UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
Curso de Pós-Graduação em Biotecnociência
Dissertação de Mestrado
Daniele Yuri Ishihara
Caracterização dos efeitos morfológicos no testículo de camundongos
após envenenamento pelo veneno bruto e fração de baixo peso
molecular da serpente Bothrops jararaca
Santo André
2014
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Curso de Pós-Graduação em Biotecnociência
Dissertação de Mestrado
Daniele Yuri Ishihara
Caracterização dos efeitos morfológicos no testículo de camundongos após
envenenamento pelo veneno bruto e fração de baixo peso molecular da
serpente Bothrops jararaca
Trabalho apresentado como requisito
parcial para obtenção do título de
Mestre em Biotecnociência, sob
orientação do Professor Doutor Carlos
Alberto-Silva.
Santo André
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2014
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Este exemplar foi revisado e alterado em relação à versão original, de acordo com as observações levantadas pela banca no dia da defesa, sob responsabilidade única do autor e com a anuência de seu orientador. Santo André, ____de _______________ de 20___. Assinatura do autor: _____________________________________ Assinatura do orientador: _________________________________
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Agradecimentos
“Viver é sempre dizer aos outros que elas são importantes. Que nós o amamos,
porque um dia eles se vão, e ficamos com a nítida impressão de que não o amamos
o suficiente.”
Chico Xavier
A minha família, pelo amor, compreendendo a minha ausência durante esse
período, pelo apoio quando tudo parecia perdido, e por acreditarem em cada passo
dado em minha vida. Apesar dos momentos difíceis que passamos nos últimos
tempos, aprendemos a superar todos os obstáculos com muito amor e união,
valorizando cada segundo que passamos juntos.
Fefê, pelo seu amor e sorriso que nos anima e ilumina, enchendo nossos corações
com a sua alegria e simpatia.
À Universidade pela oportunidade e por contribuir para o meu crescimento pessoal e
profissional e pelo apoio financeiro.
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto-Silva pela orientação.
Aos Professores do Programa de Biotecnociência, em especial aos Professores
Patrícia da Ana, Jean-Jacques pelo apoio, atenção e carinho, sempre dispostos a
ensinar.
Ao Odair, pela amizade, por sempre estar por perto para me ajudar e apoiar.
Ao Samyr, pela amizade e disposição para me ajudar.
Aos amigos Viviam, Juliana, Francielle, Adrianne, Ricardo e Alisson. Com vocês,
essa caminhada se tornou mais leve e feliz, agradecendo a vida por sempre colocar
pessoas especiais no meu caminho.
7
A D. Ilda que me acolheu em sua casa, sempre a disposição para tornar meu dia
melhor.
Aos alunos Celline Franzin e Diego Maia Brito, pela amizade e dedicação em auxiliar
a execução deste trabalho.
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“Quanto mais aumenta o nosso
conhecimento, mais evidente fica nossa
ignorância.”
John F. Kennedy
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos
não é senão uma gota de água no mar. Mas
o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”
Madre Teresa de Calcutá
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RESUMO
Os acidentes ofídicos são considerados um problema de saúde pública. Por este motivo, há a necessidade de realizar estudos de caracterização do veneno, bem como os de tratamentos e da fisiopatologia do envenenamento. Os componentes do veneno possuem especificidade com vários receptores teciduais humanos, podendo desestabilizar o sistema nervoso, cardiovascular ou hemostático. Os peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs) foram os primeiros inibidores naturais da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) descritos, presentes na fração de baixo peso molecular (Bj-FBP). No presente estudo foram avaliados as alterações no testículo e músculo estriado esquelético durante o processo de envenenamento induzido via intramuscular pela ação do veneno e da fração de baixo peso molecular da serpente Bothropoides jararaca (Bj-V). 22 camundongos machos da linhagem Swiss foram aleatoriamente distribuídos em grupos de 6h e 24h e administrados uma dose de 20μL de NaCl 0,9% nos animais controle (n=3); 1.2 mg/kg de veneno bruto (Bj-V) (n=4) e 0.24 mg/kg da fração de baixo peso molecular (Bj-FBP) (n=4). A fração de baixo peso molecular foi obtida por uma filtração com peso molecular de 10 kDa e analisado por Espectrometria de Massas onde confirmou a ausência de indícios de proteínas ou enzimas proteolíticas. Após o tratamento os testículos e fragmentos do músculo reto femoral foram coletados e analisados para avaliação morfológica dos tratamentos. O envenenamento foi caracterizado pela análise morfológica do músculo estriado esquelético, onde verificou-se, nas amostras do tratamento com Bj-V, verificou-se presença de hemorragia e necrose tecidual; nas amostras dos animais tratados com Bj-FBP verificou-se a integridade das fibras musculares, mas houve a presença de migração celular leucocitária. Na análise histopatológica dos testículos observou-se com maior freqüência, alterações na morfologia dos túbulos seminíferos dos camundongos tratados com Bj-V e Bj-FBP em comparação ao controle. Em síntese, os resultados demonstraram que o envenenamento por Bj podem afetar os túbulos seminíferos, levando a presença de túbulos hipoespermatogênicos, sendo assim, os indivíduos acometidos pelo acidente ofídico podem apresentar algum comprometimento na espermatogênese. Palavras-chave: Bothropoides jararaca; Peptídeos potenciadores de bradicinina, espermatogênese, epitélio seminífero
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ABSTRACT
Snakebites are considered a public health problem. For this reason, there is a need for studies to characterize the poison and the pathophysiology and treatment of poisoning. The components of the venom have specificity with various human tissue receptors, may destabilize the nervous, cardiovascular or hemostatic system. The bradykinin potentiating peptides (BPPs) were the first natural inhibitors of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) described, present in the low molecular weight fraction (Bj-FBP). In the present study the changes in the testis and skeletal muscle were assessed during the process of poisoning induced by intramuscular action of the poison and the fraction of low molecular weight Bothropoides snake jararaca (Bj-V). 22 male mice of the Swiss strain were randomly distributed in groups of 6h and 24h and administered a dose of 20μL of 0.9% NaCl in control animals (n = 3); 1.2 mg / kg of crude venom (Bj-V) (n = 4) and 0.24 mg / kg of low molecular weight fraction (Bj-FBP) (n = 4). The low molecular weight fraction was obtained by filtration with molecular weight 10kDa and analyzed by mass spectrometry which confirmed the absence of evidence of proteolytic enzymes or proteins. After treatment the testes and fragments of the rectus femoris muscle were collected and analyzed for morphologic evaluation of treatments. The poisoning was characterized by morphological analysis of the striated skeletal muscle, where it was found in the samples treated with Bj-V, there was the presence of hemorrhage and necrosis; in samples from animals treated with Bj-FBP was found the integrity of muscle fibers, but there was the presence of leukocyte cell migration. Histopathology of the testes was observed more frequently, changes in the morphology of the seminiferous tubules of mice treated with Bj and Bj-V-FBP compared to the control. In summary, the results showed that Bj poisoning can affect the seminiferous tubules, leading to the presence of hipoespermatogênicos tubules, so individuals affected by snakebite may have some involvement in spermatogenesis.
Keywords: Bothrops jararaca; Bradykinin potentiating peptides; spermatogenesis; seminiferous epithelium
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Bothrops jararaca ........................................................................................ 17
Figura 2. Representação esquemática do sistema reprodutor masculino ................... 22
Figura 3.Corte transversal do testículo ....................................................................... 24
Figura 4. Representação esquemática da onda espermatogênica ............................. 26
Figura 5. Caracterização da Bj-FBP por espectrometria de massasError! Bookmark not
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Figura 6. Análise morfológica do músculo reto femoral de camundongos submetidos ao tratamento com Bj-V e Bj-FBP ....................................... Error! Bookmark not defined.
Figura 7. Análise histopatológica do testículo de camundongos tratados com Bj-V ou Bj-V ................................................................................................................................... 48
Figura 8. Análise estatística da histopatologia do testículo ......................................... 50
12
LISTA DE TABELA
Tabela 1 - Peptídeos Potenciadores da Bradicinina ........................................ 19 Tabela 2 - Descrição do grau de comprometimento dos túbulos seminíferos..39
13
LISTA DE ABREVIATURAS
ADAMs – Adamalysin and metalloproteases
Ang I – Angiotensina I
Ang II – Angiotensina II
Bj – Bothrops jararaca
Bj-FBP – Fração de Baixo Peso Molecular da serpente Bothrops jararaca
Bj-V – Veneno bruto da serpente Bothrops jararaca
BK – Bradicinina
BPPs – Peptídeos Potenciadores de Bradicinina
CES – Ciclo do epitélio seminífero
CRISP: Proteína Secretada Rica em Cisteína
ECA – Enzima Conversora de Angiotensina
ECAs – Enzima Conversora de Angiotensina isoforma somática
ECAt – Enzima Conversora de Angiotensina isoforma testicular
GPI – Glicosil-folfatodil- Inositol
PLA2 – fosfolipases A2
kDa – Quilodalton
RVV-X – Russel’s viper venom factor X activator
SVMPs – Snake Venom Metalloproteases
SVSPs – Trypsin-like serine proteinases
Z2+ - zinco
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SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO....................................................................................................... 15
1.1 Bothrops jararaca .............................................................................................. 16
1.2 Efeitos do envenenamento ................................................................................ 20
1.3 Organização estrutural e funcional do testículo de mamíferos...........................22
1.4. Efeitos dos BPPs no epitélio seminifero de camundongos ............................... 28
2 – OBJETIVOS .......................................................................................................... 32
2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 33
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................ 33
3 – MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 34
3.1. Animais e Reagentes ....................................................................................... 35
3.2 Veneno bruto da Bj e obtenção da fração de baixo peso molecularError! Bookmark
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3.2.1. Espectrometria de massas ............................................................................ 36
3.3. Tratamento dos camundongos ......................................................................... 36
3.4 Coleta e processamento das amostras de materiais biológicos ........................ 37
3.5. Caracterização do envenenamento em camundongos machos induzido por Bj-V e Bj-FBP após administração intramuscular...............................................38
3.5.1. Avaliação histopatológica do músculo reto fermoral .................................. 44
3.6. Avaliação dos efeitos da Bj-V e Bj-FBP dos testículos. Caracterização histopatológica do testículo ................................................................................................................. 38
3.7. Análise Estatística ............................................................................................ 40
RESULTADOS................................................................................................41
4.1. Obtenção e caracterização da Bj-FBP ................ Error! Bookmark not defined.
4.2. Caracterização do envenenamento em camundongos machos induzido por Bj-V e Bj-FBP após administração intramuscular...............................................44
4.3. Caracterização histopatológica dos túbulos seminíferos em camundongos após envenenamento induzido com Bj-V e Bj-FBP............................................47
DISCUSSÃO.......................................................................................................51
CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................57
REFERÊNCIAS...................................................................................................59
ANEXO................................................................................................................72
15
1 - INTRODUÇÃO
16
1.1. Bothrops jararaca
Os acidentes botrópicos correspondem a 73,5% dos casos de acidentes
ofídicos no país, com um aumento da atividade humana no campo (BRASIL, 2009).
A maior incidência das picadas ocorrem nos membros inferiores, devido ao hábito
rasteiro dessas serpentes (BRASIL, 2009). Encontram-se distribuídas
geograficamente na região da América do Sul, normalmente na região do cerrado,
onde as plantações de cereais favorecem a presença de pequenos roedores, seu
principal alimento (CAMEY et al., 2002; GANS & ELLIOT, 1968).
A serpente Bothrops jararaca (Bj) (Figura 1) pertence à família Viperidae e
são responsáveis pela maior morbidade da região da América do Sul (CAMEY et al.,
2002). O gênero Bothrops é o grupo mais importante de serpentes peçonhentas,
com mais de 60 espécies encontradas em todo território brasileiro (BRASIL, 2009;
CAMPBELL & LAMAR, 1989). Bj tem capacidade adaptativa, ocupa e coloniza áreas
silvestres, agrícolas e periurbanas (BRASIL, 2009). As serpentes desse gênero
apresentam alto grau de especialização no aparelho venenífero, com um complexo
sistema de produção e estocagem do veneno; musculatura especializada ao redor
da glândula de veneno; perda do palato e presas caniculadas na parte anterior do
maxilar (GANS & ELLIOT, 1968; THOMAS & POUGH, 1979; KOCHVA, 1987).
Atualmente as espécies de serpentes Bothrops estão divididas em cinco
gêneros: Bothriopsis, Bothrocophias, Bothropoides, Bothrops e Rhinocerophis
(FENWICK et al., 2009). Werman (1992) indicou que o gênero Bothrops seria
parafilético, possibilitando a reorganização do gênero Bothrops (WERMAN, 1992).
Devido à sua grande diversidade ecológica e morfológica, a sistemática e as
relações filogenéticas deste gênero ainda não estão bem definidas (TU, 1991, 1992).
Para adquirir a classificação foram realizados seqüenciamentos de DNA mitocondrial
17
(WÜSTER et al., 2002), Wüster e colaboradores reconheceram os gêneros Bothrops
e Bothrocophias como independentes. Recentemente Fenwick e colaboradores
dividiu o gênero Bothrops em Bothropoides, Rhinocerophis e Bothrops (FENWICK et
al., 2009). Ainda, o gênero Bothropoides foram alocados 11 espécies que
anteriormente eram incluídas em Bothrops (CAMPBELL & LAMAR, 2004).
Figura 1. Imagem de uma B. jararaca. (A) Presença de fosseta loreal, órgão responsável pela
percepção de ondas de calor de um animal homeotérmico. (B) Detalhe do desenho no formato de V
invertido preto ou castanho pelo corpo. Fonte: Centro de Informações Toxicológicas de Santa
Catarina (CIT/SC).
O veneno da serpente tem como principal função a paralisação da presa,
ocasionando óbito devido às falhas circulatórias e respiratórias. Além disso, o
veneno é composto por diversas famílias de proteínas que possuem especificidade
com vários receptores teciduais humanos, que podem afetar o sistema nervoso,
cardiovascular, hemostático, podendo até causar necrose. Os principais grupos de
moléculas do veneno são: as metaloproteinases (SVMPs) (KARLSSON, 1979;
MOURA-DA-SILVA et al., 2007; GUTIÉRREZ et al., 2005; FOX & SERRANO, 2009),
A
B
18
serinoproteinases (SVSPs) (MARKLAND, 1998; SERRANO & MAROUN, 2005,
fosfolipases A2 (PLA2) (KINI, 2003, 2005); lectinas do tipo C (OGAWA et al., 2005;
MORITA, 2005; LU et al., 2005), L-aminoácidos oxidase (DU & CLEMETSON, 2002;
FOX, 2013), hialuronidases (FOX, 2013), proteínas secretórias ricas em cisteína
(CRISP), disintegrinas (CALVETTE et al., 2005), peptídeos potenciadores de
bradicinina (BPPs), peptídeos natriuréticos, entre outros (MURAYAMA et al., 1997;
BARR et al., 1996; SCHWEITZ et al., 1992; FERREIRA et al., 1992; FERREIRA et
al., 1970).
Nas secreções da glândula de veneno de várias serpentes, como a Bj,
encontra-se um grande número de peptídeos com ação hipotensora, conhecidos
como peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs). Os BPPs são oligopeptídeos
de cinco a quatorze resíduos de aminoácidos, apresentam alto conteúdo de prolinas,
na região N-terminal apresentam um resíduo de ácido piroglutâmico e na região C-
terminal, um resíduo de prolina (IANZER et al., 2004) (Tabela 1). John Vane e
colaboradores foram os primeiros a apresentar explicações para os efeitos da
potenciação da bradicinina (BK) pelos BPPs, identificando a enzima conversora de
angiotensina I (ECA) como alvo para os BPPs purificados do veneno da Bj
(FERREIRA et al., 1970). Os BPPs da Bj foram os primeiros inibidores naturais da
ECA já descritos. Estudos sobre a atividade dessas toxinas contribuíram para o
desenvolvimento de medicamentos anti-hipertensivos utilizados até hoje, como o
Captopril® (BPP-5a) (ONDETTI et al., 1977), através de evidências das principais
ações fisiológicas da BK estão as participações nos mecanismos de controle do
tônus vascular (IANZER ET AL.,2004). A ação vasodilatadora arterial da Bk deve-se
à ativação de receptores B2 na superfície de células endoteliais, seguida pela
liberação de óxido nítrico (NO) e prostaciclina (IANZER et AL., 2004).
19
Em 1997, a partir da clonagem do cDNA que codifica os BPPs na glândula de
veneno foi possível observar que estes peptídeos são produtos do processamento
da proteína precursora do peptídeo natriurético do tipo-C (Bj-CNP) (MORAIS ET AL.,
2011; GUERREIRO ET AL.,2009; FERREIRA, 2000). A partir de então, outros
peptídeos com característica estrutural de um BPP foram isolados da glândula de
veneno e do cérebro desta serpente (MORAIS ET AL.,2011; GUERREIRO ET AL.,
2009; HAYASHI & CAMARGO, 2005)..
O mecanismo de ação mais estudado está relacionado ao seu efeito inibitório
sobre a conversão da Angiotensina I (Ang I) em Angiotensina II (Ang II) (com ação
hipertensora) e preservando a bradicinina (BK) de degradação (com ação
hipotensora) (SCHWEITZ et al., 1992; FERREIRA et al., 1992; FERREIRA et al.,
1970).
NOME Sequência de aminoácidos MW
BPP-5a <EKWAP 611.7 BPP-5b <EWPRP 665.8 BPP-6a <ESWPGP 653.7 BPP-7a <EDGPIPP 705.8 BPP-9a <EWPRPQIPP 1101.3 BPP-10a <ESWPGPNIPP 1075.2 BPP-10b <ENWPRPQIPP 1215.4 BPP-10c <ENWPHPQIPP 1196.3 BPP-11a <EWPRPTPQIPP 1299.5 BPP-11b <EGRAPGPPIPP 1069.2 BPP-11c <EGRAPHPPIPP 1149.3 BPP-11d <EGRPPGPPIPP 1095.3 BPP-11e <EARPPHPPIPP 1189.4 BPP-12a <EGWAWPRPQIPP 1415.6 BPP-12b <EWGRPPGPPIPP 1281.5 BPP-12c <EWAQWPRPQIPP 1485.8 BPP-13a <EGGWPRPGPEIPP 1370.5 BPP-13b <EGGLPRPGPEIPP 1297.5 BPP-14a <EWAQWPRPTPQIPP 1683.5
Tabela 1. Quadro de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina, indicando o nome, sequencia e peso molecular de cada BPP. <E, representa ácido piroglutâmico; MW, peso molecular (LAMEU et al., 2010).
20
1.2. Efeitos do envenenamento
O envenenamento por viperídeos é considerado um problema de saúde
pública desde o século XVIII devido à sua morbimortalidade, o que motivou as
pesquisas de Vital Brazil sobre a especificidade dos soros anti-ofídicos.
O acidente botrópico, assim como a maioria dos acidentes com viperídeos, se
caracteriza pela desestabilização do sistema hemostático das vítimas causando,
principalmente, hemorragia local e sistêmica e necrose tecidual. No envenenamento
ocorre o que denomina coagulopatia de consumo, ou seja, a ativação rápida do
sistema pró-coagulante em sinergia com uma pronunciada fibrinólise, resultante da
depleção do fibrinogênio (SANTORO et al., 2008).
Clinicamente, o envenenamento pode ser dividido em sintomas locais e
sistêmicos. Os sintomas locais se tornam evidentes nas primeiras horas após a
picada, apresentando edema, dor, equimoses e hemorragia no local da picada,
progredindo para o restante do membro acometido. Com a evolução do
envenenamento, surgem bolhas, seguido de necrose tecidual com formação de
abscessos. As primeiras complicações, causadas pela necrose e infecção, podem
levar à amputação do membro ou um déficit funcional. Sistemicamente, pode-se
observar hemorragia, sangramentos espontâneos de mucosa e falência renal. Ainda,
podem ser relatados náuseas, vômitos, sudorese e hipotensão arterial, sendo que as
complicações sistêmicas podem ocasionar choque, insuficiência renal aguda,
septicemia e coagulação intravascular disseminada, ocasionando óbito (SANTORO
et al., 2008; GALAGHER et al., 2005; ESCALANTE et al., 2006; BARBOSA et al.,
21
2008). Nos exames de sangue dos acidentados, observa-se trombocitopenia nas
primeiras 49 horas após o acidente, prolongados tempos de coagulação e
diminuição da contagem de células vermelhas (FOX & SERRANO, 2005). Além da
trombocitopenia, a reatividade plaquetária também é alterada com
hipoagregabilidade e ADP e ristocetina (SANO-MARTINS et al., 1997).
Atualmente o tratamento recomendado pelo Ministério da Saúde em casos de
acidentes ofídicos causados pelo gênero Bothrops é a utilização de um soro anti-
ofídico polivalente, produzido no Brasil, pela imunização de cavalos com um pool de
veneno de cinco espécies: B. jararaca, B. neuwiedi, B. alternatus, B. moojeni e B.
jararacussu (BRASIL, 2009; SOUSA et al., 2013). Além da utilização do soro anti-
ofídico são empregados analgésicos para aliviar a dor, hidratação e
antibioticoterapia em casos de evidências de infecção. As bactérias mais
frequentemente encontradas são M. morganii, E. coli, Providentia sp e Streptococo
do grupo D. O prognóstico de pacientes tratados geralmente com baixa taxa de
letalidade, mas com possibilidade de seqüelas locais ou funcionais dos membros
acometidos.
Apesar do quadro de evolução ser amplamente caracterizado, nosso grupo
vem levantando a hipótese de que os BPPs presentes no veneno da serpente Bj
podem interferir na dinâmica do epitélio seminífero, provavelmente comprometendo
a formação dos espermatozóides. Tem-se observado pela primeira vez, que o BPP-
10c provoca infertilidade de camundongos machos de forma gradativamente
reversível após a interrupção do tratamento via intraperitoneal (dados não
publicados). Apesar disso, ainda não existem relatos na literatura sobre os possíveis
efeitos do veneno bruto por Bj e suas frações no sistema reprodutor masculino
durante o processo de envenenamento.
22
1.3. Organização estrutural e funcional do testículo de mamíferos
Em linhas gerais, o sistema reprodutor masculino é formado por um conjunto de
estruturas (testículos, epidídimos, ductos deferentes e glândulas anexas) que
permitem a formação e nutrição dos espermatozóides até sua condução para o meio
externo (Figura 3).
O testículo dos mamíferos é um órgão com formato ovóide, localizado fora da
cavidade abdominal, em uma prega cutânea denominada escroto. A localização do
escroto é importante para a manutenção da temperatura dos testículos que deve ser
menor que a temperatura abdominal para preservar suas funções. O testículo está
envolto por uma grossa camada de tecido conjuntivo denso e interiormente formado
por septos onde se localizam os túbulos seminíferos. Os túbulos seminíferos formam
alças enoveladas que percorrem toda a extensão axial do testículo (SOUSA et al.,
2013).
3
2
1
23
Figura 3. Sistema reprodutor masculino. (1) Testículo; (2) Epidídimo e (3) Ducto deferente (Atlas de
anatomia humana, 2000).
Em um corte transversal do testículo observa-se a presença de dois compartimentos
principais:
1. O compartimento tubular é avascular, não possui inervações, formado pela
túnica própria, epitélio seminífero e lúmen. A túnica própria envolve
externamente o epitélio, sendo este constituído por células peritubulares mióides
e elementos acelulares, como fibras colágenas e a membrana basal. As células
peritubulares mióides são contráteis e auxiliam na formação da membrana basal
e são responsáveis pela movimentação dos fluidos e propulsão dos
espermatozóides através do lúmen dos túbulos seminíferos (RUSSEL et al.,
1990).
2. No compartimento intertubular estão localizadas as células de Leydig
(produtoras de esteróides), vasos sanguíneos e linfáticos, nervos, fibras de
tecido conjuntivo, macrófagos, linfócitos e ocasionalmente mastócitos
(FAWCETT et al., 1973).
No epitélio seminífero encontram-se dois tipos celulares distintos: as células
espermatogênicas e as células de Sertoli que são de linhagem somática (FRANÇA &
GARCIA, 2005). As células espermatogênicas estão dispostas de forma concêntrica,
de modo que as células imaturas encontram-se próximas da membrana basal em
um compartimento adluminal que visualizado em um corte histológico, termina no
lúmen do túbulo seminífero (Figura 4) (PELLETIER & VITALE, 2003). Já as células
24
de Sertoli são responsáveis pela sustentação e nutrição das células germinativas
(FRANÇA & GARCIA, 2005).
25
2
1
26
Figura 3. (1) Corte transversal do testículo de rato adulto em três estádios diferentes do ciclo do
epitélio seminífero durante a espermatogênese, (2) Maturação das células germinativas no epitélio
seminífero durante a passagem pelo compartimento basal e adluminal (CHENG & MRUKK, 2012).
A espermatogênese é um processo cíclico, altamente organizado e complexo
que ocorre dentro dos túbulos seminíferos, especificamente no epitélio seminífero.
Este processo passa por três fases essenciais: a primeira é a fase proliferativa onde
as células passam por sucessivas e rápidas divisões mitóticas; a segunda é a fase
meiótica ou espermatocitária, na qual o material genético dos espermatozóides é
duplicado, recombinado e segregado; e por fim ocorre a fase espermiogênica, na
qual as células haplóides, no caso as espermátides, se diferenciam em
espermatozóides, uma célula altamente especializada e estruturalmente equipada
para alcançar e fertilizar o oócito (RUSSEL et al., 1990).
As células espermatogênicas constituem associações que caracterizam os
estádios do ciclo do epitélio seminífero (CES). Na maioria dos mamíferos, o arranjo
dos estádios do CES é segmentado e, normalmente existe apenas um estádio por
corte transversal do túbulo (PELLETIER & VITALE, 2003). No epitélio seminífero são
encontrados diferentes estádios, conhecidos como onda espermatogênica
(LEBLOND & CLERMONT, 1952; PEREY et al., 1961) e tem como função assegurar
uma liberação constante de espermatozóides; reduzindo a congestão que poderia
ocorrer ao longo dos túbulos se a espermiação ocorresse simultaneamente;
asseguram um fluxo constante de fluidos dos túbulos seminíferos mantendo o
veículo para o transporte dos túbulos seminíferos mantendo por m fluxo constante
de espermatozóides e fluidos vindos do testículo (CURTIS, 1918).
27
A identificação dos diferentes estádios do CES é essencial para a realização de
estudos quantitativos da espermatogênese. A organização do CES é geralmente
constante para uma determinada espécie, entretanto varia entre espécies diferentes,
por exemplo, em camundongos o ciclo é organizado em 12 estádios (I-XII) (Figura 5)
(RUSSEL et al., 1990).
Figura 4. Representação da onda espermatogênica de camundongos em XII estádios. Os estádios
de cada ciclo do epitélio seminífero se apresentam em onda espermatogênica, com presença de
células em divisão meiótica e mitótica. No estádio I observa-se a presença de espermátides recém-
formadas e espermatócitos paquítenos com cromatina grande, ocupando maior parte do interior do
núcleo. Estádio II/III as espermátides estão com a cabeça mais pontiagudo e estreito, espermatócitos
paquítenos com a cromatina compacta. Ocorre também a mitose das espermatogônias. Estádio IV
ocorre o aumento progressivo dos espermatócitos paquítenos, no final desse estádio as
espermatogônias intermediarias se dividem para formar as espermatogônias B. No estádio V os
espermatócitos paquítenos se tornam progressivamente maiores e distintos e isso continua até o
estádio VI onde pode ser observado a peça intermediária do flagelo da espermátide proeminente
resultante do alinhamento mitocondrial. Na fase VIII ocorre a espermiação. Estádio IX mais de 50%
da superfície dorsal da espermátide fica coberta pelo acrossoma, o seu núcleo e ligeiramente
28
afunilado. No estádio X ocorre a transição entre leptótenos para zigótenos. No estádio XII observa-se
a meiose I e II (RUSSEL et al., 1990).
As células de Sertoli nos mamíferos sexualmente maduros estão
completamente diferenciadas e seu número é considerado constante após a
puberdade (FAWCETT et al., 1973). Ocorre uma variação considerável na forma e
estrutura destas células durante o CES, isso demonstra o seu alto grau de
plasticidade, refletindo as alterações morfológicas e funcionais ocorridas nas células
germinativas (JOHNSON, 1991; FRANCA et al., 1993). Além da formação da
barreira que propicia um ambiente imunoprivilegiado no compartimento adluminal do
epitélio seminífero, desempenham outras funções essenciais para o
desenvolvimento das células espermatogênicas, como: síntese de várias proteínas
[Testina (FAWCETT et al., 1973), Inibina B (YE et al., 1993) e Transferrina (PIERIK
et al., 1998)]; o fornecimento de nutrientes, mediação da ação do FSH e da
testosterona na espermatogênese; fornecimento de suporte físico (sustentação) para
as células espermatogênicas; participação ativa no processo de liberação das
espermátides para o lúmen tubular (espermiação); fagocitose do excesso de
citoplasma (corpos residuais) das células espermiadas; e a fagocitose de células
espermatogênicas que sofrem apoptose (FAWCETT et al., 1973; GRISWOLD,
1998).
As células de Sertoli secretam fluidos em direção ao lúmen tubular, no qual
possui substâncias importantes para a função epididimária e maturação
espermática, servindo também de veículo para o transporte dos espermatozóides. A
secreção de fluidos também ocorre em direção ao interstício, estando envolvida com
os mecanismos de regulação parácrina de outros tipos celulares do testículo tais
29
como as células peritubulares mióides, células de Leydig e as células musculares
lisas dos vasos sanguíneos (PIERIK et al., 1998).
A barreira de células de Sertoli é composta por um conjunto de complexos
protéicos que mantém a oclusão entre os prolongamentos citoplasmáticos das
células de Sertoli (PELLETIER & VITALE, 2003; GRISWOLD, 1998; RUSSELL &
PETERSON, 1985). Este complexos são compostos por proteínas integrais de
membrana da família das claudinas, ocludinas e moléculas de aderência juncional
(YE et al., 1993), que controlam a passagem de macromoléculas que poderiam ser
nocivas ao processo espermatogênico (CHENG & MRUK, 2003).
No testículo, além das células de linhagem espermatogênica, estão presentes
células somáticas distribuídas tanto no compartimento tubular quando no
intertubular, que participam de diferentes funções. Entre elas estão os fibroblastos,
macrófagos, linfócitos, podendo ocorrer também os mastócitos (LEE & CHENG,
2005). Outra célula somática importante é a célula de Leydig, localizada no
interstício e que apresenta como uma de suas principais funções a produção de
esteróides. Possuem abundante retículo endoplasmático liso e se formam durante a
16° e 20° semana de gestação, mantendo-se dormentes até a puberdade (FRANÇA
& RUSSELL, 1998; MORI & CHRISTENSEN, 1980).
1.4. Efeitos dos BPPs no epitélio seminífero de camundongos
As propriedades estruturais, funcionais e moleculares da Enzima Conversora
de Angiotensina (ECA) permitiram relatar duas isoformas de elevada similaridade,
uma denominada testicular (ECAt) e outra somática (ECAs) no homem (SETCHELL
et al., 2002) e, em diferentes animais (SIBONY et al., 1993). A isoforma somática é
30
um dipeptidil carboxipeptidase de zinco bem caracterizada que desempenham um
papel importante para a regulação da pressão arterial pela conversão da
angiotensina I em angiotensina II pela inativação da bradicinina (PAULS et al.,
1999). A forma testicular está presente exclusivamente nas células germinativas
durante a espermatogênese no testículo, assim como, no espermatozóide maduro
(SIBONY et al., 1993; ONDETII & CUSHMAN, 1981).
Em relação a ECAt, evidências experimentais utilizando knockout em
camundongos para ECAt, indicam que esta enzima, que possui apenas o sítio C da
ECAs (HAGAMAN et al., 1998), está diretamente associada à fertilidade masculina,
envolvida na maturação das espermátides em espermatozóides (RAMCHANDRAN
et al., 1994). Considerando a similaridade estrutural do domínio C da ECAs e ECAt,
observou-se que a ECAt de ratos tratados com BPP-10c, apresentaram severa
hipofertilidade, exclusivamente na maturação de células germinativas (PAULS et al.,
1999). Além disso, observou-se pela primeira vez a expressão diferencial entre a
ECAs e ECAt no testículo do humano adulto e fetal por imunohistoquímica e
hibridização in situ, utilizando anticorpos monoclonais e sondas de RNA específicas,
respectivamente. Verificou-se que a ECAt é expressa nas células germinativas em
fase de maturação (espermátides) e espermatozóides, mas, não em células de
Sertoli, células de Leydig ou em outras células somáticas. Em estudos de
distribuição biológica do BPP-10c marcado com I125 em camundongos demonstrou
que este peptídeo acumula-se em vários órgãos como cérebro, testículo e
principalmente nos rins (SILVA et al., 2008).
Foi demonstrado que a ECAt é de fundamental importância no processo de
fertilização devido a liberação de proteínas ancoradas por GPI (glicosil-fosfatodil-
inositol) como o PH-20 e TESP-5 fundamentais para a ligação dos espermatozóides
31
na superfície do oócito. Além disso, identificaram uma nova atividade para a ECAt
que proporciona a liberação dessas proteínas por meio de clivagem entre duas
manoses na molécula de GPI, determinada como atividade endomanosidase.
Adicionalmente observam que a modificação dos aminoácidos no motif catalítico da
ECAt não interfere na atividade endomanosidase, demonstrando assim, que a
liberação das proteínas ancoradas por GPI é independente da atividade peptidásica.
Por outro lado, ainda não está esclarecido o possível envolvimento dessa nova
atividade ou mesmo da atividade catalítica durante a espermatogênese, evento
totalmente independente da fertilização. Os inibidores naturais dirigidos ao centro
ativo da ECAs, como o Captopril, o Enalapril e o Lisinopril, indicaram, recentemente,
que estes inibidores estabelecem alterações diretas com o Zn+2 do sítio ativo da
enzima pelos tiol do Captopril e pelo carboxilato do Enalapril e do Lisinopril (LAMEU
et al., 2010). Ainda, outros ensaios realizados com espermatozóides ejaculados e
isolados do epidídimo de eqüinos indicaram que a adição do Captopril reduz
significativamente atividade da ECAt em experimentos ex vivo (GALLAGHER et al.,
2005). Por outro lado, tem sido descrito que inibidores da ECAs (Captopril e seus
análogos) não afetam a atividade da ECAt in vivo, sugerindo que essa droga não
atravessam a barreira hematotesticular para proporcionar a inibição da enzima
(BARR et al., 1996; SCHWEITZ et al., 1992), o que justificaria a ausência de relatos
sobre os efeitos dos inibidores da ECA na função testicular.
Considerando a similaridade estrutural entre o sítio C-terminal da ECAs e
ECAt, o fato do BPP-10c e Captopril possuírem efeitos inibitórios sobre as ECAs
(Kiapp aproximadamente 4.0 nM (KARLSSON, 1979; FERREIRA et al., 1992), a
seletividade do BPP-10c pelo sítio C-terminal da ECAs (KARLSSON, 1979), as
características estruturais da barreira hematotesticular que impedem o acesso do
32
Captopril no testículo (FERREIRA et al., 1970), nosso grupo vem investigando os
efeitos dos inibidores da ECAs, naturais (BPPs) e não naturais (Captopril), na
espermatogênese de camundongos.
33
2 - OBJETIVOS
34
2.1. Objetivo geral:
Estudar os efeitos do envenenamento induzido por B. jararaca em
camundongos machos, via intramuscular, no testículo e músculo estriado
esquelético.
2.2. Objetivos específicos:
Obtenção da Fração de Baixo Peso Molecular (Bj-FBP) através do veneno
bruto (Bj-V);
Avaliar os efeitos morfológicos no testículo e músculo estriado esquelético
após tratamento com Bj-V e Bj-FBP.
35
3 – MATERIAL E MÉTODOS
36
3.1. Animais e Reagentes
22 camundongos machos da linhagem Swiss com maturidade sexual (peso
de 30 a 35g, aproximadamente 60 dias), provenientes da Anilab (Paulínea, São
Paulo, Brasil), foram utilizados para o desenvolvimento do presente estudo. Os
animais receberam alimentação padronizada para camundongos (Nuvilob CR-1,
NUVITAL) ad libitum, e mantidos em densidade de 10 animais/gaiola e fotoperíodos
de 12/12h em sala climatizada (22°C). Os procedimentos deste experimento foram
aprovados sob n° 009/2013 pela Comissão de Ética em Uso de Animais (CEUA) da
Universidade Federal do ABC (UFABC), de acordo com os Princípios Éticos de
Experimentação Animal adotado pela Sociedade Brasileira de Ciências de animais
de Laboratório (SBCAL).
Todos os reagentes químicos utilizados neste estudo possuem alto grau de
pureza analítica e foram adquiridos com padrão de referência da Sigma® ou
Merck®.
3.2. Veneno Bruto da B. jararaca e obtenção da Fração de Baixo Peso
Molecular (Bj-FBP)
O veneno bruto da Bj (Bj-V) foi fornecido pelo Laboratório de Herpentologia do
Instituto Butantan (São Paulo – Brasil). Para a obtenção da Bj-FBP, 2g do veneno
bruto liofilizado foi dissolvido em um volume final de 20 mL de acetato de amônio
0,1M, pH 5,0 e filtrada através de uma membrana Amicon, um filtro com corte
molecular de 10 kDa. O rendimento da Bj-FBP foi estimado pela razão entre a
quantidade inicial (g) do produto obtido liofilizado, contendo a Bj-FBP. Para confirmar
a ausência de proteínas maiores que 10 kDa e eficiência do procedimento de
37
purificação, o filtrado contendo a fração peptídica foi analisado por espectrometria de
massa.
3.2.1. Espectrometria de Massas
A análise do peso molecular e a sequência dos picos eluídos foram realizadas
por Q-TOF Ultima API (Micromass, UK), sob o modo de ionização positivo e/ou por
espectrometria de massa MALDI-TOF num sistema Ettan MALDI-TOF/Pro
(Amershan Biosciences, Suécia), utilizando como matriz o ácido cinâmico. As
alíquotas anteriormente liofilizadas foram dissolvidas em uma fase móvel de 50/50
de ácido fórmico aquoso (0,1%) acetonitrila e injetados 5μL/min por uma bomba de
infusão na fonte, ou injetado diretamente (10 mL), utilizando um circuito de amostras
Rheodyne 7010VP acoplado a bomba Shimadzu LC-10A fluxo constante de 20
μL/min. O controle dos instrumentos e aquisição de dados foram realizados pela
digitalização da razão de massa/carga (m/z) de 300 (ou 50) a 1800 (ou 2000),
utilizando um tempo de verificaão de 5S (ou 2S) aplicado durante todo o processo
cromatográfico. Os espectros de massa correspondentes a cada sinal da corrente
total de íons (TIC) geraram o cromatograma, permitindo uma determinação precisa
da massa molecular. A calibração externa da escala de massa foi realizada com
mioglobina de coração de cavalo (Sigma®) ou Nal (Fluka®). Para a análise MS/MS
na Q-TOF, energia de colisão variou de 18 a 45 íons precursores foram
selecionados e uma janela de 1m/z.
3.3. Tratamento dos camundongos
Os camundongos foram organizados em grupos de 6h e 24h e subdivididos
em três tratamentos: animais do grupo controle (n=3) injetados com 20 μL de
38
solução NaCl 0,9%; animais tratados com Bj-V (n=4), receberam uma dose de 1.2
mg/kg dissolvido em 20 μL de solução salina estéril e animais injetados com Bj-FBP
(n=4) 0,24 mg/kg dissolvido em 20 μL de solução salina estéril. As soluções foram
administradas via intramuscular (i.m.) no músculo reto femoral, utilizando seringas
de 0,5 mL (BD ULTRA-FINE) com agulha fixa de 30 gauge.
Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e com o auxílio de
material cirúrgico, os testículos e fragmentos do músculo reto femoral foram
coletados e destinados aos procedimentos de histologia para análise morfológica.
3.4. Coleta e processamento das amostras de materiais biológicos
Os tecidos biológicos coletados destinados à histologia foram imersos em
solução fixadora Davidson Modificado (LATENDRESSE et al., 2002) (água destilada
50%, formaldeído 30%, ácido acético glacial 5% e álcool 15%). Nos testículos, foram
realizados pequenos furos nos pólos apicais com agulha de 30 gauge para permitir a
penetração da solução fixadora. Após o período de 48h, os tecidos foram retirados
do fixador e mantidos em álcool 70% até emblocamento. Para histologia, os órgãos
foram imersos em concentrações alcoólicas crescentes para desidratação (álcool
70% ao álcool 95%), infiltrados e emblocados em parafina. Os cortes histológicos (5
μm de espessura) foram obtidos em micrótomo automático LEICA RM 2155 com
navalha de aço, realizado no Laboratório de Histotécnica e Imunohistoquímica da
Universidade Nove de Julho (UNINOVE – São Paulo – Brasil). Em seguida, os cortes
foram lavados em água destilada a 35°C para serem colhidos em lâminas de vidro.
As lâminas foram mantidas em estufa a 60°C overnight para serem
desparafinizados. Em seguida, os cortes foram hidratados em solução alcoólica
39
decrescente e corados por método de Hematoxilina e Eosina (1:1000), destinados
para análise morfológica do testículo e músculo estriado esquelético, em
fotomicroscópio Zeiss Axioskop 2 da Central Experimental Multiusuário da
Universidade Federal do ABC (CEM – UFABC).
3.5. Caracterização do envenenamento em camundongos machos induzido por
Bj-V e Bj-FBP após administração intramuscular
3.5.1. Avaliação histopatológica do músculo reto femoral
As fibras do músculo estriado esquelético são cobertas por uma fina
membrana denominada sarcolema. O sarcolema é formado pela fibra muscular onde
permanece aderido firmemente ao lado da fibra. As fibras musculares possuem
estrias transversais constituídas de miofibrilas dispostas longitudinalmente. Entre as
miofibrilas há uma substância denominada sarcoplasma contendo mitocôndrias e
retículo endoplasmático (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
O músculo estriado esquelético dos camundongos tratados com Bj-V foi
analisado morfologicamente para confirmar os efeitos do envenenamento.
Observou-se através de cortes longitudinais, para uma análise qualitativa, a
integridade das fibras musculares (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
3.6. Avaliação dos efeitos da Bj-V e Bj-FBP os testículos. Caracterização
histopatológica do testículo
40
No epitélio seminífero, verificou-se a integridade das células espermáticas,
apoptose, necrose, observando a presença de túbulos seminíferos
hipoespermatogênicos, com ausência de células germinativas em meiose e pós-
meiótica. Com o objetivo de mensurar a representação ou dimensão das alterações
ou não observadas nos cortes histológicos dos testículos, 200 túbulos seminíferos
de cada tratamento foram selecionados aleatoriamente e classificados em quatro
categorias, conforme pode ser visualizado na Tabela 2.
Grau de comprometimen
to Descrição Morfologia
0
Túbulos seminíferos sem alterações evidentes, pois mesmo em condições fisiológicas normais podem ser encontrados túbulos alterados.
1
Túbulos com alterações discretas. Presença de células germinativas degeneradas, desprendimento de células germinativas para o lúmen tubular com formação ou não de células multinucleadas. Presença de vacúolos no epitélio seminífero.
2
Alterações moderadas. Acentuada perda de células germinativas, apresentando as remanescentes degeneradas. (→)Vacuolização acentuada no epitélio seminífero e diminuição da altura do epitélio.
41
3
Alterações acentuadas. Apenas algumas células germinativas picnóticas permanecem no epitélio. (→) Epitélio germinativo composto quase exclusivamente por células de Sertoli. Espessamento da membrana basal.
Tabela 2. Descrição do grau de comprometimento dos túbulos seminíferos. 3.7. Análise estatística
As análises estatísticas realizadas pelo método ANOVA utilizando o teste
Tuckey ou o teste t-Student quando necessário, empregando-se o software
estatístico GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software, Incorporation. Os critérios para
a significância estatística foram ajustados para p<0.05.
42
4 - RESULTADOS
43
4.1 Obtenção e caracterização da Bj-FBP
O rendimento do Bj-FBP liofilizado, após filtração em um filtro com um peso
molecular de corte 10 kDa, foi estimado em ~0.4g/g do peso inicial de Bj-V. A análise
por Espectrometria de massas (ESI-MS) da Bj-FBP indica sinais de massas entre
440 e 11371.71 m/z, mas não acima de 1500 m/z (Figura 6). Alguns íons foram
selecionados aleatoriamente para o sequenciamento de peptídeos por análise de
espectrometria de massas (MS/MS) em tanden. Após fragmentação e
sequenciamento dos íons 708.67 e 10.96.44, identificou-se os peptídeos BPP-12a
[<EGWAWPRPQIPP] e BPP-11d [<EGRPPGPPIPP], respectivamente (Figura 6B).
Ainda, o sequenciamento dos íons 1197.45 e 1371.71 apontam as sequências dos
BPPs 10c [<ENWPHPQIPP] e 13a [<EGGWPRPGPEIPP]. Analisados em conjunto,
os resultados indicam que a Bj-FBP obtida do veneno bruto contém apenas a fração
peptídica do veneno, sem indícios de proteínas ou enzimas proteolíticas com peso
molecular acima de 10 kDa.
44
Figura 6. Caracterização da Bj-FBP obtida por (A) ) ESI-MS da Bj-FBP indicando os íons 708.6 [a. BPP-12b] e 1096.44 [b. BPP-11d]. (B) ESI-MS caracterização da região ampliada de 900 a 1400 m/z do espectro de massa da figura A e indicação dos íons 1197.5 [c. BPP-10c] e 1371.71 [d. BPP-13a].
45
4.2. Caracterização do envenenamento em camundongos machos induzido por
Bj-V e Bj-FBP após administração via intramuscular (i.m.)
Todos os camundongos foram pesados antes do experimento, para definir a
dose do tratamento. Depois de separados e identificados, os animais foram tratados
com a solução NaCl 0,9%, Bj-V e Bj-FBP. A dose administrada do VB (1.2 mg/kg) foi
equivale a dose necessária para desencadear os efeitos do envenenamento local e
sistêmico, conforme descrito na literatura (ESCALANTE et al., 2006). Para calcular a
dose administrada de Bj-FBP foi realizado o cálculo do peso inicial do veneno bruto
liofilizado (2g) e o peso final da fração de baixo peso molecular liofilizado (0.2g).
Assim, os grupos tratados com Bj-FBP administrou-se 0.24 mg/kg, equivalente a
20% do veneno bruto.
O experimento controle, nos dois períodos de tratamento, não apresentaram
nenhuma alteração no comportamento. Após eutanásia, na análise macroscópica
não se observou alterações nos órgãos ou tecidos coletados.
Os animais pertencentes aos grupos experimentais de 6h e 24h, tratados com
Bj-V, apresentaram alterações comportamentais como dor e agitação durante as 24h
durante o período de tratamento. Após o período de 6h de tratamento, o músculo do
local da picada apresentou coloração escura, devido a hemorragia seguido de
necrose. Nos animais tratados com Bj-V após 24h, a hemorragia havia se espalhado
para o abdômen do animal e entre o músculo. Nesses animais, as amostras dos
músculos foram coletadas com cuidado, por causa da necrose, devido à perda de
fibras musculares que são degradadas por enzimas proteolíticas presentes no
veneno. Apesar disso, não houve perda de nenhum camundongo durante o
experimento.
46
Os camundongos do grupo experimental tratados com Bj-FBP não
apresentaram mudanças no comportamento em todos os tempos avaliados. Após a
eutanásia, não foram observadas alterações macroscópicas, ou seja, sem indícios
de hemorragia no local de administração da Bj-FBP. Após eutanásia, os testículos e
fragmentos do músculo foram coletados.
No grupo de animais controle, observou-se a presença de miócitos
multinucleados com fibras musculares longas conforme esperado (Figura 6A). Por
outro lado, nos animais tratados com Bj-V verificou-se intensa hemorragia no local
de aplicação do veneno após 24h, caracterizada pela perdao das fibras musculares,
mantendo a presença dos núcleos celulares e necrose tecidual (Figura 6B). Já os
animais tratados com Bj-FBP não apresentaram hemorragia no local da
administração da amostra, mas observou-se intensa migração leucocitária na
estrutura das fibras musculares (Figura 6C).
47
48
Figura 6. Análise morfológica do músculo reto femoral de camundongos tratados ou não com Bj-V ou Bj-FBP após 24h. (A) Imagem capturada por microscopia óptica dos músculo reto femoral de camundongos machos controle após 24h. Aumento 20x; (B) Músculo reto femoral de camundongos machos Bj-V após 24h. Aumento 20x. (C) Músculo reto femoral de camundongos machos Bj-FBP após 24h. Aumento 20x.
4.3. Caracterização histopatológica dos túbulos seminíferos em camundongos
após envenenamento induzido com Bj-V e Bj-FBP
Os testículos foram analisados morfologicamente para avaliar o grau de
comprometimento dos túbulos seminíferos em relação aos diferentes grupos
experimentais. Verificou-se que os camundongos do grupo experimental controle
apresentam morfologia normal ou com pequenas alterações, pois mesmo em
condições fisiológicas normais são encontrados túbulos com alguma alteração.
Nesse grupo, observa-se a morfologia do epitélio seminífero com túbulos
seminíferos arredondados, presença de espermatogônias no compartimento basal,
espermatócitos no compartimento adluminal e as espermátides alongadas próximo
ao lúmen. Ainda, apesar de não ser muito freqüente, é possível identificar os túbulos
seminíferos com rupturas no compartimento adluminal (Figura 7A, B).
Em camundongos tratados com Bj-V no período de avaliação de 24h,
verificou-se túbulos seminíferos com ruptura no compartimento adluminal, ausência
de lúmen, desorganização celular e túbulos hipoespermatogênicos com presença de
células espermatogênicas no compartimento intertubular (Figura 7 C,D).
No grupo experimental de 24h tratado com Bj-FBP, verificou-se com mais
freqüência, intensa ruptura no compartimento adluminal nos túbulos seminíferos
(Figura 7E, F).
49
Figura 7. Análise histopatológica do testículo de camundongos tratados com Bj-V ou Bj-FBP.
Imagem capturada de microscopia óptica de túbulos seminíferos de camundongos. (A,B) grupo
experimental controle. Aumento 20x. (C,D) Grupo experimental Bj-V. Aumento 20x-50x. (E,F) grupo
experimental Bj-FBP. Aumento 20x.
Como esperado, nos animais controle verificou-se a presença de túbulos com
as quatro classificações, mas predominantemente classificados como túbulos
normais (categoria 0) (Figura 8). A caracterização histopatológica do epitélio
50
seminífero de camundongos tratados com Bj-V após o período de 24h indicou, em
relação ao grupo controle, a redução da quantidade de túbulos íntegros, mas um
aumento de túbulos hipoespermatogênicos, presença de células no compartimento
intertubular, ruptura e presença de vacúolos no compartimento adluminal. Por outro
lado, observou-se nos camundongos tratados com Bj-FBP a presença de túbulos
com ausência de lúmen ou com desorganização celular, mas não intensas quanto
aos efeitos do Bj-V. Em camundongos tratados com Bj-FBP as alterações mais
freqüentes foram os túbulos com ausência de lúmen ou com desorganização celular,
onde encontram-se células do compartimento adluminal dispersas no lúmen.
Figura 8. Análise histopatológica de testículos de camundongos tratados ou não com Bj-V e Bj-FBP. Os valores foram apresentados como média ± desvio padrão a partir da classificação de 200 túbulos seminíferos escolhidos aleatoriamente para classificação (0-3) e analisados pelo teste estatístico ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Tukey*p<0,05; **p<0,01; e ***p<0,001. (n=3).
51
5 - DISCUSSÃO
52
Os acidentes ofídicos são considerados um problema de saúde pública
devido à sua letalidade. Por este motivo, há necessidade de se realizar estudos de
caracterização do veneno, bem como os de tratamentos e da fisiopatologia do
envenenamento. Os componentes do veneno possuem especificidade com vários
receptores teciduais humanos, podendo desestabilizar o sistema nervoso,
cardiovascular ou hemostático. O envenenamento por viperídeos, como descrito na
literatura, é caracterizado pela desestabilização do sistema hemostático causando,
principalmente, hemorragia local e sistêmica, e necrose tecidual ocasionada pelas
metaloproteinases presentes no veneno, essas enzimas promovem a degradação
dos componentes da membrana basal dos capilares sanguíneos, causando o
rompimento das paredes dos vasos e liberação do sangue para o tecido intersticial
(GUTIÉRREZ et al., 2005).
Com o objetivo de mimetizar os efeitos do envenenamento, a administração
do veneno foi realizada por via intramuscular, no músculo reto femoral, local de
maior incidência nos acidentes ofídicos (BRASIL, 2009). Os acidentes ofídicos
acometem principalmente homens jovens no período de calor, a inoculação
geralmente ocorre nos membros inferiores ou nas mãos (BRASIL, 2009). A dose
utilizada para induzir o envenenamento foi de 1.2 mg/kg, valor superior a dose
mínima hemorrágica, que causa um halo hemorrágico de 10 mm (1cm2). Essa dose
foi necessária para desencadear os efeitos do envenenamento local e sistêmico
conforme descrito por GUTIÉRREZ e colaboradores (1980).
Para definir a concentração da fração de baixo peso molecular a ser
administrada (Bj-FBP) foi realizado o cálculo do peso inicial do veneno bruto
liofilizado (2g) e o peso final de baixo peso molecular liofilizado (0.2g). Assim, os
53
grupos tratados com Bj-FBP receberam uma dose de 0.24 mg/kg, equivalente a 20%
do veneno bruto.
Fosfolipases A2, presentes no veneno da Bj, possuem massa molecular de 13
a 18 kDa e apresentam alta atividade miotóxica, sendo responsáveis pela necrose
tecidual, observada no local de inoculação do veneno (SCHWEITZ et al., 1992;
FERREIRA et al., 1992). Os camundongos tratados com o veneno bruto (Bj-V)
apresentaram hemorragia e necrose tecidual, no local de inoculação do veneno.
Após 24h da inoculação do veneno observou-se que os animais tratados com Bj-V
apresentavam intensa hemorragia abdominal e necrose tecidual no local de
inoculação do venenos.
As metaloproteinases têm como principal característica a relação à toxicidade
do veneno por causarem formação de edema, inflamação, sangramentos e necrose
(BJARNASON & FOX, 1995; FOX & SERRANO, 2005; TAKEDA et al., 2012) e
também são responsáveis pelos fatores primários do envenenamento, como
hemorragia local e sistêmica (GUTIÉRREZ et al., 2005; TAKEDA et al., 2012); as
hemorraginas rompem o endotélio vascular, degradando vários componentes da
matriz extracelular, além de serem um potente inibidor da agregação plaquetária
(FRANÇA & MÁLAQUE, 2009). Degradação da lamina basal e do colágeno são
efeitos das toxinas hemorrágicas e são altamente neutralizadas pelos antivenenos
(GUTIÉRREZ, 1990).
Nos animais tratados com Bj-V após 24h, observou-se a presença de
necrose, devido à perda de fibras musculares, aumento de núcleos celulares. Isso
ocorre pela presença de fosfolipases A2 (PLA2), presente no veneno bruto da Bj.
PLA2 quando injetado intramuscular resulta em necrose do músculo no local de
inoculação ou nas proximidades da injeção (GUTIÉRREZ et al., 1998). A inoculação
54
do veneno no tecido muscular resulta em multiplicidade celular e reações do tecido,
alguns dos quais são consequências da ação direta dos componentes do veneno,
considerando que outros dependem das respostas teciduais que seguem os danos
induzidas pelo veneno. PLA2 são responsáveis pela indução local de mionecrose e
lesões nos vasos linfáticos.
Os camundongos tratados com Bj-FBP não apresentaram hemorragia, porque
todas as proteínas responsáveis pela hemorragia possuem mais que 10 kDa e não
estão presentes na fração. As fibras musculares foram preservadas, mas houve
migração leucocitária entre as fibras musculares.
Estudos da literatura mostraram que os componentes do veneno possuem
similaridade com componentes presentes na espermatogênese dentro dos túbulos
seminíferos (GILIO et al., 2013). A isoforma testicular da enzima conversora de
angiotensina (ECAt) está presente exclusivamente nas células germinativas durante
a espermatogênese no testículo e no espermatozóide maduro (PAULS et al., 1999;
HAGAMAN et al., 1998).
KONDOH e colaboradores (2005) demonstraram que a ECAt é de
fundamental importância no processo de fertilização devido à liberação de proteínas
ancoradas por GPI (glicosil-fosfatidil-inositol), como a PH-20 e TESP-5 fundamentais
para a ligação do espermatozóide na superfície do oócito. Identificaram também
uma nova atividade para ECAt que proporciona a liberação dessas proteínas por
meio de clivagem entre duas manoses na molécula de GPI, determinada como
atividade endomanosidase. Adicionalmente, observaram que a modificação dos
aminoácidos no motif catalítico da ECAt não interfere na atividade endomanosidase,
demonstrando que a liberação das proteínas ancoradas por GPI é independente da
atividade peptidásica (LEISLE et al., 2005).
55
No epitélio seminífero de camundongos tratados com Bj-V e Bj-FBP verificou-
se alguns túbulos seminíferos hipoespermatogênicos e com maior freqüência de
túbulos apresentando desorganização celular, ruptura no compartimento adluminal
ou células atípicas no lúmen. Segundo Gilio e colaboradores (2013) após
administração intraperitoneal de BPP-10c, os túbulos seminíferos mostraram intensa
ruptura do epitélio, presença de células multinucleadas atípicas no lúmen e
degeneradas células germinativas no compartimento adluminal, sem afetar a
permeabilidade da barreira de células de Sertoli e a distribuição da Claudina-1.
Outros BPPs também foram testados, como por exemplo, o BPP-5a e BPP-9a, que
são inibidores naturais da ECAs, são também inibidores da ECAt in vitro na ordem
de nanomolar (FARIAS et al., 2006; SIBONY et al., 1994). O Captopril e seus
derivados também não afetam a atividade da ECAt in vivo, sugerindo que essas
drogas não atravessam a barreira de células de Sertoli, inibindo a enzima
(SAKAGUSHI et al., 1988; JACKSON et al., 1988).
Dados do nosso grupo demonstraram que o BPP-11eAP apresentou intenso
comprometimento da espermatogênese nos túbulos seminíferos, onde foi possível
identificar túbulos seminíferos hipoespermatogênicos, ou seja, túbulos somente com
células de Sertoli, intensa perda de células germinativas para o lúmen e para o
compartimento intertubular.
As alterações observadas na análise histopatológica do testículo foram
discretas, devido ao envenenamento ter sido intramuscular e distribuído
sistemicamente. Na análise histopatológica do testículo observou-se que nos
animais controle apresentavam túbulos seminíferos com as quatro classificações,
mas predominantemente os túbulos classificados como normais (classificação 0),
pois mesmo em condições fisiológicas normais são encontrados túbulos com alguma
56
alteração. Nesse grupo, observa-se a morfologia do epitélio seminífero com túbulos
seminíferos arredondados, presença de espermatogônias no compartimento basal,
espermatócitos no compartimento adluminal e as espermátides alongadas próximo
ao lúmen. No grupo experimental tratado com Bj-V observa-se com maior freqüência
túbulos com classificação 2 e 3, com um maior comprometimento no epitélio
seminífero. Os animais tratados com Bj-FBP também apresentaram diferenças
estatísticas, mas com um comprometimento no epitélio seminífero mais discretas
que o grupo tratado com Bj-V.
Em síntese, os resultados demonstraram que o envenenamento por Bj pode
afetar os túbulos seminíferos, levando a presença de túbulos hipoespermatogênicos,
sendo assim, os indivíduos acometidos pelo acidente ofídico podem apresentar
algum comprometimento na espermatogênese.
57
6 – CONSIDERAÇÕES FINAIS
58
Os resultados deste estudo demonstraram que a Bj-FBP obtida não
apresentam proteínas ou enzimas proteolíticas com massa molecular superior a 10
kDa, por não apresentarem bandas acima de 1500 m/z na espectrometria de
massas. Os níveis de creatinina sérica do grupo experimental de 24h demonstrou
aumento significativo em relação aos do grupo de 6h, indicando possível perda
muscular, pois os níveis de creatinina são proporcionais a massa muscular do
animal. Sugerem também que o envenenamento intramuscular pela serpente Bj,
pode levar à alterações locais e sistêmicas como observado, apresentando
hemorragia local e necrose tecidual. Microscopicamente, observa-se perda de fibras
musculares e aumento de núcleos celulares, enquanto que a Bj-FBP promove
aumento de células leucocitárias no locam de inoculação, sugerindo uma possível
inflamação no tecido.
Ainda, foi possível observar que, os camundongos tratados com Bj-V e Bj-
FBP apresentaram alterações morfológicas nos túbulos seminíferos, sendo
observado ruptura do epitélio seminífero, desorganização celular, onde células
imaturas migram para o lúmen do túbulo.
Mediante essas evidências sugere-se que o envenenamento por Bj-V pode
promover alteração na dinâmica do epitélio seminífero o que pode levar a alterações
na espermatogênese.
59
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