Dna forense

Dr. João Francisco dos Anjos Junior - Biólogo

Perito Criminal – Polícia Civil do Amazonas

FORENSE:da Descoberta do DNA à identificação criminal

• Gregor Mendel – 1864

Histórico - A Descoberta do DNA

Experiência Clássica com ervilhas

• Unidade de transferência da hereditariedade ou Gene

• Recessividade e Dominância

• Heterozigose e Homozigose

• Genótipo e Fenótipo


1868 – Friedrich Mischer Purificou uma nova substância do núcleo de células que chamou de Nucleína.

Trabalhou com Glóbulos Brancos isolados do pus de feridas contidas em curativos de hospital.


1909 – Theodor Lavene: O DNA como uma composição de 4 Nucleotídeos. A T G C

Caracterizou quimicamente os diferentes tipos de Ácidos Nucléicos.

Mostrou que o DNA era formado por unidades monoméricas chamada de nucleotídeo em um esqueleto baseado em fosfato e açucar.

1928 – Frederick Griffith e o ensaio com bactérias patogênicas.

Cepas R (Rough) e S (Smooth) de Streptococcus pneumoniae

Agente transformante



1943 – Avery, McCarty e McCleod. O Agente transformador é o DNA.

Org. Tecido Adenina Guanina Citosina Timina

E. Coli 26,0 23,9 24,9 25,2

Rato Osso 28,6 28,4 21,4 21,5

Homem Figado 30,3 30,3 19,5 19,9

Homem Semen 30,7 31,2 19,3 18,8


1950 – Erwin Chargaff e a proporção de Bases Nitrogenadas. A=T; C=G

Após inúmeros estudos da composição do DNA em diversos tecidos e varias espécies, concluiu que a ocorrência das quatro bases no DNA obedece às relações A = T e C = G. Esta regra é conhecida como “Regra de Chargaff”


1951 – Rosalim Franklin e a Difração de raios X.


1951 – Rosalim Franklin e a Difração de raios X.

Padrão de difração em formato de X é típico de estruturas heicoidais.

O fotografia revelou ainda que havia um padrão de repetição na estrutura e em séries regulares.

Que o esqueleto Fosfato-açucar estaria voltada para fora e as bases voltadas para o interior da molécula.


1953 – Watson e Crick com uso de modelos e dedução lógica teorizam a Estrutura do DNA.

1962 – Watson, Crick e Wilkins são premiados com o prêmio Nóbel pela descoberta da estrutura do DNA e sua Importância para a transferência da informação entre os seres vivos.

Francis Crick(1916 –2004)

James Watson(1928 - )

Maurice Wlkins(1916-2004)

MLA style: "The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962". Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013. Web. 7 Nov 2013. <http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1962/>

Rosalin Franklin(1920-1958)

GANHADORES DO NOBEL EM 1962

ESTRUTURA E FUNÇÃO DO DNAESTRUTURA E FUNÇÃO DO DNA

A estrutura do DNA

Dupla hélice

Parte externa formada por um esqueleto de Fosfato-Açucar alternados.

Parte interna contendo as bases nitrogenadas.

3 Bilhões de Pares de bases.

DUPLICAÇÃO DO DNA• A estrutura do DNA bem

como o pareamento complementar de Bases revelaram o segredo da hereditariedade.

• Acontece que o duplo filamento de DNA, durante a divisão celular se separa, e cada uma funciona como um molde para fabricaçao de duas novas moléculas de DNA.

Cromossomos

Estrutura condensada do DNA encontrada no núcleo da célula.

Cromossomos Autossômicos 22 pares

Cromossomos Sexuais 1 par

XX Mulher

XY Homem

Cromossomos

O Conjunto de Cromossomos é resultado da fusão de dois gametas (óvulo com espermatozóide).

LOCUS

GENE 1GENE 2

ALELO

GENE 1GENE 2GENE 3GENE 4




DNA FINGERPRINTING E OS POLIMORFISMOS

• RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism

• Se baseia nas diferenças de sítio de clivagem do DNA por enzimas de restrição.

• Foi a primeira técnica utilizada para análise de DNA.

• Utilizada no mapeamento do genoma humano e em testes de paternidade.

DNA fingerprinting e os polimorfismos

Alec Jeffrey

• RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism

• Se baseia nas diferenças de sítio de clivagem do DNA por enzimas de restrição.

• Foi a primeira técnica utilizada para análise de DNA.

• Utilizada no mapeamento do genoma humano e em testes de paternidade.

DNA fingerprinting e os polimorfismos

Alec Jeffrey

PROJETO GENOMA HUMANO1990 - Cria-se o consórcio público do projeto genoma humano, formado por Instituições científicas de 20 países.

Conhecer a sequência de pares de bases ao longo da cadeia de DNA.

Permitiu avanços na área da medicina

CLONAGEM

ENGENHERIA GENÉTICA

TRANSGENIA

POLIMORFISMOS • Polimorfismos de Sequência- Substituição, Deleção, Adição de Bases

• SNPs – Single Nucleotide Polymorphism

• ATCT C CCAT – Alelo 1

• ATCT G CCAT – Alelo 2

• Polimorfismos de tamanho

• STRs – Short Tandem Repeats

ACCT ACCT ACCT – 3 repetiçõesACCT ACCT ACCT ACCT – 4 repetições

DNA MITOCONDRIAL

As Mitocôndrias

São organelas encontradas no citoplasma da célula.

Atuam fornecedo energia para as reações químicas produzindo ATP.

Seu número varia entre 500 até 10000 unidades por célula.

Apresentam DNA em forma circular.

Capacidade duplicativa.

Apresentam genes similares aos encontrados em bactérias.

DNA MITOCONDRIAL

Herança Matrilinear

Durante a fecundação apenas o núcleo do espermatozóide entra no óvulo.

Logo, todos os indivíduos de uma mesma linhagem materna apresentam o mesmo DNAmt.

Valiosa ferramenta para identificação de restos mortais.

Não é um exame individualizador.

PRIMEIRO CASO CRIMINAL AO USAR O EXAME DE DNA• Dois casos de estupro seguido de

homicídio: um Dawn Ashworth e Lynda Mann, ambas de 15 anos de idade.

• Um principal suspeito foi interrogado mas liberado por falta de provas. Seu nome era Colin Pitchfork.

• Um homem foi preso e confessou um dos assassinatos.

• Resolveram realizar o teste de DNA que acabou inocentando o rapaz preso.

• Decidiram coletar amostras de toda a população masculina. Cerca de 4500 pessoas foram submetidas a coleta de sangue.

PRIMEIRO CASO CRIMINAL AO USAR O EXAME DE DNA• Pithfork trocou sua amostra de sangue o

que o deixou livre de ser pego.

• Entretanto uma denuncia anônima dizia ter ouvido em um PUB que Pitchfork teria trocado a amostra.

• Foi o suficiente para ser preso e o teste de DNA foi refeito, dando resultado positivo.

POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA• As Séries televisivas

POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA

• Casos de repercussão

• O.J. SIMPSON

• Acusado de ter assassinado sua ex mulher Nicole Brown e seu amigo Ronald Goldman em 1994.

• Mais de 20 milhões de pessoas assistiram o julgamento pela TV.

• 45 amostras de sangue no total ligavam O.J. à cena do crime.

POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA

POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA – CASO O.J. SIMPSON

Luvas encontradas na casa de O. J. Simpson continha perfil genético de Nicole.

Manchas de sangue encontradas no carro de Simpson continha perfil genético de Nicole.

Fibras e cabelos

Porque houve a absolvissão mesmo com a evidência do DNA forense incriminando O. J. Simpson?

O Exame era novidade nos tribunais.

Falta de prática na coleta e manuseio do vestígio biológico.

Falta de padronização dos exames.

Resultados estatísticos muitas vezes difíceis de entender.

POPULARIZAÇÃO DO EXAME DE DNA – CASO O.J. SIMPSON

Simpson após receber o veridicto.

Perícia Criminal em Local do Crime – COLETA E PRESERVAÇÂO DE AMOSTRAS

A resolulção de crimes depende da associação dos vestígios materiais encontrados no local de crime.

Materiais biológicos que podem conter DNA

Fluídos corporais – • Suor, sangue, • saliva, sêmen, • urina, secreção vaginal.

Restos mortais• Dentes e ossos.

Fios de cabelos, pelos, unhas.

Vestígios potenciais para busca de DNA

Objetos pessoais• óculos, boné, sapato, sandálias, escova,

etc...

Objetos descartados• Guardanapo, Garrafas plásticas, Palito de

dente, cigarro, etc...

Armas manuseadas• Barra de ferro, porrete, faca, espeto de

churrasco, etc...

Métodos gerais de busca – Como encontrar?

Vestígios latentes

Necessitam de técnicas específicas para torná-las visíveis.

Testes preliminares

Indicam ou classificam a natureza de um vestígio biológico.

Testes confirmatórios

Confirmam a natureza de um vestigio.

LUZES FORENSE

MÉTODOS DE BUSCA – Luz Forense

Se baseia no fenômeno da fluorescência de certas substâncias ao incindir uma luz sobre elas.

Alguns materiais refletem um comprimento de onda enquanto absorvem outros.

Fluídos corporais

Impressões digitais

Pêlos e fibras

MÉTODOS DE DETECÇÃO – LUZ FORENSE

Comportamento espectral da absorção do sangue seco. • Espectro de fotoluminescência de semen seco.

MÉTODOS DE BUSCA – Testes preliminares para sangueVestígio comum em crimes contra a vida e relativamente frequente em crimes contra o patrimônio.

A presença de sangue pode ser de muito valor em determinadas ocasiões.

A análise do padrão de dispersão de sangue pode fornecer indícios sobre a dinâmica do ocorrido.

Tendência em ocultar tal vestígio.

Teste de Fluorescência/Luminescência

Teste de Flourescência/Luminescência

Um dos testes mais antigos. Criada em 1928.

Na presença de H2O2 sofre uma reação de oxidação tendo o Fe presente na hemoglobina como catalisador.

A sensibilidade chega a PPB (Parte Por Bilhão).

Capaz de detectar sangue após 6 anos.

Teste de Flourescência/Luminescência

BLUE STAR FORENSIC

Apresenta maior intensidade de brilho

Maior tempo de duração.

Pode-se obter a visualização em condições de penunbra.

Não degrada o DNA.

Testes de coloração

Teste da Benzidina (Adler Ascarelli)

Reação de oxidação da Benzidina em meio ácido, que resulta na formação de um produto intermediário de cor azul.


Teste da Benzidina (Adler Ascarelli)

Passo 1: Adiciona uma solução de benzidina diluída com ácido acetico sobre a mancha.

Passo 2: Em seguinda pinga-se uma gota de Peróxido de Hidrogênio.


Teste da Fenolftaleína (Kastle-Meyer)

Oxidação da Fenoftaleína em solução alcalina com mudança de cor para Rosa.

Testes Imunocromatográficos

• Coletar de maneira correta afim de minimizar a degradação do DNA:

• Sangue Líquido: Suabe, Seringa

Fatores que afetam a análise do DNA.

Degradação

Calor

Umidade

Luz Solar

Substâncias químicas


• Sangue Líquido: Suabe, Seringa


Degradação

Calor

Umidade

Luz Solar



• Sangue em objetos removíveis: Acondicionamento em sacos plástico ou de papel.


Degradação

Calor

Umidade

Luz Solar



• Sangue Seco: Suabe ou raspagem.


Degradação

Calor

Umidade

Luz Solar



• Sêmen em camisinha: Acondicionamento ou suabe.


Degradação

Calor

Umidade

Luz Solar


São extremamente populares em análises de DNA forense devido a sua análise ser baseada em PCR e a funcionarem com pouca quantidade de DNA molde ou mesmo com amostras degradadas. Os métodos de análise de microssatélites são facilmente automatizados, e envolvem detecção por fluorescência, o que permite que o analista colete dados destes marcadores rapidamente. Os STRs são altamente discriminativos entre indivíduos não relacionados e mesmo entre estreitamente aparentados.

Os marcadores STRs

Etapas do Exame de DNA

AMOSTRAGEM

O vestígio é analisado no Contexto do Local do Crime.

QUANTIFICAÇÃOUma Reação de PCR em tempo real permite estimar a quantidade de DNA presente.

EXTRAÇÃOAs Amostras são submetidas a processos químico e físico que permitem o isolamento do DNA dos demais componentes.

Etapas do Exame de DNA

AMPLIFICAÇÃO

Regiões específicas do DNA são replicadas milhares de vezes.

ELETROFORESE CAPILARO produto da PCR, fragmentos de DNA, são separados por tamanho e visualizados sob forma de picos (eletroferograma).

Extração do DNA

Servem para separar o DNA de outros componentes celulares e outros contaminantes.

Extração Orgânica.

Extração por chelex.

Extração por Papel FTA.

Extração do DNA

Extração Diferencial.

Utilizado em casos de crimes sexuais em que a amostra contém células masculinas e femininas em uma mistura.

Azoospermia.

Uso de camisinha.

Amplificação por PCR

Permite realizar milhões de cópias de DNA em poucas horas.

Primer – Se ligam ao DNA em locais específicos.

DNA Polimerase – Adiciona os nt a cadeia pelo pareamento complementar

Envolve o aquecimento e resfriamento da amostra.

Amplificação por PCR

Permite realizar milhões de cópias de DNA em poucas horas.

Primer – Se ligam ao DNA em locais específicos.

DNA Polimerase – Adiciona os nt a cadeia pelo pareamento complementar

Envolve o aquecimento e resfriamento da amostra.

Termociclador

PCR em Tempo real.

Eletroferograma

Education

Dna forense