileptogênica? 3) o tratamento está sendo adequado? (BRASÍLIA, 2013). Exames de EEG em vigília e em sono são obrigatórios para confirmação
diagnóstica de epilepsia, entretanto, a eletroencefalografia é normal em 30%
dos casos e não exclui o diagnóstico de epilepsia (BRASÍLIA, 2013; NAGAE
et al., 2016).
A imagiologia pode auxiliar no diagnóstico de pacientes com epilepsia
também abrangendo ressonância magnética (RM), tomografia computadorizada
de emissão de um único fóton (SPECT), tomografia por emissão de pósitrons
(PET) e magnetoencefalografia (MEG), importantes para a detecção de lesões
cerebrais (NAGAE et al., 2016; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).
Estes devem ser solicitados na suspeita de causas estruturais, tais como
tumores, malformações vasculares ou esclerose hipocampal (BRASÍLIA,
2013). Exames laboratoriais, como análises sanguíneas e punção lombar,
auxiliam na investigação da etiologia da epilepsia, assim como a investigação
com testes genéticos, às vezes, se faz necessária (SILVA; CARDOSO;
MACHADO, 2013).
44
Alguns tipos de CEs podem não ser responsivas ao tratamento com
FAEs, desencadeando encaminhamento para consulta cirúrgica. O tratamento
cirúrgico da epilepsia intratável mostrou diminuir o custo geral de saúde e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes, embora possa haver recorrência das convulsões após a cirurgia (NAGAE et al., 2016).
3.1.4 Manifestações clínicas
As manifestações clínicas da epilepsia variam dependendo da extensão
da área do cérebro afetada e da sua localização. As convulsões podem ocorrer
ou não, e quando ocorrem podem afetar funções sensoriais, motoras e
autonômicas, consciência, estado emocional, memória, cognição e comportamento (VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).
Cabe salientar que convulsão não é sinônimo de epilepsia e que as
mesmas podem ser desencadeadas por processos biológicos transitórios (febre
alta, por exemplo) sem indução completa a um quadro de epilepsia. Trata-se de
um termo leigo, que caracteriza episódio de contração muscular excessiva ou
anormal, usualmente bilateral, que pode ser sustentada ou interrompida. Nem
todas as CEs afetam necessariamente todos estes fatores acima descritos, mas
influenciam pelo menos um. Neste contexto, podem surgir também manifestações somatossensoriais, auditivas, visuais, olfativas e gustativas,
variando nos pacientes conforme o gênero (NAGAE et al., 2016).
Segundo a ILAE, déficits cognitivos durantes as CEs podem aparecer
como problemas de percepção, atenção, emoção, memória, execução e
alteração de discurso. Esse dado é amplamente discutido atualmente pela
literatura, sobretudo na epilepsia infantil (FUENTES; KERR, 2017).
Alguns pacientes podem apresentar manifestações que precedem as
crises, como auras de curta duração (1 ou 2 minutos), que correspondem a
manifestações sensitivo-sensoriais, vegetativas ou psíquicas puramente
subjetivas e que ocorrem em 20% a 90% dos casos. Como exemplos podem-se
citar a aura epigástrica (sensação de náusea, mal-estar); medo; depressão e angústia; déjà-vu (ilusão da memória que leva ao indivíduo a crer que já
vivenciou algo desconhecido); jamais vu (sensação de vivenciar algo
totalmente estranho); e pensamento forçado (pensamento que ocorre
repetidamente mesmo quando se tenta concentrar em outro fato)
(FERNANDES, 2013).
De acordo com Bem et al. (2016), os pacientes que apresentam CEs
podem entrar em estado pós-ictal, ou seja, apresentam sintomas após o evento
epiléptico. Com exceção das crises de ausência, podem surgir sintomas como:
confusão mental prolongada, sonolência, dor muscular e fadiga.
45
3.1.5 Hipóteses neuroquímicas envolvidas na epilepsia
As CEs podem ser causadas por vários mecanismos. Embora estes ainda não estejam totalmente esclarecidos, podem-se estabelecer hipóteses de
envolvimento neuronal relacionados às crises. Sabe-se que o desequilíbrio entre
excitação e inibição dos neurônios cerebrais está envolvido e facilita a
ictogênese, ou seja, a geração das crises (SILVA; CABRAL, 2008; WERNER;
COVEÑAS, 2015).
Em condições fisiológicas normais, existem mecanismos que
promovem disparos neuronais e outros que controlam e protegem os neurônios
de descargas excessivas (SILVA; CABRAL, 2008). Alterações de canais
iônicos e das funções neurotransmissoras estão intimamente relacionadas com
distúrbios e doenças neurológicas, assim como na epilepsia (SILVA;
CABRAL, 2008; WERNER; COVEÑAS, 2015). Segundo Werner e Coveñas (2015), os principais desequilíbrios
envolvidos na fisiopatologia da epilepsia são a hipoatividade do
neurotransmissor ácido-γ-aminobutírico (GABA) e hiperatividade do
neurotransmissor glutamato (GLU). Há relatos do envolvimento de outros
neurotransmissores, como hiperatividade da dopamina (DA) e noradrenalina
(NA), hipoatividade da serotonina (5-HT), distúrbios na função
neuromoduladora do óxido nítrico (NO) o qual com ação dual: pró-convulsiva
ou anticonvulsiva, e disfunção de neuropeptídeos.
3.1.5.1 Neurotransmissão glutamatérgica na epilepsia
O GLU é o principal neurotransmissor excitatório do SNC e
desempenha papel importante no desenvolvimento neural, plasticidade
sináptica, aprendizado, memória e no mecanismo de doenças neurológicas, em
especial, a epilepsia (FORMAN et al., 2009; VALLI; SOBRINHO, 2014;
WERNER; COVEÑAS, 2015).
Atua sobre dois diferentes tipos de receptores: ionotrópicos,
subdivididos em receptores do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), cainato
(KA) e ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA)
(HADZIC; JACK; WAHLE, 2017) e metabotrópicos (FORMAN et al., 2009; WERNER; COVEÑAS, 2015) (Figura 2).
Os receptores ionotrópicos medeiam respostas excitatórias rápidas,
são constituídos por múltiplas unidades, que ativadas, permitem o fluxo de íons
Na+, K+ e Ca++ através das membranas plasmáticas. É reportado na literatura
que o aumento da concentração dos níveis de Ca++ intracelular tem papel
fundamental na manutenção da hiperexcitabilidade que ocorre em processos
convulsivos. Além disso, os defeitos de função do canal iônico também estão
46
associados a formas de epilepsia adquirida. Os auto-anticorpos dirigidos contra
canais iônicos ou proteínas associadas, tais como canais K+, receptores LGI1 ou
NMDA, foram identificados em desordens epilépticas, estado epiléptico e
sintomas psiquiátricos (FORMAN et al., 2009; VALLI; SOBRINHO, 2014). Os receptores AMPA são encontrados em todo SNC, principalmente
no hipocampo e no córtex cerebral. Sua ativação permite o influxo de Na+,
efluxo de K+ e o aumento da permeabilidade ao Ca++, permitindo a regulação
da despolarização pós-sináptica excitatória celular (FORMAN et al., 2009).
Receptores do tipo KA são expressos em todo SNC, amplamente
distribuídos no hipocampo e no cerebelo, também permitem a entrada de Na+ e
a saída de K+ e maior permeabilidade ao Ca++ (FORMAN et al., 2009).
Figura 2. Figura ilustrativa da sinapse glutamatérgica e dos tipos de receptores glutamatérgicos.
Fonte: traduzido de DU et al., 2004.
Os receptores NMDA, que são expressos particularmente no
hipocampo, no córtex cerebral e na medula espinhal, exige a ativação
simultânea pelo neurotransmissor GLU e glicina; e permite o efluxo de K+ e o
influxo de Na+ e Ca++ (FORMAN et al., 2009; YAO; ZHOU, 2017). De todos
os receptores glutamatérgicos, o NMDA é o mais estudado atualmente. A ativação destes receptores dá início a cascatas de sinalização intracelular
47
dependente de Ca++, as quais estão relacionadas a processos biológicos
importantes (VALLI; SOBRINHO, 2014) (Figura 2).
Os receptores NMDA são essenciais para todos os aspectos da função cerebral, incluindo aprendizagem e formação de memória. As mutações
distribuídas ao longo das subunidades do receptor NMDA foram associadas a
uma série de distúrbios neuropsiquiátricos, dentre eles a depressão e a epilepsia.
Estudos estruturais, funcionais e computacionais recentes auxiliaram no
discernimento da verdadeira natureza sobre o processo de ativação que liga o
GLU com a abertura do canal iônico, que é central para a fisiologia e
fisiopatologia do receptor NMDA (ZHOU; WOLLMUTH, 2017).
Os chamados receptores metabotrópicos de GLU (mGluR) desempenham suas funções através da proteína G. Existem pelo menos oito
subtipos de mGluR, pertencentes a três grupos (I, II e III) (Figura 3).
Figura 3. Classificação dos receptores glutamatérgicos.
Fonte: adaptado de FLORES-SOTO et al., 2012.
Receptores do grupo I promovem excitação neuronal através de
mecanismos de ativação da fosfolipase C (PLC) e liberação intracelular de
inositoltrifosfato (IP3), mediada por Ca++ ou através da adenilato ciclase e
geração de AMP cíclico (cAMP). Receptores do grupo II e III inibem a
adenilato ciclase e diminuem a formação de cAMP. Estas vias conduzidas por segundos mensageiros, como IP3 e cAMP, regulam o fluxo de íons de outros
canais. A hiperestimulação de receptores glutamatérgicos pode induzir
convulsões e dano neuronal (FORMAN et al., 2009; WERNER; COVEÑAS,
2015).
A atividade excitatória do GLU é interrompida por proteínas
transportadoras que fazem sua receptação e o retiram da fenda sináptica ou
48
dessensibilização do receptor (FORMAN et al., 2009; VALLI; SOBRINHO,
2014). Como reportado anteriormente, em estados patológicos, como na
epilepsia, o aumento deste neurotransmissor na fenda ou a desregulação na sua
receptação resulta em níveis elevados de Ca++ intracelular, podendo levar ao fenômeno conhecido como excitotoxicidade, morte neuronal causada por
excessiva excitação celular (MURPHY-ROYAL et al., 2017; VALLI;
SOBRINHO, 2014).
3.1.5.2 Neurotransmissão GABAérgica na epilepsia
O GABA é o principal neurotransmissor inibitório do SNC e seus
receptores ativados diminuem a excitabilidade neuronal por vários mecanismos
(FORMAN et al., 2009; WERNER; COVEÑAS, 2015). Esse neurotransmissor
desempenha suas funções por ativação de receptores ionotrópicos (GABAA e GABAC), que aumentam o fluxo de Cl-, e metabotrópicos (GABAB), receptores
acoplados à proteína G que permitem a troca iônica a partir de segundos
mensageiros (MELE; LEAL; DUARTE, 2016).
Os receptores GABAA (Figura 4) são os mais estudados, e
estruturalmente, são formados por 5 subunidades: duas α, duas β e uma γ. O
neurotransmissor e agonistas se ligam nas porções α e β do complexo receptor-
canal, que abre passagem para o íon Cl-. Com o fluxo do íon, há a
hiperpolarização de membrana, inibindo o impulso nervoso (MELE; LEAL;
DUARTE, 2016).
Figura 4. Imagem ilustrativa da estrutura do receptor GABAA.
Fonte: traduzido e adaptado de UUSI-OUKARI; KORPI, 2010.
Os receptores GABAB, quando ativados, interagem com proteínas Gi,
inibindo a adenilato ciclase, que ativam canais iônicos de K+ e inibem canais de
49
Ca++ voltagem-dependentes, reduzindo assim, a geração de potenciais de ação,
restringindo correntes excitatórias (FORMAN et al., 2009). Esses receptores
têm sido estudados nos últimos anos em várias desordens neurológicas e,
parecem estar envolvidos em processos cognitivos e na formação de memória (HEANEY; KINNEY, 2016).
Os receptores GABAC não estão diretamente ligados à epilepsia,
porém em outras desordens do SNC. Esses receptores são expressos
principalmente na retina e sua distribuição no SNC é restrita. De particular
interesse é o desenvolvimento de análogos seletivos de GABA e o seu potencial
uso em distúrbios do sono, inibindo o desenvolvimento de miopia, bem como
melhorando a aprendizagem e a memória (NG et al., 2011).
Devido sua importante função inibitória no SNC, prejuízos na síntese
GABAérgica, alterações na expressão ou mutações nas subunidades receptoras
principalmente do receptor GABAA, que perturbam a homeostase de Cl-, e
perda neuronal podem levar ao aparecimento de descargas excessivas, com
indução de epileptogênese em humanos e em testes animais, como no teste do PTZ (TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016).
3.1.5.3 Outras vias de neurotransmissão envolvidas na epilepsia
Conforme reportado na literatura, há relatos do possível envolvimento
de vários neurotransmissores na fisiopatologia da epilepsia (WERNER;
COVEÑAS, 2015). As monoaminas são os principais sistemas
neuromoduladores do SNC e evidências convincentes acumuladas nos últimos
30 anos também estabeleceram seu papel central na epilepsia. 5-HT, DA, NA, histamina e melatonina são conhecidas por interromper a atividade de crises
convulsivas. Porém há muita controvérsia e pouco estudo para desvendar o real
papel das monoaminas no processo epiléptico (WERNER; COVEÑAS, 2015).
No SNC, mais especificamente na epilepsia, o envolvimento da NA se
dá por ação pós-sináptica pró-convulsiva em baixas doses e antiepiléptica em
altas doses. Durante o estado epiléptico, a liberação de NA no hipocampo está
diminuída. O bloqueio de receptores α e β adrenérgicos aumenta a
concentração do neurotransmissor e reduz a epileptogênese (WERNER;
COVEÑAS, 2015). No entanto, a relação NA e epilepsia se faz mais presente
não na epileptogênse em si, mas principalmente quanto aos efeitos pós crise, sobretudo no sistema cardiovascular. Um recente estudo confirma que a
atividade de crises prolongadas resulta em alterações agudas e crônicas no
controle cardiovascular, levando a uma deterioração da estrutura e função
cardíaca (READ et al., 2015).
A DA e a 5-HT são conhecidas por seu papel modulador da
ictogênese. Há relatos de que inibidores da reabsorção de DA têm propriedades
anticonvulsivantes, embora o envolvimento da DA seja bastante controverso.
50
As respostas para atividade epiléptica são opostas de acordo com o tipo de
receptor dopaminérgico estudado. Os receptores D1 medeiam efeitos pró-
convulsivos e os D2 anticonvulsivantes. Assim, o real mecanismo de ação pelo
qual a DA influencia na epileptogênese não é bem estabelecida. Os inibidores seletivos de recaptação de 5-HT podem potencializar convulsões. O aumento da
concentração de 5-HT no hipocampo induz a ictogênese. Recentes estudos
sugerem a ausência de uma relação direta entre a suscetibilidade à convulsão e
as alterações nos níveis 5-HT do hipocampo (WERNER; COVEÑAS, 2015).
A ativação de receptores colinérgicos muscarínicos e nicotínicos tem
uma ação pró-convulsiva e está envolvida na epileptogênese (WERNER;
COVEÑAS, 2015).
3.1.5.4 Estresse oxidativo e estresse nitrosativo na epilepsia
Uma atenção especial vem sendo dada ao NO, no que tange a epilepsia. O NO é um gás solúvel produzido pela óxido nítrico sintase (NOS)
com funções de sinalização no SNC (ZHU et al., 2016).
Inicialmente, a investigação do papel do NO se deu a partir do
interesse pelo uso de nitratos orgânicos no tratamento de doenças cardíacas
(DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003). Na década de 70, várias atividades
foram atribuídas ao NO no SNC. Em 1980, a produção de NO no SNC foi
confirmada, assim como a sua liberação estimulada pelo GLU, a partir da
ativação dos receptores NMDA (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003).
A partir da oxidação do aminoácido L-arginina em L-citrulina, o NO é
sintetizado através da enzima NOS. Existem três diferentes isoenzimas:
endoteliais (eNOS), constitutiva endotelial, dependente de íons Ca++ e de calmodulina, presente normalmente nas células endoteliais vasculares e nas
plaquetas; neuronais (nNOS), constitutiva neuronal, dependente de íons Ca++ e
de calmodulina, presente normalmente nos neurônios; e induzíveis (iNOS),
produzidas por macrófagos e outras células ativadas por citocinas (DUSSE;
VIEIRA; CARVALHO, 2003; MOHAZAB et al., 2012; ZHU et al., 2016). Das
três isoformas de NOS, a nNOS é a principal forma expressa no cérebro (ZHU
et al., 2016).
Todas as isoformas de NOS podem ser inibidas por análogos da
arginina N-substituídos, como o N(G)-nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME),
utilizado em vários estudos da função oxidonitrérgica in vivo (DUSSE;
VIEIRA; CARVALHO, 2003; MOHAZAB et al., 2012). De acordo com dados relatados na literatura, sabe-se que o NO está fortemente implicado como um
fator neurodegenerativo nos estados epilépticos (ZHU et al., 2016).
Várias evidências relatam o envolvimento do NO em processos
fisiológicos e fisiopatológicos no cérebro, incluindo necrose e apoptose, a
modulação da transmissão sináptica e da plasticidade, funções cognitivas e
51
comportamentais e em distúrbios neurológicos, como a epilepsia e a depressão
(BHAT et al., 2015; GOOSHE et al., 2017; ZHU et al., 2016).
O NO pode desempenhar suas funções biológicas por vários
mecanismos diferentes, mas é através da difusão pela membrana plasmática que qualquer processo que o envolve se inicia. Como vasodilatador, pesquisadores
relataram que o NO promove o relaxamento vascular sanguíneo através da
ativação da enzima guanilato ciclase (GC) com conseqüente acúmulo de
guanosina monofosfato cíclica (GMPc) (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO,
2003).
Os efeitos biológicos relacionados ao NO podem ocorrer por
diferentes mecanismos: a) a ativação de GC e GMPc, e b) S-nitrosilação (RAJU
et al., 2016).
O NO é envolvido na sinalização celular através da influência sobre a
GC, com consequente formação de GMPc e ativação de diversas proteínas
quinases (OLIVEIRA et al., 2016). A S-nitrosilação consiste na modificação de
resíduos de cisteína reduzidos em proteínas para a formação da S-nitrosocisteína (RAJU et al., 2016). Sob condições normais, a S-nitrosilação
regula a atividade de muitas proteínas e é um mecanismo de sinalização celular.
No entanto, em condições caracterizadas por estresse nitrosativo, níveis
aumentados de NO conduzem a S-nitrosilação aberrante, que contribui para o
surgimento de diversas patologias (NAKAMURA; LIPTON, 2015). Um
importante efeito da S-nitrosilação envolve o receptor glutamatérgico NMDA.
Altos níveis de NO podem levar a diminuição da expressão dos receptores
glutamatérgicos e inativação de proteínas responsáveis pela liberação de
glutamato. Assim, evidências indicam que a S-nitrosilação leva a diminuição da
liberação de glutamato na fenda sináptica (MORRIS et al., 2016). Ainda, os
autores Gu, Nakamura e Lipton (2010) e Oliveira e colaboradores (2016) relataram que o NO é produzido em resposta à estimulação dos receptores
NMDA, impulsionando o influxo de Ca++ e a síntese de nNOS, bem como a
geração de NO. Além disso, o aumento dos metabólitos reativos de NO podem
interagir com estes receptores glutamatérgicos, potencializando a ação
excitotóxica no SNC.
Em concentrações fisiológicas, como abordado, o NO possui
importantes funções reguladoras e mediadoras (NIEDZIELSKA et al., 2016),
mas alterações nos níveis de NO dão origem a citotoxicidade, resultado da sua
ação direta ou da sua reação com compostos liberados durante um processo
oxidativo e nitrosativo (BHAT et al., 2015; NIEDZIELSKA et al., 2016). Em
analogia com o estresse oxidativo, o termo "estresse nitrosativo" foi proposto
para a formação excessiva ERNs que pode ocorrer in vivo em patologias associadas a processos inflamatórios, neurotoxicidade e isquemia, bem como
durante a neurotransmissão através da ativação do receptor NMDA (KLATT;
LAMAS, 2000).
52
Como já abordado acima, os processos de estresse oxidativo e
nitrosativo, também são fatores determinantes da epilepsia, que podem ser
mediados fisiologicamente via cascata oxidonitrérgica formando os radicais
livres. Em processos metabólicos, estes radicais medeiam o transporte de elétrons mitocondrial em diversas reações bioquímicas. A transferência de
elétrons é considerada uma etapa crítica nos processos biológicos já que está
envolvida em eventos como fosforilação, permeabilidade de membrana,
participação em mecanismos imunes, síntese de neurotransmissores e
exocitose, geração de energia e controle de canais iônicos, contribuindo para a
excitabilidade neuronal (BHAT et al., 2015; DUSSE; VIEIRA; CARVALHO,
2003; NIEDZIELSKA et al., 2016).
Os radicais livres podem ser derivados do oxigênio ou do nitrogênio,
compondo, dessa forma, as espécies reativas de oxigênio e do nitrogênio, EROs
ou ERNs, respectivamente (Figura 5). As EROs incluem radicais livres como
superóxido (O2-), hidroxil (OH-), alcoxil (RO) e peroxil (RO2), juntamente com
espécies não radicalares, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), ácido hipocloroso (HOCl) e o ozônio (O3). Dentre as ERNs estão o óxido nítrico
(NO) e o ânion peroxinitrito (ONOO-) (CALLONI, 2014).
Figura 5. Exemplos de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs/ERNs).
Fonte: adaptado de ZISHAN et al., 2017.
A formação excessiva e a alta reatividade das EROs/ERNs com
proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos (Figura 6), ou a deficiência de
53
antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, aumenta o risco de danos às
células, levando ao estado conhecido como estresse oxidativo/nitrosativo,
bastante relacionado na literatura a diversas condições neurológicas e
neurodegenerativas agudas e crônicas, como acidente vascular cerebral, trauma, doença de Parkinson, Alzheimer, Huntington, epilepsia, esclerose lateral
amiotrófica e câncer. Os processos chamados de estresse oxidativo e nitrosativo
são conhecidos por causar lesão e morte neuronal, através da alteração da
função mitocondrial e excitotoxicidade induzida pelo glutamato (BHAT et al.,
2015; MAZHAR; MALHI; SIMJEE, 2016; NIEDZIELSKA et al., 2016).
Figura 6. Formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e o impacto do estresse oxidativo e nitrosativo na função proteica.
Fonte: traduzido de KLATT; LAMAS, 2000.
Os mecanismos de lesão celular causados por altas concentrações de
NO incluem vários processos celulares. Entre eles, alguns efeitos podem estar
relacionados a reação do NO com o superóxido (O2-), formando o peroxinitrito
(ONOO-). A liberação de glutamato pela ativação de receptores do tipo NMDA é associada a formação de radicais livres, pela ativação da enzima nNOS.
Dentre estes radicais livres, o superóxido, na presença do NO, pode formar o
peroxinitrito, que pode perturbar funções mitocondriais e outras funções
celulares, o que é responsável pelo dano neuronal (CALLONI, 2014;
GUMIENICZEK; OWCZAREK; PAWLIKOWSKA, 2012; RAJU et al., 2016).
54
Além disso, um dos principais mecanismos de formação de EROs é a
redução do O2. Inicialmente há a formação do superóxido, resultante da adição
de um elétron à molécula de O2. Este produto inicial pode ser rapidamente
degradado pela enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), dando origem a outra ERO, o peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2, por sua vez,
pode ser decomposto por outras enzimas antioxidantes, a catalase (CAT) ou a
glutationa peroxidase (GPx), em H2O e O2, ou ainda, ser convertido a OH- na
presença de metais como o ferro, através da reação de Fenton (CALLONI,
2014).
A maior fonte endógena de geração de EROs/ERNs é a mitocôndria,
onde há a formação destas espécies reativas a partir do escape de elétrons da
chamada cadeia de transporte de elétrons (CTE) (CALLONI, 2014; ZISHAN et
al., 2017). As mitocôndrias são os principais produtores de ATP necessários
para atividades elétricas normais de neurônios e transmissão sináptica. Além
disso, elas têm um papel central na síntese de neurotransmissores, homeostasia
de Ca++, sinalização redox, produção e modulação de EROs/ERNs e morte neuronal. As hipóteses ligam a falha mitocondrial à geração de crises através de
alterações na homeostase do Ca++, oxidação de canais iônicos e transportadores
de neurotransmissores por EROs/ERNs, diminuição do potencial da membrana
plasmática neuronal e redução da inibição da rede devido à disfunção
interneuronal (VENEDIKTOVA et al., 2017). As apreensões,
independentemente da sua origem, representam uma demanda excessiva de
energia aguda no cérebro. Consequentemente, a disfunção mitocondrial
secundária tem sido descrita em várias doenças epilépticas, incluindo distúrbios
que são principalmente de origem não mitocondrial. Uma compreensão da
relação recíproca entre disfunção mitocondrial e epilepsia é crucial para
selecionar o tratamento anticonvulsivo apropriado e tem o potencial de abrir novas abordagens terapêuticas no subconjunto de doenças epilépticas causadas
por disfunção mitocondrial (GULER et al., 2016).
Outras fontes endógenas de geração de EROs/ERNs são as enzimas
microssomais, como o citocromo P450, e o metabolismo de lipídeos nos
peroxissomas, onde há a formação, principalmente, de H2O2 (CALLONI, 2014;
ZISHAN et al., 2017).
Os peroxissomas são organelas celulares que contém diversas
proteínas de função enzimática, capazes de catalisar reações de síntese e
degradação de compostos de importantes no metabolismo celular. São
caracterizados pela presença de enzimas oxidativas que transferem átomos de
hidrogênio de diversos substratos para o oxigênio. Suas funções incluem a
oxidação dos ácidos graxos de cadeia longa, formação de lipídeos localizados na mielina, colesterol e ácidos biliares. Algumas de suas enzimas são a CAT,
urato oxidase, acil CoA oxidases, D-aminoácido oxidase, L-alfa-hidroxi
oxidase, xantina oxidase e D-aspartato oxidase, capazes de produzir diferentes
55
EROs/ERNs (BORGES, 2002; ZISHAN et al., 2017). Receptores PPARs têm
sido relacionados à modulação do transporte de lipídios e do metabolismo de
ácidos graxos, principalmente via oxidação mitocondrial e peroxissomal
(ABDELMEGEED et al., 2009). Estudos de Garcia-Bueno e colaboradores (2007) demostraram que ligantes de PPARs sintéticos e naturais impedem as
consequências oxidativas e nitrosativas no SNC de animais expostos ao
estresse, sugerindo que estes fármacos podem ser úteis como potenciais agentes
neuroprotetores.
O estresse oxidativo/nitrosativo pode ser desencadeado por radicais
gerados tanto por processos endógenos, como citados anteriormente, ou por
processos exógenos, como xenobióticos, infecções virais ou bacterianas,
radiação, ultrassom, má alimentação, consumo de álcool e drogas (CALLONI,
2014; NIEDZIELSKA et al., 2016).
Qualquer disfunção nos mecanismos que mantém o equilíbrio entre a
formação e a eliminação de EROs/ERNs podem levar a um distúrbio da
homeostase redox, conduzindo a um estado de estresse oxidativo/nitrosativo (CALLONI, 2014).
Para manter a homeostase celular e limitar os níveis de EROs/ERNs
intracelulares, evitanto danos oxidativos, as células possuem mecanismos de
defesa antioxidantes, que podem ser endógenos ou absorvidos na dieta. Os
antioxidantes enzimáticos endógenos (Figura 7), incluem a superóxido
dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-transferase (GST)
e catalase (CAT), e os não enzimáticos, glutationa reduzida (GSH), peptídeos
de histidina, proteínas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), ácido
diidrolipóico e o citocromo C redutase (CoQH2). Dentre os antioxidantes
adquiridos na dieta se destacam o ácido ascórbico, α-tocoferol (vitamina-E) e β-
caroteno (pró-vitamina-A) (NIEDZIELSKA et al., 2016; RAJ; GOTHANDAM, 2014).
Os antioxidantes endógenos têm função muito importante na
prevenção da geração e degradação das EROs/ERNs formadas. Mesmo assim,
podem ser insuficientes para conter a formação excessiva das EROs/ERNs,
levando a dano celular por peroxidação lipídica e inativação de enzimas.
Durante o processo de peroxidação lipídica, há a alteração da fluidez e forma
da membrana celular, e como consequência ocorre a paralisação do transporte
de Ca++, essencial nas vias de transdução de sinal. Devi et al. (2008) relataram
que os antioxidantes reduzem as manifestações convulsivas e as alterações
bioquímicas acompanhantes (isto é, marcadores de estresse
oxidativo/nitrosativo). Seus achados suportam um papel para os radicais livres
em convulsões e destacam o possível uso de antioxidantes como adjuvantes de FAEs para melhorar o controle de convulsões.
Devido sua excessiva atividade, o cérebro tem menor capacidade de
regeneração celular em relação a outros órgãos, por isso, está mais susceptível a
56
danos oxidativos, fortemente relacionados ao fator neurodegenerativo nos
estados epilépticos (BHAT et al., 2015; ZHU et al., 2016).
Figura 7. Reações bioquímicas envolvidas na geração de espécies reativas de oxigênio e mecanismos de defesa antioxidantes.
Fonte: traduzido de NIEDZIELSKA (2016).
A GSH é o antioxidante hidrossolúvel não proteico mais importante
nos seres vivos. É constituída por três aminoácidos: o ácido glutâmico, a
cisteína e a glicina; e é catalisada sequencialmente por duas enzimas
citosólicas, a gama-glutamilcisteína sintetase e GSH-sintetase. Apresenta um
papel muito importante no metabolismo de nutrientes, regulação do
metabolismo celular e na defesa antioxidante. Estudos demonstram que a
deficiência da atividade da GSH, contribui para a formação de EROs/ERNs, e
essa diminuição parece estar relacionada com a fisiopatologia de doenças psiquiátricas, dentre elas se destacam a ansiedade, esquizofrenia, epilepsia e
depressão (NIEDZIELSKA et al., 2016).
As enzimas SOD, tem a função de catalisar a dismutação do O2- em
oxigênio e H2O2, causando a proteção das células expostas as reações do O2-,
além de evitar o envelhecimento precoce causado pelas EROs/ERNs.
Ercegovac et al. (2013) relataram que as atividades de SOD foram
significativamente aumentadas em pacientes com epilepsia, e diminuíram após
6 meses de tratamento com os FAEs.
57
Neste contexto, os estresses oxidativo e nitrosativo são possíveis
mecanismos implicados na patogênese da epilepsia, onde estes têm um papel
importante na excitabilidade e lesão celular. A utilização experimental de
substâncias antioxidantes ou sequestradoras de radicais livres em animais possuem propriedade redox protetora, e melhoram a atividade convulsiva
(MAZHAR; MALHI; SIMJEE, 2016). Assim, o uso de antioxidantes
administrados exogenamente, como vitamina C e vitamina E, pode ser um
importante adjuvante contra lesões cerebrais induzidas por ataques epilépticos
(OLIVEIRA et al., 2016).
3.1.6 Tratamento da epilepsia
3.1.6.1 Fármacos antiepilépticos (FAEs)
O tratamento dos pacientes diagnosticados com epilepsia deve ser
realizado com o intuito de melhorar a qualidade de vida pelo alcance do
controle das CEs (BRASÍLIA, 2013; NAGAE et al., 2016; SILVA;
CARDOSO; MACHADO, 2013).
Os FAEs são também conhecidos como anticonvulsivantes, e são
definidos como substâncias capazes de diminuir a incidência ou a severidade
das CEs em pacientes portadores de epilepsia (NAGAE et al., 2016; REMÍGIO,
2014; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017). A introdução dos FAEs se deu a partir de 1857 por Locock (Figura 8),
onde era utilizado como fármaco eficaz o brometo (MARCOS, 2011). De fato,
a era farmacológica contra a epilepsia se deu a partir da descoberta do
fenobarbital (Gardenal®), ainda hoje prescrito na terapia antiepiléptica. Em
seguida, foram descobertos a fenitoína (Hidantal®), o valproato de sódio
(Depakene®), e em 1953 foi sintetizada a carbamazepina (Tegretol®),
juntamente com os benzodiazepínicos (MARCOS, 2011).
Os FAEs de primeira geração: carbamazepina (Tegretol®); fenobarbital (Gardenal®); fenitoína (Hidantal®); valproato de sódio
(Depakene®); clonazepam (Rivotril®); diazepam (Valium®) e etossuximida
(Etoxin®) (MARCOS, 2011; REMÍGIO, 2014), apresentam efeitos colaterais
significativos: ataxia, sedação, visão turva, retenção de água, reações de
hipersensibilidade, leucopenia, insuficiência hepática, aumento de peso,
hipersonia, dentre outros (ver tabela 2).
Ao longo dos anos com o desenvolvimento farmacêutico e médico na
compreensão da fisiopatologia da epilepsia, novos fármacos foram descobertos
com o objetivo de melhorar o controle das convulsões, diminuir os efeitos
adversos e interações medicamentosas. Surgiram então os fármacos de segunda e terceira geração: lamotrigina (Lamictal®), vigabatrina (Sabril®), tiagabina
58
(Gabitril®), topiramato (Topamax®), gabapentina (Neurontin®), leviracetam
(Keppra®), felbamato (Felbatol®), oxcarbazepina (Trileptal®), pregabalina
(Lyrica®), zonisamida (Zonegran®), lacosamida (Vimpat®) e rufinamida
(Inovelon®) (MARCOS, 2011; REMÍGIO, 2014). Estes medicamentos possuem melhor perfil farmacocinético e farmacodinâmico comparado aos
antiepilépticos de primeira geração e, portanto, são mais vantajosos em relação
aos efeitos adversos e interações medicamentosas, facilitando a adesão ao
tratamento (REMÍGIO, 2014).
Figura 8. Período de introdução de fármacos antiepilépticos no mercado farmacêutico entre 1857 e 2012.
Fonte: YACUBIAN; CONTRERAS-CAICEDO; RÍOS-POHL, 2014.
Considerando os fármacos de primeira e segunda geração, há no
mercado farmacêutico um arsenal terapêutico bastante amplo para o tratamento
da epilepsia, mas cerca de 30% dos pacientes não respondem adequadamente e
destes, 40% apresentam resistência aos fármacos (FERNANDES, 2013;
NAGAE et al., 2016; VAURIO; KARANTZOULIS; BARR, 2017).
O sucesso da terapia antiepiléptica depende de fatores como o tipo de
crise, tempo de duração e frequência, estilo de vida e idade do paciente, além
de fatores relacionados ao fármaco, como cinética e efeitos colaterais (SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013). O ideal é a escolha por monoterapia, mas
59
alguns pacientes apresentam maior controle das CEs com politerapia devido a
sinergia (BRASÍLIA, 2013; SILVA; CARDOSO; MACHADO, 2013).
Os FAEs podem atuar por diferentes mecanismos de ação, entre eles: bloqueio de canais de Na+, bloqueio de canais de Ca++, aumento da inibição
GABAérgica e bloqueio da transmissão glutamatérgica excitatória (BRASÍLIA,
2013).
Fármacos como a carbamazepina (Tegretol®), gabapentina
(Neurontin®), lamotrigina (Lamictal®), leviracetam (Keppra®), oxcarbazepina
(Trileptal®), fenitoína (Hidantal®), topiramato (Topamax®), valproato de
sódio (Depakene®) e zonisamida (Zonegran®) atuam bloqueando canais de
Na+ ou Ca++ e são importantes no tratamento das crises parciais e tônico-
clônicas generalizadas (SILVA; CABRAL, 2008).
As crises de ausência podem ser tratadas com fármacos que
bloqueiam seletivamente canais de Ca++ como a etossuximida (Etoxin®) e zonisamida (Zonegran®); e valproato de sódio (Depakene®) que bloqueia o
influxo de Na+ (SILVA; CABRAL, 2008).
Todos os tipos de crise, exceto crises de ausência, podem ser tratados
com fármacos que atuam em receptores do tipo GABAA (SILVA; CABRAL,
2008).
O quadro 2 mostra as classificações dos FAEs e seus principais
exemplos, descreve os principais mecanismos de ação, suas indicações clínicas
e efeitos adversos.
60
Quadro 2. Fármacos antiepilépticos, mecanismos de ação e efeitos adversos.
FÁRMACO INDICAÇÃO
CLÍNICA MECANISMO DE
AÇÃO EFEITOS ADVERSOS
Barbitúricos – Fenobarbital (Gardenal®)
NH
NH
O O
O
CH3
Convulsões
tônico-clônicas,
generalizadas e parciais
Modulação alosté-
rica de GABAA, prolongamento da abertura dos canais
de Cl-.
Depressão, hipoten-
são, bradicardia, sonolência, letargia, ataxia, tolerância e
dependência
Benzodiazepínicos – Diazepam (Valium®)
ClN
N
O
CH3
Ausência, con-
vulsões parciais e
febris
Modulação alosté-rica, aumento da ação do GABA
Sedação, tolerância e dependência
Carbamazepina (Tegretol®)
N
NH2O
Convulsões tônico-
clônicas generalizadas
e parciais
Bloqueio de canais de Na+ dependen-tes de voltagem
Sedação, ataxia, retenção hídrica,
hipersensibilidade grave
Etossuximida (Etoxin®)
NH
O
O
CH3
CH3
Convulsões parciais e
generalizadas
Bloqueio de canais
de Ca++ e Na+ voltagem-
dependentes
Visão dupla, tontu-
ra, náuseas, dor de cabeça, exantema e
leucopenia
Gabapentina (Neurontin®)
NH2
O
OH
Convulsões parciais
Análogo estrutural do GABA, blo-queio canais de
Ca++ voltagem-dependentes
Sedação, náuseas, alteração de
comportamento e
movimento, ganho de peso
61
Hidantoínas – Fenitoína (Hidantal®)
NH
NH
O
O
Convulsões tônico-
clônicas generalizadas
e parciais
Bloqueio de canais de Na+ dependen-tes de voltagem
Sedação e anemia megaloblástica
Lacosamida (Vimpat®)
NHNH
O
O
CH3
O
CH3
Convulsões parciais
Modulação de canais de Na+
Tontura, náuseas,
fadiga, ataxia, diplopia e nistagmo
Lamotrigina (Lamictal®) N
NN
NH2 NH2
Cl
Cl
Coadjuvante para
convulsões parciais em adultos e epilepsia
generalizada
Bloqueio de canais de Na+ e bloqueio
indireto da libera-ção do GLU
Rash, diplopia, sedação, síndrome
de Stevens-Johnson, necrólise epidérmica tóxica
Leviracetam (Keppra®)
N
O
CH3
NH2
O
Convulsões parciais e
generalizadas
Mecanismo desco-nhecido
Irritabilidade e transtornos de hu-
mor
Oxcarbazepina (Trileptal®)
N
O
NH2
O
Convulsões parciais
Mecanismo desco-nhecido
Sonolência, fadiga, cefaleia, tontura, ataxia e vômito
62
Perampanel (Fycompa®)
N
N
O
N
Convulsões parciais
Bloqueio do recep-tor AMPA de GLU
Tontura, sonolência,
irritabilidade, dor de cabeça e ataxia
Pregabalina (Lyrica®)
CH3 OH
OCH3
NH2
Complementar
para convulsões
focais
Modulação de canais de Ca++
Sonolência, tonturas, ataxia,
diplopia, ganho de peso, irritabilidade
e euforia
Primidona (Primid®)
NH
NH
O
O CH3
Convulsões
parciais e generalizadas
Metabolização a barbituratos, blo-queio canais de
Na+.
Anemia megaloblástica,
interações far-macológicas por
indução enzimática
Topiramato (Topamax®)
O
O
OO
O
CH3
CH3
CH3
CH3
O
S
OO
NH2
Coadjuvante no tratamento
de crises parciais e
generalizada
Bloqueio de canais de Na+, anta-
gonismo glutama-térgico (AMPA) e ação gabaérgica
Alterações do pen-samento, perda de peso, parestesias,
nefrolitíase
Tiagabina (Gabitril®)
N
OH
O
H
S
S
CH3
CH3
Coadjuvante de crises
parciais
Inibição de trans-portadores gaba-
érgicos
Nervosismo, tontu-ras, perda de peso
Valproato de sódio (Depakene®)
ONa
O
CH3
CH3
Convulsões generalizadas,
mioclônicas e ausência
Bloqueio de canais de Na+ e alteração
da atividade gluta-matérgica
Hepatotoxicidade, perda de pelos,
malformações fetais
Vigabatrina (Sabril®)
OH
O CH2
NH2
Crises parciais e
generalizadas
Análogo estrutural do GABA, inibição da GABA transa-
minase
Sedação, náuseas, ganho de peso, de-pressão, psicose, alteração visual
Fonte: adaptado de FORMAN et al., 2009; MOSHÉ et al., 2015; SILVA; CABRAL,
2008.
63
De acordo com a Academia Brasileira de Neurologia (2014) a maioria
dos tratamentos são oferecidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) de maneira
individualizada em centros credenciados. Entretanto, 30% dos pacientes que não respondem ao tratamento convencional são encaminhados para os centros
de especialização em epilepsia e normalmente há a indicação cirúrgica ou
alternativas como a estimulação nervosa vagal (VNS) (NAGAE et al., 2016).
3.1.6.2 Antioxidantes como adjuvantes na terapia antiepiléptica
Como descrito no item 3.1.5.4, o efeito mais importante da formação
excessiva dos radicais livres é o processo de peroxidação lipídica, no qual pode ocorrer o rompimento das membranas lipídicas e a destruição celular. Estes
efeitos das EROs/ERNs são controlados in vivo pela ação de vários
antioxidantes como vitamina E, vitamina C, vitamina A e enzimas
antioxidantes GPx, GSH, SOD e CAT, por exemplo (SUDHA; RAO; RAO,
2001).
À exemplo dos antioxidantes, pode-se citar a vitamina C, uma
substância exógena solúvel em água que desempenha função neuroprotetora
pela inibição do estresse oxidativo, bloqueando o efluxo de Ca++, portanto,
pode interferir nos mecanismos de liberação e/ou absorção de
neurotransmissores. Além disso, a vitamina C diminui a peroxidação lipídica e atua como um neuromodulador (SAMARIYA; SHAH, 2016; SAWICKA-
GLAZER; CZUCZWAR, 2014; SUDHA; RAO; RAO, 2001).
O SNC possui regiões específicas mais susceptíveis a reações
oxidativas, como o hipocampo. O hipocampo é bastante vulnerável a
concentrações desta vitamina, além da amígdala e hipotálamo. A vitamina C é
transportada principalmente para mitocôndrias, onde as EROs/ERNs estão
acumuladas, e lá transfere um elétron para "peroxidase dependente de
ascorbato", atuando bioquimicamente como um agente redutor. Além disso, as
vitaminas antioxidantes são capazes de reduzir o estresse oxidativo e evitar a
depleção de reservas de antioxidantes endógenos pelas espécies reativas. Neste
contexto, a vitamina C parece oferecer benefícios na terapia complementar em pacientes epilépticos (OLIVEIRA et al., 2016; SAMARIYA; SHAH, 2016;
SAWICKA-GLAZER; CZUCZWAR, 2014).
3.2 Testes animais em epilepsia
A experimentação animal é uma ferramenta fundamental para a
neurociência. Os testes animais são utilizados para explorar e avaliar
determinadas doenças, mecanismos envolvidos e avaliar a potencial eficácia
das intervenções terapêuticas, a partir do efeito produzido que mimetiza, direta
64
ou indiretamente, o que acontece nos seres humanos (FERNANDES, 2013;
MCGONIGLE, 2014).
Distúrbios do SNC normalmente são multicausais e não tem todos os
mecanismos bem estabelecidos. Em decorrência da escassez de informações e mecanismos moleculares não compreendidos, a tarefa de se pesquisar e
reproduzir testes animais é desafiadora (GRONE; BARABAN, 2015;
MCGONIGLE, 2014).
Os experimentos animais utilizados em doenças mentais, como por
exemplo a epilepsia, mimetizam os sintomas de maneira discreta e distante,
pois envolve não só a fisiopatologia, mas outros fenômenos somáticos
associados, que ocorrem unicamente in vivo. O desenvolvimento e a utilização
de testes animais do SNC estão limitados a sintomas mensuráveis da doença,
como alterações sensoriais e comportamentais (GRONE; BARABAN, 2015;
YACUBIAN, 2014) e com os testes de epilepsia isso não é diferente.
Um experimento animal in vivo ideal deve satisfazer alguns critérios,
como: presença de padrões fisiológicos semelhantes aos observados em humanos; predisposição genética ou lesão semelhantes; a condição
experimental deve responder de maneira semelhante aos FAEs; e as
características comportamentais devem também refletir as manifestações
humanas (AUVIN et al., 2012). Neste contexto, os testes devem satisfazer três
critérios primordiais: validade de constructo, validade preditiva e validade
fenomenológica, ou seja, deve apresentar habilidade de reproduzir as condições
fisiopatológicas humanas, os agentes terapêuticos utilizados devem reverter os
sintomas causados pelo teste, e mimetizar os sintomas da doença (GRONE;
BARABAN, 2015).
Os experimentos animais disponíveis para o estudo dos mecanismos
epilépticos são categorizados em testes de convulsões ou modelos de epilepsia. Os testes que induzem somente crises agudas devem ser considerados testes de
convulsão. Do contrário, modelos que permitem a investigação de mecanismos
fisiopatológicos, avaliação, desenvolvimento de novos FAEs, consequências
cognitivas e comorbidades concomitantes a epilepsia são considerados modelos
de epilepsia (AUVIN et al., 2012).
Diversas espécies animais podem ser utilizadas em estudos
experimentais epilépticos, mas roedores como ratos e camundongos são os mais
empregados devido ao baixo custo, facilidade de procriação em laboratório, e
pelos conhecimentos sobre questões neuroanatômicas, neuroquímicas e
comportamentais (FERNANDES, 2013).
Os procedimentos devem sempre ser aprovados pelo Comitê de Ética
no Uso de Animais (CEUA) da instituição pesquisadora, com o objetivo de reduzir conflitos de interesse em relação a avaliação e aprovação de protocolos
experimentais, verificando a viabilidade dos mesmos (GRONE; BARABAN,
2015). Após aprovação pelo CEUA, os animais são submetidos a indução das
65
CEs por agentes químicos (PTZ, STR, pilocarpina, por exemplo), físicos
(criogenia) ou elétricos (eletrochoque máximo), e podem ser mantidos vivos
para acompanhar o desenvolvimento e a evolução da epileptogênese
(FERNANDES, 2013). O teste de convulsão induzida por PTZ, um dos mais utilizados no
desenvolvimento de FAEs, induz crises convulsivas agudas ou crônicas
(método do abrasamento). A geração das crises se dá pelo antagonismo dos
receptores GABAA, reduzindo sua ação inibitória no SNC. Após a
administração de PTZ os animais apresentam crises tônico-clônicas,
mioclônicas e de ausência, de aproximadamente 5 minutos (HAHN;
BURRELL, 2015).
No teste de convulsão induzida por STR há a geração de crises
intensas, que normalmente levam os animais a óbito. Sua ação é o antagonismo
dos receptores de glicina, promovendo a diminuição do seu efeito inibitório no
SNC (SOLIMAN et al., 2016).
A pilocarpina é capaz de induzir crises prolongadas (estado epiléptico), seguido de crises recorrentes, por seu potencial agonista colinérgico
muscarínico. As manifestações epilépticas iniciam cerca de 15-30 minutos após
a administração da pilocarpina e podem durar por horas. O animal que
sobrevive às manifestações agudas entre num período de latência até a
ocorrência de novas crises que perduram toda a vida (FERNANDES, 2013).
Comumente usado no desenvolvimento de novos FAEs, o teste de
eletrochoque máximo (ECM) é capaz de induzir convulsões clônicas e/ou
tônicas generalizadas a partir de uma corrente elétrica alternada, administrada
na cavidade auricular dos animais através de eletrodos, com impulsos de
intensidade que variam entre 60 Hz e 50 mA (em camundongos) ou 150 mA
(em ratos) (YACUBIAN, 2014). Além dos experimentos animais in vivo mencionados acima, a
atividade farmacológica de compostos em estudo pode ser rastreada
inicialmente por testes animais in vitro, que permitem a utilização de tecidos e
cultura celular para estudar processos associados à epileptogênese
(FERNANDES, 2013; GALANOPOULOU et al., 2013).
Técnicas de baixo custo e potencial permitem a avaliação de milhares
de compostos que vem sendo desenvolvidos. Neste sentido, testes em
organismos simples (Drosophila, C. elegans, zebrafish e Xenopus), podem
servir de screening para compostos com atividade anticonvulsivante
(CALCAGNOTTO; MELLO, 2014).
A utilização de métodos alternativos tem papel fundamental na
comunidade científica porque proporciona a redução do número de animais e custos nos experimentos. No entanto, mas não substituem os testes
convencionais já que os fenômenos envolvidos nas patologias mentais ocorrem
unicamente in vivo. Mesmo que existam outros testes animais disponíveis e
66
relatados na literatura, nenhum mostra-se mais eficaz do que os testes de PTZ e
ECM na descoberta de novos FAEs (YACUBIAN, 2014).
3.3 Química medicinal e a descoberta de fármacos
Desde o início da civilização os povos procuravam e utilizavam
substâncias naturais para o alívio das doenças. A sociedade científica é
constantemente instigada pelos tratamentos e pela cura das doenças através da
implementação de nova e avançada tecnologia na busca de novos fármacos
(NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).
Estima-se que cerca de 1,5 bilhões de pessoas no mundo sofrem de
algum transtorno do SNC e, portanto, há uma forte demanda pela busca e
desenvolvimento de novos tratamentos eficazes. De acordo com Brasnjevic et
al. (2009), se novos fármacos não forem descobertos, o número de pessoas com
distúrbios do SNC será de aproximadamente 1,9 bilhões até 2020. A cadeia farmacêutica transforma, em primeiro passo, intermediários
químicos e extratos vegetais em princípios ativos, os quais, posteriormente são
convertidos em medicamentos finais para o tratamento e prevenção de doenças
no ser humano (BARREIRO, 2009).
É através de estudos da química medicinal que a pesquisa de
moléculas biologicamente ativas é realizada, sendo de fundamental importância
durante o processo de desenvolvimento de novos medicamentos, até sua
inclusão no mercado farmacêutico. A química medicinal, segundo definição da
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), é uma ciência
multidisciplinar de importante papel na produção e desenvolvimento de
fármacos, cuja implicação se dá nas áreas química, biológica, médica e
farmacêutica, na qual os objetivos são o planejamento, descoberta, invenção, identificação e preparação de protótipos, para a elucidação da relação estrutura
química e a atividade farmacológica (GUIDO; ANDRICOPULO; OLIVA,
2010; LIMA, 2007).
O principal foco das indústrias farmacêuticas, atualmente, está voltado
à descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos que possam satisfazer
as necessidades da população, tanto na oferta de novas terapias para doenças
sem tratamento, quanto para a melhoria das opções de tratamentos já existentes,
contudo mais eficazes e mais seguros (MIGNANI et al., 2016a). Além disso, as
empresas farmacêuticas devem buscar novas abordagens de desenvolvimento,
visando a melhoria da produtividade, garantia das demandas do setor de saúde e
da sobrevivência em termos de retorno do investimento (MIGNANI et al., 2016b).
A descoberta de novos fármacos é considerada o maior desafio
encontrado para a indústria farmacêutica. A área de P&D necessita de altos
investimentos, que mostra um contraste em relação aos medicamentos incluídos
67
no mercado nos últimos anos. Durante várias décadas, o setor encarou grandes
questões não técnicas, como a redução do número de medicamentos aprovados
pela FDA, reduções nos orçamentos e aumentos nos custos globais de P&D
(MIGNANI et al., 2016a). Estima-se que a cada 9 anos, desde a década de 1950, o número de aprovações de novos medicamentos tenha reduzido pela
metade (BAYLISS et al., 2016).
Segundo Lima (2007), há uma questão quanto à produtividade, já que
a relação entre os investimentos em P&D e a descoberta de NCEs é
inversamente proporcional. Segundo dados recentes de Bayliss e colaboradores
(2016) apenas 4,3% dos projetos de P&D prosseguem com fármacos
promissores desde a fase clínica até estudos de fase III.
A relação estrutura química e atividade biológica compreende o estudo
dos efeitos que a estrutura química de um composto pode causar durante sua
interação com o receptor biológico levando-se em consideração as forças
intermoleculares, para que esses compostos se tornem fortes candidatos a novos
fármacos. Geralmente, novos compostos são descobertos durante um planejamento racional, que envolve etapas como a identificação e a otimização
de um composto-protótipo (BARREIRO, 2009). O grande desafio dos pesquisadores durante a descoberta de novos
fármacos é o equilíbrio que deve existir entre sua eficácia, que se traduz em
potência e seletividade, e características farmacocinéticas, que envolve
absorção, distribuição, metabolização e excreção (MELO, 2008).
Em resposta a esta demanda crescente por substâncias estruturalmente
inovadoras para a avaliação farmacológica, um novo paradigma se estabelece
na identificação de substâncias bioativas e ao desenvolvimento de compostos-
protótipo com propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas otimizadas,
com o intuito de se obter conhecimentos mais detalhados sobre a complexidade de doenças.
3.4 Desenvolvimento de fármacos anticonvulsivantes
Apesar dos avanços da neurociência e das pesquisas que tratam do
desenvolvimento de novos fármacos para doenças do SNC, o número de
aprovações de novos medicamentos tem diminuído ao longo das décadas. Para
Muglia (2011), a psiquiatria pode ser considerada a área terapêutica mais difícil
e arriscada para a descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos.
Um dos principais desafios para a indústria farmacêutica na produção
e desenvolvimento destes medicamentos é o alto investimento necessário para a pesquisa, que chegam a milhares de dólares e que tendem a aumentar com o
passar dos anos (MILLER, 2010).
Segundo o IMS Health (2016) os gastos globais com medicamentos
chegarão a aproximadamente US$ 1,5 trilhões até 2021. A inovação em
68
medicamentos, inclusive para SNC, continuará elevando os gastos de 30% em
2016, para 35% em 2021. De acordo com o instituto, devido a má compreensão
dos mecanismos das doenças que acometem o SNC, e falhas no processo de
P&D por conta de efeitos colaterais e falta de eficácia, o desenvolvimento de medicamentos foram escassos por vários anos, mas até 2021, novos fármacos
para o SNC podem chegar ao mercado farmacêutico (Figura 9).
Figura 9. Estimativa de crescimento e gastos globais com medicamentos até 2021.
Fonte: Traduzido de IMS Health (2016).
Nos próximos anos, o lançamento de novos fármacos deverá atingir
níveis que poderão chegar a 45 novas substâncias ativas até 2021. Estes novos
agentes terapêuticos atenderão as necessidades de várias doenças, que ainda
não foram satisfeitas, incluindo doenças autoimunes, câncer e SNC. Compostos com ação central ocupam o 3º lugar dos medicamentos globais na fase tardia de
desenvolvimento clínico (Figura 10) (IMS HEALTH, 2016).
69
Figura 10. Medicamentos globais em fase avançada de desenvolvimento em 2016.
Fonte: Traduzido de IMS Health (2016).
De acordo com Franco, French e Perucca (2016) os altos
investimentos são necessários não só na fase de pesquisa. Estima-se que até
2019, a venda dos FAEs nos principais mercados do mundo (Estados Unidos,
França, Alemanha, Itália, Espanha, Reino Unido e Japão) deverá atingir US$
4,5 bilhões. Segundo os mesmos autores, a lacosamida (Vimpat®),
anticonvulsivante que aumenta a inativação de canais de Na+, que foi
introduzida no mercado farmacêutico em 2008, pode se tornar um dos fármacos
mais rentáveis do mundo até 2020, atingindo vendas de até US$ 1,2 bilhões.
De acordo com Muglia (2011), além dos medicamentos desenvolvidos
para o SNC custarem mais, estes demoram mais tempo para serem lançados no
mercado farmacêutico, quando comparados com outros tipos de fármacos, pois, segundo ele, modelos pré-clínicos preditivos e biomarcadores humanos
validados não são suficientemente eficazes. A figura 11 mostra que os prazos
para as fases clínicas e aprovação de drogas do SNC, entre 2005 e 2009 foi
maior do que para qualquer outro fármaco de outra área terapêutica: 10 anos
para fármacos que atuam no SNC contra 7,8 anos para fármacos com ação
cardiovascular e 7,6 para antineoplásicos.
70
Figura 11. Média de prazos para as fases clínicas e aprovação de entidades terapêuticas entre 2005 e 2009.
Fonte: adaptado de MILLER, 2010.
Como descrito na literatura, apenas 8% dos fármacos para SNC que
chegam aos ensaios clínicos são aprovados, o que significa cerca de metade da
taxa de sucesso em outras áreas terapêuticas (Figura 12). Outra questão importante, é que quando estes fármacos falham, costumam falhar em fases
tardias do processo de descoberta e desenvolvimento, quando muitos
investimentos já foram realizados (MILLER, 2010; MUGLIA, 2011).
Figura 12. Taxa de sucesso de aprovação clínica.
Fonte: adaptado de MILLER, 2010.
71
No que tange a epilepsia, as indústrias farmacêuticas e os
pesquisadores continuam na busca por novos agentes anticonvulsivantes
eficazes a partir de duas vertentes principais: o uso de testes experimentais de
epilepsia em animais de laboratório e a síntese de compostos com potencial ação na geração de crises (CALCAGNOTTO; MELLO, 2014). Porém, sabe-se
que até o presente momento, não há um FAE ideal capaz de prevenir ou curar a
epilepsia. Fármacos bem tolerados, superiores aos agentes existentes em
relação a capacidade de influenciar mecanismos da doença, sugere um enorme
sucesso no mercado (FRANCO; FRENCH; PERUCCA, 2016).
3.5 Planejamento de fármacos e ferramentas computacionais
3.5.1 Parâmetros físico-químicos para a permeação e biodisponibilidade por
via oral in sílico
Inovações tecnológicas têm contribuído no desenvolvimento de novos
produtos e, consequentemente, a sobrevivência da indústria farmacêutica tem se
destacado no mercado por ser considerada uma das mais lucrativas. Inovar é
fundamental para a sobrevivência das empresas neste setor industrial. O método
de descoberta de fármacos baseado na modificação estrutural de moléculas
conhecidas leva à obtenção de novos compostos-protótipo, que possam atuar
pelo mesmo mecanismo farmacológico da molécula de origem (BARREIRO;
FRAGA, 2008).
Os modelos computacionais são conhecidos por relacionar dados
químicos e propriedades biológicas e propor mecanismos de ligação entre
ligantes e alvos, conhecido como modelos de relação estrutura-atividade (QSAR) foram desenvolvidos em 1962 (MALTAROLLO et al., 2014), a fim
de minimizar custos e experimentação animal (CLARK et al., 2015).
As técnicas de modificação molecular e estudos QSAR são
largamente empregadas na indústria farmacêutica durante o desenvolvimento
de novos fármacos. No entanto, são dispendiosas e demandam considerável
tempo de investigação. Por outro lado, a descoberta de novas substâncias
bioativas de possível aplicação terapêutica, caracteriza a inovação
farmacêutica (BARREIRO; FRAGA, 2008).
Várias análises se destacam como estratégias de avaliação para
identificar novas moléculas e melhorar a qualidade do composto, como, por
exemplo, técnicas de triagem e acompanhamento dos vários índices cinéticos e parâmetros físico-químicos (MIGNANI et al., 2016a).
Além da otimização de candidatos a fármacos em desenvolvimento,
uma das principais razões para a utilização dos métodos computacionais na
72
triagem de novas moléculas é a teórica classificação de um composto como
ativo ou inativo, utilizando descritores (MALTAROLLO et al., 2014).
Maltarollo et al. (2014) relataram que há estimativas em que entre
2020 e 2030, os estudos computacionais precederão os experimentais indicando aplicação bem-sucedida destas ferramentas em estágios iniciais de
desenvolvimento farmacêutico. A probabilidade de sucesso pode ser melhorada
através do aumento do número de compostos que possuem ótimo perfil,
levando-se em conta parâmetros ADMET, o qual podem ser avaliados por
testes de predição computacionais, chamados in sílico, além de testes in vitro e
in vivo. Neste campo, a compreensão das propriedades físico-químicas é
fundamental quando se pensa em desenvolvimento de novos compostos-
protótipo (MIGNANI et al., 2016a).
Segundo Uddin e Khan (2016) existem várias abordagens in sílico
para o rastreio de dados químicos e biológicos essenciais no processo de
desenvolvimento de novos compostos sintéticos. Dentre as estratégias
utilizadas na identificação de novas substâncias biologicamente ativas, a técnica de triagem biológica virtual (Virtual screening), ocupa papel
fundamental, levando-se em conta o significativo número de alvos
farmacológicos. Esta técnica consiste em um método computacional, in sílico,
utilizado em grandes bases de dados de compostos, a fim de se identificar
substâncias capazes de interagir com alvos para futuros testes in vitro (UDDIN;
KHAN, 2016).
Ferramentas como Molinspiration, Osiris Property Explore e
PreADMET são programas de livre acesso na internet, que auxiliam na
determinação de propriedades físico-químicas e farmacocinéticas, a partir de
bases de dados químicas disponíveis. A triagem virtual é uma abordagem
importante na P&D de novas moléculas, já que correlaciona a estrutura molecular com as possíveis propriedades farmacológicas (UDDIN; KHAN,
2016).
O software Molinspiration permite a análise de alguns parâmetros
sugeridos por Lipinski, em 1997 (LIPINSKI et al., 2001) e reavaliados pelo
mesmo autor em 2016 (LIPINSKI, 2016). Estes parâmetros possuem grande
relevância na descoberta e identificação de novas substâncias ativas, sendo
utilizados pelas indústrias farmacêuticas para estimar a solubilidade e a
permeabilidade de fármacos administrados pela via oral (v.o.). A partir dos
resultados obtidos, podem-se predizer as influências moleculares e estruturais
de um fármaco que estão relacionadas a sua absorção in vivo (MIGNANI et al.,
2016a; NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).
A regra de Lipinski (Lipinski rule) ou “regra dos cinco” (Five´s rule ou Rule of five) tem este nome pois, cada parâmetro envolvido usa valores que
são múltiplos do número 5 (LIPINSKI et al., 2001; MIGNANI et al., 2016;
NOGUEIRA; MONTANARI; DONNICI, 2009).
73
De acordo com Lipinski, para que um composto possua boa absorção e
permeabilidade oral, este deve obedecer alguns critérios: massa molecular
(MM) menor que 500 Da (daltons); LogP calculado menor do que 5; não mais
do que 5 doadores de ligação de hidrogênio (OH + NH); não mais do que 10 aceptores de ligações de hidrogênio (O + N) (LIPINSKI et al., 2001;
MATSSON et al., 2016; MIGNANI et al., 2016; NOGUEIRA;
MONTANARI; DONNICI, 2009).
Estudos posteriores também realizados por Lipinski sugeriram a
ampliação das análises pela introdução dos parâmetros: número de ligações
rotacionais, que não deve exceder a 10; e a área de superfície polar (TPSA),
que deve ser menor ou igual a 140 Å2 (LIPINSKI, 2004).
Conforme mencionado anteriormente, a regra dos cinco foi reavaliada
pelo mesmo autor recentemente (LIPINSKI, 2016). Segundo ele, três dos
quatro parâmetros avaliados pela regra, são fundamentais para a ligação
fármaco-receptor. São elas: MM, aceptores e doadores de ligação de
hidrogênio. A lipofilicidade é também um parâmetro importante, mas não se relaciona diretamente com a biofísica do sítio de ligação.
Em 2008 surgiu o OSIRIS, programa eletrônico que abrange
informações desde a síntese de compostos até o desenvolvimento clínico. É
uma ferramenta de análise que, a partir do acesso à base de dados, pode-se
predizer o perfil toxicológico, as propriedades físico-químicas, a semelhança
aos fármacos (druglikeness) e a classificação de fármacos (drugscore). Quanto
aos valores de druglikeness, espera-se que os compostos ativos tenham
resultados positivos, o que indica a presença de fragmentos de fármacos já
conhecidos na base de dados, em relação a descritores topológicos, dados
estruturais, LogP e MM. A avaliação do potencial farmacológico do composto
é dada pelo drugscore com valores positivos, a partir da comparação entre lipofilicidade, solubilidade, MM e toxicidade (HASSAN et al., 2015). Além
dos dados de druglikeness e drugscore, o programa fornece valores de LogS
(solubilidade), que também auxilia na avaliação da sua capacidade de absorção,
e normalmente apresenta valor maior que -4mol/L (NUNES, 2016; OSIRIS,
2017).
O programa PreADMET é utilizado para a avaliação dos parâmetros
farmacocinéticos, como a absorção intestinal humana (AIH), passagem pela
barreira hematoencefálica (BHE) e toxicidade, avaliando mutagênese e
carcinogênese. Particularmente o modelo in sílico AIH e BHE podem fornecer
informações essenciais sobre a administração oral e ação no SNC,
respectivamente (KOVAČEVIĆ et al., 2014; MALTAROLLO et al., 2014;
NUNES, 2016; PreADMET, 2017). As estratégias moleculares in sílico tornam possível o
estabelecimento de estudos sobre moléculas promissoras e de interesse
biológico, em especial no caso dos anticonvulsivantes, já que a relação de
74
permeabilidade cerebral e fármaco-sangue é a medida experimental mais
utilizada na previsão de compostos ativos no SNC (LIPINSKI, 2004).
3.5.2 Parâmetros físico-químicos para a permeação no SNC in sílico
Como mencionado anteriormente, o desenvolvimento de fármacos
direcionados ao SNC é um desafio e apenas 8% dos compostos chegam aos
estudos de Fase 1 e ao lançamento no mercado farmacêutico (MILLER, 2010;
MUGLIA, 2011).
A BHE é o principal obstáculo que impede a entrada de fármacos e
outras substâncias no cérebro. Esta barreira consiste em uma monocamada de
células endoteliais microvasculares cerebrais, unidas por junções apertadas que
formam uma membrana (Figura 13). Estas junções restringem o movimento de
fármacos através da via paracelular e forçam os compostos a utilizarem as vias
transcelulares. Portanto, a função da BHE é o transporte de nutrientes e substâncias para o cérebro e remoção de compostos potencialmente tóxicos.
Compostos lipossolúveis se difundem por difusão passiva, enquanto que
compostos hidrossolúveis requerem a presença de transportadores, como a
glicoproteína-P (GELDENHUYS et al., 2015; ZHANG et al., 2016).
Figura 13. Esquema estrutural da barreira hematoencefálica e capilares periféricos.
Fonte: traduzido de GELDENHUYS et al., 2015.
A capacidade de permeação pela BHE depende de propriedades
físico-químicas e farmacocinéticas, incluindo: LogP, MM, TPSA, doadores e
aceptores de ligações de hidrogênio, ligações rotacionais, Log S, ligação a
proteínas plasmáticas, coeficiente de distribuição (LogD), entre outros
75
(GELDENHUYS et al., 2015; GOLANI; GOLANI, 2015; ZHANG et al.,
2016). De acordo com Geldenhuys et al. (2015), os principais descritores
considerados na predição da permeabilidade no SNC devem ser LogP, LogD e
TPSA, seguido pela predição dos outros parâmetros (Figura 14).
Figura 14. Principais descritores utilizados para a predição da permeabilidade da
barreira hematoencefálica segundo Geldenhuys et al., 2015.
Fonte: traduzido de GELDENHUYS et al., 2015.
A lipofilicidade, comumente medida pelo LogP, desempenha papel
importante na ADME de fármacos. Embora o elevado grau de lipossolubilidade
favoreça a penetração pela BHE por difusão transmembrana, pode ocorrer a
captação do composto pelos tecidos periféricos, diminuindo a quantidade de
fármaco livre. Normalmente, a lipofilicidade é um bom preditor da penetração da BHE (GOLANI; GOLANI, 2015). Os valores de LogP recomendados para
os fármacos atuarem no SNC estão entre 1 e 4 (EIGENMANN et al., 2016).
A MM ideal de um composto para a passagem pela BHE situa-se na
região de 300 a 450 Da (CLARK, 2003; EIGENMANN et al., 2016; GOLANI;
GOLANI, 2015).
Com relação à polaridade ou capacidade de ligação de hidrogênio, os
descritores como doadores e aceptores de hidrogênio se correlacionam
inversamente com a permeabilidade pela BHE. Ou seja, compostos altamente
polares não permeiam facilmente esta membrana. Assim, os valores
recomendados são 3 e 7 para doadores e aceptores de ligações de hidrogênio,
respectivamente (PAJOUHESH; LENZ, 2005). Segundo Clark (2003) e Pajouhesh; Lenz (2005), se a soma de átomos de nitrogênio e oxigênio (N + O)
em uma molécula é ≤ 5, o composto tem maior chance de entrar no SNC.
O papel da flexibilidade molecular é importante para a permeação
cerebral, e o aumento da taxa de permeação está relacionado com a diminuição
da contagem de ligações rotacionais, as quais devem ser menores que 8 para
fármacos do SNC (CLARK, 2003; EIGENMANN et al., 2016).
76
A TPSA é uma medida comumente usada para a otimização da
capacidade de um fármaco em permear as células. Compostos com TPSA
superior a 140 Å2, tem contribuição negativa para permeabilidade na BHE
(GOLANI; GOLANI, 2015). Segundo a literatura, compostos bem absorvidos e com ação central apresentam valor de TPSA entre 70 Å2 e 90 Å2 (CLARK,
2003; EIGENMANN et al., 2016; PAJOUHESH; LENZ, 2005).
Clark (2003) também leva em consideração os valores de LogD, que
é o logaritmo do coeficiente de distribuição de um composto, no qual um valor
no intervalo de 0 – 3 é recomendado. A distribuição dos fármacos nos tecidos
está intimamente relacionada com a ligação às proteínas plasmáticas (albumina,
glicoproteína P e lipoproteínas). Dependendo do fármaco e do alvo, a afinidade
com proteínas plasmáticas pode, consequentemente, ser vantajosa ou não para a
eficácia. A albumina é a proteína mais abundante no plasma sanguíneo e serve
como uma proteína de transporte de baixa afinidade e alta capacidade de
ligação. Os fármacos com grau de ligação mais baixo estão mais disponíveis
para a distribuição para os órgãos e tecidos, incluindo o SNC. Apenas o fármaco livre está disponível para difusão passiva através da BHE, e
consequentemente, para efeito farmacológico (GOLANI; GOLANI, 2015;
PAJOUHESH; LENZ, 2005). A glicoproteína-P tem baixa capacidade de
ligação e alta afinidade, portanto, fármacos para o SNC não devem ser um
substrato de glicoproteína-P eficiente e um ligante de albumina sérica de
elevada afinidade (PAJOUHESH; LENZ, 2005).
A tabela 1 mostra os descritores mencionados por Mahar Doan et al.
(2002) e Pajouhesh e Lenz (2005) para o sucesso da penetração de fármacos
pela BHE.
Assim, o possível efeito no SNC de um novo candidato a fármaco
pode ser investigado por predições de parâmetros físico-químicos e farmacocinéticos, os quais devem se adequar ao maior número de critérios
estabelecidos cientificamente, para uma taxa de sucesso muito maior em
relação à penetração cerebral.
77
Tabela 1. Propriedades físico-químicas de compostos e valores relacionados à penetração da barreira hematoencefálica.
Propriedades físico-
químicas
SNC Não-SNC
MM 319 (151 – 655) 330 (163-671)
LogP 3,43* (0,16 – 6,59) 2,78* (-2,81 – 6,09)
LogD 2,08 (-1,34 – 6,57) 1,07 (-2,81 – 5,53)
TPSA 40,5 (4,63 – 108) 56,1 (3,25 – 151)
∑NH+OH 0,85* (0 – 3) 1,56* (0 – 6)
∑N+O 3,56 (1 – 10) 4,51 (1 – 11)
nRot 1,27* (0 – 5) 2,18* (0 – 4) Legenda: MM – massa molecular; LogP – coeficiente de partição octanol/água; LogD –
coeficiente de distribuição; TPSA – área de superfície polar; ∑NH+OH – doadores de ligação de
hidrogênio; ∑N+O – aceptores de ligação de hidrogênio; nRot – número de ligações rotacionais.
*Diferença estatística
Fonte: adaptado de MAHAR DOAN et al., 2002; PAJOUHESH; LENZ, 2005.
3.6 Heterociclos
Os heterociclos são amplamente distribuídos na natureza e fazem parte
da grande maioria de substâncias essenciais para a vida. Fragmentos
farmacologicamente ativos podem conter átomos de nitrogênio, enxofre e
oxigênio e são utilizados para o design de novos medicamentos (TOMI et al.,
2016).
A química de heterociclos trata da síntese e de suas aplicações
essenciais para o desenvolvimento de novos bioprodutos. Em especial na
indústria farmacêutica, os heterociclos são fragmentos comuns na grande
maioria dos fármacos comerciais. Estes podem ser definidos como estruturas
cíclicas que contém diferentes heteroátomos em um anel, sendo oxigênio,
enxofre e especialmente nitrogênio, os heteroátomos prevalentes (TOMI et al.,
2016). A figura 15 mostra heterociclos de interesse biológico.
78
Figura 15. Modelos estruturais de heterociclos de interesse biológico.
S
N
Tiazol
NH
NH
Piperazina
NH
O
O
Succinimida
N
NH
Pirazol
N
S
Isotiazol
NH
Pirrol
O
N
Oxazol
Fonte: o autor.
A partir da introdução de heterociclos em estruturas moleculares, as propriedades farmacológicas, farmacocinéticas, toxicológicas e físico-químicas
podem ser manipuladas e modificadas, contribuindo na melhoria das
características essenciais dos novos candidatos a fármacos (GOMTSYAN,
2012).
Dentre os compostos extensivamente estudados e frequentemente
submetidos a alterações estruturais em busca de moléculas mais reativas frente
às diversas atividades biológicas relatadas, destacam-se as TZDs, uma classe de
compostos com utilidade comprovada pela química medicinal.
3.6.1 Tiazolidinodiona (TZD)
Existem atualmente muitos compostos biologicamente ativos com
anéis de cinco membros que contém heteroátomos. As TZDs são consideradas
umas das mais promissoras estruturas na química medicinal (SHYAM;
DEBNATH; DEVBHUTI, 2016). A tiazolidina-2,4-diona é uma substância
derivada do tiazol ou tiazolidina (A), que apresenta em sua estrutura um
sistema de anel de cinco membros, contendo três átomos de carbono, um átomo
de enxofre e um átomo de nitrogênio, com dois grupos carbonila nas posições 2
e 4 do anel (Figura 16) (KORMANN, 2013; SHYAM; DEBNATH;
DEVBHUTI, 2016).
79
Figura 16. Estrutura molecular da tiazolidina (A) e seu derivado tiazolidina-2,4-diona (TZD) (B).
Fonte: adaptado de KORMANN, 2013.
As TZDs, também conhecidas como glitazonas, foram inicialmente
descobertas pela indústria farmacêutica Takeda, no Japão, em 1975
(CHINTHALA et al., 2013). Na década de 1980, as TZDs foram
extensivamente estudadas como agentes antihiperglicêmicos. De acordo com
Chinthala e colaboradores (2013), e Shyam, Debnath, Devbhuti (2016), o
primeiro representante do grupo foi a ciglitazona (1), porém, embora
melhorasse o controle glicêmico, a toxicidade impediu ensaios em humanos.
Em seguida, foram descobertos seus derivados englitazona (2), troglitazona
(Resulin®) (3), retirada do mercado farmacêutico por causa de sua toxicidade
hepática (GAONKAR et al., 2014), rosiglitazona (Avandia®) (4), associada a
riscos cardiovasculares (GILBERT, KRUM, 2015), e pioglitazona (Actos®) (5), útil no tratamento para diabetes mellitus tipo 2 (CHINTHALA et al., 2013)
(Figura 17). Estes compostos partilham uma estrutura comum de tiazolidina-
2,4-diona, responsável pela atividade farmacológica.
5
4
S1
NH3
2
5
4
S1
NH3
2
O
O
(A) (B)
80
Figura 17. Agentes antihiperglicêmicos contendo o núcleo TZD.
NH
SO
O
O
CH3
Ciglitazona (1)
NH
S
OO
O
Englitazona (2)
NH
SO
O
O
N
CH3
Pioglitazona (5)
NH
S
O
O
O
OCH3
OH CH3
CH3
CH3
Troglitazona (3)
NH
S
O
O
O
NCH3
N
Rosiglitazona (4)
Fonte: adaptado de CHINTHALA et al., 2013 e NCBI, 2016.
Além da atividade antihiperglicêmica, são atribuídas diversas
atividades biológicas ao núcleo TZD, tais como antitumoral, antimicrobiana,
antiviral, antiarrítmica, anti-inflamatória e analgésica, anti-hiperlipidêmica,
anti-obesidade, anti-oxidante e anticonvulsivante (KORMANN, 2013;
SHYAM; DEBNATH; DEVBHUTI, 2016). Recentemente, tem surgido vários
trabalhos apontando os possíveis efeitos anti-Alzheimer das TZDs em ensaios
pré-clínicos e clínicos (LIU; WANG; JIA, 2014; TOBA et al., 2016).
O mecanismo de ação das TZDs é atribuído a capacidade de ativação
dos receptores ativadores de proliferadores de peroxissomas (PPARs), um
receptor nuclear amplamente expresso em todos os tipos de células do SNC e
81
células imunes, capaz de controlar a expressão gênica relacionada com a
homeostase de lipídeos e glicose, diferenciação e proliferação celular, apoptose
e inflamação (DUHART et al., 2016; KORMANN, 2013; YASMIN;
JAYAPRAKASH, 2017). Existem três diferentes tipos de isoformas desse receptor: PPARα, PPARβ/δ e PPARγ, que diferem quanto à distribuição nos
tecidos, seletividade e responsividade aos ligantes. Ligantes específicos de
PPARs, geralmente são moléculas pequenas e lipofílicas, que provocam a
alteração conformacional do receptor e dá orgiem à transcrição de genes alvo
(CHING et al., 2015).
As TZDs agem como agonistas dos receptores PPARγ. A ativação dos
receptores PPARs pelas TZDs conduz à formação de heterodímeros com
receptores X-retinóides (RXRs), que contém sítios de ligação para as TZDs e
para o ácido retinóico. Após a ativação, ocorrem ligações específicas de
sequências de DNA, chamadas elementos de resposta do proliferador de
peroxissoma (PPREs). Estes PPREs são encontrados nos promotores dos genes
PPARγ, estimulando a transcrição. O PPARγ também reprime a expressão de genes de resposta inflamatória através do mecanismo chamado de
transrepressão, que não envolve a ligação ao seu elemento de DNA, e sim pela
ativação de outras classes de fatores de transcrição, como proteínas NF-kB
(fator nuclear kappa B) e AP-1 (proteína ativadora 1), e citocinas incluindo IL-
1β, IL-6 e TNF-α (fator de necrose tumoral α), reduzindo as vias de sinalização
inflamatória (DUHART et al., 2016; KORMANN, 2013). Porém, as TZDs
também podem estar envolvidos em outros mecanismos independentes de
PPARs.
Embora muitas contribuições dessa classe de compostos já se
encontram relatadas na literatura, os agentes da classe TZD estão associados à
efeitos colaterais como anemia, edema, risco cardiovascular, ganho de peso e hepatotoxicidade, portanto, fármacos com perfil mais seletivo e seguro são o
foco das pesquisas das indústrias farmacêuticas (GILBERT; KRUM, 2015).
Estudos têm demonstrado o envolvimento de respostas inflamatórias
no cérebro de humanos com epilepsia e também em modelos animais. Em
diferentes modelos, especialmente envolvendo a ciclooxigenase (COX-2) e
citocinas, como as IL-1β, IL-6 e o TNF-α, têm sido reportados com
propriedades pró-convulsivas (CHING et al., 2015; OKADA; YAMASHITA;
TSUJI, 2006).
Segundo Ching e colaboradores (2015) e Okada, Yamashita e Tsuji
(2006), a administração crônica de pioglitazona em animais reduz os
fenômenos epilépticos e a expressão de RNAm de interleucinas IL-1β, IL-6 e
TNF-α no cérebro. Ainda que se tenham dados na literatura sobre possíveis alvos das TZDs, seu mecanismo real no SNC não está totalmente elucidado.
Além da inibição da expressão de mediadores inflamatórios, ligantes
específicos PPARγ podem inibir a expressão de genes indutíveis da óxido
82
nítrico sintase (iNOS). Como mencionado anteriormente, o NO é um
modulador da susceptibilidade à convulsão, com diversos efeitos
anticonvulsivantes e/ou pró-convulsivos, e pode ser inibido por diversos
análogos de L-arginina, como por exemplo o L-NAME (MOHAZAB et al., 2012; SHAFAROODI et al., 2012).
Estudos têm demonstrado que a pioglitazona aumenta o limiar
convulsivo induzido pelo PTZ através do sistema óxidonitrérgico (MOHAZAB
et al., 2012; SHAFAROODI et al., 2012), reforçando a ideia de que derivados
da TZD podem ser úteis no tratamento da convulsão (MOHAZAB et al., 2012;
OKADA; YAMASHITA; TSUJI, 2006; SHAFAROODI et al., 2012).
Desta forma, o estudo de novos fármacos anticonvulsivantes com o
núcleo TZD parece ser bastante promissor, o que corrobora a relevância deste
estudo em encontrar novas moléculas mais seletivas, potentes, eficazes e menos
tóxicas, contribuindo para a P&D de novos compostos com potencial na
terapêutica da epilepsia.
83
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Química
4.1.1 Compostos tiazolidinodiônicos em estudo
Os compostos em estudo foram sintetizados no laboratório de Síntese
Orgânica da UNIVALI pela doutoranda Elaine Cristina Kormann sob
orientação da Profª Drª Fátima de Campos Buzzi.
Eles foram sintetizados em três etapas sequenciais (KORMANN,
2013). Inicialmente foi sintetizada (5Z)-5-benzilideno-1,3-tiazolidino-2,4-diona
(BTZD), por irradiação em micro-ondas da 1,3-tiazolidino-2,4-diona e do
benzaldeído, utilizando piperidina e ácido acético como catalisadores (Figura
18A). Em seguida, o composto BTZD foi clorossulfonado, por refluxo com
ácido clorossulfônico por uma hora, formando o cloreto de 4-[(5Z)-(2,4-dioxo-
1,3-tiazolidino-5-lideno)-metil]benzeno-sulfonila (BTZDCl) (Figura 18B). A partir desta etapa foram realizadas as reações de substituição nucleofílica com
as anilinas contendo os diferentes grupos espaçadores, para a obtenção das
substâncias em estudo (Figura 18C).
Figura 18. Rota sintética para a obtenção dos derivados sulfonamídicos benzilidenotiazolidinodionas.
Fonte: adaptado de KORMANN, 2013.
O
+S
NH
O
O
S
NH
O
O
+ H2O
Ácido acético
Piperidina(A)
1,3-tiazolidino-2,4-diona
Benzaldeído
BTZD
(B)
S
NH
O
O
+ H2SO3ClS
NH
O
O
S
O
OCl
BTZD BTZDCl
(C)S
NH
O
O
S
O
OCl
BTZDCl
+S
NH
O
O
S
O
ONH
R
NH2R
R = -C6H5; -CH2C6H5; -(CH2)2)C6H5; -(CH2)3C6H5; -(CH2)4C6H5
Derivados sulfonamídicos
benzilidenotiazolidinodionas
MeOH + HCl
+H2O
SO30-45ºC
84
Os compostos foram caracterizados por fator de retenção (Rf) e ponto
de fusão (p.f.) e confirmados por análise de IV, RMN 1H e RMN 13C
(KORMANN, 2013). As substâncias foram denominadas conforme Quadro 3.
Quadro 3. Compostos tiazolidinodiônicos em estudo.
Código do
composto Estrutura química e nomenclatura IUPAC
A1
S NH
O
OS
O
O
NH
4-[(5Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]-N-
fenilbenzenosulfonamida
D1
S NH
O
OS
O
O
NH
N-benzil-4-[(5Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]-
benzenosulfonamida
D2
S
NH
O
O
S
O
O
NH
4-[(5Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]-N-(2-
feniletil)benzenosulfonamida
D3
S NH
O
OS
O
O
NH
4-[(5Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]-N-(3-
fenilpropil)benzenosulfonamida
D4
S
NH
O
O
S
O
O
NH
4-[(5Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-ilideno)metil]-N-(4-
fenilbutil)benzenosulfonamida Fonte: adaptado de KORMANN, 2013.
85
4.1.1.2 Relação Estrutura-Atividade: análise in sílico
Os valores de MM, LogP, aceptores de ligação hidrogênio (∑ N + O),
doadores de ligação hidrogênio (∑ NH + OH), número de violações, número de ligações rotacionais, volume e TPSA foram obtidos por cálculos teóricos
computacionais, através do programa Free Molinspiration Online, através do
JME Editor, cortesia de Peter Ertl da Novartis, disponível no site:
http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties.
Os parâmetros de Lipinski foram calculados utilizando o ícone de
acesso à calculadora do programa Molinspiration, o qual permite a criação de
tabelas a partir dos resultados gerados.
O coeficiente de partição octanol/água (LogP), capaz de mensurar a
hidrofobicidade, foi calculado pelo software a partir da soma do LogP
calculado e LogP experimental de fragmentos de mais de 12 mil moléculas (35
pequenos fragmentos e 185 fragmentos maiores). A TPSA, relacionada com a absorção intestinal e penetração na
barreira hematoencefálica (BHE), foi calculada com base na soma de
superfícies dos átomos polares (normalmente N e O), pelo procedimento
detalhado descrito por Ertl, Rohde e Selzer (2000).
O volume molecular determina características relacionadas ao
transporte das moléculas, influenciando na absorção intestinal e permeação da
BHE. Foi calculado pelo software a partir de valores já preestabelecidos de
fragmentos ou métodos de geometria 3D. Dados de MM, ligações rotacionais,
aceptores e doadores de hidrogênio também foram calculados e fornecidos pelo
programa.
A abordagem druglikeness e drugscore foi realizada a partir de
cálculos fundamentados em base de dados de fragmentos de substâncias já conhecidas pelo programa OSIRIS, disponível no site http://www.organic-
chemistry.org/prog/peo/. Resultados positivos para druglikeness, calculados em
combinação com descritores topológicos, dados estruturais, LogP e MM,
indicam compostos possivelmente ativos devido a presença de fragmentos
disponíveis na base de dados. O potencial do composto (drugscore) foi previsto
a partir da combinação de valores referentes a lipofilicidade, solubilidade, MM
e toxicidade (HASSAN et al., 2015; NUNES, 2016).
O programa PreADMET, disponível no site
https://preadmet.bmdrc.kr/, permite a predição de parâmetros farmacocinéticos
(ADME) e de toxicidade (NUNES, 2016; PreADMET, 2017). Para a avaliação
de AIH foram considerados: 0 a 20% baixa absorção, 20 a 70% absorção moderada e 70 a 100% alta absorção (HOU et al., 2007; NUNES, 2016). Para
BHE: > 2,0 compostos com alta absorção, entre 2,0 e 0,1 compostos com média
absorção e < 0,1 compostos com baixa absorção (NUNES, 2016). Além disso,
86
o programa forneceu valores de ligação a proteínas plasmáticas, solubilidade
aquosa e LogD.
4.2 Atividade anticonvulsivante
O delineamento experimental para o estudo das TZDs (A1, D1, D2, D3
e D4) foi realizado no laboratório de farmacologia da UNIVALI em parceria
com as acadêmicas do Curso de Farmácia, Cristiani Vanessa Ternus e Maria
Tereza Dalla Vecchia (TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016), sob orientação
da Profª Drª Márcia Maria de Souza e co-orientação da Profª Drª Fátima de Campos Buzzi. O protocolo experimental foi aprovado pelo CEUA/UNIVALI
com parecer 13/15p (Anexo 1).
Os compostos foram avaliados quanto a atividade anticonvulsivante
nos testes de convulsão induzida quimicamente por PTZ e STR; e convulsão
induzida eletricamente. Os compostos foram comparados com fármacos usados
na terapia da epilepsia. A substância com melhor desempenho farmacológico
nos testes foi selecionada para avaliação sobre efeitos na memória, ansiedade,
hipnose e sistema motor, além do mecanismo de ação e avaliação bioquímica.
Após os experimentos, os animais que sobreviveram as convulsões
foram eutanasiados por equipe responsável, pelo método em atmosfera de CO2.
4.2.1 Drogas e reagentes
Para os ensaios farmacológicos, foram utilizados: estricnina (4,0
mg/Kg) (SIGMA, EUA), pentilenotetrazol (85mg/Kg) (SIGMA, EUA),
carbamazepina (20 mg/Kg) (SIGMA, EUA), gabapentina (20 mg/Kg)
(CRISTÁLIA, Brasil), flumazenil (2 mg/Kg) (CRISTÁLIA, Brasil), ketamina
(0,5 mg/Kg) (RHOBIFARMA, Brasil), fenobarbital (100 mg/mL)
(CRISTÁLIA, Brasil), L-arginina (60 mg/Kg) (SIGMA, EUA), L-NAME (10
mg/Kg) (SIGMA, EUA), 7-NI (40 mg/Kg) (SIGMA, EUA), e o composto D4
(10 mg/Kg). Foram solubilizados em solução salina enquanto que os derivados
TZD foram solubilizados em Tween 80 mais salina.
4.2.2 Via de administração
A via i.p. foi utilizada para a administração dos derivados TZDs,
salina utilizada como veículo, fármacos utilizados como controles positivos, e
PTZ e STR utilizados como indutores da crise convulsiva, no volume 0,10 mL
para cada 10 g de peso.
87
4.2.3 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss Webster machos e fêmeas com
peso entre 25 e 30 g, criados no biotério central da UNIVALI, mantidos conforme critérios exigidos pelo CEUA. Os protocolos experimentais foram
enviados ao CEUA/Univali sendo aprovado com o parecer 13/15p.
Os derivados TZDs foram inicialmente avaliados em dose única 10
mg/Kg, i.p., nos testes de PTZ, STR e ECM. Os animais foram divididos em 7
grupos com número experimental igual a 10 indivíduos por grupo (n = 10).
Num segundo momento, a substância mais ativa nos testes de
convulsão em dose única foi avaliada no teste de convulsão induzida por PTZ
em 3 doses (3, 10 e 30 mg/Kg, i.p.), para determinação da curva dose-resposta.
Para a avaliação dos parâmetros comportamentais relacionados a
deambulação, a substância foi avaliada no teste CA. Foram também avaliados
os efeitos sobre memória, ansiedade e sono, através dos testes de esquiva inibitória, labirinto em cruz elevado, e sono induzido por tiopental,
respectivamente.
4.2.4 Avaliação dos efeitos dos compostos em estudo nos testes de convulsão
induzida por pentilenotetrazol e estricnina
Conforme descrito e padronizado por Holzmann e colaboradores
(2011), grupos de animais diferentes foram tratados com os compostos em
estudo e, receberam, no teste de PTZ, como controles positivos a gabapentina
(20 mg/Kg, i.p.) e o fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.), e controle negativo a salina (10 mL/Kg, i.p.). Após 30 minutos dos tratamentos, foi administrado o PTZ (85
mg/Kg, i.p.), sendo os animais colocados sob funis de vidro para observação do
tempo de latência para a primeira crise convulsiva, número de crises e número
de óbitos, num período de mais 30 minutos. Foi realizado também um teste de
convulsão induzida por PTZ por via oral (v.o.). Os animais foram tratados
conforme o mesmo procedimento descrito por Holzmann et al. (2011),
modificando apenas o tempo para a administração do composto D4 (100
mg/Kg) e do controle positivo fenobarbital (100 mg/Kg) (SON; YEN, 2014;
YAMADA; SUMIDA; SAITO, 2016), que foram administrados 1 hora antes da
indução das CEs.
No teste da STR foi modificado apenas o agente indutor das crises,
neste caso a STR (4 mg/Kg, i.p.) mantendo-se os mesmos procedimentos descritos anteriormente (HOLZMANN et al., 2011). O tempo de observação do
efeito neuroprotetor (sobrevivência) se deu num período de 24 horas após a
indução com os agentes convulsivantes.
88
4.2.5 Avaliação dos efeitos dos compostos em estudo nos testes de convulsão
induzida eletricamente
Foi utilizado um gerador de choques, conhecido como PLAT-2, como
indutor das crises. O aparato é responsável por gerar correntes elétricas
alternadas, que são aplicadas através de eletrodos de aço inoxidável na
cavidade auricular dos animais. O estímulo, necessário para a produção de
extensão tônica dos membros traseiros em 95% dos animais, foi ajustado para
impulsos de intensidade 50 mA a 60 Hz, por 200 ms. A extensão tônica
provocada pelo eletrochoque foi considerada como o registro da crise e o tempo/porcentagem de animais que a apresentaram geraram o índice de
gravidade de convulsão, conforme descrito por Swinyard e colaboradores
(1952).
4.2.6 Avaliação do efeito do composto D4 sobre os parâmetros
comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field)
Conforme descrito por Holzmann e colaboradores (2011), foi
administrada a substância D4 nas doses de 3, 10 e 30 mg/Kg via i.p. nos
animais. Passados 30 minutos, os animais foram transferidos ao aparato de
campo aberto (Figura 19) (TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016). O aparato
consiste numa caixa de madeira medindo 40 x 60 x 50 cm, no qual possui um
assoalho dividido em 12 quadrantes iguais (GONÇALVES et al., 2012).
Durante um período de 6 minutos, foram avaliados o número de cruzamentos,
registrado pelo número de vezes que o animal cruzava, com as quatro patas, as
divisões do campo (crossing), e o número de atividades exploratórias caracterizado pelo levantamento do corpo do animal apoiado pelas patas
posteriores (rearing). O número crossings foi considerado como indicativo de
atividade locomotora e o número de elevações (rearing) indicativo de
comportamento exploratório.
89
Figura 19. Foto ilustrativa do aparato de campo aberto (Open Field).
Fonte: adaptado de CRYAN; HOLMES, 2005.
4.2.7 Avaliação do efeito do composto D4 sobre a memória através do teste da
esquiva inibitória (EI)
Com o intuito de verificar os efeitos do D4 sobre a memória dos
animais foi utilizado o teste da EI. O aparato de EI consiste numa caixa automatizada (ALBARSCH®), que mede 50 cm de comprimento, 25 cm de
largura e 25 cm de altura, com uma das paredes em vidro, permitindo a
observação dos animais pela parte frontal (Figura 20). O aparato possui
assoalho com uma grade formada por barras de bronze de 1 mm de diâmetro
espaçadas por 1 cm, que, quando eletrificada, aplica uma diferença de potencial
regulável de 0 a 1 mA. Sobre o assoalho encontra-se uma plataforma de
madeira. Os animais foram treinados primeiramente colocando-os sobre a
plataforma e foi cronometrado o tempo de latência para sua descida até as
barras de bronze (com as quatro patas na grade). Quando o animal desce e entra
em contato com a grade de bronze são disparados choques de 0,4mA com
duração de 2 s. Após o treino, os animais receberam o tratamento com o composto D4
e/ou salina (10 mL/Kg, i.p.), e os testes foram realizados 24 h depois, seguindo
o mesmo procedimento, com a omissão dos choques. A diferença entre a
latência de descida entre o treino e o teste foi considerada como o índice de
memória.
90
Figura 20. Foto ilustrativa do aparato e esquema do teste de esquiva inibitória.
Fonte: traduzido e adaptado de IZQUIERDO; FURINI; MYSKIW, 2016.
4.2.8 Avaliação do efeito ansiolítico do composto D4 através do teste do
labirinto em cruz elevado (LCE) (Plus-maze)
Com o intuito de avaliar o efeito do tratamento do composto D4 sobre
os parâmetros de ansiedade foi utilizado o teste do LCE. O aparato LCE tem
forma de cruz composta de dois braços abertos (50 x 10 cm) com 1 cm de
altura e dois braços fechados (50 x 10 x 15 cm), ambos opostos, interligados
por uma plataforma central de 10 x 10 cm, a uma altura de 70 cm do chão
(Figura 21).
Os animais foram tratados com o composto D4 na dose de 10 mg/Kg,
i.p., controle negativo com salina (10 mL/Kg, i.p.) e positivo com diazepam
(DZP) (0,75 mg/Kg, i.p.), e colocados sobre a plataforma central voltados com a cabeça para um dos braços fechados, após 30 minutos. O comportamento de
cada animal foi observado por 5 minutos e foram registrados a frequência de
entradas nos braços abertos e fechados, bem como o tempo gasto para
exploração desses braços (HOLZMANN et al., 2011).
91
Figura 21. Foto ilustrativa do aparato do labirinto em cruz elevado (Plus-maze).
Fonte: CRYAN; HOLMES, 2005 e REDISH, 2016.
4.2.9 Avaliação do efeito do composto D4 sobre o sono através do teste da
indução do sono por barbitúricos (MSB)
Para avaliar a atividade hipnótica do composto D4, os animais foram
avaliados no teste MSB. Os animais foram tratados com D4 na dose de 10
mg/Kg, i.p., controle positivo diazepam (2 mg/Kg, i.p.) e controle negativo
veículo. Decorridos 30 minutos, os mesmos receberam tiopental (30 mg/Kg,
i.p.) e foram colocados individualmente em funis de vidro. Foi cronometrado a latência para o sono e o tempo de sono, o que representa perda e recuperação
do reflexo postural, respectivamente (DEVI et al., 2003).
4.3 Análise do mecanismo de ação do composto D4
4.3.1 Investigação da via GABAérgica sobre o mecanismo de ação da
propriedade anticonvulsivante do composto D4
Com o objetivo de analisar a influência do sistema GABAérgico sobre
o mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4, realizou-se o teste de convulsão induzida por PTZ, com a administração de
92
flumazenil, um antagonista do sítio de ligação dos benzodiazepínicos no
receptor GABAA (MOHAMMADI-KHANAPOSHTANI et al., 2016).
Grupos de animais receberam o flumazenil (2 mg/Kg, i.p.) e controles,
e após 30 minutos os mesmos foram tratados com D4 (10 mg/Kg, i.p.). Decorridos mais 30 minutos, os animais foram avaliados no teste do PTZ,
conforme procedimento descrito anteriormente (item 4.2.4).
4.3.2 Investigação da via glutamatérgica sobre o mecanismo de ação da
propriedade anticonvulsivante do composto D4
Com o objetivo de investigar a influência da via
glutamatérgica/sistema NMDA sobre o mecanismo de ação do composto D4, os
experimentos foram conduzidos conforme descrito por Mohseni et al., (2016).
Diferentes grupos de animais foram tratados com ketamina (0,5 mg/Kg, i.p.), um antagonista não-competitivo dos receptores glutamatérgicos do tipo
NMDA, e decorridos 30 minutos, receberam o composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e
controles. Após mais 30 minutos, esses animais foram submetidos ao teste do
PTZ conforme descrito no anteriormente (item 4.2.4).
4.3.3 Investigação da via oxidonitrérgica sobre o mecanismo de ação da
propriedade anticonvulsivante do composto D4
Com o intuito de avaliar a influência da via oxidonitrérgica sobre o
mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4 os procedimentos experimentais foram conduzidos confome descrito por Mohseni
et al., (2016). Diferentes grupos de animais foram tratados com L-arginina,
precursor do NO (60 mg/Kg, i.p.), L-NAME, um análogo da L-arginina
inibidor não-seletivo da NOS (10 mg/Kg, i.p.), e 7-NI, um inibidor seletivo da
NOS (40 mg/Kg, i.p.) e, após 30 minutos foram tratados com D4 (10 mg/Kg,
i.p.) e controles. Decorridos mais 30 minutos, os animais foram avaliados no
teste do PTZ conforme descrito anteriormente (item 4.2.4).
4.4 Avaliação do tratamento subcrônico com o composto D4
Os animais foram tratados por 21 dias consecutivos com o composto em estudo D4 (10 mg/Kg, i.p.), fenobarbital, agonista GABAA utilizado como
controle positivo (50 mg/Kg, i.p.) e salina como controle negativo (10 mg/Kg,
i.p.). Foi realizado controle de peso dos animais a cada 3 dias. Ao final dos
tratamentos, os animais foram eutanasiados através do método da guilhotina
93
para a coleta de sangue a fim de realizar análises bioquímicas do plasma e para
a retirada do cérebro, rins, fígado e coração, a fim de realizar análises
toxicológicas, ambas descritas abaixo.
4.4.1 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 sobre os parâmetros
comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field)
Animais tratados (n = 8, por grupo) com o composto em estudo D4 (10
mg/Kg, i.p.), fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) e controle negativo com veículo (10
mg/Kg, i.p.) foram submetidos ao teste do campo aberto no 21º dia do
experimento, conforme proposto por Holzmann e colaboradores (2011),
descrito no item (4.2.6), para a avaliação da atividade locomotora e
comportamento exploratório e comparação com os resultados do teste agudo.
4.4.2 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 no teste de convulsão
induzida por PTZ
Conforme padronizado por Holzmann e colaboradores (2011), animais
tratados (n = 8, por grupo) com o composto D4 (10 mg/Kg, i.p.), fenobarbital
(50 mg/Kg, i.p.) e controle negativo com veículo (10 mg/Kg, i.p.) receberam
PTZ (85 mg/Kg, i.p.) (MOEZI et al., 2015), no 21º dia do experimento, para
observação do tempo de latência para a primeira crise convulsiva e número de
óbitos, e comparação com o teste agudo.
4.4.3 Investigação de alterações fisiológicas pelo tratamento com o composto
D4 através de análise laboratorial de plasma
As amostras de plasma foram obtidas através da adição do
anticoagulante heparina, após centrifugação a 2000 rpm por 10 minutos. Foram
encaminhadas ao Laboratório Escola de Análises Clínicas (LEAC) da Univali
para a realização das análises de ureia e creatinina, determinados como
parâmetros renais, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gamma-glutamiltransferase, fosfatase alcalina, bilirrubina total e direta
como parâmetros hepáticos, além de proteínas totais, glicose e
creatinofosfoquinase (ARAÚJO, 2012; SASIDHARAN et al., 2015; SPINELLI
et al., 2014), através do analisador automático de bioquímica Vitalab Flexor E
(VITAL SCIENTIFIC N.V., 2000).
94
4.4.4 Avaliação de parâmetros oxidativos no tecido cerebral
4.4.4.1 Preparação das amostras
Após o tratamento subcrônico por 21 dias consecutivos, os animais foram eutanasiados pelo método da guilhotina, para a coleta das amostras
utilizadas na realização dos testes bioquímicos. Por ser a principal região
cerebral envolvida em distúrbios neuropsiquiátricos, a região límbica (Figura
22) foi utilizada para a realização dos testes, sendo separados córtex e
hipocampo. Fazem parte da região límbica estruturas cerebrais corticais que se
situam em volta do tronco encefálico, na face interna (medial) e inferior dos
hemisférios cerebrais (dentre essas estruturas se destaca o hipocampo, a
amígdala, a substância cinzenta periaquedutal, o hipotálamo) e subcorticais
dentre as quais foram incluídos os bulbos olfatórios. O córtex e o hipocampo
dos animais foram pesados e homogeneizados em tampão fosfato 200 mM (pH
= 6,5) a 4°C (MAIA, 2016; SILVA et al., 2015). Esse homogenato foi utilizado
para a quantificação dos níveis de GSH, LOOH e SOD.
Figura 22. Partes do cérebro de camundongos utilizadas para obtenção das amostras.
Fonte: MAIA, 2016.
4.4.4.2 Quantificação dos níveis de GSH
Através do método de Sedlak e Lindsay (1968) os níveis de GSH
foram determinados. Em tubos de microcentrífuga foram adicionados 50 μL do
homogenato de cada amostra preparado conforme item (4.4.4.1) e 40 μL de
ácido tricloroacético (ATC) 12%. Foram agitados em vórtex e centrifugados
por 15 minutos a 4.000 rpm (4 °C).
95
Em placa de 96 poços foram adicionados 20 μL do sobrenadante, 280
μL de tampão TRIS 0,4 M (pH 8,9) e 5 μL de solução 3,96 mg/mL de DTNB
(5,5’-ditiobis-2-ácidonitrobenzoico) em metanol.
A leitura espectrofotométrica em 420 nm foi realizada após 15 minutos pelo leitor de microplacas Molecular Devices®, modelo VersaMax. Os
valores individuais foram interpolados numa curva padrão de GSH (0,41 – 3,33
μg) e expressos em μg GSH/g tecido (MARIANO, 2016; SILVA et al., 2015).
4.4.4.3 Determinação de LOOH
Conforme metodologia de Jiang et al. (1991) procedeu-se a
determinação do total de LOOH no tecido cerebral. Em tubos de
microcentrífuga foram adicionados 50 μL de metanol e 50 μL do homogenato,
agitados em vórtex e centrifugados a 20 minutos a 11.000 rpm (4°C) em
ultracentrífuga.
Em placa de 96 poços foram colocados 30 μL do sobrenadante e 170
μL de meio reacional (xilenol laranja, ferro II e hidroxitolueno butilado solubilizados em metanol), incubados por 30 minutos ao abrigo da luz a
temperatura ambiente. Procedeu-se a leitura em espectrofotômetro a 560 nm,
determinando-se a concentração de LOOH para cada 1 mg de tecido. Desta
maneira, os resultados foram apresentados como mmol/mg de tecido
(MARIANO, 2016; SILVA et al., 2015).
4.4.4.4 Determinação da atividade de SOD
A atividade da SOD foi medida de acordo com a metodologia proposta
por Marklund e Marklund (1974) e Gao et al. (1998), baseada na capacidade de
inibição da enzima sobre o processo de autoxidação de pirogalol. Em tubos de microcentrífuga foram adicionados 40 µL de sobrenadante, 442,5 µL de
solução tampão (Tris HCl-EDTA 200 mM, pH 8,5) e 25 µL pirogalol (1 mM),
e depois misturou-se durante 1 min. A reação foi incubada por 20 minutos à
temperatura ambiente, parada com a adição de 12,5 µL de HCl 1 N. Em placa
de 96 poços foram adicionados 150 μL da reação e a absorbância foi
determinada a 405 nm. A quantidade de SOD que inibiu a oxidação de
pirogalol em 50%, em relação ao controle, foi definida como uma unidade de
atividade de SOD, expressa como U/mg de proteína (SILVA et al., 2015).
96
4.4.4.5 Mensuração da concentração de proteínas
A concentração de proteínas foi mensurada em espectrofotômetro a
590 nm utilizando o reagente de Bradford (AMRESCO®) e albumina bovina (0,012 – 0,100 mg/mL) foi utilizada como curva padrão.
4.4.5 Análises complementares: avaliação do peso em tratamento subcrônico
com o composto D4 e peso dos órgãos isolados
Durante o tratamento subcrônico de 21 dias, foi realizado controle do
desenvolvimento ponderal dos animais (ganho ou perda de peso do animal
durante o período do experimento), a cada 3 dias, para ajuste de dose e
avaliação da variabilidade de peso. Para avaliar possíveis efeitos tóxicos sobre
rins, fígado e coração, após a eutanásia, estes foram coletados e pesados
separadamente.
4.4.6 Análise estatística
Os resultados foram apresentados como média erro padrão da média (EPM) e os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) de uma
ou duas vias quando aplicável, seguidas pela análise post hoc Tukey e
Bonferroni. Para ensaios como a EI foi utilizado o teste de Kruskal Wallis
seguido pelo teste de Dunns. Para a análise estatística dos resultados do estresse
oxidativo foi utilizado o teste de Dunnett. Os dados foram expressos como
medianas com os intervalos interquativos (25 e 75); diferenças estatisticamente
significantes foram consideradas com p<0,05. Os testes e as figuras foram
gerados pelo programa estatístico GraphPad Prisma® 5.0.
97
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliação química
5.1.1 Compostos tiazolidinodiônicos em estudo: caracterização e identificação
Os resultados obtidos na síntese e na caracterização dos compostos
estão demonstrados na Tabela 2. Considerando a rota reacional de síntese dos
compostos, nas primeiras duas etapas formou-se o BTZDCl, a partir do qual os
derivados foram obtidos em um curto espaço de tempo a temperatura ambiente.
Os compostos foram submetidos ao processo de recristalização com etanol, a fim de se obter maior grau de pureza. Dentre as propriedades físicas utilizadas
pelos químicos como critério básico na determinação do grau de pureza de
substâncias orgânicas, destaca-se o ponto de fusão (p.f.) (DIAS et al., 2014;
ZAYED et al., 2016). Como o p.f. é afetado por impurezas e considerando que
a faixa de fusão das moléculas não ultrapassou 1ºC, pode-se considerar que foi
possível a obtenção de compostos puros (KORMANN, 2013).
Tabela 2. Estrutura, rendimento, R.f. e p.f. dos compostos em estudo.
S1
2
5
NH3
4
O6
O7
8
9
10
14
11
13
12
R15
Substituinte
-R Código
Tempo
(min)#
Rend*
(%) R.f.** p.f.*** (ºC)
NH
SO2
A1 5 74,68 0,71 236,8-237,2
NH
SO2
D1 5 50,10 0,69 248,1-248,8
(CH2)2NH
SO2
D2 5 23,85 0,47 210,2-210,7
(CH2)3NH
SO2
D3 6 55,12 0,67 235,3-235,7
(CH2)4NH
SO2
D4 5 40,40 0,75 198,2-198,8
#Tempo reacional da etapa 3; *Rendimento; **Fator de retenção com eluente hexano: acetato de
etila 1:1; ***Ponto de fusão.
Fonte: adaptado de KORMANN, 2013.
98
Técnicas espectroscópicas como IV, RMN 1H e RMN 13C são
utilizadas para identificar os principais picos característicos da estrutura
química, comparar a similaridade com o seu análogo de referência e/ou avaliar
a pureza de compostos (ZAYED et al., 2016). Estas técnicas foram utilizadas para a confirmação estrutural dos compostos em estudo, onde foi possível a
identificação de todos os picos, deformações e estiramentos correspondentes as
estruturas TZDs, cujos resultados estão demonstrados de forma detalhada em
KORMANN (2013).
5.1.2 Relação Estrutura-Atividade: análise in sílico
5.1.2.1 Molinspiration - Análise de Lipinski (Regra dos cinco)
Alguns parâmetros físico-químicos auxiliam na predição da
capacidade do fármaco em atravessar membranas biológicas e, consequentemente, desempenhar suas atividades farmacológicas. A regra de
Lipinski avalia se um determinado composto possui propriedades físico-
químicas adequadas para serem biodisponíveis por v.o. (LIPINSKI et al., 2001;
LIPINSKI, 2004; MIGNANI et al., 2016b).
A tabela 3 mostra os resultados obtidos a partir do software
Molinspiration que calcula os parâmetros de Lipinski e alguns extensores como
a TPSA (≤ 140 Å2) e o número de ligações rotacionais (nRot ≤ 10). De acordo
com os critérios da regra, pode-se observar que nenhum dos compostos violou
os parâmetros propostos, o que significa que os compostos apresentam
capacidade para atravessar membranas biológicas e potencial farmacológico
para administração oral. A MM dos compostos variou entre 360,42 e 416,52 g/mol, faixa
aceitável para a regra dos 5, que considera valor máximo de 500 g/mol
(LIPINSKI et al., 2001). Segundo Matsson e colaboradores (2016) a
permeabilidade celular, absorção e biodisponibilidade são características
essenciais para compostos protótipo e, normalmente, são conseguidas por
fármacos de baixa MM. Teoricamente, o aumento da MM tem sido
correlacionado com a diminuição da solubilidade e da permeabilidade e com o
aumento do efluxo mediado por transportador e toxicidade (MATSSON et al.,
2016).
Os valores de LogP variaram entre 1,95 a 3,14, também obedecendo
a regra estipulada por Lipinski. O aumento da lipofilicidade (representado pelo
LogP) promove o aumento da permeabilidade celular com consequente acúmulo em membranas e tecido adiposo, e risco de toxicidade (MATSSON et
al., 2016). Portanto, valores de LogP menores que 5 indicam boa
permeabilidade aos compostos em estudo.
99
Quanto aos valores de doadores e aceptores de hidrogênio, os
compostos também não violaram as regras. O número de aceptores foi 6 e de
doadores foi 2, para todos os compostos, estando de acordo com os resultados
estabelecidos. Doadores e aceptores de hidrogênio podem promover interações intramoleculares a fim de reduzir a hidrofilicidade e aumentar a
hidrofobicidade, facilitando a permeação da molécula entre as camadas
lipídicas celulares. No sítio alvo, as ligações de H aumentam a seletividade do
fármaco. Portanto, o limite estabelecido por Lipinski prevê que o equilíbrio
entre grupos doadores e aceptores de hidrogênio é fundamental para a potência
e seletividade de um fármaco, pois já que possuem a capacidade de aumentar a
lipofilicidade, podem promover o acúmulo em tecidos gordurosos e causar
toxicidade (ALEX et al., 2011). Além disso, a redução de doadores e aceptores
de H+ é uma estratégia de sucesso para otimizar a atividade de fármacos no
SNC. Assim, pode-se sugerir que os compostos em estudo são suficientemente
hidrofóbicos para atravessar as bicamadas lipídicas e interagir com seus sítios
alvo. O número de ligações rotacionais variou entre 4 e 8, e prevê boa
flexibilidade e conformação dos compostos em estudo. As moléculas são
capazes de modificar sua conformação para a interação com seus receptores.
Ligantes mais flexíveis, ou seja, que apresentam conformações mais acessíveis,
ligam-se mais facilmente a uma variedade maior de receptores, estando,
portanto, relacionada com eficácia clínica. Quando há o extrapolamento (nRot
>10) pode também ser associada a toxicidade (HE; LEE, 2015).
A área de superfície polar (TPSA) está intimamente relacionada com a
capacidade de formar ligações de hidrogênio e facilitar o transporte entre
membranas. A limitação da TPSA abaixo de 140 Å2 como nos resultados
obtidos, onde valores de TPSA foram 96,10 Å2, aumenta a probabilidade de uma boa absorção oral (ALEX et al., 2011).
Dados do fenobarbital, fármaco anticonvulsivante utilizado no
tratamento da epilepsia e como controle dos experimentos, mostram que não há
violações dos parâmetros da regra de Lipinski, assim como os compostos
TZDs. Os valores dos parâmetros de extensão também se mostram dentro dos
limites considerados para boa permeabilidade celular e absorção oral. Esta
comparação entre fármacos de referência e compostos em desenvolvimento
demonstra, que, teoricamente, os compostos sintetizados seriam capazes de
permear membranas biológicas para interagir com seus receptores alvo.
100
Tabela 3. Parâmetros de Lipinski e extensão da regra dos 5 dos compostos tiazolidinodiônicos e fenobarbital, calculados pelo software Molinspiration.
Parâmetros de Lipinski Extensão
LogP MM ∑N+O ∑NH+OH Viol nRot Vol TPSA
A1 2,25 360,42 6 2 0 4 284,36 96,10
D1 1,95 374,44 6 2 0 5 301,16 96,10
D2 2,35 388,47 6 2 0 6 317,96 96,10
D3 2,87 402,50 6 2 0 7 334,76 96,10
D4 3,14 416,52 6 2 0 8 351,57 96,10
Fnb 0,80 232,24 5 2 0 2 204,82 75,27 Legenda: LogP: valores de coeficiente de partição octanol/água; MM: massa molecular (g/mol);
∑N+O: número de aceptores de hidrogênio; ∑NH+OH: número de doadores de hidrogênio; Viol:
violações; nRot: número de ligações rotacionais; Vol: volume (mm3); TPSA: área de superfície
polar (Å2); Fnb: Fenobarbital.
5.1.2.2 OSIRIS
Como na metodologia, os cálculos de druglikeness, drugscore, LogS e
parâmetros de toxicidade como mutagenicidade, carcinogenicidade, irritação e
efeitos sobre o sistema reprodutor foram obtidos a partir da ferramenta OSIRIS,
através das estruturas dos composos analisados.
A tabela 4 mostra os resultados calculados para os parâmetros de
druglikeness, drugscore e LogS. Observa-se que todos os compostos em estudo
apresentaram para druglikeness valores positivos, o que indica que apresentam
fragmentos de fármacos conhecidos em suas estruturas. Em relação ao drugscore, os valores calculados também foram todos positivos, o que indica
que os compostos estudados apresentam em sua estrutura grupos
farmacofóricos, facilitando o reconhecimento fármaco-receptor e atividade
biológica (HASSAN et al., 2015; NUNES, 2016).
A solubilidade aquosa de compostos pode afetar significativamente a
capacidade de absorção e distribuição no meio biológico. Em geral, é
necessário que os compostos tenham um equilíbrio entre solubilidade e
lipofilicidade para que estes sejam suficientemente permeáveis a membrana.
Um parâmetro de avaliação da solubilidade é o LogS, cujo valor desejável é
maior que -4 mol/L (NUNES, 2016). Segundo Nunes (2016), mais de 80% dos
medicamentos comercializados no mercado farmacêutico apresentam valores
superiores ao estimado. Os valores de LogS calculados pelo software foram todos menores que -4 mol/L e são mostrados na tabela 13. Para o parâmetro de
LogS os compostos não demonstraram valores como o estimado, mas de acordo
com alguns autores nem todos os medicamentos disponíveis se enquadram na
regra estabelecida (NUNES, 2016; RITCHIE; MACDONALD, 2014).
101
Tabela 4. Valores de druglikeness, drugscore e LogS dos compostos tiazolidinodiônicos e fenobarbital, calculados pelo software OSIRIS.
Composto Druglikeness Drugscore LogS (mol/L)
A1 4,72 0,73 -4,48
D1 5,09 0,76 -4,03
D2 5,63 0,73 -4,14
D3 4,51 0,68 -4,41
D4 1,22 0,56 -4,68
Fnb 9,60 0,20 -2,80 Legenda: Fnb – Fenobarbital.
Parâmetros toxicológicos também foram calculados pelo programa
OSIRIS. Substâncias químicas podem induzir danos no material genético,
contribuindo para os processos de mutagênese e carcinogênese (OSIRIS, 2017;
ZANONI, 2014). Uma substância é considerada mutagênica quando favorece a transmissão de danos no DNA de uma célula mãe a uma célula filha e pode dar
origem a diversas outras doenças hereditárias humanas. Quando há danos no
material genético o ciclo celular pode ser bloqueado, levando ao processo de
envelhecimento e apoptose celular. Portanto, o processo mutagênico quando
instalado e permanente, pode levar ao processo de carcinogênese (ZANONI,
2014).
A tabela 4 mostra os resultados dos parâmetros toxicológicos
preestabelecidos pelo software. Observa-se que todos os compostos TZDs
estudados neste trabalho não apresentaram perfil tóxico. Em relação ao
fenobarbital, que apresenta risco alto de toxicidade ao sistema reprodutor,
mutagenicidade e carcinogenicidade, percebe-se que, mesmo fármacos já comercializados e utilizados na clínica para o tratamento de doenças do SNC,
como a epilepsia, não se enquadram em todos os limites desejáveis de análise.
Embora os compostos tenham apresentado ótimo perfil, vale ressaltar que a
ausência de alerta de riscos não garante que estas substâncias estejam livres
destes efeitos (NUNES, 2016).
102
Quadro 4. Parâmetros toxicológicos dos compostos tiazolidinodiônicos calculados pelo software OSIRIS.
Composto
Parâmetros
Mutagênico Carcinogênico Irritante Sistema
Reprodutor
A1
D1
D2
D3
D4
Fenobarbital
Legenda:
Sem toxicidade
Média toxicidade
Alta toxicidade
5.1.2.3 PreADMET
O processo de absorção é imprescindível para a potência
farmacológica das substâncias (KOVAČEVIĆ et al., 2014; TRIFUNOVIĆ et
al., 2016). A absorção intestinal humana (AIH) é um dos principais
mecanismos da passagem entre as membranas e foi predito pelo programa PreADMET. Conforme descrito na metodologia, para a avaliação de AIH são
considerados: 0 a 20% baixa absorção, 20 a 70% absorção moderada e 70 a
100% alta absorção (HOU et al., 2007; NUNES, 2016). Os compostos TZDs
investigados apresentaram valores superiores a 90% (Tabela 5), indicando a
probabilidade de uma boa absorção intestinal (TRIFUNOVIĆ et al., 2016),
inclusive superior ao fármaco fenobarbital, cujo valor estimado foi de 89,42%.
Os valores obtidos estão de acordo com os valores de TPSA preditos pela
extensão da regra de Lipinski (Tabela 3), pois, para fármacos com boa
permeabilidade oral, baixos valores de TPSA são necessários, além de ligações
rotacionais abaixo de 10 que melhoram a flexibilidade molecular (HASSAN et
al., 2015). Estes dados também corroboram com os dados já obtidos na tabela
6, que indicam uma boa permeabilidade celular e absorção oral. A BHE representa uma superfície que controla a troca de compostos
entre o sangue e o cérebro, dificultando a entrada de compostos hidrofílicos
pelas células endoteliais e capilares cerebrais (TRIFUNOVIĆ et al., 2016). Para
compostos que devem atuar no SNC, a penetração por esta barreira é crucial
(KOVAČEVIĆ et al., 2014). A permeação pela BHE de fármacos foi predita
103
também pelo programa PreADMET. Valores positivos descrevem a possível
passagem pela barreira, enquanto que valores negativos indicam a incapacidade
do composto de acender ao cérebro. A tabela 5 mostra os valores da predição
farmacocinética para BHE. Todos os compostos apresentaram valores positivos, indicando que possuem capacidade para permeação pela BHE, sendo
que os compostos D3 e D4 foram os que mais se aproximaram do fármaco
fenobarbital.
O programa PreADMET também prediz resultados para
mutagenicidade e carcinogenicidade, como a ferramenta OSIRIS. Observa-se
que os resultados não são equivalentes para ambos os programas. Pelo OSIRIS,
os compostos TZDs não apresentaram perfil tóxico, enquanto que o
fenobarbital se mostrou tóxico ao sistema reprodutor, mutagênico e
carcinogênico. Pelo software PreADMET, todos os compostos investigados por
este trabalho se mostraram mutagênicos, carcionogênicos em camundongos e
sem risco de carcinogenicidade em ratos; ao passo que o fármaco fenobarbital
também foi mutagênico e carcinogênico. Deste modo, são necessárias investigações mais detalhadas para determinar a real toxicidade dos compostos.
Tabela 5. Parâmetros farmacocinéticos (ADMET) dos compostos tiazolidinodiônicos calculados pelo software PreADMET.
5.1.2.4 Descritores físico-químicos e farmacocinéticos utilizados na predição
da permeabilidade no SNC dos compostos TZDs
Assim como para permeabilidade oral, a predição in sílico é fundamental para auxiliar cientistas na seleção de compostos com potencial
ação no SNC, após a determinação teórica de propriedades físico-químicas e
farmacocinéticas, também em programas computacionais online baseados em
perfis de fármacos comerciais (ZHANG et al., 2016). Como descrito no item
3.5.2, os descritores moleculares que podem afetar a permeação no cérebro
incluem LogP, MM, TPSA, doadores e aceptores de ligações de hidrogênio,
Parâmetros A1 D1 D2 D3 D4 Fnb
AIH (%) 95,22 95,39 95,39 95,37 95,35 89,42
BHE 0,21 0,23 0,34 0,45 0,42 0,50
TA M M M M M M
PC +C/-R +C/-R +C/-R +C/-R +C/-R + Legenda: AIH - absorção no intestino humano (%); BHE - penetração na barreira
hematoencefálica in vivo (concentração cérebro/concentração sangue); TA - Teste de Ames (M =
mutagênico / --- = não mutagênico); PC - potencial carcinogênico em camundongosC ou ratosR (+
= positivo/ - = negativo); Fnb - Fenobarbital.
104
ligações rotacionais, ligação a proteínas plasmáticas e LogD (GELDENHUYS
et al., 2015; GOLANI; GOLANI, 2015; ZHANG et al., 2016).
Como na regra de Lipinski e extensão de seus parâmetros (ver tabela
6), a lipofilicidade, mencionada pelo LogP, é considerada como parâmetro para permeabilidade no SNC. Neste caso, segundo Lipinski (2004), se LogP é
positivo, então o composto pode ser ativo no SNC. Os valores também se
enquadram nos valores recomendados para fármacos do SNC, que são entre 1-4
de acordo com Eigenmann et al. (2016). Quanto à MM, os resultados obtidos
também se enquadram nos valores estabelecidos para fármacos que atuam no
SNC, onde é considerado o valor de até 450 g/mol para boa permeabilidade
pela BHE, de acordo com os autores Clark (2003) e Pajouhesh e Lenz (2005).
Mensch e colaboradores (2009) identificaram como descritores de
forte influência o número de doadores e aceptores de hidrogênio, além do
TPSA, assim como Geldenhuys et al. (2015). De acordo com estudos
científicos da literatura, valores de TPSA até 90 Å2 indicam a probabilidade de
penetração pela BHE (CLARK, 2003; PAJOUHESH; LENZ, 2005). Em 2002, Mahar Doan e colaboradores realizaram experimentos bioquímicos e
computacionais de 48 fármacos para o SNC e 45 para outros fins terapêuticos.
Nestes estudos, os pesquisadores observaram que os valores de TPSA para os
compostos do SNC podem variar entre 4,63 e 108 Å2. O valor de TPSA de
todos os compostos testados foi de 96,10 Å2, indicando boa permeabilidade
celular oral e, por apresentarem valores muito próximos a 90 Å2, e estarem na
faixa estipulada por Mahar Doan et al. (2002), indicam capacidade para
penetração na BHE. Zhang et al. (2016) também analisaram 54 fármacos
comerciais do SNC em ratos e verificaram que a maioria dos compostos tinha
TPSA <100. Segundo Geldenhuys et al. (2015) e Mensch e colaboradores
(2009), espera-se que um composto seja rapidamente permeável ao SNC se possuírem <3 doadores de H e <7 aceptores. Estes valores também corroboram
com resultados obtidos pela predição computacional dos compostos, no qual o
resultado foi 2 e 6, respectivamente. No mesmo estudo de Zhang et al. (2016), a
maioria dos 54 fármacos comerciais do SNC apresentaram número de aceptores
de hidrogênio entre 1 e 6. Ainda, Segundo Pajouhesh e Lenz (2005), o valor
máximo de 8 ligações rotacionais deve ser considerado para fármacos com ação
central, no qual a predição dos compostos também se encaixa, enfatizando a
probabilidade de atuar no SNC.
Como mencionado anteriormente, a lipofilicidade é questão
fundamental na absorção de fármacos e permeabilidade pela BHE. Muitos dos
fármacos são ácidos ou básicos, e dependendo do pH, se apresentam
fisiologicamente na forma ionizada. Para isto, outro parâmetro pode ser considerado como indicativo de boa permeabilidade. O LogD é utilizado para
descrever o logarítmo do coeficiente de distribuição de um fármaco ionizável,
ou seja, é o LogP em determinado pH. Normalmente o pH considerado para
105
permeabilidade de fármacos para o SNC é 7,4 (ALLEN-JR, 2016). Para uma
melhor permeação do cérebro e para uma boa permeabilidade intestinal, os
valores de LogD têm de ser maiores do que 0 e inferiores a 3 (CLARK, 2003;
PAJOUHESH; LENZ, 2005). Os valores de LogD foram obtidos a partir do programa PreADMET, e variaram entre 2,54 e 3,58, conforme Tabela 6. Os
resultados obtidos para os compostos A1, D1 e D2 se mostraram dentro do valor
estimado por Clark (2003) e Pajouhesh; Lenz (2005). Os compostos D3 e D4
apresentaram valores superiores a 3, mas de acordo com o estudo realizado por
Mahar Doan et al. (2002), a faixa para a penetração pela BHE de compostos do
SNC encontrada foi -1,34 e 6,57 (ver tabela 1), portanto, estes cálculos
teóricos, podem indicar que os compostos possuam capacidade para atravessar
a BHE.
Outros fatores que influenciam a permeabilidade são a ligação à
proteínas plasmáticas e seu metabolismo. Fármacos que atuam no SNC
normalmente ligam-se à albumina do plasma e à glicoproteína P. Conforme
descrito na revisão da literatura, os fármacos SNC não devem sofrer inibição da glicoproteína-P e não ser um bom ligante de albumina sérica, pois pode haver a
redução de fármaco disponível para a atividade farmacológica (GOLANI;
GOLANI, 2015; PAJOUHESH; LENZ, 2005). Os resultados, também
calculados pelo software PreADMET, estão descritos na tabela 6. Percebe-se
que os resultados de inibição da glicoproteína P corroboram com o descrito na
literatura, mas a ligação dos compostos à albumina é elevada, o que pode
implicar na redução do seu potencial. Nota-se também, que dentre os
compostos estudados, o que apresentou menor valor em relação a este
parâmetro foi o composto D4, que corrobora com os resultados observados nos
testes in vivo.
Alguns parâmetros ADME, incluindo avaliações do citocromo P, podem ser realizadas em testes de triagem. As CYP constituem a família mais
importante de enzimas de biotransformação envolvidas no metabolismo de
fármacos, e possuem função importante na disposição dos fármacos e nos seus
efeitos. As isoformas mais conhecidas são CYP3A4, CYP2C9, CYP2D6,
CYP1A2 e CYP2C19. Para boa absorção oral, um fármaco voltado ao SNC
bem sucedido não deve ter metabolismo CYP2D6 significativo e ser um indutor
não potencial de CYP3A4 (GOLANI; GOLANI, 2015; PAJOUHESH; LENZ,
2005). Os resultados demonstrados na tabela 6, corroboram com os dados
descritos na literatura, pois os compostos não apresentam metabolismo via
CYP2D6 e não são indutores da enzima CYP3A4, de acordo com resultados
computacionais teóricos, indicando possível permeação oral e pela BHE.
106
Tabela 6. Parâmetros farmacocinéticos considerados para boa permeabilidade
no sistema nervoso central.
LogD Indução
CYP3A4
Metabolismo
CYP2D6
Ligação à
albumina (%)
Inibição
glicoproteína-P
Valor
estimado* 0 – 3 FRACA NÃO BAIXA NÃO
A1 2,54 NÃO NÃO 98,69 NÃO
D1 2,52 NÃO NÃO 100 NÃO
D2 2,67 FRACA NÃO 100 NÃO
D3 3,13 FRACA NÃO 96,39 NÃO
D4 3,58 FRACA NÃO 95,97 NÃO
Legenda: LogD: coeficiente de distribuição.
*Valores estimados por autores citados no texto.
A partir da avaliação in sílico, pode-se perceber a importância da
utilização das ferramentas computacionais na compreensão das características
físico-químicas e farmacológicas no desenvolvimento de novas substâncias
candidatas a fármacos (MIGNANI et al., 2016a; RITCHIE; MACDONALD,
2014), e que os resultados aqui apresentados demonstram a possibilidade das
moléculas em estudo atuarem no SNC.
5.2 Atividade anticonvulsivante
Os derivados TZDs sintetizados foram estudados inicialmente em
parceria com as acadêmicas do Curso de Farmácia, Cristiani Vanessa Ternus e
Maria Tereza Dalla Vecchia, para a avaliação da possível atividade
anticonvulsivante, considerando que compostos contendo o núcleo TZD
demonstraram resultados importantes e promissores contra CEs (KORMANN,
2013; SHYAM; DEBNATH; DEVBHUTI, 2016).
5.2.1 Avaliação dos efeitos dos compostos em estudo nos testes de convulsão
induzida por pentilenotetrazol e estricnina
O PTZ (6,7,8,9-tetrahidro-5H-tetrazol-[1,5-a]azepina) (Figura 23), utilizado inicialmente na década de 1920 (OFFORD; ISOM, 2016), é um dos
principais indutores de crises convulsivas agudas ou crônicas, utilizados em
testes experimentais de epilepsia. Trata-se de um farmacóforo que contém em
sua estrutura um anel tetrazol, altamente eficaz, encontrado em diversos
compostos farmacêuticos no mercado. Além da atividade convulsiva, derivados
107
tetrazólicos possuem atividades biológicas como atividades hipotensivas,
antimicrobianas, citostáticas e outras. A introdução de um anel tetrazol em uma
molécula conduz a estruturas mais eficazes, com um aumento no
prolongamento da ação destes fármacos. O PTZ é constituído por um anel tetrazol condensado a um anel de 7 membros, capaz de formar ligações
intermoleculares de hidrogênio com seus sítios ativos (OSTROVSKII;
TRIFONOV; POPOVA, 2012).
A ação convulsiva do PTZ se dá por sua capacidade de reduzir a
atividade inibitória dos receptores GABAA no SNC. O antagonismo destes
receptores dá origem a crises generalizadas do tipo ausência ou mioclônicas e
crises tônico-clônicas, de aproximadamente 5 minutos com rigidez de cauda,
extensão corporal e morte (HAHN; BURRELL, 2015; KUMAR; LALITHA;
MISHRA, 2014; KUMAR et al., 2016).
Figura 23. Estrutura química do pentilenotetrazol (PTZ).
6
10
7
9
8
N1
5
N4
N3
N2
Fonte: OSTROVSKII; TRIFONOV; POPOVA, 2012.
No teste de convulsão induzida por PTZ através da administração via
i.p., o composto D4 aumentou a latência para as crises de maneira
estatisticamente significativa (p<0,001) quando comparado ao controle
negativo (Figura 24). A porcentagem de latência para a crise foi de 51,98% em
relação ao controle, mas o tratamento com o composto D4 não protegeu os
animais contra a letalidade, uma vez que os animais não sobreviveram às crises
induzidas por PTZ. Assim como o tratamento com D4, os animais submetidos
ao tratamento com gabapentina tiveram um aumento de 44,06% (p<0,05) na latência para as crises, embora também não foram protegidos contra a
letalidade.
108
Figura 24. Efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo (10 mg/Kg, i.p.), da gabapentina (20 mg/Kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste de convulsão induzida por pentilenotetrazol.
C Gabap. Fnb. A1 D1 D2 D3 D4
0
100
200
300
400
***
***
*
Tratamentos (10 mg/Kg, i.p.)
PTZ (85 mg/Kg, i.p.)
La
tên
cia
pa
ra
cri
ses
(s)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média do tempo
de latência para crises (s) de 8 a 10 animais por grupo. Os asteriscos denotam significância
estatística quando comparados ao grupo controle (salina) (C) (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Os
dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de
Tukey. Siglas: C – controle, Gabap. – Gabapentina, Fnb – Fenobarbital, PTZ – Pentilenotetrazol.
A gabapentina é um fármaco análogo estrutural do GABA (Figura 23),
ou seja, mimetiza a estrutura GABAérgica (OFFORD; ISOM, 2016; WANKA;
IQBAL; SCHREINER, 2013). Segundo Wanka, Iqbal e Schreiner (2013),
interage com a subunidade α2-δ dos canais de Ca++ voltagem-dependentes,
reduzindo sua concentração, com consequente modulação da liberação de
neurotransmissores e CEs. Foi desenvolvida com características químicas
lipofílicas para que pudesse atravessar facilmente a BHE e desempenhar seus
efeitos no SNC. A gabapentina tem ação anticonvulsivante em testes
experimentais de convulsão induzida por PTZ e STR e também é ativa em
testes de convulsão induzida por eletrochoque (OFFORD; ISOM, 2016). Diferentemente do tratamento com o composto D4 e com a
gabapentina, o tratamento com o fenobarbital foi capaz de proteger os animais
das crises convulsivas. O fenobarbital, quimicamente chamado de ácido 5-etil-
5-fenilbarbitúrico (Figura 25), é um barbitúrico anticonvulsivante utilizado
comercialmente há mais de 100 anos. Este fármaco reduz a gravidade e o
número de CEs tônico-clônicas, generalizadas e parciais, atuando sobre
receptores GABAA, intensificando a abertura dos canais de Cl- e
109
hiperpolarização neuronal, diminuindo a excitabilidade da célula alvo
(STABILE; BARNETT, 2017).
Figura 25. Estrutura química do ácido gama-aminobutírico (GABA), da gabapentina e do fenobarbital.
NH2
OH
ONH2
OH
O
GABA Gabapentina
NH
NH
O
O
O CH3
Fenobarbital
Fonte: NCBI, 2016; OFFORD; ISOM, 2016.
Os resultados descritos acima corroboram com os resultados
demonstrados na literatura, pela qual observa-se uma gama de estudos que
comprovam o uso eficaz das TZDs em testes de indução química de
convulsões. Shyam, Debnath e Devbhuti (2016) fizeram uma revisão da
literatura e demonstram que uma série de derivados TZDs apresentam potencial
anticonvulsivante, inclusive alguns compostos possuem atividade superior à da
fenitoína. Patil et al. (2015) afirmou que os compostos TZDs testados exibiram
proteção contra as CEs induzidas por PTZ em até 80%. Payandemehr e
colaboradores (2015) estudaram um canabinóide sintético conhecido como
mesilato Win 55, 212-2, que possivelmente medeia as atividades dos receptores
PPARs envolvidas em funções do SNC. Assim como as TZDs, o “Win” apresenta atividade agonista PPARs e, portanto, apresentou aumento
significativo do limiar convulsivo de animais submetidos ao teste do PTZ.
Estes mesmos autores, Moezi et al. (2015), Ranade (2013) e Wong et al.
(2015), afirmaram que também há o aumento do limiar convulsivo através da
redução da hiperexcitabilidade neuronal pela administração de pioglitazona e
rosiglitazona, fármacos pertencentes a classe das TZDs, também agonistas
PPARs, que eram utilizados por sua ação hipoglicemiante.
Outro indutor de convulsão utilizado neste estudo foi a STR, um
alcaloide natural de núcleo indólico monoterpênico, obtido a partir das
sementes secas de Strychnos nux-vomicaum. A STR, utilizada também em testes animais de epilepsia, é um indutor de crises convulsivas intensas,
caracterizadas apenas por extensões tônicas, capaz de reduzir a atividade
inibitória do SNC pelo antagonismo de receptores de glicina (SOLIMAN et al.,
2016).
110
Neste teste, os compostos D1, D2, D3 e D4, quando administrados via
i.p. na dose de 10 mg/Kg, produziram um aumento da latência da crise
convulsiva induzida pela STR, de forma estatisticamente significativa (p<0,01;
p<0,001; p<0,05; p<0,01), quando comparados com o grupo controle (salina) (Figura 26). A porcentagem de latência calculada para as crises convulsivas foi
de 49,59% para D1, 54,81% para D2, 47,07% para D3 e 51,67% para D4, em
relação ao controle. A porcentagem de latência calculada para os compostos em
estudo foi muito próxima as porcentagens de latência obtidas pela
administração da gabapentina, que foi 50,98% (p<0,01) e pela administração de
fenobarbital, que foi 48,26% (p<0,05) em relação ao grupo controle.
Assim como nos testes de convulsão induzida por PTZ, observa-se na
literatura estudos que apontam o uso eficaz das TZDs em testes de indução
química por STR. O resultado obtido neste estudo corrobora com os resultados
demonstrados na literatura, pela qual Wong et al. (2015) indicam a supressão
das descargas epileptiformes e a inibição significativa da liberação pré-
sináptica do neurotransmissor glutamatérgico, mediada pela ativação de receptores PPARs através da administração da rosiglitazona.
Figura 26. Efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo (10 mg/Kg, i.p.), da gabapentina (20 mg/Kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste de convulsão induzida por estricnina.
C Gabap. Fnb. A1 D1 D2 D3 D4
0
50
100
150
200
***
********
Tratamentos (10 mg/Kg, i.p.)
STR (4 mg/Kg, i.p.)
Latê
nci
a p
ara c
rise
s (s
)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média do tempo
de latência para crises (s) de 8 a 10 animais por grupo. Os asteriscos denotam significância
estatística quando comparados ao grupo controle (salina) (C) (p*<0,05; **p<0,01). Os dados foram
submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C –
controle, Gabap. – Gabapentina, Fnb – Fenobarbital, STR – Estricnina.
111
5.2.2 Avaliação do efeito anticonvulsivante dos compostos em estudo no teste
de convulsão induzida eletricamente
O teste de ECM foi desenvolvido para avaliar a eficácia
anticonvulsivante de compostos químicos em 1946, por Merritt e Putnam. A
partir de uma corrente elétrica administrada na cavidade auricular dos animais,
há a indução das CEs caracterizadas por extensão tônica das patas traseiras
(TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016; YACUBIAN, 2014). O teste de indução
elétrica é utilizado em testes experimentais para mimetizar CEs generalizadas
do tipo tônico-clônicas. O teste também é requerido junto aos órgãos de
aprovação de fármacos como antiepilépticos (JACKSON et al., 2016).
A incidência de crises foi reduzida em 70, 15, 55 e 65% em animais
tratados com carbamazepina, A1, D1 e D4, respectivamente, quando comparados
ao grupo controle. Grupos tratados com os compostos D2 e D3 tiveram 100% de
crises (Figura 27A). Foi observada diminuição significativa da duração da extensão tônica do membro posterior dos animais pelos tratamentos com
carbamazepina (p<0,001), compostos A1 (p<0,05), D1 (p<0,01) e D4
(p<0,0001), com porcentagens de 45,22, 34,78, 42,61 e 53,04%,
respectivamente, também em relação ao grupo controle (Figura 27B).
Segundo Vengurlekar, Sharma e Trivedi (2012), assim como nos testes
de indução química de convulsões, as TZDs apresentam efeito
anticonvulsivante em testes de indução elétrica de convulsões. Nos resultados
descritos acima, observou-se que a administração do composto D4 aumentou o
limiar convulsivo dos animais, corroborando com os dados encontrados na
literatura, na qual o estímulo elétrico é utilizado como indutor da crise
convulsiva.
112
Figura 27. Efeito dos compostos A1, D1, D2, D3 e D4 (10 mg/Kg, i.p.) e da carbamazepina (20 mg/Kg, i.p.) sobre a porcentagem de crise (A) e duração da extensão clônica dos membros posteriores dos animais (B) submetidos ao teste de convulsão ECM.
(A)
C Carb. A1 D1 D2 D3 D4
0
50
100
150% de crises
% de inibição das crises
Tratamentos (10 mg/Kg, i.p.)
Cri
ses
(%)
(B)
C Carb. A1 D1 D2 D3 D4
0
5
10
15
****
******
Tratamentos (10 mg/Kg, i.p.)
Du
raçã
o e
xte
nsã
o
tôn
ica d
o m
emb
ro p
ost
eri
or (
s)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média de 10
animais por grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparados ao grupo
controle (salina) (C) (****p<0,0001; ***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05). Os dados foram submetidos
à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C – controle,
Carb. – Carbamazepina.
113
5.2.3 Escolha do composto efetivo nos testes de convulsão induzida
quimicamente e eletricamente
Com os resultados descritos acima, a substância D4 foi escolhida para
continuidade dos testes, pois foi o único composto que apresentou efeito
anticonvulsivante nos testes de indução química por PTZ e STR, e elétrica.
Assim, foram realizados testes de indução química por PTZ pela administração
do composto D4 nas doses de 3, 10 e 30 mg/Kg, i.p., para avaliação do efeito
dose-resposta. Conforme demonstrado na figura 28, não houve efeito contra a
epileptogênese na dose de 3 mg/Kg, i.p., mas houve um aumento significativo
do limiar convulsivo nas doses de 10 (p<0,01) e 30 (p<0,001) mg/Kg, i.p., em
comparação com o controle. O limiar das crises aumentou em 40,49% para 10
mg/Kg, i.p., e 51,22% para 30 mg/Kg, i.p. Embora houve aumento da resposta
na dose de 30 mg/Kg, i.p., não houve diferença significativa entre as doses,
somente em relação ao veículo (salina). Desta forma, a dose de 10 mg/Kg, i.p. foi a escolhida para o prosseguimento dos experimentos com administração do
composto pela via i.p.
Figura 28. Efeito do composto D4 nas doses de 3, 10 e 30 mg/Kg, i.p., sobre a latência da crise convulsiva no teste de convulsão induzida por PTZ.
C 3 10 300
80
160
**
***
D4 (mg/Kg, i.p.)
PTZ (85 mg/Kg, i.p.)
Latê
nci
a p
ara
cri
ses
(s)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média do tempo
de latência (s) para crises de 10 animais por grupo. Os asteriscos denotam significância estatística
quando comparados ao grupo controle (salina) (C) (**p<0,01; ***p<0,001). Os dados foram
submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C –
controle, PTZ – Pentilenotetrazol.
114
5.2.4 Avaliação do efeito anticonvulsivante do composto D4 no teste de
convulsão induzida quimicamente por pentilenotetrazol administrado por via
oral
Conforme descrito no item 4.2.4, a atividade anticonvulsivante do
composto D4 foi avaliada também pela administração por v.o., a fim de
verificar se o composto é absorvido pelo trato gastrointestinal. De acordo com
os resultados das análises in sílico realizadas e descritas anteriormente, a figura
29 demonstra que o composto D4 é capaz de atravessar as membranas lipídicas
intestinais e atuar em seu sítio alvo. O limiar convulsivo dos animais tratados
com o composto D4 (100 mg/Kg, v.o.) aumentou em 24,31% em relação ao
grupo dos animais tratados somente com veículo (salina). O fenobarbital,
utilizado como controle positivo neste experimento, foi capaz de proteger os
animais das CEs, uma vez que estes não apresentaram CEs dentro de 24 horas. Os resultados foram apresentados com tempo máximo de 180 segundos para
melhor visualização.
Os resultados obtidos neste estudo corroboram com dados descritos na
literatura, já que os compostos que atuam em receptores PPARs demonstram
atividade farmacológica através de administração v.o. em experimentos
científicos publicados. A pioglitazona foi testada por Barbiero et al. (2014) e
Lalouxa e colaboradores (2012) no desenvolvimento de terapias
neuroprotetoras para a doença de Alzheimer. Os autores observaram atividade
neuroprotetora após a administração por gavagem, reforçando a possibilidade
de boa permeabilidade deste composto pelas membranas biológicas e sua
utilização oral.
115
Figura 29. Efeito anticonvulsivante do composto D4 (100 mg/Kg, v.o.) e do fenobarbital (100 mg/Kg, v.o.) no teste de convulsão induzida por pentilenotetrazol.
C D4 Fenobarbital0
50
100
150
200
**
***
###
PTZ (85 mg/Kg, i.p.)
100 mg/Kg, v.o.
La
tên
cia
pa
ra c
rise
(s)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média do tempo
de latência para crises (s) de 10 animais por grupo. Os asteriscos denotam significância estatística
quando comparados ao grupo controle (C) (salina) (**p<0,01; ***p<0,001). Sustenidos denotam
significância estatística quando comparados ao grupo D4 (###p<0.001). Os dados foram submetidos
à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C – controle,
PTZ – Pentilenotetrazol.
5.2.4 Avaliação do efeito do composto D4 sobre os parâmetros
comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field).
O teste conhecido como CA permite a avaliação de comportamentos emocionais, exploração de novos ambientes e atividade locomotora dos
animais. Segundo Bailey e Crawley (2009), o teste fornece também subsídios
comportamentais para a avaliação de parâmetros relacionados a ansiedade, que
pode ser influenciada por fatores como o isolamento social resultante da
separação física do animal e seus companheiros durante o teste, e o estresse
criado pelo novo ambiente, iluminado e desprotegido (BAILEY; CRAWLEY,
2009; HOLZMANN et al., 2011; TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016).
Naturalmente, os roedores possuem preferência por áreas protegidas,
explorando, por um período significativamente maior, a periferia da arena,
geralmente em contato com as paredes. Os roedores que permanecem mais
tempo explorando áreas centrais desprotegidas apresentam comportamento
ansioso (BAILEY; CRAWLEY, 2009; TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016). Neste contexto, avaliam-se variáveis como números de cruzamentos (crossings)
e atividade exploratória (rearings).
116
A avaliação dos efeitos do composto D4 em animais submetidos ao CA
mostrou que não houve influência significativa sobre a atividade motora dos
animais, já que os números de crossings e rearings entre tratamento e controle
permaneceram semelhantes (Tabela 7). O efeito do composto D4 sobre os parâmetros comportamentais dos
animais obtidos neste estudo estão de acordo com os resultados obtidos em
estudos científicos. Park et al. (2007) realizou uma pesquisa na qual comprovou
que o tratamento com agonistas PPARs, como a rosiglitazona e pioglitazona,
melhoram a função motora. Salehi-Sadaghiani et al. (2012) estudou compostos
TZDs e observou uma redução significativa no tempo de imobilidade sem
alterações significativas no comportamento locomotor dos animais tratados.
Assim como os dados destes estudos, os autores Shahsavarian et al. (2014) e
Pérez e Quintanill (2015) também reforçaram que a administração de derivados
TZDs não altera a atividade locomotora.
Tabela 7. Efeitos do composto D4 avaliados no teste do Open Field.
Tratamento Latência do
movimento (s)
Comportamento
exploratório
(rearing)
Número de
cruzamentos
(crossing)
Controle negativo 4 56 127
D4 3mg/Kg, i.p. 2 53 115
D4 10mg/Kg, i.p. 4 53 121
D4 30mg/Kg, i.p. 3 45 123
Resultados apresentados como média. Cada linha representa 8 animais por grupo. Os dados
foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey.
5.2.4 Avaliação do efeito do composto D4 sobre a memória através da esquiva
inibitória (EI)
Testes experimentais baseados no aprendizado de tarefas
comportamentais são utilizados para o esclarecimento de mecanismos
envolvidos em processos de memória. Dentre os testes convencionais e
amplamente utilizados, a esquiva inibitória ou esquiva passiva, é um teste de
memória de aprendizagem rápida, que envolve sessões de teste e treino.
Conforme item 4.2.7, o animal aprende que, ao descer de uma plataforma,
recebe um choque, reprimindo a tendência natural dos roedores em explorar o
ambiente além da plataforma (IZQUIERDO; FURINI; MYSKIW, 2016; KÖHLER, 2012). Replicando à humanos, a EI representa uma forma de
memória utilizada para questões de sobrevivência, por exemplo: nós humanos
passamos por um processo de aprendizagem quando colocamos nosso dedo em
117
uma tomada elétrica (IZQUIERDO; FURINI; MYSKIW, 2016; KÖHLER,
2012).
Os processos envolvidos na formação da memória estão bem
estabelecidos na literatura. As vias glutamatérgica e GABAérgica podem estar envolvidas no processo de consolidação de memória. De maneira geral, através
de receptores metabotrópicos e ionotrópicos do tipo NMDA e AMPA, o
neurotransmissor GLU induz ao aumento dos níveis intracelulares de Ca++ com
consequente alterações na morfologia e composição de neurônios envolvidos
no aprendizado. A ativação de receptores NMDA no hipocampo, na amígadala
e em outras áreas cerebrais, regulam processo de plasticidade neural, na fase de
consolidação da memória (FABBRI et al., 2016).
Estudos também indicam que a ativação do sistema GABAérgico, via
receptor GABAA, pode diminuir a consolidação da memória (KÖHLER, 2012).
Descobertas como estas foram fundamentais na elucidação dos efeitos dos
barbitúricos e benzodiazepínicos, que, pela potencialização dos receptores
GABAA, podem dificultar o processo de aprendizagem e memória (FORSAN, 2010; KÖHLER, 2012). A exemplo, o flumazenil, antagonista GABAérgico, é
usado na reversão dos efeitos psicomotores, amnésicos e sedativos adversos dos
benzodiazepínicos (RAUT; BOLEGAVE; MARATHE, 2016).
Compostos hipnóticos e anticonvulsivantes podem exercer efeitos
negativos sobre a memória. Substâncias psicoativas, como os
benzodiazepínicos, classe terapêutica de fármacos utilizados na terapia da
epilepsia, ansiedade e insônia, causam déficits de memória (amnésia
anterógrada) em humanos e em testes animais experimentais (LEÃO et al.,
2016).
Neste contexto, tratamentos com fármacos e compostos químicos em
desenvolvimento podem também afetar o processo de consolidação da memória, portanto, o teste de esquiva inibitória foi escolhido para investigar
possíveis efeitos sobre a memória dos animais tratados com o composto D4.
Após a sessão de treino e a administração de 10 mg/Kg, i.p. da
substância D4, foram avaliados possíveis efeitos sobre a consolidação da
memória de longa duração nos animais. De acordo com a Figura 30, os
resultados demonstraram que o composto não tem efeito negativo sobre a
memória, já que a latência do teste não foi significativamente diferente do
grupo controle.
O tratamento com compostos TZDs mostra uma melhora significativa
na memória de acordo com alguns pesquisadores. Heneka, Fink e Doblhammer
(2015) verificaram que agonistas PPARs melhoram o aprendizado em pacientes
com demência e doença de Alzheimer, e reduzem a formação das placas β-amilóides, responsáveis pela manifestação da doença. Pérez e Quintanill (2015)
relataram que animais tratados com rosiglitazona mostraram uma melhoria
significativa na aprendizagem e na tarefa de memória. Segundo ele, este efeito
118
está relacionado com a regulação da via de sinalização da insulina, que envolve
a redução na expressão de alguns mediadores celulares, e melhora o
comprometimento induzido pelas placas β-amilóides. Em animais os efeitos
nootrópicos de TDZs também é observado. Em nossos laboratórios, análogos das TDZs foram testados em animais com doença de Alzheimer induzida pela
estreptozotocina e por peptídeo amiloide Aβ 1-42, e mostraram efeitos
superiores à rivastigmina e galantamina (SILVA et al., 2014, resultados não
publicados).
Figura 30. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) sobre a consolidação da memória no teste de esquiva inibitória.
C treino C teste D4 treino D4 teste0
50
100
150
200
La
tên
cia
de
des
cid
a (s
)
Cada coluna representa a mediana dos experimentos seguidos dos intervalos interquativos (25 e
75). Os dados foram submetidos à análise de variância não paramétrica de uma via (Kruslkal-
Wallis) e teste de comparações múltiplas Dunns. Sigla: C – controle.
5.2.5 Avaliação do efeito do composto D4 sobre parâmetros de ansiedade
através do teste do labirinto em cruz elevado (LCE) (Plus-maze)
Os anticonvulsivantes utilizados na terapêutica da epilepsia podem
alterar parâmetros de ansiedade, tornando-se ansiolíticos ou ansiogênicos. Os
agonistas diretos do receptor GABAA como os benzodiazepínicos podem ser
ansiolíticos (HUANG et al., 2016), enquanto que carbamazepina tem um perfil ansiogênico. Para verificar se o composto D4 exibia tais efeitos, foi utilizado no
presente estudo o teste do LCE, conhecido também como plus–maze.
Desenvolvido por Handley e Mithani (CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ,
2012), o teste de plus-maze é utilizado há vários anos para a avaliação de
parâmetros comportamentais de ansiedade. É um teste etológico que se baseia
na tendência natural de roedores em explorar novos ambientes (BAILEY;
CRAWLEY, 2009; CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012). O aparato é
feito de madeira, e possui braços abertos e fechados em forma de cruz. Os
119
animais, durante a execução do teste, têm a opção de permanecerem nos braços
abertos e desprotegidos do labirinto, ou nos braços fechados e protegidos, que
são elevados do chão (BAILEY; CRAWLEY, 2009; TERNUS; DALLA-
VECCHIA, 2016). Normalmente, os animais tendem a evitar áreas abertas, iluminadas, preferindo os braços fechados. Portanto, a porcentagem de entrada
e o tempo de permanência nos braços abertos representam efeito ansiolítico.
Neste contexto, a administração de ansiolíticos e benzodiazepínicos promove
diminuição da ansiedade nos animais, resultando em aumento de transições
entre os compartimentos, sem afetar a atividade locomotora geral (BAILEY;
CRAWLEY, 2009; CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012; TERNUS;
DALLA-VECCHIA, 2016).
De acordo com os estudos realizados, o tratamento dos animais com o
composto D4 (10 mg/Kg, i.p.), em relação ao grupo controle, aumentou
significativamente a frequência de entrada dos animais nos braços abertos do
labirinto, em torno de 49,74% (p<0,05), (Figura 31A), enquanto que o
tratamento com DZP (0,75 mg/Kg, i.p.), controle positivo, promoveu um aumento da frequência de entrada nos braços abertos de 67,35% (p<0,0001). O
tempo de permanência nos braços abertos dos animais tratados com D4 também
aumentou de maneira significativa quando comparado ao grupo controle, em
torno de 59,52% (p<0,05) (Figura 31B). Nos animais tratados com DZP,
observou-se um aumento de 76,22% (p<0,0001).
O efeito de derivados TZDs sobre a ansiedade foi avaliado em teste
LCE em estudos anteriores. De acordo com Kurhe e Mahesh (2016), a
pioglitazona eleva a frequência de entrada e o tempo gasto nos braços abertos
do labirinto, na depressão induzida por estresse em camundongos obesos. Domi
et al. (2016) também estudaram e afirmaram que os compostos TZDs reduzem
comportamentos relacionados a ansiedade em testes experimentais. Estes dados demonstram que os resultados obtidos pelos testes farmacológicos realizados
neste estudo corroboram com os dados científicos já descritos na literatura.
120
Figura 31. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e diazepam (DZP) (0,75 mg/Kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais: (A) frequência de entradas nos braços abertos; e (B) tempo de permanência nos braços abertos, de animais submetidos ao plus-maze.
(A) (B)
C D4 (10 mg/Kg) DZP (0,75 mg/Kg)0
20
40
60
80
*
****
Tratamento i.p.
Fre
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ência
de e
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bra
ço
s a
bert
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oplu
s-m
aze
C D4 (10 mg/Kg) DZP (0,75 mg/Kg)0
20
40
60
80
100
*
****
Tratamento i.p.
Tem
po
de
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ma
nên
cia
no
s b
raço
s a
bert
os
do
plu
s-m
aze
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa a média de 10
animais por grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparados ao grupo
controle (salina) (C) (*p<0,05; ****p<0,0001). Os dados foram submetidos à análise de variância
ANOVA de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C – controle, DZP – Diazepam.
5.2.6 Avaliação do efeito do composto D4 sobre o sono através da indução do
sono por barbitúricos (MSB)
A sonolência também é um dos efeitos colaterais observados com o
tratamento de anticonvulsivantes (HUANG et al., 2016). Desta forma no
presente estudo, o efeito hipnótico do composto D4 foi avaliado através de um
teste farmacológico específico para esse fim, o teste de indução do sono por
barbitúricos. Sintetizados em 1864 por Adolph von Baeyer, os barbitúricos são
conhecidos e utilizados por suas propriedades anticonvulsivantes e hipnóticas
(ELLENS; FIGUEROA; CLARK, 2015; TERNUS; DALLA-VECCHIA,
2016). De maneira geral, os barbitúricos como o tiopental, fármaco escolhido
para o teste, induzem o sono por atuar em receptores GABAA em sítios de
ligação diferentes dos benzodiazepínicos (FALUDI et al., 2016; WALLE et al.,
2014).
Como demostra a figura 32, o composto D4 (10 mg/Kg i.p.) no teste de indução do sono por tiopental promoveu a redução da latência para o sono em
38,30% (p<0,01), e o DZP (p<0,001) em 44,85% (Figura 32A) e o aumento do
tempo total do sono em 35,95% (p<0,001), enquanto o DZP (p<0,001) em
62,29% (Figura 32B), conferindo possível efeito hipnótico ao composto em
estudo.
Como mencionado anteriormente, Patil et al. (2015) avaliaram
derivados TZDs quanto à proteção das CEs e, corroborando com os resultados
deste estudo, os compostos por eles estudados, apresentaram capacidade para
potencializar a hipnose induzida por barbitúricos em animais. Segundo os
121
autores, o aumento total do sono variou de 10 ± 3 min nos animais do grupo
controle e 98,6 ± 10 min em animais pré-tratados com as TZDs. Outro estudo
bastante recente de Duhart e colaboradores (2016) revelou propriedades
sedativas e hipnóticas de compostos TZDs. Estes autores sintetizaram e avaliaram o perfil tóxico dos compostos e observaram que derivados TZDs
exibiram efeito sedativo-hipnótico e alguns animais manifestaram letargia
grave com extremidades cianóticas após a administração de doses superiores a
700 mg/Kg v.o., doses estas muito superiores as usadas no presente estudo.
O efeito hipnótico de fármacos anticonvulsivantes pode ser
considerado vantajoso ou não, dependendo do tipo de CE a que ele será
indicado e, muitas vezes, está relacionado à dosagem utilizada e ao mecanismo
de ação farmacodinâmico, que independente do mecanismo apresentado, de
uma forma geral, deprimem o SNC (HUANG et al., 2016). No presente estudo,
o composto D4 demonstrou tanto a propriedade hipnótica, quanto sedativa,
apresentando um padrão de resposta muito parecido aos anticonvulsivantes
utilizados na clínica. Figura 32. Efeito do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) sobre: (A) latência do sono e (B) tempo total de sono, no teste de sono induzido por barbitúrico.
(A) (B)
C D4 (10 mg/Kg) DZP (2 mg/Kg)0
50
100
150
200
250
*****
Tiopental (30 mg/Kg, i.p.)
La
tên
cia
pa
ra o
so
no
(s)
C D4 (10 mg/Kg) DZP (2 mg/Kg)0
5000
10000
15000
***
***
Tiopental (30 mg/Kg, i.p.)
Tem
po t
ota
l d
e so
no (
s)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna do gráfico A, representa o
tempo de latência para sono (s), e do gráfico B, o tempo total de sono (s) de 10 animais por grupo.
Os asteriscos denotam significância estatística quando comparados ao grupo controle (salina) (C)
(**p<0,01, ***p<0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via
seguido pelo post-hoc de Tukey. Siglas: C – controle, DZP – Diazepam.
5.3 Mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4
Para avaliação do mecanismo de ação, a dose escolhida do composto
D4 foi a dose 10 mg/Kg, i.p., pois os efeitos obtidos com 10 ou 30 mg/Kg, i.p.
não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. Ambas as doses
tiveram eficácia anticonvulsivante.
122
5.3.1 Influência da via GABAérgica sobre a propriedade anticonvulsivante do
composto D4
Os anticonvulsivantes disponíveis para o tratamento de pacientes
epilépticos podem atuar através da via GABAérgica. Desta forma optou-se in
vivo, investigar a influência dessa via no mecanismo de ação do composto D4.
O GABA exibe papel preponderante como neurotransmissor inibitório no SNC
e sua função é antagônica a função do GLU, o qual é excitatório. Fármacos
como fenobarbital, diazepam, vigabatrina, valproato e benzodiazepínicos atuam
sobre a via GABAérgica, ora inibindo a degradação do GABA via
GABAtransaminase, ora inibindo a sua receptação via GAT1 (transportador
GABAérgico), ora aumentando a condutância do Cl- no receptor GABAA como
agonistas (ABOU-KHALIL; FAAN, 2016).
Com esse intuito, procurou-se avaliar a via GABAérgica, sobretudo a
influência do receptor GABAA, utilizando o flumazenil (antagonista dos sítios de ação dos benzodiazepínicos no receptor GABAA) e se o mesmo poderia
interferir no efeito do composto D4.
O flumazenil é um imidazobenzodiazepínico, se comporta como um
antagonista benzodiazepínico específico e foi descoberto por Hoffman e
Warren, (1993). O flumazenil se liga com alta afinidade a locais específicos
sobre o receptor GABA, onde impede a ligação e os efeitos hipnóticos dos
benzodiazepínicos. Em estudos realizados em animais, o flumazenil não
influenciou nos efeitos de substâncias que não demonstram afinidades pelos
receptores benzodiazepínicos, como por exemplo, barbitúricos, etanol,
meprobamato, GABA-miméticos e agonistas de receptores de adenosina.
Entretanto, são bloqueados os efeitos de agonistas não benzodiazepínicos dos receptores benzodiazepínicos, tais como as ciclopirrolonas (zopiclona, por
exemplo) e as triazolopiridazinas. Em estudo pré-clínicos, o flumazenil é usado
para avaliação do envolvimento do receptor GABAA no mecanismo de ação de
compostos sintéticos e naturais (RAINES, 2017).
123
Figura 33. Influência da via GABAérgica sobre o efeito anticonvulsivante do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.).
Salina Flumazenil (2 mg/Kg, i.p.)0
20
40
60
80
100Controle
D4 (10 mg/Kg)**
La
tên
cia
pa
ra c
rise
(s)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa 10 animais por
grupo. Os asteriscos denotam significância (**p<0,01). Os dados foram submetidos à análise de
variância ANOVA de duas vias seguido pelo post-hoc de Tukey.
Com relação à via GABAérgica investigada, a análise da figura 33
mostra que o composto D4 promoveu o aumento do limiar convulsivo dos
animais em 37,61% em relação ao controle/salina, de forma estatisticamente
significante (p<0,01), replicando o efeito anticonvulsivante demonstrado nos
resultados anteriores. Porém, de forma não esperada (uma vez que o composto
D4 mostrou-se hipnótico e ansiolítico), os dados demonstram também que o
pré-tratamento dos animais com flumazenil não reverteu esse efeito, sugerindo
que a via GABAérgica, via receptor GABAA, parece não estar envolvida no mecanismo de ação do composto em estudo.
De fato, até o momento não foi encontrada na literatura nenhuma
relação direta entre a classe das TDZs com o sitesma GABAérgico, tampouco
com os receptores PPARs e esse sistema. A relação entre o efeito
anticonvulsivante das TDZs e o envolvimento dos receptores PPARs na
epilepsia envolvem as vias oxidonitérgica (MOHAZAB et al., 2012) e
glutamatérgica (WONG et al., 2015), bem como a atenuação do estresse
oxidativo (YU et al., 2008) e neuroinflamação (OKADA et al., 2006). A partir
destes resultados, não foi possível afirmar que os receptores PPARs estão
envolvidos no mecanismo de ação do efeito anticonvulsivante do composto D4.
Para isto, é necessário realizar estudos que avaliem diretamente a atividade destes receptores, como, por exemplo, com a administração de antagonistas
PPARs. Utilizando antagonistas PPARs, como o GW-9662, pode-se avaliar se
o efeito anticonvulsivante do composto D4 é dependende ou independente da
atividade dos receptores PPARs. Assim, a atividade independente do receptor
PPAR é suportada pelo fato de a reversão do efeito anticonvulsivante do
124
composto D4 não ser inibida pelo GW-9662, e vice-versa (COSTELLO;
O’LEARY; HERRON, 2005; WONG et al., 2015).
5.3.2 Influência da via glutamatérgica sobre a propriedade anticonvulsivante
do composto D4
O sistema glutamatérgico é outro alvo de investigação no
mecanismo de ação de FAEs. Como já reportado anteriormente, o GLU é o
principal neurotransmissor excitatório do SNC e desempenha papel importante
no mecanismo de doenças neurológicas (FORMAN et al., 2009; VALLI;
SOBRINHO, 2014; WERNER; COVEÑAS, 2015). Atua sobre dois diferentes
tipos de receptores: ionotrópicos, subdivididos em receptores do tipo NMDA,
KA e AMPA (HADZIC; JACK; WAHLE, 2017); e metabotrópicos (FORMAN
et al., 2009; WERNER; COVEÑAS, 2015). Os receptores ionotrópicos são responsáveis pelas respostas
excitatórias rápidas e ao serem ativados, permitem o fluxo de íons Na+, K+ e
Ca++ através das membranas plasmáticas. De acordo com o que é reportado na
literatura, o aumento da concentração dos níveis de Ca++ intracelular participa
de eventos de hiperexcitabilidade que ocorre em processos convulsivos.
Portanto, defeitos de função de canais iônicos podem estar associados a formas
de epilepsia. Fármacos anticonvulsivantes utilizados na clínica podem envolver
mecanismos de inibição do sistema glutamatérgico, como por exemplo o
felbamato, a acetazolamida e o topiramato (FORMAN et al., 2009; VALLI;
SOBRINHO, 2014).
No presente estudo, a ketamina foi utilizada para investigar o
envolvimento do receptor NMDA no mecanismo de ação do composto D4. A ketamina, também conhecida como cetamina, quetamina ou Special K, é um
anestésico dissociativo que às vezes é utilizado para produzir sono profundo. O
fármaco foi desenvolvido em 1963 como um substituto para a fenilciclidina
(PCP). Na maioria das vezes, a ketamina é utilizada em medicina veterinária
como um tranquilizante de animais, no entanto, também pode ser utilizada em
medicina humana como um anestésico ou em episódios de depressão (AMIRI
et al., 2016). Seus efeitos no SNC se dão pelo antagonismo de receptores
glutamatérgicos do tipo NMDA (MOHSENI et al., 2016).
Analisando a figura 34, verifica-se que o composto D4, aumenta o
limiar convulsivo dos animais em torno de 33,63% em relação ao veículo.
Além disso, pode-se observar que o efeito anticonvulsivante do composto D4 não foi revertido, mas potencializou o efeito anticonvulsivante com o pré-
tratamento com a ketamina (antagonista seletivo dos receptores NMDA).
Portanto, o sistema glutamatérgico, via participação do receptor NMDA, pode
estar envolvido no mecanismo de ação do composto D4, já que, em estudos
125
anteriores, a inibição da liberação pré-sináptica do GLU pela administração de
TZDs foi observada (WONG et al., 2015).
O resultado obtido no presente estudo com relação à via
glutamatérgica, era o esperado. Geralmente, compostos sintéticos ou naturais, que exibem efeito anticonvulsivante pela via glutamatérgica, atuam bloqueando
o receptor NMDA, ou seja, comportam-se como antagonistas desse receptor ou
de outros receptores glutamatérgicos (WHITE; BARKER-HALISKI, 2016).
Espera-se que o bloqueio dos receptores glutamatérgicos diminuam a excitação
cerebral induzida pelo GLU, e em contrapartida, melhorem, consequentemente,
a inibição GABAérgica. De fato, fármacos antivonvulsivantes como o
felbamato, bloqueiam diretamente os receptores NMDA, enquanto que o
topiramato, bloqueia receptores AMPA (STRIANO et al., 2016). Entretanto, a
via glutamatérgica é bastante complexa, e o efeito anticonvulsivante dos
fármacos nessa via não se restringe somente ao bloqueio de receptores.
Fármacos como a carbamazepina e fenitoína, por exemplo, não são
antagonistas glutamatérgicos, mas inibem os disparos elétricos de neurônios glutamatérgicos bloqueando canais de Na+, impedindo assim, a propagação do
impulso nervoso. A gabapentina, por sua vez, bloqueia canais de Ca++ voltagem
dependentes de neurônios glutamatérgicos, bloqueando desta forma, a liberação
de GLU (VALLI; SOBRINHO, 2014).
Na literatura, tem sido reportado que as TDZs, como a rosiglitazona,
suprimem as descargas epileptiformes mediadas pelo receptor NMDA por
inibição da liberação de GLU pré-sináptico. Os autores reportam que em testes
in vitro, a rosiglitazona protegeu fatias do hipocampo de ratos da
excitotoxicidade provocada pela ativação de receptores NMDA, parcialmente
pela ativação de receptores PPARγ, sugerindo que a rosiglitazona pode ser um
agente potencial para tratar pacientes com CEs do lobo temporal (WONG et al., 2015).
126
Figura 34. Influência da via glutamatérgica sobre o efeito anticonvulsivante do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.).
Salina Ketamina (0,5 mg/Kg, i.p.)0
50
100
150Controle
D4 10 mg/Kg
****
**
*
*
La
tên
cia
pa
ra c
rise
(s)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa 10 animais por
grupo. Os asteriscos denotam significância estatística (*p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001). Os
dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de duas vias seguido pelo post-hoc de
Tukey.
5.3.3 Influência da via oxidonitrérgica sobre a propriedade anticonvulsivante
do composto D4
O envolvimento da via oxidonitrérgica nos mecanismos indutores de
CEs e no mecanismo de ação dos FAEs tem sido estudado por muitos
pesquisadores. O NO é conhecido por ser um neuromodulador que participa de
vários processos fisiológicos no SNC, como a percepção da dor, plasticidade
neuronal, memória e comportamento. Além disso, o NO também está envolvido
em processos neurodegenerativos patológicos, como na doença de Alzheimer,
doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose múltipla e, claro, na epilepsia. O NO atua como um mensageiro neuronal intracelular no cérebro e é
um modulador da susceptibilidade a convulsões com efeitos anticonvulsivantes
e/ou pró-convulsivos (GOYA et al., 2006; MOHAZAB et al., 2012). Os níveis
elevados de NO em todas as regiões cerebrais, especialmente no córtex
temporal, contribuem para o limiar de convulsões induzidas por PTZ
(GOOSHE et al., 2017).
Em adição, estudos científicos demonstram que o NO pode estar
aumentado no cérebro de animais que forem tratados com PTZ e há uma forte
atuação do NO no hipocampo e em outras regiões do cérebro de animais após a
127
indução de CEs. Este excesso de NO pode dar origem a formação do ONOO-,
radical livre extremamente potente que pode levar à apoptose celular
(MOHAZAB et al., 2012).
Como descrito, o NO é sintetizado a partir do aminoácido L-arginina pelas enzimas NOSs e pode ser inibido por análogos da L-arginina, como o L-
NAME (MOHAZAB et al., 2012; ZHU et al., 2016).
No presente estudo, o possível envolvimento da via oxidonitrérgica no
mecanismo de ação da propriedade anticonvulsivante do composto D4 foi
investigado utilizando o L-NAME (inibidor não seletivo da NOS), a L-arginina
(precursor do NO) e o 7-NI (inibidor seletivo da nNOS), administrados antes da
administração do composto D4. Os resultados expressos na figura 33
demonstram que o composto D4 aumentou de forma estatisticamente
significativa (p<0,01) o limiar convulsivo dos animais em relação ao veículo
(salina), confirmando o efeito anticonvulsivante obtido nos resultados
anteriores nas três situações apresentadas (Figura 35 A, B e C). Os resultados
também demonstram que houve redução não significativa do limiar convulsivo dos animais pré-tratados com L-arginina e L-NAME e, nos animais pré-tratados
com 7-NI houve redução estatisticamente significativa do limiar convulsivo,
conforme visualizados na figura 35 A, B e C, respectivamente, em relação aos
animais tratados somente com o composto D4, sugerindo, portanto, o
envolvimento da via oxidonitrérgica no mecanismo de ação do efeito
anticonvulsivante do composto D4. O aumento dos níveis de NO pela
administração prévia de L-arginina revertem o efeito do composto, sugerindo
que a dose de L-arginina usada é suficiente para alterar as concentrações de NO
no cérebro dos animais de forma que o efeito anticonvulsivante seja alterado.
Da mesma forma, a administração prévia de L-NAME nos animais também
reverteu o efeito anticonvulsivante do composto, corroborando com os resultados obtidos pela administração prévia de 7-NI no mesmo experimento,
bem como resultados já descritos na literatura. No estudo de Mohazab e
colaboradores (2012), os pesquisadores observaram que o L-NAME reverteu
significativamente o efeito anticonvulsivante da pioglitazona, e reforçaram a
ideia de que o fármaco pode ser um adjuvante útil no tratamento da convulsão.
Allami et al. (2011) relataram que o efeito neuroprotetor dos agonistas
de PPARs em crises convulsivas se deve, pelo menos em parte, pela supressão
de NO e pode ser revertido por um gerador de NO, como a L-arginina. Os
autores afirmam também que a atenuação da síntese de NO está entre os vários
mecanismos pelos quais os agonistas de PPARs reduzem a neuroinflamação,
causa de diversos processos patológicos do SNC, como a epilepsia. Como já
reportado, o NO está envolvido em processos patológicos neurodegenerativos e/ou neuropsicológicos. As TZDs, por exemplo, melhoram a cognição nos
estágios iniciais da doença de Alzheimer, a partir da diminuição no acúmulo de
placas senis e da reação inflamatória na glia, o que resulta em neuroproteção
128
(GRAY et al., 2012). Sadaghiani et al. (2011) estudaram a co-administração de
pioglitazona com inibidores da NOS, como o L-NAME e com o precursor de
NO, L-arginina, e observaram a reversão significativa do efeito antidepressivo
da pioglitazona. Um estudo bastante recente de Mansouri et al. (2017) evidenciou que
os agonistas de PPARγ podem inibir a expressão da enzima NOS e
consequentemente reduzir a produção de NO. Pode-se propor, portanto, que as
vias PPARγ e oxidonitrérgica podem interagir em conjunto na modulação de
algumas condições fisiológicas e/ou fisiopatológicas.
129
Figura 35. Influência da via oxidonitrérgica sobre o efeito anticonvulsivante do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.).
(A)
(B) Salina L-arginina
0
20
40
60
80
100Controle
D4 10 mg/Kg
**
*
**
La
tên
cia
pa
ra c
rise
(s)
(C) Salina L-NAME
0
20
40
60
80
100Controle
D4 10 mg/Kg
***
***
La
tên
cia
pa
ra c
rise
(s)
Salina 7-NI
0
20
40
60
80Controle
D4 10 mg/Kg**
*
*
*
La
tên
cia
pa
ra c
rise
(s)
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Cada coluna representa 10 animais por
grupo. Os asteriscos denotam significância estatística (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Os dados
foram submetidos à análise de variância ANOVA de duas vias seguido pelo post-hoc de Tukey.
130
5.4 Avaliação do tratamento subcrônico com o composto D4
5.4.1 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 sobre os parâmetros
comportamentais avaliados no teste de campo aberto (Open Field)
Compostos que atuam no SNC, utilizados no tratamento de desordens
psiquiátricas, como no caso da epilepsia, quando administrados
subcronicamente, podem produzir alterações neuroquímicas e comportamentais
em roedores (ENKEL; THOMAS; BARTSCH, 2013). Assim, se faz importante
a investigação da influência do tratamento subcrônico de compostos em estudo
com ação no SNC.
Para a avaliação dos efeitos comportamentais emocionais, exploração
de novos ambientes e atividade locomotora (BAILEY; CRAWLEY, 2009;
HOLZMANN et al., 2011; TERNUS; DALLA-VECCHIA, 2016), os animais foram submetidos ao teste CA no 20º dia de tratamento com o composto D4.
De acordo com a figura 36, pelos resultados demonstrados é possível
observar que os roedores deram preferência por áreas protegidas, explorando
durante maior período de tempo as áreas em contato com as paredes e, portanto,
o tratamento subcrônico não influenciou significativamente a atividade motora
dos animais, já que os números de crossings (A) e rearings (B), entre
tratamento e controle, permaneceram semelhantes.
Assim como no teste agudo do CA descrito anteriormente, o efeito do
composto D4 sobre os parâmetros motores dos animais obtidos neste estudo
estão de acordo com os resultados descritos na literatura, no qual Park et al.
(2007), Pérez e Quintanill (2015), Salehi-Sadaghiani et al. (2012) e
Shahsavarian et al. (2014) relataram que o tratamento com compostos agonistas PPARs não influenciam a atividade locomotora.
131
Figura 36. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros comportamentais avaliados no teste Open Field.
(A) (B)
C D4 Fenobarbital0
50
100
150
Nú
mer
o d
e cr
oss
ings
C D4 Fenobarbital0
20
40
60
80
Nú
mer
o d
ere
arin
gs
Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 8 animais por
grupo. Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-
hoc de Tukey.
5.4.2 Avaliação do efeito subcrônico do composto D4 no teste de convulsão
induzida por PTZ
As TZDs, agonistas PPARs (ver item 3.6.1), apresentam benefícios em
vários testes de doenças do SNC (MOEZI et al., 2015; SHYAM; DEBNATH;
DEVBHUTI, 2016). A ação antiepiléptica das TZDs, a partir de testes com a pioglitazona, foi relatada pela primeira vez por Okada, Yamashita e Tsuji
(2006) em tratamento agudo e crônico no teste de convulsão induzida por PTZ,
antagonista GABAérgico (ver item 4.2.1).
Segundo Moezi e colaboradores (2015), a pioglitazona reduz o tempo
de latência para CEs e encurta a duração da convulsão em roedores. De acordo
com Okada, Yamashita e Tsuji (2006), a pioglitazona reduz o fenômeno
epiléptico pela inibição de citocinas inflamatórias envolvidas na patogenia da
doença.
Pela constatação de que o tratamento com TZDs induz efeito
anticonvulsivo em testes de convulsões de PTZ agudos e crônicos, no presente
estudo, animais foram tratados com o composto D4 por 21 dias, para a observação do tempo de latência para a primeira crise convulsiva e número de
óbitos.
No teste de convulsão induzida por PTZ em administração subcrônica
com o composto D4, houve aumento significativo (p<0,01) do limiar
convulsivo em 28,82% quando comparado ao controle negativo e 42,35%
(p<0,001) quando comparado ao fenobarbital, fármaco utilizado como controle
positivo (Figura 37).
Com base em estudos da literatura científica, compostos que contém o
núcleo TZD possuem ação anticonvulsivante em tratamento agudo e crônico
132
(MOEZI et al., 2015; PATIL et al., 2015; PAYANDEMEHR et al., 2015;
RANADE, 2013; SHYAM; DEBNATH; DEVBHUTI, 2016; WONG et al.,
2015). Nos estudos realizados pelos autores, revelou-se um efeito
anticonvulsivo significativo da pioglitazona nas doses 10 e 20 mg/Kg em testes de convulsão induzida por PTZ, administradas cronicamente pelas vias
intravenosa e intraperitoneal. Ranade (2013) verificou a ação anticonvulsivante
PPARγ da pioglitazona em testes in vitro e correlacionou este resultado com a
redução crônica da hiperexcitabilidade in vivo. O efeito anticonvulsivante
subcrônico pela administração com o composto D4 corroboram com os
resultados apresentados acima, onde observou-se que sua utilização apresenta
potencial anticonvulsivo tanto em testes agudos, quanto em testes subcrônicos.
Figura 37. Efeito anticonvulsivante subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) no teste de convulsão induzida por PTZ.
C D4 Fenobarbital0
50
100
150
**
###
Latê
nci
a p
ara
cri
ses
(s)
Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 8 a 10 animais por
grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparada ao grupo controle (salina)
(C) (**p<0,01). Sustenidos denotam significância estatística quando comparada ao grupo
fenobarbital (###p<0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via
seguido pelo post-hoc de Tukey.
5.4.3 Análise do plasma de animais tratados subcronicamente com o
composto D4
Antes de um medicamento ser efetivamente usado clinicamente, seus
efeitos tóxicos devem ser avaliados. Alterações em parâmetros bioquímicos
estão bastante relacionados com a toxicidade de produtos químicos e fármacos.
Portanto, estes parâmetros se fazem extremamente necessários na avaliação de
alterações toxicológicas induzidas por tratamentos farmacológicos
(ORLANDINI, 2012). Os exames bioquímicos são utilizados como indicadores de resposta a
alterações endógenas e como biomarcadores diagnósticos. Têm a finalidade de
avaliar alterações em funções metabólicas desempenhadas por órgãos e tecidos,
133
identificar alterações patológicas de animais de laboratório e realizar
acompanhamento terapêutico e/ou procedimentos experimentais. Os ensaios
bioquímicos disponíveis avaliam funções renais, hepáticas, pancreáticas e
cardíacas, além de alterações na homeostase eletrolítica e endócrina (ARAÚJO, 2012; BRANCO, et al., 2011; SASIDHARAN et al., 2015).
Todos os parâmetros bioquímicos avaliados no plasma dos animais
devem ser comparados aos grupos controle e a valores de referência (VR) para
cada espécie animal utilizada, e então interpretados. Na literatura, dados sobre
os VR para animais de laboratório, especialmente camundongos Swiss, são
limitados. Os valores podem variar dependendo das condições a que os animais
são submetidos. Portanto, cada biotério deve padronizar e estabelecer seus
valores conforme as espécies utilizadas. Além disso, os valores podem ser
discrepantes entre estudos da literatura, pois muitos analisam um número
pequeno de animais ou parâmetros, utilizam metodologias e equipamentos
diferentes, e os resultados são influenciados por fatores como coleta, idade,
sexo e nível de estresse (ARAÚJO, 2012; ORLANDINI, 2012; SPINELLI et al., 2014).
Neste estudo, os animais foram avaliados para a determinação de
possíveis alterações bioquímicas relacionadas ao uso subcrônico do composto
D4 e os resultados foram comparados com o grupo controle. Foram também
selecionadas duas referências para comparação dos resultados, conforme tabela
8.
Tabela 8. Valores de referência de parâmetros bioquímicos plasmáticos em camundongos Swiss.
Parâmetro bioquímico Valor de referência (VR)
SPINELLI et al., 2012 ARAÚJO, 2012
ALT/TGP 15,03 – 33,37 U/L 41 U/L
AST/TGO 21,97 – 44,03 U/L 152 U/L
FALC - 141,8-248,4 U/L
PT 47,38 – 47,78 mg/dL 5,22 g/dL
URE 12,93 – 23,71 mg/dL 20,7 mg/dL
CRE 0,10 – 0,18 mg/dL 0,28 mg/dL
GLI 62,38 – 88,02 md/dL -
CPK - - ALT/TGP: alanina aminotransferase; AST/TGO: aspartato aminotransferase; FALC: fosfatase
alcalina; PT: proteínas totais; URE: ureia; CRE: creatinina; GLI: glicose; CPK:
creatinofosfoquinase.
5.4.3.1 Avaliação de parâmetros hepáticos
O fígado é o órgão responsável por várias funções vitais do organismo.
As células hepáticas, chamadas hepatócitos, são capazes de sintetizar
134
substâncias como albumina, fibrinogênio, α e β-globulinas, lipoproteínas e
colesterol. Além disso, possuem a função excretora relacionada a síntese e
secreção de substâncias à bile (LOPES; BIONDO; SANTOS, 2007).
Alguns testes bioquímicos podem ser utilizados para avaliar a função hepática como: dosagens de ALT/TGP, AST/TGO, fosfatase alcalina, gama-
glutamiltransferase, bilirrubina, entre outros. A liberação destas substâncias
pode ocorrer por alterações como reações inflamatórias, degeneração celular,
cirrose crônica e ingestão de substâncias hepatotóxicas (LOPES; BIONDO;
SANTOS, 2007; SASIDHARAN et al., 2015).
As aminotransferases são enzimas intracelulares que realizam a
conversão de aminoácidos pela transferência de grupamentos amina. A enzima
ALT é uma transaminase encontrada abundantemente no fígado e em menores
quantidades no rim e na musculatura esquelética, utilizada para a determinação
de lesões hepáticas, já que é liberada por hepatócitos lesados. A AST é
encontrada em órgãos e tecidos como o coração, fígado, músculo esquelético e
eritrócitos. O aumento desta enzima é indicativo de lesões hepáticas mais profundas, pois está presente no citoplasma e mitocôndrias. A redução das
enzimas ALT e AST não possui significado clínico (LOPES; BIONDO;
SANTOS, 2007; SPINELLI et al., 2014).
A fosfatase alcalina é uma enzima mitocondrial presente em tecidos
ósseos, sistema hepatobiliar e mucosa gastrointestinal, além de rins, placenta e
baço. Seu aumento também pode indicar dano hepático (LOPES; BIONDO;
SANTOS, 2007), mas as maiores elevações nos níveis de fosfatase alcalina
ocorrem nos casos de obstrução do trato biliar que pode ser induzida por
medicamentos (COSTA et al., 2012).
Outra enzima utilizada como marcador em desordens hepáticas é a
gama-glutamiltransferase (LOPES; BIONDO; SANTOS, 2007). Além das enzimas, substâncias como as bilirrubinas podem estar
envolvidas em processos patológicos hepáticos. A bilirrubina é um pigmento
biliar resultante do metabolismo da hemoglobina e deve ser conjugada ao ácido
glicurônico nos hepatócitos para sua excreção. Seu aumento pode ser
caracterizado pela icterícia e ser decorrente de alterações hepáticas, aumento de
produção ou redução de excreção e doenças extra-hepáticas, como doenças
pancreáticas (COSTA et al., 2012; LOPES; BIONDO; SANTOS, 2007).
O fígado está envolvido em diversas funções celulares, como catálise
de reações bioquímicas, regulação de hormônios, coagulação sanguínea, defesa
humoral e como carreadores de constituintes plasmáticos (LOPES; BIONDO;
SANTOS, 2007).
As TZDs, especialmente a rosiglitazona e troglitazona, foram associadas a hepatotoxicidade e a efeitos colaterais cardiovasculares, causa da
sua retirada do mercado nos EUA (DUHART et al., 2016). Por isso, foram
realizadas dosagens de parâmetros bioquímicos hepáticos como AST, ALT,
135
fosfatase alcalina e proteínas totais. Nenhuma diferença estatisticamente
significativa pôde ser observada com a administração subcrônica do composto
D4 para os valores de AST e fosfatase alcalina. Os valores de AST variaram
entre 197,80±19,63 U/L para o grupo controle, 191,20±70,79 U/L para D4 e 184,00±28,51 U/L para o fenobarbital. Já os valores de fosfatase alcalina foram
257,00±30,15 U/L, 180,00±60,82 U/L e 208,80±39,74 U/L, para os grupos
controle, D4 e fenobarbital respectivamente. Nota-se uma discrepância entre os
valores de referência citados por Spinelli et al. (2012) e Araújo (2012) para
valores de AST. Nossos resultados corroboram com o VR de Araújo (2012).
Houve também uma redução estatisticamente significativa (p<0,05) (30%) para
valores de ALT, quando comparados ao controle. Os valores obtidos foram
43,33±4,46 U/L para controle, 33,33±8,26 U/L para D4 e 41,60±5,37 U/L para
fenobarbital, mas, estes resultados estão de acordo com Araújo (2012).
Conforme relatado anteriormente, a redução desta enzima não possui
significado clínico (LOPES; BIONDO; SANTOS, 2007; SPINELLI et al.,
2014). Embora os valores de PT terem sido menores que o VR citado por Araújo (2012), pode-se perceber que, o composto D4 aumentou de maneira
estatisticamente significativa (p<0,01), em torno de 31,13%, os valores de PT
(2,88±0,44 g/dL), enquanto que o fármaco de referência, fenobarbital,
aumentou 35,33% (p<0,001) (3,07±0,48 g/dL), em relação ao controle
(1,98±0,04 g/dL) (Figura 38). Segundo Ruiz-Giménez et al. (2010), em casos
de disfunção hepática, o metabolismo hepático de alguns FAEs pode ser
prejudicado, e pode haver hipoalbuminemia associada. Por esta razão, sugere-
se investigar os níveis de albumina no tratamento subcrônico com o composto
D4. Valores de gama-glutamiltransferase não foram obtidos devido a
linearidade do método. Sugere-se, portanto, que a partir destes resultados
obtidos não há alta possibilidade de hepatotoxicidade em tratamento subcrônico, embora sejam necessários aprofundamentos nos estudos
bioquímicos.
136
Figura 38. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros hepáticos avaliados no plasma.
Aspartato aminotransferase
C D4 Fenobarbital0
50
100
150
200
250
AS
T (
U/I
)
Alanina aminotransferase
C D4 Fenobarbital0
10
20
30
40
50
*
AL
T (
U/I
)
Fosfatase alcalina
C D4 Fenobarbital0
100
200
300
FA
LC
(U
/I)
Proteínas totais
C D4 Fenobarbital0
1
2
3
4
*****
PT
(g/d
L)
Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 6 animais por
grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparada ao grupo controle (salina)
(C) (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA
de uma via seguido pelo post-hoc de Tukey.
5.4.3.2 Avaliação de parâmetros renais
Os rins são os órgãos responsáveis pela manutenção da homeostase de
líquidos do organismo através da filtração sanguínea e produção da urina. É
através deles, que a maioria das substâncias exógenas e estranhas são eliminadas. As principais provas bioquímicas realizadas para a determinação da
função renal são as dosagens sérica/plasmática e urinária de ureia e creatinina
(COSTA et al., 2012; SASIDHARAN et al., 2015; SPINELLI et al., 2014).
A ureia é o principal produto do catabolismo de proteínas. Em
condições de comprometimento renal, a filtração glomerular diminui, levando
ao aumento dos níveis de ureia. A creatinina é resultado do metabolismo da
creatina e fosfocreatina muscular. É utilizada como parâmetro de filtração
glomerular, pois é totalmente excretada pelos glomérulos (OGNA et al., 2015;
SPINELLI et al., 2014).
137
Embora superiores aos VR dos autores acima citados, os valores de
ureia com a administração do composto D4 (34,66±13,54 mg/dL) e fenobarbital
(21,60±2,19 mg/dL) não foram estatisticamente diferentes do grupo controle
(30,60±6,54 mg/dL). Já para valores de creatinina, houve redução estatisticamente significativa, em torno de 42,86% (p<0,01) (0,19±0,02
mg/dL), dos resultados obtidos pela administração do composto D4, e 45,24%
para fenobarbital (p<0,001) (0,18±0,04 mg/dL), em relação ao grupo controle
(0,34±0,07 mg/dL) (Figura 39). A redução nos níveis plasmáticos de ureia e
creatinina não possuem significado clínico, e podem fornecer indícios de
melhora renal (COSTA et al., 2012). Os agonistas PPARs, como as TZDs
podem influenciar favoravelmente a hemodinâmica glomerular. Um exemplo é
a pioglitazona, que se mostrou nefroprotetora e preveniu a deterioração da
função renal (BENIGNI et al., 2006).
O reconhecimento de lesões renais requer a consideração de vários
fatores, incluindo avaliação de marcadores de lesão em testes de função renal,
concentrações de eletrólitos séricos, análise de urina e estudos de imagem renal. Estes marcadores podem sugerir que lesões renais estão presentes, mas não
necessariamente confirmam a presença de doenças renais (POLZIN, 2011). A
confirmação da presença de lesões renais deve ser baseada em avaliações de
plasma (ex: ureia e creatinina), juntamente com biomarcadores urinários (ex:
depuração de creatinina 24 horas) (CASTRO et al., 2014; DEVARAJAN;
MURRAY, 2014; OGNA et al., 2015). Considerando os resultados obtidos no
teste experimental deste estudo, sugere-se que, possivelmente, não há
sobrecarga renal na utilização subcrônica do composto D4, embora sejam
necessários estudos aprofundados para a avaliação dos níveis de creatinina e
sua excreção pela urina, a fim de se estimar o real potencial de ação do
composto sobre os rins.
Figura 39. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre parâmetros renais avaliados no plasma.
Ureia
C D4 Fenobarbital0
10
20
30
40
50
UR
E (
mg/d
L)
Creatinina
C D4 Fenobarbital0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
*****
CR
E (
mg/d
L)
Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 6 animais por
grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparada ao grupo controle (salina)
(C) (**p<0,01; ***p>0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma
via seguido pelo post-hoc de Tukey.
138
5.4.3.3 Outros parâmetros
O pâncreas participa do processo de manutenção do equilíbrio
nutricional do organismo, através do glucagon e insulina, produzidos respectivamente pelas células α e β das ilhotas de Langerhans. A glicose induz
a liberação de insulina a fim de manter a homeostase nutricional. Assim,
distúrbios pancreáticos podem levar ao aparecimento de doenças como o
diabetes mellitus (ARAÚJO, 2012; SPINELLI et al., 2012). Embora os
resultados de glicose se mostraram inferiores aos VR estabelecidos por Spinelli
et al. (2012), estes apresentaram aumento estatisticamente significativo dos
valores em relação ao controle (11,00±1,22 mg/dL), em torno de 53,78%
(p<0,001) (23,80±3,03 mg/dL) para o composto D4 e 50,75% (p<0,001)
(22,33±2,16 mg/dL) para o fenobarbital (Figura 40A).
O aumento dos níveis de glicose pode estar associado a alterações
originadas por estresse e metabólicas. Diversos estudos científicos relatam o aumento de glicose por episódios estressantes há vários anos. Mediada pelo
eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e pelo sistema simpato-adrenal, a
resposta neuroendócrina ao estresse é caracterizada por excessiva
gliconeogênese, glicogenólise e resistência à insulina (MARIK; BELLOMO,
2013). Segundo Banin (2011), Kubokawa et al. (1999) e Tanno; Marcondes
(2002), durante o estresse, ocorre a ativação do sistema nervoso simpático,
levando o hipotálamo a produzir Fatores de Liberação de Corticotropina (FLC),
que coordenam as respostas ao estresse. A partir daí, há a produção do
hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) que estimula a liberação dos
corticoesteróides, que, juntamente com a adrenalina e NA, atuam no fígado
para estimular a glicogenólise, elevando os níveis de glicose.
O grau de resposta ao estresse está relacionado à intensidade do agente estressor e também às espécies envolvidas. Além disso, o hormônio ACTH é
aumentado e possui ação mais prolongada em fêmeas do que em machos
(TANNO; MARCONDES, 2002). Assim, os níveis de glicose elevados neste
estudo podem estar relacionados ao estresse do processo de coleta do plasma e
ao sexo dos animais.
Como o aumento nos níveis de glicose também pode estar relacionado
a alterações metabólicas, baixa capacidade de captação e distúrbios na
gliconeogênse hepática (PÁDUA et al., 2009), sugere-se o aprofundamento das
análises e investigação da causa do aumento nos níveis glicêmicos do composto
D4.
É relatado na literatura que as TZDs estão relacionadas a efeitos adversos cardíacos (DUHART et al., 2016; ERDMANN; CHARBONNEL;
WILCOX, 2009). A creatinofosfoquinase é uma enzima presente em tecidos
musculares e, portanto, reflete índices de lesão muscular (SPINELLI et al.,
2012). Seus níveis elevados podem estar presentes em miocardites e infarto
139
agudo do miocárdio, por exemplo (ERDMANN; CHARBONNEL; WILCOX,
2009). Assim, a dosagem de creatinofosfoquinase foi realizada no plasma dos
animais para verificar possível aumento e indicativo de lesão cardíaca. Nenhum
autor acima citado estabeleceu o VR para creatinofosfoquinase, mas também não se observou diferença significativa em relação ao grupo controle
(7305,60±1299,48 U/L), após administração do D4 (8499,20±3270,83 U/L) e
fenobarbital (6868,00±2146,00 U/L) (Figura 40B). Vale ressaltar que a enzima
creatinofosfoquinase não é um marcador específico, e para isto, sugere-se que,
em estudos posteriores sejam avaliados os níveis de marcadores como
creatinoquinase-MB, troponina-1 e mioglobina, relacionados diretamente com
problemas cardíacos (ELSHAMA; EL-KENAWY; OSMAN, 2016).
Figura 40. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre glicose e creatinofosfoquinase avaliados no plasma.
(A) (B)
Glicose
C D4 Fenobarbital0
10
20
30
******
GL
I (m
g/d
L)
Creatinofosfoquinase
C D4 Fenobarbital0
5
10
15
CP
K (
U/I
)
Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 6 animais por
grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparada ao grupo controle (salina)
(C) (**p<0,01; ***p>0,001). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma
via seguido pelo post-hoc de Tukey.
5.4.4 Estresse oxidativo
O cérebro consome aproximadamente 20% do total de oxigênio do
organismo humano. Mais da metade desta energia consumida é utilizada para restaurar o potencial de repouso das células excitatórias. Sendo assim, o SNC
conta com um número bastante elevado de mitocôndrias, organela com função
extremamente importante na respiração celular. Por conta disso, o SNC está
fortemente susceptível a disfunções mitocondriais, que resultam na
desregulação da homeostase de Ca++ e da geração de EROs/ERNs, ambas
ligadas à neurotoxicidade, instalando-se o chamado estresse
oxidativo/nitrosativo (BHAT et al., 2015).
A produção excessiva de EROs/ERNs, pode também estar associada
ao processo de excitotoxicidade, fortemente relacionado com a epilepsia. O
140
aumento do GLU e os níveis de Ca++ levam a perda neuronal e instala-se o
processo de lesão oxidativa/nitrosativa. Conforme item 3.1.5.4, o estresse
oxidativo/nitrosativo causa efeitos negativos sobre a membrana celular,
proteínas e DNA, podendo levar ao processo de neurodegeneração (BHAT et al., 2015; MAIA, 2016; SULAKHIYA et al., 2015).
Segundo Ercegovac e colaboradores (2013), o equilíbrio antioxidante
na epilepsia não é apenas modulado pelas CEs, mas também pelos FAEs. Os
anticonvulsivantes utilizados na clínica, como carbamazepina, fenobarbital e
ácido valpróico podem gerar metabólitos reativos, provocando toxicidade
sistêmica (ERCEGOVAC et al., 2013). Há estudos controversos na literatura,
que relatam que os FAEs não influenciam os marcadores
oxidativos/nitrosativos e que são as CEs que induzem os danos (GULER et al.,
2016; MENON; RAMALINGAM; KUMAR, 2012).
Há relatos também de que os agonistas do receptor PPARγ diminuem
o estresse oxidativo/nitrosativo no SNC (POPA-WAGNER et al., 2013).
Assim, é importante que sejam realizados estudos relacionados ao estresse oxidativo/nitrosativo em compostos derivados das TZDs.
Como as EROs/ERNs podem estar envolvidas na fisiopatogenia da
epilepsia e o uso prolongado de FAEs pode provocar alterações nos radicais
livres, o composto D4 foi avaliado em testes ex vivo para a avaliação de dano
oxidativo/nitrosativo.
5.4.4.1 Quantificação dos níveis de GSH
Dentre os componentes que desempenham funções antioxidantes está
a GSH, a principal responsável pela defesa antioxidante intracelular não
enzimática no corpo. A glutationa oxidada (GSSG) é reduzida pela glutationa redutase, a GSR, utilizada como um dos marcadores de estresse oxidativo. O
desequilíbrio nesse sistema dá origem a alterações mitocondriais e danos
celulares, afetando a excitabilidade neuronal e, portanto, a CEs (RAJ;
GOTHANDAM, 2014).
Níveis reduzidos de GSH no homogenato cerebral podem indicar
danos do estresse oxidativo, assim como níveis elevados de GSH podem
indicar o favorecimento das defesas antioxidantes (MAIA, 2016; MARIANO,
2016).
A fim de analisar os níveis de GSH no tecido cerebral, animais foram
tratados por 21 dias para a determinação de possíveis danos oxidativos do
composto D4. A figura 41 mostra os resultados obtidos na quantificação dos níveis de GSH no tecido cerebral, mais especificamente no córtex e hipocampo.
Os gráficos mostram que não houve diferença significativa dos níveis de GSH
do composto D4 em relação ao controle. O mesmo resultado pode ser observado
no tratamento com fenobarbital, fármaco utilizado como controle positivo.
141
Em estudos anteriores aprovados cientificamente em periódicos,
autores relatam que o aumento de EROs/ERNs danificam estruturas celulares, e
compostos TZDs podem influenciar positivamente a atividade antioxidante. De
acordo com Pilipović e colaboradores (2015), a administração de uma dose única de pioglitazona aumenta significativamente a os níveis de GSH,
sugerindo que a pioglitazona, diminuiu o dano oxidativo cerebral. Os resultados
do presente estudo corroboram com os resultados de Pilipović et al. (2015) e de
Popa-Wagner et al. (2013) que também relatou o aumento dos níveis de GSH,
indicando que a administração subcrônica do composto D4, provavelmente
reduziu os danos oxidativos no cérebro dos animais. Figura 41. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis de glutationa reduzida (GSH).
C D4 Fenobarbital0
500
1000
1500
2000
GSH - Córtex
GS
H (
mg
/g t
ecid
o)
GSH - Hipocampo
C D4 Fenobarbital0
500
1000
1500
GS
H (
g/g
tecid
o)
Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 6 animais por
grupo. Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-
hoc de Dunnett.
5.4.4.2 Determinação de LOOH
As membranas celulares são constituídas por ácidos graxos poli-
insaturados, responsáveis por sua fluidez. Danos às camadas lipídicas celulares
podem gerar alterações estruturais e funcionais da célula. Algumas EROs/ERSs
podem abstrair átomos de hidrogênio destes ácidos graxos e dar origem ao
início do processo conhecido como peroxidação lipídica (LPO) (COBB; COLE,
2015; RAJ; GOTHANDAM, 2014). Em distúrbios neurodegenerativos, a
alteração da homeostase oxidativa resulta em produtos LPO acumulados,
chamados LOOH (COBB; COLE, 2015). Os produtos finais da decomposição
de LOOH incluem aldeídos altamente citotóxicos, como malonaldeído (MDA), acroleína, 4-hidroxi-2-trans-nonenal (HNE) e trans,trans-2,4-decadienal (DDE)
(RAJ; GOTHANDAM, 2014).
Pesquisadores têm procurado avaliar este processo e, para isto,
utilizam métodos que determinam os produtos da oxidação de lipídeos, como
indicadores da produção de EROs/ERSs (COBB; COLE, 2015). A importância
142
da determinação da presença destes produtos derivados da LPO se dá pela
citotoxicidade dos mesmos, que pode causar alterações celulares (ANDRADE,
2011). O aumento dos níveis de LOOH indica a presença de estresse oxidativo
(SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004; SILVA et al., 2015). A figura 42 mostra os resultados obtidos quanto a determinação dos
níveis de LOOH em tecido cerebral (córtex e hipocampo) de animais tratados
subcronicamente com o composto D4. Percebe-se através dos resultados, que no
córtex, os níveis de LOOH foram reduzidos em 47,13% em relação ao grupo
controle, de maneira estatisticamente significativa (p>0,05). Isso significa que
possivelmente houve uma redução do processo de estresse oxidativo nos
animais tratados, especificamente naquela região. Contrariamente, no
hipocampo houve um aumento significativo (p>0,01) de LOOH em 36,41% nos
animais tratados com o composto D4 e 38,05% com o fármaco de referência
fenobarbital, indicando possível aumento do estresse oxidativo nesta área
cerebral.
Com base na literatura, observa-se que derivados TZDs possuem capacidade de reduzir os danos oxidativos celulares. Baghcheghi et al. (2016)
estudaram os efeitos da pioglitazona e rosiglitazona em ratos hipotiroideanos e
observaram a redução da LPO cerebelar. Collino e colaboradores (2006)
afirmaram que a administração dos mesmos fármacos, pioglitazona e
rosiglitazona, 30 minutos antes da indução de lesão isquêmica, diminui
significativamente a produção de EROs/ERNs e, como consequência, a LPO.
Os níveis de MDA, um produto final do processo de LPO, mostraram-se
reduzidos em experimentos com animais após o tratamento com pioglitazona
(BUTTERFIELD; DOMENICO; BARONE, 2014; KAUNDAL et al., 2009),
sugerindo que os compostos TZDs possuem capacidade de aumentar os níveis
de antioxidantes endógenos, responsáveis pela redução no estresse oxidativo. Os resultados deste estudo mostraram uma redução significativa dos LOOH no
córtex, mas, contrariamente, elevaram seus níveis no hipocampo. Este dado é
compatível com os achados na literatura sobre o envolvimento da
pontencialização de longa duração (LTP) nos processos epileptogênicos
hipocampais. A LTP pode ser mediada pelo GLU, via receptores NMDA, e
também, pela modulação de NO. Agonistas NMDA promovem a estimulação
da LTP e o que ocorre é a manuntenção da excitabilidade nesta área do SNC,
originando o estatus do mal epiléptico (KULLMANN; ASZTELY; WALKER,
2000). Além disso, os resultados também sugerem que, em outros locais do
SNC, o efeito anticonvulsivante do composto D4 pode envolver outras vias de
neurotransmissão e, no hipocampo, ocorra estimulação da via glutamatérgica.
O composto D4 não se mostrou agonista do receptor NMDA, uma vez que o pré-tratamento com ketamina não reverteu seu efeito. Além disso, a LTP é
altamente sensível a NOS e à ação do NO, sendo possível a facilitação da LTP
por ligantes TZDs, como o composto D4, pela atuação através da via
143
oxidonitrérgica (CHONG et al., 2017; COSTELLO; O’LEARY; HERRON,
2005).
Figura 42. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) sobre os níveis de hidroperóxidos lipídicos (LOOH).
C D4 Fenobarbital0
1
2
3
4
*
LOOH - Córtex
LO
OH
(mm
ol/
mg
de
teci
do
)
C D4 Fenobarbital0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5**
LOOH - Hipocampo
**
LO
OH
(mm
ol/
mg
de t
eci
do
)
Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 6 animais por
grupo. Os asteriscos denotam significância estatística quando comparados ao grupo controle
(salina) (C) (*p<0,05; **p<0,01). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de
uma via seguido pelo post-hoc de Dunnett.
5.4.4.3 Determinação da atividade de SOD
O sistema antioxidante do corpo humano é constituído por diversas
enzimas que, por meio de mecanismos de prevenção, impedem e/ou controlam
a formação de radicais livres e espécies não-radicais, são responsáveis pela
manutenção do equilíbrio oxidativo/nitrosativo. Dentre as principais enzimas, a
SOD é responsável pela conversão do radical O2- em H2O2. Posteriormente,
outras enzimas, CAT e GPx convertem o H2O2 em água e oxigênio, reduzindo
os efeitos tóxicos (BARBOSA et al., 2010; RAMA; MANJABHAT, 2014;
RAJ; GOTHANDAM, 2014). O aumento da atividade da SOD reflete em um aumento da resistência ao estresse oxidativo ou aumento da geração de ânion
superóxido (SANTOS, 2013; TORSDOTTIR et al., 2010).
A figura 43 mostra os resultados obtidos na determinação da
atividade da SOD no córtex e no hipocampo de animais tratados
subcronicamente com o composto D4. Percebe-se que não houve aumento na
atividade da SOD, quando se comparam os resultados do tratamento com o
composto D4 com o controle negativo. Também não houve diferença
significativa no tratamento com o fenobarbital, fármaco de referência utilizado
neste experimento. Pressupõe-se, a partir destes resultados, que o composto D4
não influenciou na atividade de SOD, já que o resultado foi semelhante ao
controle. Os resultados obtidos estão de acordo com os estudos realizados por Guler et al. (2016) e Menon, Ramalingam e Kumar (2012), que afirmaram que
o tratamento com FAEs não influencia o status antioxidante. Além disso, Fong
144
et al. (2010) relataram que a rosiglitazona suprimiu a geração de H2O2,
protegendo contra a apoptose induzida por hipóxia. Portanto, se não houve
alteração na atividade de SOD, não houve também a redução de H2O2,
justificando o resultado de LOOH descrito anteriormente. Os mesmos autores ainda propuseram que os agonistas PPARs medeiam a transcrição de genes
SOD, promovendo a remoção de EROs/ERNs. Remels e colaboradores (2008)
relataram que os agonistas de PPARs podem atenuar diretamente o estresse
oxidativo impedindo a geração de EROs/ERNs, pela regulação de enzimas
antioxidantes, incluindo a SOD. Assim, a ativação de PPARs aumenta a
capacidade antioxidante. Collino et al. (2006) demonstraram que o pré-
tratamento com agonistas de PPAR-γ protegeu células do hipocampo de ratos
contra o estresse oxidativo induzido por GLU ou H2O2. Os resultados obtidos
pelo presente experimento são apoiados por dados relatados anteriormente,
sugerindo que a pioglitazona possui papel contra o estresse oxidativo,
reforçando o sistema de defesa antioxidante (YIN et al., 2013).
Figura 43. Efeito subcrônico do composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50
mg/Kg, i.p.) sobre os níveis da atividade de superóxido dismutase (SOD).
C D4 Fenobarbital0.000
0.005
0.010
0.015
SOD - Córtex
U S
OD
/mg p
rote
ína
C D4 Fenobarbital0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
SOD - Hipocampo
U S
OD
/mg p
rote
ína
Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada coluna representa 6 animais por
grupo. Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-
hoc de Dunnett.
5.4.5 Acompanhamento do desenvolvimento ponderal e efeito sobre o peso
dos órgãos dos animais submetidos ao tratamento subcrônico com o
composto D4
A administração de compostos químicos, especialmente fármacos
administrados cronicamente, podem induzir alterações no peso corporal de
animais e alterações morfológicas e funcionais em órgãos como fígado, rins e coração, e assim dar indícios simples e sensíveis de toxicidade (GRIFFITHS;
145
MATULKA, 2006; TAN et al., 2008). Além disso, o uso prolongado de FAEs
está associado ao risco de alterações de peso (NAKKEN, 2011; RUIZ-
GIMÉNEZ et al., 2010; SHAPIRO et al., 2016; SHETH, 2004; VERROTTI et
al., 2011). Com o objetivo de avaliar possíveis alterações tóxicas devido tratamento subcrônico com o composto D4, foram avaliados os pesos dos
animais durante o experimento e o peso dos órgãos após eutanásia, cujos
valores são demostrados a seguir.
5.4.5.1 Efeito do tratamento subcrônico com o composto D4 sobre o peso
corporal dos animais
O uso terapêutico de FAEs pode ter influência variável no peso
corporal. Alguns medicamentos, como fenitoína, oxcarbazepina, levetiracetam,
lamotrigina e tiagabina, parecem não ter efeitos significativos sobre o peso
corporal dos seus usuários (SHETH, 2004). Um segundo grupo de FAEs, incluindo topiramato, felbamato e zonisamida, é associado com perda de peso,
ao passo que um terceiro grupo, que compreende valproato, carbamazepina,
gabapentina, pregabalina, fenobarbital e vigabatrina, promove ganho de peso e
pode causar sobrepeso e obesidade (RUIZ-GIMÉNEZ et al., 2010; SHAPIRO
et al., 2016). A obesidade é o aspecto mais preocupante, pois pacientes
epilépticos apresentam risco aumentado de sobrepeso, independente do
tratamento, pelo sedentarismo, depressão e co-morbidades psiquiátricas
associadas (BORTOLINI; KULAK; BOGUSZEWSKI, 2008; VERROTTI et
al., 2011).
Sengupta et al. (2016) relatam que os agonistas PPARs, como as
TZDs, podem afetar o peso de animais devido alterações a nível metabólico. A redução de massa corporal deve-se a uma variedade de respostas, que pode
estar associada a toxidade sistêmica (LIMA, 2014). A figura 44 mostra os
resultados do peso corporal dos animais durante o tratamento de 21 dias com o
composto D4 e com o fenobarbital. De acordo com a literatura, os resultados
demonstram que os grupos ganharam peso de maneira não significativa entre si,
durante o período do experimento, levando-se em consideração a ingesta de
água e alimentos, não demonstrando, portanto, influência do composto D4 sobre
o desenvolvimento ponderal dos animais tratados. Estudos posteriores
relacionando o tratamento com D4 e o ganho ponderal, devem ser aprofundados
para comprovar se o mesmo altera ou não o peso em tratamentos prolongados.
146
Figura 44. Porcentagem do aumento de peso dos animais submetidos ao tratamento subcrônico com o composto D4.
Desenvolvimento ponderal
1 7 14 2190
100
110
120
130
140
Controle
D4 (10 mg/Kg, i.p.)
Fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.)
Dia de tratamento
Au
men
to d
e p
eso (
%)
Resultados apresentados como média. Cada coluna representa 10 animais por grupo. Os dados
foram submetidos à análise de variância ANOVA de duas vias seguido pelo post-hoc de
Bonferroni.
5.4.5.2 Avaliação do peso dos órgãos dos animais tratados subcronicamente
com o composto D4.
São relatados na literatura alguns efeitos colaterais das TZDs, como
disfunção renal, retenção de sódio e insuficiência cardíaca congestiva. A
necessidade de estudos toxicológicos das TZDs se dá pela capacidade destas
moléculas causarem, por mecanismos ainda não bem reconhecidos, edema periférico e insuficiência cardíaca congestiva devido a um aumento de
transportadores tubulares e diminuição na taxa de filtração glomerular em
consequência da retenção de sódio renal. Assim, alterações no peso destes
órgãos: rins e coração podem ocorrer (HORITA et al., 2015).
Os agonistas PPAR, como os derivados TZDs, podem também exercer
efeitos sobre o tecido adiposo e na homeostase de lipídeos. Há evidências de
esteatose hepática e hepatócitos distendidos com o uso de TZDs
(BOELSTERLIA; BEDOUCHA, 2002).
Em avaliações toxicológicas, é avaliado o efeito de compostos sobre o
peso dos órgãos dos animais submetidos ao tratamento com o intuito de
verificar alterações morfológicas. A tabela 9 demonstra os resultados dos pesos
dos órgãos dos animais. De acordo com Fong et al. (2010), a pioglitazona e a rosiglitazona estão associadas a eventos adversos como ganho de peso e edema
periférico. Nota-se que não há diferença significativa entre os grupos tratados
com fenobarbital, fármaco de referência, e com o composto D4, para os órgãos:
147
rins, fígado e coração, o que dá indícios de que não há alterações referentes a
efeitos adversos conhecidos das TZDs, como nefrotoxicidade, hepatotoxicidade
e toxicidade cardíaca. O tratamento com composto D4 e fenobarbital não
promoveu aumento do peso desses órgãos, embora tenha ocorrido uma diminuição do peso do coração nos animais tratados em relação ao controle.
Ainda sim, ressalta-se a importância de mais estudos para a elucidação do
potencial toxicológico.
Tabela 9. Peso dos órgãos dos animais submetidos a tratamento subcrônico com o composto D4 (10 mg/Kg, i.p.) e fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.).
Fígado (g) Rim (g) Coração (g)
Controle 1,19±0,14 0,15±0,02 0,13±0,02
D4 (10 mg/Kg, i.p.) 1,18±0,13 0,15±0,01 0,11±0,01
Fenobarbital (50 mg/Kg, i.p.) 1,23±0,11 0,13±0,01 0,11±0,01 Resultados apresentados como média seguida de EPM. Cada linha representa 6 animais por
grupo. Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo post-
hoc de Tukey.
148
149
6 CONCLUSÃO
Pela observação dos aspectos analisados, este estudo demonstrou que
os compostos TZDs propostos são inéditos e podem ser sintetizados. Os
resultados in sílico e in vivo, em conjunto, indicaram o potencial anticonvulsivante destes compostos TDZs, corroborando com dados já
apresentados pela literatura. Nenhum dos compostos estudados violou os
parâmetros de Lipinski, na análise in sílico, sugerindo que a série de compostos
possui propriedades físico-químicas adequadas para serem biodisponíveis por
v.o. Além disso, os resultados obtidos de druglikeness e drugscore indicaram
que os compostos apresentam fragmentos de fármacos conhecidos e que
possuem grupos farmacofóricos, facilitando o reconhecimento fármaco-
receptor. Os resultados dos descritores físico-químicos e farmacocinéticos
utilizados na predição da permeabilidade indicaram que os compostos TZDs
estudados possuem capacidade para permear a BHE e terem boa absorção
intestinal (AIH). Os compostos D1, D2, D3 e D4 apresentaram atividade
anticonvulsivante no teste de convulsão induzida por STR e, os compostos A1, D1 e D4 apresentaram ação anticonvulsivante no teste de convulsão induzida
por eletrochoque. Apenas o composto D4 foi efetivo em todos os testes de
indução química e elétrica, e, portanto, foi escolhido para os estudos
posteriores.
Em resumo, os resultados in sílico e in vivo mostraram potencial
anticonvulsivante dos compostos TZDs. O composto D4 reduziu
significativamente o limiar convulsivo dos animais tratados por v.o. e por via
i.p., e o seu mecanismo de ação parece envolver a via oxidonitrérgica. O
composto D4 não produziu déficit motor no CA e de memória na EI, apresentou
efeito ansiolítico observado no LCE e efeito hipnótico no MSB.
A administração subcrônica do composto D4 apresentou atividade anticonvulsivante e não alterou significativamente os níveis de aspartato
aminotransferase, fosfatase alcalina, ureia e creatinofosfoquinase, mas alterou
outros parâmetros bioquímicos, como glicose, creatinina, proteínas totais e
alanina aminotransferase, portanto, são necessários estudos mais aprofundados
para a confirmação de possível hepatotoxicidade e nefrotoxicidade em
tratamento subcrônico. O tratamento com o composto D4 não influenciou
significativamente os níveis de GSH e SOD, mas aumentou os níveis de LOOH
no hipocampo, em testes ex vivo e, a administração do composto não
influenciou o desenvolvimento ponderal e aparentemente não causou alterações
morfológicas nos rins, fígado e coração.
Em virtude dos dados mencionados, o composto D4 pode ser útil no manejo de crises epilépticas (CEs), embora estudos adicionais são importantes
para garantir a sua segurança.
150
151
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