UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE – UFRN
CENTRO DE TECNOLOGIA – CT
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA – DEQ
VITOR FERNANDES DIAS LOPES
OBTENÇÃO DO EXTRATO DA RUMEX ACETOSA COM ETANOL
PRESSURIZADO
NATAL-RN
2017
VITOR FERNANDES DIAS LOPES
OBTENÇÃO DO EXTRATO DA RUMEX ACETOSA COM ETANOL
PRESSURIZADO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, como parte dos requisitos para obtenção do título de Bacharel em Engenharia Química.
Orientador: Prof. Dr. Humberto Neves Maia de Oliveira
Co-orientador: Dr. Ênio Rafael de Medeiro Santos
NATAL-RN
2017
Resumo
Os compostos oxidantes são indicados por diversos estudos como responsáveis por
diversas doenças degenerativas no corpo humano, como envelhecimento e doenças
cardiovasculares. No intuito de cessar seus efeitos e inibi-los, os antioxidantes
apresentam um papel fundamental. Estes são, em geral, compostos fenólicos e podem
ser de origem sintética ou natural, estes últimos são geralmente metabolizados pelo
organismo de plantas. A Rumex acetosa é uma delas, a qual apresenta uma vasta gama
destes compostos na sua raiz, despertando o interesse de pesquisas cientificas no âmbito
de extraí-los. Para que isso ocorra de forma limpa, rápida e eficaz, foi escolhida a
extração com líquido pressurizado (ELP) com etanol como solvente, a qual consiste na
pressurização deste líquido em altas temperaturas, de modo que permaneça em estado
líquido, melhorando a solubilização do analito de interesse. Este trabalho visa estudar a
influência da vazão do solvente e do tempo de extração no rendimento do processo,
solubilidade do substrato no solvente, poder antioxidante e teor de fenóis totais, através
das curvas cinéticas de extração, método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-
hidrazil, DPPH e método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, respectivamente. O
rendimento variou proporcionalmente com a vazão e o tempo de extração, de 7,27 % a
10,81 %. Contudo, a solubilidade dos compostos no solvente não permaneceu na mesma
ordem de grandeza em todas as extrações, variando entre 0,0418 g/g e 0,0721 g/g, assim
como a composição de fenóis totais e o poder antioxidante (medido como EC50) das
amostras, os quais se apresentaram, também, todos na mesma ordem de grandeza,
variando de 149,80 mg/g a 181,63 mg/g; e 18,32 µg/mL a 22,84 µg/mL,
respectivamente. Isso demonstra que todas as vazões, na faixa estudada, estão
promovendo a saturação do analito no solvente.
Palavras chave: Rumex acetosa. Extração com líquidos pressurizados. Solubilidade
Atividade antioxidante.
Abstract
The oxidant compounds are indicated by many studies as responsible for various
degenerative diseases in the human body, as aging and cardiovascular issues. Aiming to
inhibit and cease its effects, the antioxidants have a fundamental role. Those are at
large, phenolic compounds and can have a synthetic or natural origin, with the last ones
being, in general, metabolized by the organism of plants. One of them is Rumex
acetosa, which presents a large amount of those compounds in its roots, arousing
interest in scientific researches to extract them. To accomplish this in a clean, fast and
effective way, pressurized liquid extraction (PLE) with ethanol as solvent was chosen,
which consists in pressurize the liquid at high temperatures, causing it to remain in the
liquid state, enhancing the solubilization of the interest analyte. This work aims to study
the influence of the flow rate of solvent and time of extraction in the process’ yield,
solubilization of substrate in the solvent, antioxidant power, and total phenolic content,
through kinetics extraction graphics, method of capture of the 2,2-difenil-1-picril-
hidrazil, DPPH radical and spectrophotometric method of Folin-Ciocalteau,
respectively. The yield varied proportionally with the flow rate and time of extraction
from 7,27 % to 10,81 %. However, the solubility of the compounds in the solvent
remained basically the same order of magnitude in all the extractions, varying from
0,0418 g/g to 0,0721 g/g, the same way as the total phenolic content and antioxidant
power (measured as EC50) of the samples, which also remained all in the same order of
magnitude, varying from 149,80 mg/g to 181,63 mg/g and 181,63 µg/mL to 18,32
µg/mL, respectively. This shows that all flow rates, in the range studied, are promoting
the saturation of the analyte in the solvent.
Keywords: Rumex acetosa. Pressurized Liquid Extraction. Solubility. Antioxidant
activity.
Sumário
1. Introdução............................................................................................................1
2. Revisão Bibliográfica...........................................................................................2
2.1. Rumex acetosa...............................................................................................2
2.2. Extração com Líquido Pressurizado (ELP)...................................................2
2.2.1. Curva cinética e etapas de extração......................................................3
2.2.2. Vazão e Solubilidade............................................................................4
2.3. Antioxidantes................................................................................................5
2.4. Métodos de Análise.......................................................................................6
2.4.1. Método espectrométrico Folin-Ciocalteau..........................................6
2.4.2. Método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil, DPPH..7
3. Materiais e Métodos...........................................................................................8
3.1. Preparação da matéria-prima.........................................................................8
3.2. Extração com Líquido Pressurizado .............................................................8
3.3. Preparo da solução das amostras.................................................................10
3.4. Obtenção do rendimento, da curva cinética da extração e solubilidade......10
3.5. Determinação da atividade antioxidante (EC50)..........................................10
3.6. Determinação do teor de fenóis totais (TFT)...............................................12
4. Resultados e Discussões.....................................................................................14
4.1. Rendimento e Solubilidade..........................................................................14
4.2. Teor de Fenóis Totais..................................................................................16
4.3. Atividade Antioxidante................................................................................17
5. Conclusão............................................................................................................20
6. Referências.........................................................................................................21
Índice de Figuras
Figura 2.1: Rumex acetosa ("Azedinha). Fonte:
(http://rawedibleplants.blogspot.com.br/2013/12/common-sorrel-rumex-acetosa.html)..2
Figura 2.2: Exemplo de curva cinética de extração, apresentando o ajuste linear para as
curvas das etapas CER e FER. Fonte: Santos (2017)........................................................4
Figura 2.3: Mecanismo de ação dos antioxidantes, em que ROO• e R• são radicais livres
estabilizados pelo antioxidante AH, o qual gera os compostos ROOH e RH e A•,
estáveis. Fonte: Casagrande (2014)...................................................................................5
Figura 2.4: Ração do Molibdênio (um dos componentes do reagente de Folin-
Ciocalteau) e ácido gálico em meio alcalino, causando redução do Mo+6 para Mo+5,
acarretando em mudança de cor do meio. Fonte: Oliveira, et al (2009)............................6
Figura 2.5: Reação do DPPH com BHT (antioxidante sintético). Fonte: Santos (2015)..7
Figura 3.1: Raíz seca da Rumex acetosa. Fonte: Santos (2013)........................................8
Figura 3.2: Esquema da unidade de ELP, em que V-1, V-2: válvulas agulha
macrométricas; V-3: válvula agulha micrométrica; R-1: frasco com etanol; R-2: coletor
de extrato; P-1: bomba de solvente; E-1 coluna extratora; B-1: banho termostatizado; T-
1: termopar; M-1: manômetro. Fonte: Santos (2017)........................................................9
Figura 4.1: Curva cinética das extrações de rendimento versus tempo...........................14
Figura 4.2: Curvas cinéticas das extrações, mostrando a massa acumulada de extrato
versus massa utilizada de solvente..................................................................................15
Figura 4.3: Curvas cinéticas das extrações, mostrando a massa acumulada de extrato
versus massa utilizada de solvente, com os ajustes lienar para as retas das etapas CER e
FER das extrações de 150 bar e 80 ° C com: 0,5 mL/min e 3h (a); 1,5 mL/min e 3h (b);
2,0 mL/min e 4h (c); e 3,0 mL/min e 4h (c)....................................................................16
Figura 4.4: Curvas de AS (%) versus concentração com suas respectivas equações da
reta, par as extrações 1 (150 bar; 80 °C; 0,5 ml/min; 3h) (a); 2 (150 bar; 80 °C; 1,5
ml/min; 3h) (b); 3 (150 bar; 80 °C; 2,0 ml/min; 4h) (c) e 150 bar; 80 °C; 3,0 ml/min; 4h
(d).....................................................................................................................................18
Índice de Tabelas
Tabela 3.1: Volumes de diluição para as soluções de amostras e obtenção das curvas de
AS (%).............................................................................................................................11
Tabela 3.2: Volumes de diluição para a obtenção da curva padrão de àcido gálico......12
Tabela 3.3: Volumes de diluição das amostras...............................................................13
Tabela 4.1: Rendimento e solubilidade de cada extração nas condições estudadas.......16
Tabela 4.2: Absorbâncias médias obtidas nos ensaios de Folin-Ciocalteau e os
resultados de EAG e TFT para o extrato de cada extração.............................................17
Tabela 4.3: Concentração final corrigida dos ensaios de DPPH, juntamente com os
resultados de absorbância média e os cálculos de AS (%)..............................................17
Tabela 4.4: Resultados de EC50 para cada extração.......................................................19
1
1. Introdução
Os radicais livres e as substâncias oxidantes são indicados, por várias
evidências, como os grandes responsáveis por doenças degenerativas, como o
envelhecimento, câncer, doenças cardiovasculares, catarata, declínio do sistemas
imune, disfunções cerebrais, aterosclerose, inflamações, entre outras (Santos,
2013; Shahidi et. al, 2015; Sousa et. al; 2007). Sua produção é controlada
através dos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena, ou adquiridos
através de dieta alimentar ou medicamentos e atuam estabilizando, ou
desativando os radicais livres antes que ataquem as células (Sousa et. al; 2007).
Antioxidantes podem ser sintéticos ou naturais. Os primeiros são obtidos
através de manipulação química, mas estão caindo em desuso devido ao fato de
apresentarem riscos à saúde. Portanto, as pesquisas por fontes naturais desse tipo
de substância vêm crescendo nos últimos anos. Eles são comumente encontrados
em plantas, frutas, vegetais, cereais, grãos, entre outros, e podem ser isolados
como compostos puros para uso nutracêutico e farmacêutico (Shahidi et. al,
2015). Os compostos fenólicos são antioxidantes poderosos gerados
naturalmente pelo metabolismo de plantas (Stalikas, 2007).
Assim, a “Azedinha” (Rumex acetosa) é uma herbácea encontrada em
clima temperado da Europa, Ásia e no Brasil nas regiões entre Minas Gerais e
Rio Grande do Sul (Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento, 2010) e
de grande interesse, porque apresenta uma vasta gama de compostos fenólicos
(Kemper, 1999).
Para a obtenção de maneira limpa, rápida e simples, e sem deteriorar os
compostos bioativos sensíveis pela presença de oxigênio e luz, a extração com
líquido pressurizado (ELP) é uma das mais utilizadas para a obtenção desses
compostos (Herrero, 2015; Nieto et. al, 2010). A técnica consiste no uso de
solvente a alta pressão e temperatura, de modo que se mantenha no estado
líquido (Herrero, 2015). As condições de operação como temperatura, pressão,
solvente utilizado e vazão podem alterar o rendimento da extração e a
seletividade do analito (Mustafa et. al, 2011).
Ademais, o estudo da otimização do método de extração dos compostos
fenólicos antioxidantes da Rumex acetosa é de grande importância para a
sociedade, pois busca alternativas mais econômicas, limpas e eficazes, para se
produzir compostos importantes e benéficos à saúde humana.
Dessa forma, este trabalho tem o objetivo de utilizar a ELP com etanol
como método de obtenção dos compostos fenólicos antioxidantes da raiz da
Rumex acetosa e avaliar suas curvas cinéticas, no intuito de analisar a influência
da vazão e do tempo de extração em seus rendimentos e solubilidades. Além
disso, será quantificada e avaliada a atividade antioxidante e os fenóis totais de
cada extração.
2
2. Revisão Bibliográfica 2.1 Rumex acetosa
É uma herbácea perene da família Plygonaceae conhecida popularmente
por “azedinha”, mede cerca de 20 cm de altura, é composta de folhas verdes e
sagitadas, com flores avermelhadas formando uma panícula. A planta é natural
das regiões de clima temperado (geralmente entre 5 e 30°C) da Europa e Ásia, e
é considerada exótica no Brasil, sendo cultivada entre os estados de Minas
Gerais e Rio Grande do Sul (Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento,
2010; Franzener 2013; Souto 2010).
Suas folhas e raízes possuem componentes importantes para quesitos
nutricionais e medicinais (Franzener, 2013), como por exemplo oxalatos,
taninos, derivados do antraceno, quinoides e flavonoides (Kemper, 1999). Seu
uso está relacionado, principalmente, a concentração de taninos antioxidantes, a
qual está ligada com o tratamento medicinal de irritações na pele e diarreia
(Bicker, 2009), além de também ser usada como diurético, tônico da primavera e
ingrediente para remédio de câncer (Kemper, 1999), embora o alto teor de ácido
oxálico limite seu uso por aqueles que sofrem de doenças renais (Santos, 2016).
A Figura 2.1 mostra as folhas da “Azedinha” com suas flores.
Figura 2.1: Rumex acetosa ("Azedinha). Fonte:
(http://rawedibleplants.blogspot.com.br/2013/12/common-sorrel-rumex-acetosa.html)
2.2 Extração com Líquido Pressurizado (ELP)
A técnica foi primeiramente introduzida na conferência Pittcon pela
empresa Dionex em 1995 pelo nome de extração com solvente acelerado (ASE)
3
(Mustafa, 2011). Hoje também é conhecida como Extração com líquido
pressurizado (ELP), extração com solvente-quente pressurizado (PHSE) e
extração com fluido pressurizado (PFE). Este processo consiste no uso de
solventes pressurizados em altas temperaturas, sempre abaixo do seu ponto de
ebulição, de forma que permaneçam no estado líquido (Herrero, 2015), sendo
considerada uma técnica simples, rápida, pouco complicada e fácil de aprender
(Nieto et. al, 2010). Sob estas condições a taxa de transferência de massa entre
analito e solvente é incrementada, pois aumentam sua solubilidade, diminuindo
a viscosidade e tensão superficial do líquido, assim conseguindo uma maior
penetração na matriz, alcançando áreas mais profundas e aumentando a
superfície de contato (Herrero, 2015).
Na maioria dos casos, ELP exige pouco volume de solvente e um tempo
menor de extração comparado a outros métodos (Herrero, 2015), além de ser
considerada uma técnica “verde”, ou seja, que não prejudica tanto o meio
ambiente, uma vez que usa solventes menos nocivos ao meio ambiente
(comparados a outros já utilizados) tais como álcoois (metanol e etanol), alcanos
(Heptano e hexano) ou água. A escolha do solvente depende do analito desejado,
sendo necessária sua excelente solubilização no líquido, enquanto os outros
compostos indesejados devem ter nenhuma ou pouca solubilização (Mustafa,
2011).
ELP é conduzida em um ambiente livre de oxigênio e luz (Stalikas,
2007), portanto é ideal e tem sido amplamente empregado na extração de
compostos bioativos sensíveis de plantas, diminuindo sua degradação (Herrero,
2015). Estudos mostram que este método leva vantagens em relação aos
métodos convencionais, uma vez que é mais econômico em relação ao solvente
e material utilizado, rápido e possui um rendimento melhor ou aproximado a
estes (Mustafa, 2011). Contudo, a sua limitação consiste no fato da seletividade
do analito de interesse não ser tão eficaz quanto pode ser desejado dependendo
do objetivo da extração, incluindo a possibilidade de conter interferentes, e a
ocorrência de sua diluição (Nieto et. al, 2010).
2.2.1 Curva cinética e etapas da extração
A curva cinética característica da extração é obtida plotando um
gráfico da massa acumulada de extrato seco em função da massa de solvente
acumulado, ou do tempo. Esta curva apresenta todas as etapas da extração
(Santos, 2013) e é uma resposta ao fluxo de solvente entrando no extrator.
Ela se mostra mais eficaz na comparação de experimento com mesmos
substratos e equipamentos, uma vez que é altamente influenciável pelos
parâmetros do processo (Oliveira, 2010).
A extração pode ser dividida em três etapas: CER, FER e DF, as
quais estão descritas abaixo.
Na etapa CER (constant extraction rate), a taxa de extração é
constante e predomina-se a transferência de massa através da convecção,
sendo o soluto disponível na interfase sólido/fluido, ou seja, na superfície
4
externa das partículas. Esta etapa pode corresponder a 50% do rendimento
total (Oliveira, 2010; Santos, 2013).
Já na etapa FER (falling extraction rate), a taxa de extração é
decrescente e ocorre a transferência de massa difusional, além da convectiva.
Isto deve-se ao fato do extrato na interface sólido/fluido se esgotar,
promovendo o aumento da resistência à transferência de massa. Nessa etapa,
o rendimento pode ultrapassar os 70% do rendimento total (Oliveira, 2010;
Santos, 2013).
Por fim, na última etapa, a etapa DC (diffusion-cotrolled), onde há
predominantemente a transferência de massa por difusão, de modo que a
resistência à transferência de massa é muito elevada e a taxa de extração é
praticamente nula (Oliveira, 2010; Santos, 2013).
A curva é importante para o estudo de parâmetros do processo,
como tempo de extração, caracterização das etapas, determinação da
solubilidade, modelagem da transferência de massa e aumento de escala
(Oliveira, 2010). Um exemplo de curva cinética com as retas ajustadas para a
etapa CER e FER está representado na Figura 2.2.
Figura 2.2: Exemplo de curva cinética de extração, apresentando o ajuste linear para as
curvas das etapas CER e FER. Fonte: Santos (2017).
2.2.2 Vazão e Solubilidade
A solubilidade é a razão entre a massa de extrato pela massa de
solvente consumido (Queiroz, 1993). Na etapa CER, a taxa constante de
extração é controlada pela solubilidade do equilíbrio, podendo corresponder
à metade da extração (Santos, 2013). Nesta etapa, a saturação está
5
relacionada à vazão do solvente, uma vez que o tempo de residência do
solvente na coluna, deve garantir um tempo de contato mínimo, com a
matéria-prima, para que isso aconteça (Galvão, 2009).
Portanto, para cada condição de operação, há uma faixa de vazões
que permite essa saturação (Queiroz, 1993). As vazões mais elevadas tendem
a aumentar a taxa da extração, já que a razão entre quantidade de solvente e
massa de matéria-prima é aumentada, favorecendo o contato entre eles
(Santos, 2017). Porém, se muito elevadas, não permitirão que o solvente
permaneça o tempo certo na coluna para solubilizar o extrato, podendo até
gerar um rendimento maior, mas sem extrair os compostos de interesse
(Queiroz, 1993).
Para o cálculo da solubilidade, foi utilizado o método de Draper e
Smith, já utilizado por Galvão (2009), Queiroz (1993) e Santos (2013), de
modo que se estimam duas retas, em um gráfico massa de extrato acumulada
versus massa de solvente utilizada, correspondentes as etapas CER e FER,
como as retas da Figura 2.2 (Queiroz, 1993). Então, o coeficiente angular da
reta da etapa CER corresponde à solubilidade do extrato no solvente e a
interseção entre as duas retas é o tempo final desta etapa e inicio da etapa
FER (Santos, 2013).
2.3 Antioxidantes
Antioxidantes são compostos que podem retardar, prevenir ou inibir a
oxidação de materiais, diminuindo o estresse oxidativo (estado onde a
capacidade antioxidante endógena é superada, levando a oxidação de
macromoléculas, como enzimas e lipídeos). (Dai et al., 2010). O aparecimento
excessivo de radicais pode causar danos a células e tecidos do corpo humano,
além de acelerar o processo de envelhecimento e o aparecimento de células
cancerígenas. Assim, os antioxidantes reduzem estes efeitos, já que conseguem
doar elétrons ou átomos de Hidrogênio e cessar a formação de radicais livres e
reações de oxidação em cadeia. (Oliveira, 2010), como mostrado na Figura 2.3.
Figura 2.3: Mecanismo de ação dos antioxidantes, em que ROO• e R• são radicais livres
estabilizados pelo antioxidante AH, o qual gera os compostos ROOH e RH e A•,
estáveis. Fonte: Casagrande (2014).
Eles podem ser naturais ou sintéticos, sendo que os sintéticos apresentam
restrições no uso em alimentos, pelo fato de serem considerados carcinogênicos.
Em vista disso, a busca pelos naturais vem crescendo, principalmente dos
extraídos de plantas. Uma espécie antioxidante amplamente utilizada e
encontrado nelas são os compostos fenólicos, os quais são substancias que
6
possuem anel aromático com um ou mais substituinte hidroxílico (Oliveira,
2010) e funcionam como aceptores de radicais livres e quebradores de cadeia,
cessando a atividade oxidante. (Dai et al., 2010).
2.4 Métodos de Análises
2.4.1 Método espectrofotométrico Folin-Ciocalteau
A quantidade de fenóis totais é uma importante medida na
quantificação do poder antioxidante de uma amostra e amplamente usada na
determinação dessa medida em extratos de plantas, frutas, cereais e legumes
(Shahid et. al, 2015). Entre os métodos utilizados para este fim, o método
espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau (F-C) é um dos mais
extensivamente utilizados. (Sousa et. al, 2007). Inicialmente, o
procedimento foi desenvolvido por Folin e Ciocalteau para a quantificação
de tirosina (Folin & Ciocalteau, 1927; Santos, 2013) e posteriormente foi
adaptado por Singleton e Rossi, em 1965, para a avaliação de fenóis totais
em vinhos (Singleton & Rossi, 1965; Santos, 2013), se tornando uma análise
de rotina para a determinação de atividade antioxidante de alimentos e
extratos de plantas (Shahidi, et. al, 2015).
A análise consiste no uso de uma mistura de ácido
fosfomolibídico e fosfotuguístico como reagente, onde o molibdênio e o
tungstênio se encontram no estado de oxidação +6 (Sousa et. al, 2007). Em
meio alcalino e na presença de agentes redutores, eles são reduzidos ao
estado +5 (Figura 2.4), onde apresentarão coloração azul com absorbância
máxima em 765nm. Os compostos fenólicos conseguem doar o elétron
necessário para a redução (Shahidi, et. al, 2015), portanto, a coloração da
substancia permite a determinação da concentração dessas substâncias
(Sousa et. al, 2007). Na maioria dos casos, para esta quantificação são
utilizadas análises espectrofotométricas (Santos, 2013).
Figura 2.4: Ração do Molibdênio (um dos componentes do reagente de Folin-
Ciocalteau) e ácido gálico em meio alcalino, causando redução do Mo+6 para Mo+5,
acarretando em mudança de cor do meio. Fonte: Oliveira, et al (2009).
7
As vantagens do método são sua simplicidade, reprodutibilidade e
robustez. Porém, as condições da reação, como pH, temperatura e tempo de
reação, afetam bastante o resultado final, devendo ser controladas para a
obtenção de resultados mais confiáveis (Shahidi, et. al, 2015). O tempo
médio para a reação é de duas horas, podendo ser reduzido com o
aquecimento da amostra (Santos, 2013). O ácido gálico é usualmente usado
como padrão e, em vista disso, o resultado é expresso em equivalente em
ácido gálico (Shahidi, et. al, 2015).
2.4.2 Método do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-
hidrazil, DPPH
O DPPH é um radical livre estável a temperatura ambiente, o qual
apresenta uma coloração violeta quando em solução com etanol e possui
absorção máxima em 517nm (Oliveira, 2010). Este composto é amplamente
utilizado em testes da capacidade antioxidante de soluções, já que se pode
considera-la como a capacidade de doar elétron, ou seja, o poder de redução,
e esta substancia é capaz de receber elétrons para a sua neutralização (Shahid
et al, 2015).
Quando o radical DPPH recebe um elétron ou um hidrogênio,
torna-se mais estável e sua absorção diminui (Oliveira, 2010), causando
alteração na cor visível, a qual a intensidade da descoloração é um indicador
da capacidade antioxidante. A leitura deve ser feita através de um
espectrofotômetro UV (Shahid et al, 2015). A Figura 2.5 demonstra como
um antioxidante fenólico (BHT) consegue estabilizar o radical livre presente
no DPPH.
Figura 2.5: Reação do DPPH com BHT (antioxidante sintético). Fonte:
Santos (2015).
8
3. Materiais e Métodos
3.1 Preparação da matéria-prima
A matéria-prima utilizada nos experimentos foi a raiz da Rumex acetosa,
obtida pela empresa Trisâmya Produtos Naturais e Ervas Medicinais, localizada
em Santa Catarina, Brasil. As amostras são de lote único e foram colhidas em
2015 (maio-agosto) sendo secas ao sol e com auxílio de estufa a gás.
Figura 3.1: Raíz seca da Rumex acetosa. Fonte: Santos (2013).
Para serem utilizadas nos experimentos, a matéria-prima bruta foi
submetida a um processo de trituração em um liquidificador doméstico (Arno,
modelo MPAC, Brasil) e posteriormente processada através de peneiramento em
um sistema vibratório (Bertel, modelo 1868, Caieiras, SP, Brasil) durante 15
minutos, onde foram separadas pelo tamanho de suas partículas, sendo
selecionadas as de tamanho médio 1,42 mm, correspondentes a -10/+20 Mesh
(Série Tyler, Wheeling, USA).
3.2 Extração com líquidos pressurizados
Para a extração com líquido pressurizado, utilizamos o resultado de
maior rendimento de Santos (2017) para estabelecermos a pressão e a
temperaturas de todos os experimentos, de 150 bar e 80 °C, respectivamente.
Assim, foram realizados 4 experimentos para avaliação da influência da vazão
no rendimento do processo, variando-a em 0,5 ml/min, 1,5 ml/min, 2,0 ml/min e
3,0 ml/min. Sendo os experimentos de 2,0 ml/min e 3,0 ml/min realizados em
um tempo total de 4 horas e os demais em 3 horas.
9
O experimento se dá com uma unidade de extração esquematizada na
Figura 3.2. O aparato consiste em uma coluna extratora de 145 cm³
(comprimento de 30,7 cm e diâmetro interno de 2,45 cm); bomba de HPLC
(Serie III, LabAlliance, USA); banho termostático (Marconi, MA-184,
Piracicaba, Brasil); válvulas, manômetros e indicadores de pressão e
temperatura.
Figura 3.2: Esquema da unidade de ELP, em que V-1, V-2: válvulas agulha
macrométricas; V-3: válvula agulha micrométrica; R-1: frasco com etanol; R-2: coletor
de extrato; P-1: bomba de solvente; E-1 coluna extratora; B-1: banho termostatizado; T-
1: termopar; M-1: manômetro. Fonte: Santos (2017).
O processo tem início com o “empacotamento manual” da amostra na
coluna. Para isso são recortadas telas de proteção e acopladas a parte de baixo
da coluna. Depois é inserido algodão (algodão hidrofílico, Nevoa, 100%
algodão), aproximadamente 30 g de matéria prima e esferas de vidro até
completar o volume da coluna, nesta ordem. Após isso, é fechada com a tela de
cima e acoplada à unidade.
Montada a coluna, acopla-se a o banho termostático já em 80 °C e
bombeia-se o solvente etanol (Synth, Álcool etílico P.A.) até atingir a pressão
de trabalho com as válvulas V-2 e V-3 fechadas. Após 30 minutos para a
estabilização das condições de operação, abre-se cuidadosamente tais válvulas e
tem início a extração, sendo controlada a pressão manualmente através da
válvula V-3.
As coletas de extrato foram realizadas em tempos de 10, 25, 40, 60, 80,
100, 120, 140, 160, 180 minutos, nas extrações de 3 horas; também em 210 e
240 minutos, nas extrações de 4 horas. Os frascos eram previamente pesados
minutos antes da coleta e após a coleta postos diretamente em uma estufa
(Marconi, modelo MA 035) a 60 °C para secagem do solvente.
10
3.3 Preparo das soluções das amostras
Para a realização das análises de fenóis totais e atividade antioxidante, foi
necessário o preparo de soluções alcoólicas dos extratos secos. Para isso, foram
solubilizados em etanol todos os extratos secos dos pontos coletados em seus
respectivos frascos e, após total solubilização, unidos todos em uma placa petri
e colocados para secar em uma estufa a 60 °C.
Posterior a total secagem, pesou-se cerca de 20 mg da amostra e diluiu-a
com etanol em um balão de 10 ml, para uma concentração aproximada de 2
mg/mL. Então, homogeneizou-se as amostras em um agitador (Phoenix AP56) e
estocou-as em um frasco âmbar ao abrigo de luz.
3.4 Obtenção do rendimento, da curva cinética da extração e
da solubilidade
Para o cálculo do rendimento das extrações, foram pesados todos os
frascos após total secagem e comparado seu peso com o do frasco antes da
extração, obtendo assim a massa de extrato em cada frasco. Somando, esses
resultados, obtemos a massa total de extrato (mextrato) e dividindo pela massa de
matéria prima inserida na coluna (mmatéria-prima) obtemos o rendimento da
extração, de acordo com a equação 1.
Já para a obtenção da curva cinética, calculamos o rendimento em cada
tempo pré-determinado, somando as massas dos frascos até este e dividindo por
mmatéria-prima. Então, plotamos um gráfico de massa de extrato versus massa de
solvente consumido.
Para o cálculo da solubilidade utilizou-se o método de Draper e Smith, já
aplicado por Queiroz (1993), Galvão (2009), Souza (2001) e Santos (2017), que
consiste no ajuste da curva cinética em duas retas de coeficientes angulares
diferentes, uma para a etapa CER e outra para a etapa FER, de modo que haja
uma interseção entre elas, a qual corresponde ao tempo final da etapa CER
(tCER). O coeficiente angular da reta correspondente à etapa CER equivale à
solubilidade do analito no solvente (grama de extrato/grama de solvente).
3.5 Determinação da atividade antioxidante (EC50)
A determinação do poder antioxidante se deu através do Método do
sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil, DPPH, que consiste, na prática,
no preparo de duas soluções: solução de DPPH e soluções alcoólicas diluídas de
extrato seco.
A solução de DPPH é preparada com 11,80 mg deste reagente diluídos
em um balão de 500 mL com etanol, para obtenção de uma concentração de 23,6
11
μg/mL. A solução agitada é transferida para um frasco âmbar e protegida com
alumínio para o abrigo de luz, devido a ser fotossensível.
Após isso, foram feitas as análises das soluções das amostras. As
soluções a serem lidas no espectrofotômetro (VARIAN, modelo 50 conc) em um
comprimento de onda de 517 nm, foram obtidas efetuando as diluições da
Tabela 3.1 para cada solução de amostra das extrações, reagindo por 30 minutos
em banho ultrassônico.
Tabela 3.1: Volumes de diluição para as soluções de amostras e obtenção das curvas de
AS (%).
Concentração estimada
para soluções de amostra
2 mg/mL
(μg/mL)
Volume de
amostra
(μL)
Volume de
etanol
(μL)
Volume de
solução de
DPPH
(μL)
3,33 10 590 5400
10,00 30 570 5400
20,00 60 540 5400
33,33 100 500 5400
A partir dos resultados de absorbância obtidos para as diluições, em
duplicata, obteve-se a absorbância média e calculou-se a porcentagem de captura
do radical DPPH (AS (%)), através da equação 2, ou seja, a quantidade de DPPH
da solução controle pelos antioxidantes da amostra.
Após estes cálculos, é obtida uma reta para cada amostra de AS (%)
versus concentração, e sua equação fornece o resultado de EC50 quando AS(%)
equivale a 50 %, ou seja, concentração de amostra necessária para inibir em 50
% a atividade dos radicais de DPPH. Portanto, menores valores de EC50
implicam em um maior poder antioxidante da amostra.
3.6 Determinação do teor de fenóis totais (TFT)
A determinação da quantidade de fenóis totais se deu através do método
espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, descrito no item 2.4.1. Na prática, o
método consiste no preparo de soluções reacionárias que ocorrem com mudança
de cor e podem ser lidas em um espectrofotômetro com absorbância em um
comprimento de luz de 760 nm.
Para isso foram utilizadas três soluções: solução aquosa de carbonato de
sódio a 15% em massa, preparada pela diluição de 3,75 g de Na2CO3 em 25 mL
de água destilada; solução de ácido gálico a 0,5 mg/mL, obtida através da
diluição de 10 mg do ácido em 10 mL de água destilada e diluindo 5 mL desta
12
solução, em 10 mL de água destilada para obtenção da solução de 0,5 mg/mL; e
por fim, as soluções das amostras, preparadas conforme o item 3.3.
Para determinar a concentração de fenóis totais em função da
absorbância, foi-se necessário o preparo de uma curva de calibração, utilizando
a solução de ácido gálico como padrão. Esta curva, foi obtida por Santos
(2017), nas mesmas condições e no mesmo espaço físico do presente trabalho,
portanto será utilizada aqui. As quantidades de reagentes estão descritas na
Tabela 3.2, abaixo:
Tabela 3.2: Volumes de diluição para a obtenção da curva padrão de àcido Gálico.
Concentração final
das soluções de
Ác. Gálico
(μg/mL)
Volume de
solução de Ác.
Gálico a
0,5mg/mL
(μL)
Volume de
água destilada
(μL)
Volume do
reagente Folin-
Ciocalteu
(μL)
Volume de
solução de
Na2CO3 a 15%
(μL)
1,0 20 9180 200 600
2,5 50 9150 200 600
5,0 100 9100 200 600
7,5 150 9050 200 600
10,0 200 9000 200 600
12,5 250 8950 200 600
15,0 300 8900 200 600
20,0 400 8800 200 600
Após a obtenção da curva de calibração e a obtenção da relação
concentração e absorbância, preparou-se as soluções, diluídas com os volumes
de reagentes conforme a Tabela 3.3 e deixou reagir por duas horas ao abrigo de
luz.
Tabela 3.3: Volumes de diluição das amostras.
Concentração final
estimada para soluções
de amostras de
2 mg/ml
(μg/ml)
Volume de
amostra
(μL)
Volume de
água
destilada
(μL)
Volume de
reagente Folin-
Ciocalteu
(μL)
Volume de
solução de
carbonato de
cálcio 15%
25 125 9075 200 600
Após a obtenção da absorbância em duplicata de cada amostra, obteve-se
a absorbância média e através da equação da curva padrão, obteve-se o
equivalente em ácido gálico em µg/mL (EAG). Com isso, o teor de fenólicos
totais (TFT), pode ser calculado segundo a equação 3, pela razão do EAG com a
concentração final das soluções das amostras após a diluição.
13
14
4. Resultados e discussões
4.1 Rendimento e Solubilidade
Com base no peso de cada frasco da extração, foi possível averiguar a
massa acumulada em cada tempo e o rendimento (segundo a equação 1). A
massa de solvente total utilizada é obtida através da multiplicação da vazão pelo
tempo e densidade do etanol nas condições de extração. Assim, pode-se obter
alguns gráficos para análise da influência da vazão e de tempo no processo de
extração com líquido pressurizado.
Ao plotar o rendimento em função do tempo, vê-se que quanto maior o
tempo de extração e a vazão do solvente, maior o rendimento da extração.
Observa-se esta tendência na Figura 4.1, onde em um mesmo período de tempo,
o rendimento da maior vazão é sempre maior, e prolongando-se o tempo de
extração, o rendimento continua a aumentar.
Figura 4.1: Curva cinética das extrações de rendimento versus tempo
Este comportamento pode ser explicado pelo fato de que com maior
vazão, há uma maior quantidade de massa de solvente para solubilizar a
matéria-prima, gerando um maior contato entre o etanol e os solutos (Santos,
2017). Já em relação ao tempo, caso continue-se a extração, o soluto continua a
ser extraído através dos mecanismos difusionais, tendendo ao contínuo aumento
da massa extraída até que entre na etapa DC, onde a taxa de extração é
praticamente nula (Queiroz, 1993).
Quanto à solubilidade pode ser entendida melhor analisando as Figuras
4.2 e 4.3, as quais representam o gráfico massa acumulada versus massa total de
solvente e os gráficos obtidos através dos métodos de Draper e Smith para com
as duas retas das etapas CER e FER, com suas respectivas equações.
7,27
8,46
9,89
10,81
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270
REN
DIM
ENTO
(%
)
TEMPO (MIN)
150bar; 80 °C; 0,5 mL/min; 3h
150bar; 80 °C; 1,5 mL/min; 3h
150bar; 80 °C; 2,0 mL/min; 4h
150bar; 80 °C; 3,0 mL/min; 4h
15
Observa-se visualmente pela Figura 4.2 que para a faixa de vazão
estudada, a solubilidade do soluto em etanol permanece praticamente constante,
uma vez que as curvas estão aparentemente sobrepostas, principalmente na etapa
CER, tendendo a possuir inclinações próximas e, consequentemente, uma razão
massa de soluto por massa de solvente também próximas. Isso pode ser
confirmado pelas equações das retas plotadas na Figura 4.3, onde temos a faixa
de solubilidade variando entre 0,0418 g/g e 0,0721 g/g, (de acordo com a Tabela
4.1) o que representa uma variação pouco distinta. Isso confirma que o solvente
está sendo extraído em equilíbrio e saturado com o soluto (Santos, 2017). Em
vazões superiores a esta faixa, pode ser que não ocorra a saturação, devido a um
tempo de contato menor com a matéria-prima e consequentemente, reduza a
eficiência da extração (Queiroz, 1993).
Figura 4.2: Curvas cinéticas das extrações, mostrando a massa acumulada de
extrato versus massa utilizada de solvente
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 100 200 300 400 500 600 700
MA
SSA
AC
UM
ULA
DA
DE
EXTR
ATO
(G)
MASSA DE SOLVENTE (G)
150bar; 80 °C; 0,5 mL/min; 3h
150bar; 80 °C; 1,5 mL/min; 3h
150bar; 80 °C; 2,0 mL/min; 4h
150bar; 80 °C; 3,0 mL/min; 4h
16
Figura 4.3: Curvas cinéticas das extrações, mostrando a massa acumulada de
extrato versus massa utilizada de solvente, com os ajustes lienar para as retas das
etapas CER e FER das extrações de 150 bar e 80 ° C com: 0,5 mL/min e 3h (a);
1,5 mL/min e 3h (b); 2,0 mL/min e 4h (c); e 3,0 mL/min e 4h (c).
Tabela 4.1: Rendimento e solubilidade de cada extração nas condições estudadas
Extração Rendimento (%) Solubilidade (g/g)
150 bar; 80 °C; 0,5 mL/min; 3h 7,27 0,0721
150 bar; 80 °C; 1,5 mL/min; 3h 8,46 0,0551
150 bar; 80 °C; 2,0 mL/min; 4h 9,89 0,0418
150 bar; 80 °C; 3,0 mL/min; 4h 10,81 0,056
4.2 Teor de Fenóis Totais
O TFT foi obtido pelo método descrito no item 3.6 e os resultados das
absorbâncias obtidas nos ensaios, bem como os cálculos da concentração final
corrigida das amostras após a diluição, EAG e TFT estão descritos na Tabela
4.2.
17
Tabela 4.2: Absorbâncias médias obtidas nos ensaios de Folin-Ciocalteau e os
resultados de EAG e TFT para o extrato de cada extração.
Amostra Absorbância
média
Concentração
final corrigida
(μg/mL)
EAG
(µg/mL)
TFT
(mgEAG/gextrato)
1 (0,5 ml/min; 3h) 0,4489 25 4,54 181,63
2 (1,5 ml/min; 3h) 0,4592 30,125 4,64 154,06
3 (2,0 ml/min; 4h) 0,4712 29 4,76 164,06
4 (3,0 ml/min; 4h) 0,42675 28,875 4,33 149,80
Pelos resultados vê-se que os o TFT das amostras estão na mesma ordem
de grandeza, além de não seguir um padrão proporcional à vazão. Isso pode ser
explicado pelo fato da solubilidade ser praticamente a mesma para a faixa de
vazão trabalhada (como mostra a Tabela 4.1), portanto, mesmo que a extração
apresente maiores rendimentos a maiores vazões, o composto de interesse é
solubilizado e extraído praticamente na mesma quantidade (quantidade de
saturação) em todas as extrações (Queiroz, 1993).
Além disso, o tempo também não influenciou no teor, como vemos que
as extrações de 4 horas possuem TFT próximos das extrações de 3 horas. Uma
hipótese para isso é que devido à etapa CER representar cerca de 60% do
rendimento da extração (Santos, 2017), os compostos fenólicos sejam extraídos
nesta etapa, ou seja, no início da extração, onde, como discutido anteriormente,
são solubilizados praticamente da mesma forma.
4.3 Atividade Antioxidante (EC50)
A atividade antioxidante (EC50) foi obtida segundo o método descrito no
item 3.5. A concentração final corrigida da diluição, bem como a absorbância
média obtida nos ensaios, a absorbância de controle do DPPH puro e a AS %
estão apresentadas na Tabela 4.3.
Tabela 4.3: Concentração final corrigida dos ensaios de DPPH, juntamente com os
resultados de absorbância média e os cálculos de AS (%).
ABS controle 0,6028
Extração
Concentração
final corrigida
(μg/mL)
Absorbância
média AS (%)
1 (0,5 ml/min; 3h) 3,33 0,47 21,68
1 (0,5 ml/min; 3h) 10,00 0,38 36,79
1 (0,5 ml/min; 3h) 20,00 0,27 55,91
1 (0,5 ml/min; 3h) 33,33 0,16 74,12
2 (1,5 ml/min; 3h) 4,02 0,47 22,38
2 (1,5 ml/min; 3h) 12,05 0,38 37,43
2 (1,5 ml/min; 3h) 24,10 0,26 57,23
18
2 (1,5 ml/min; 3h) 40,17 0,17 72,26
3 (2,0 ml/min; 4h) 3,87 0,46 24,45
3 (2,0 ml/min; 4h) 11,60 0,36 40,38
3 (2,0 ml/min; 4h) 23,20 0,24 59,88
3 (2,0 ml/min; 4h) 38,67 0,14 76,73
4 (3,0 ml/min; 4h) 3,85 0,48 20,38
4 (3,0 ml/min; 4h) 11,55 0,40 33,66
4 (3,0 ml/min; 4h) 23,10 0,28 52,99
4 (3,0 ml/min; 4h) 38,50 0,17 71,70
A partir dos resultados de AS %, foram plotadas as retas e suas equações
para cada extração conforma a Figura 4.4.
Figura 4.4: Curvas de AS (%) versus concentração com suas respectivas equações da
reta, par as extrações 1 (150 bar; 80 °C; 0,5 ml/min; 3h) (a); 2 (150 bar; 80 °C; 1,5
ml/min; 3h) (b); 3 (150 bar; 80 °C; 2,0 ml/min; 4h) (c) e 150 bar; 80 °C; 3,0 ml/min; 4h
(d).
19
Com as equações dos gráficos da Figura 4.4, para cada extração, calcula-
se o EC50 quando y (AS%) equivaler a 50 %. Os valores de EC50 para cada
extração estão na Tabela 4.4.
Tabela 4.4: Resultados de EC50 para cada extração.
Extração EC50
(µg/mL)
150 bar; 80 °C; 0,5 ml/min; 3h 18,32
150 bar; 80 °C; 1,5 ml/min; 3h 22,03
150 bar; 80 °C; 2,0 ml/min; 4h 19,09
150 bar; 80 °C; 3,0 ml/min; 4h 22,84
Os resultados de da Tabela 4.4 exibem uma mesma ordem de grandeza
para o EC50 em todas as extrações. Isso indica que, analogamente ao TFT, os
compostos com atividade antioxidantes são extraídos em sua maioria na etapa
CER, onde possuem solubilidades semelhantes e, portanto, são extraídos em
quantidades similares (quantidade de saturação), não sendo influenciados pelas
vazões da faixa estudada ou pelo tempo de extração.
20
5. Conclusão
Os resultados obtidos neste trabalho averiguaram que a vazão e o tempo de
processo têm grande influência no rendimento da extração, de modo que é
diretamente proporcional a estes parâmetros. No entanto, os ensaios de teor de
fenólicos totais e atividade antioxidante inferiram que os parâmetros estudados não
possuem ligação com a qualidade do extrato, uma vez que os resultados se
apresentaram muito semelhantes em todas as extrações. Este comportamento é
explicado pela curva cinética que mostrou uma solubilidade de analito similar na
etapa CER em toda a faixa de vazão trabalhada, demonstrando que os componentes
fenólicos antioxidantes são extraídos praticamente na mesma quantidade de
saturação em todos os casos estudados.
21
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