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Programa de Pós-Graduação em Química de Produtos Naturais
Projeto de Pesquisa para Exame de Qualificação
Composição química e atividade inseticida dos óleos voláteis das
folhas de Eucalyptus spp. utilizadas pela população de Luz-MG no
combate à dengue
ALDA ERNESTINA DOS SANTOS
RIO DE JANEIRO – RJ
Outubro – 2014
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Pesquisas de Produtos Naturais
Alda Ernestina dos Santos
Composição química e atividade inseticida dos óleos voláteis das
folhas de Eucalyptus spp. utilizadas pela população de Luz-MG no
combate à Dengue
Projeto de pesquisa para exame de
qualificação apresentado ao Instituto de
Pesquisas de Produtos Naturais da
Universidade Federal do Rio de Janeiro –
UFRJ, como requisito parcial à obtenção
do título de Doutor em Ciências.
Rio de Janeiro – RJ
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 1
1.1 - Óleos voláteis.................................................................................................................... 1
1.1.1 - Definição, características e fontes de obtenção ..................................................... 1
1.1.2 - Composição química................................................................................................ 2
1.1.3 - Monoterpenos........................................................................................................... 3
1.1.4 - Sesquiterpenos.......................................................................................................... 5
1.1.5 - Atividade sobre insetos ............................................................................................ 6
1.1.6 - Importância comercial ............................................................................................ 8
1.2 - O gênero Eucalyptus ........................................................................................................ 9
1.2.1 - Características, ocorrência e importância econômica.......................................... 9
1.2.2 - Óleos voláteis de Eucalyptus ................................................................................. 10
1.2.2.1 - Composição química...................................................................................... 10
1.2.2.2 - Atividade inseticida e repelente .................................................................... 14
1.2.2.3 - Atividade sobre Aedes aegypti ....................................................................... 15
1.3 - Dengue ............................................................................................................................ 17
1.4 - Área de coleta de Eucalyptus spp.................................................................................. 18
2 - JUSTIFICATIVA.............................................................................................................. 21
3 - OBJETIVOS ..................................................................................................................... 22
4 - METODOLOGIA ............................................................................................................ 23
4.1 - Coleta, identificação botânica e herborização............................................................. 23
4.2 - Secagem das folhas, extração e tratamento dos óleos voláteis .................................. 23
4.3 - Análises por CG-EM...................................................................................................... 24
4.4 - Determinação das propriedades físico-químicas dos óleos voláteis .......................... 24
4.5 - Avaliação da atividade inseticida sobre Aedes aegypti ................................................ 25
5 - ORÇAMENTO DO PROJETO....................................................................................... 29
6 - CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DO PROJETO..................................................... 30
7 - RESULTADOS ESPERADOS E PERSPECTIVAS ...................................................... 31
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 32
1 – INTRODUÇÃO
1.1 - Óleos voláteis
1.1.1 - Definição, características e fontes de obtenção
Os óleos voláteis também conhecidos por óleos essenciais consistem de uma
mistura complexa de compostos voláteis, produzidos como metabólitos secundários por
plantas aromáticas, onde atuam no mecanismo de defesa, protegendo a planta do ataque
por predadores e microorganismos patogênicos, bem como na atração de polinizadores
(BAKKALI et al., 2008).
A norma 9235.2 da International Standards Organization (ISO) define óleo
volátil como: "produto obtido a partir de matéria prima vegetal por hidrodestilação ou
destilação por arraste a vapor; ou a partir do epicarpo de espécies de Citrus por processo
mecânico ou destilação a seco", neste caso, devido à instabilidade térmica de seus
componentes (SCHMIDT, 2010).
Os óleos voláteis são geralmente produzidos por estruturas secretoras
especializadas, que podem estar presentes em órgãos específicos como por exemplo nas
flores de rosa e magnólia, sementes de noz-moscada, folhas de eucalipto, cascas da
laranja, raízes do gengibre e madeira da canela; ou em toda a planta (VITTI & BRITO,
2003).
Embora encontrados em outras espécies, a produção e acúmulo de óleos voláteis
é característica de espécies pertencentes às famílias Cupressaceae, Pinaceae, Apiaceae,
Asteraceae, Lamiaceae, Poaceae, Myrtaceae e Zingiberaceae, onde ocorrem geralmente
como líquidos voláteis, lipossolúveis, incolores e menos densos que a água (FRANZ &
NOVAK, 2010).
A produção e o acúmulo de óleos voláteis é influenciada por fatores diversos
como variabilidade genética, variáveis climáticas (temperatura, índice pluviométrico,
fotoperíodo, sazonalidade, altitude) e também pela fase de desenvolvimento do vegetal.
De forma que variações na composição química desses óleos durante o
desenvolvimento do vegetal, bem como ao longo do dia são comumente observadas
para diversas espécies vegetais (SCHMIDT, 2010).
1.1.2 - Composição química
Embora sejam conhecidos e utilizados desde a antiguidade principalmente pelos
egípcios, persas, chineses e indianos, as primeiras investigações sobre a composição
química dos óleos voláteis foram conduzidas pelo químico francês Jean-Baptiste
Dumas, que publicou seus resultados em 1833. Entretanto, os principais estudos foram
conduzidos por Otto Wallach, assistente do químico alemão Kekulé. Estudos que dentre
outros revelaram a presença de hidrocarbonetos com a fórmula C10H16, substâncias as
quais Kekulé chamou de terpenos devido a sua ocorrência no óleo de terebentina.
Estudos posteriores explorando a química dos terpenos rendeu a Wallach o prêmio
Nobel de Química de 1910, em reconhecimento a sua contribuição à pesquisa desses
compostos orgânicos (KUBECZA, 2010).
Hoje se sabe que os óleos voláteis ocorrem como misturas complexas contendo
geralmente cerca de 20-60 componentes diferentes, dos quais dois ou mais apresentam-
se como majoritários (20-70% de abundância), enquanto os demais ocorrem em
quantidades traços. Embora estejam presentes compostos como álcoois simples,
cetonas, aldeídos, ácidos carboxílicos, ésteres, dentre outros, a maior parte dos
componentes dos óleos voláteis consiste de terpenos e compostos aromáticos
(BAKKALI et al., 2008).
É impossível se falar de óleos voláteis sem destacar a importância dos terpenos,
especialmente mono e sesquiterpenos que são de longe os componentes mais
abundantes nestes óleos (ADAMS, 2007).
Os terpenos compreendem um extenso grupo de substâncias cuja biossíntese
envolve as vias do mevalonato e deoxixilulose fosfato, sendo derivados de unidades de
isopreno (C5) e de acordo com o número de unidades isoprênicas presentes são
classificados em hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15),
diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30) ou esteroides e tetraterpenos
(C40) ou carotenoides (SELL, 2010).
Dimetilalil pirofosfato (DMAPP) (1) (Figura 1) e isopentenil pirofosfato (IPP)
(2) são os principais intermediários envolvidos na biossíntese dos terpenos e através de
acoplamentos do tipo "cabeça-cauda" originam o pirofosfato de geranila (GPP) (3),
pirofosfato de farnesila (FPP) (4), pirofosfato de geranil-geranila (GGPP) (5), esqualeno
(6) e fitoeno (7), precursores dos mono, sesqui, di, sester, tri e tetraterpenos,
respectivamente (DEWICK, 2002).
FIGURA 1: Principais classes de terpenos e suas unidades precursoras.
1.1.3 - Monoterpenos
Os monoterpenos compreendem cerca de 90% dos constituintes dos óleos
voláteis e apresentam uma grande variedade estrutural, ocorrendo principalmente sob a
forma de terpenoides como álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres, éteres e fenóis,
(BAKALLI et al., 2008).
O pirofosfato de geranila (GPP) (8) (Figura 2) é o precursor dos monoterpenos e
conforme a configuração da ligação dupla e posição do grupo pirofosfato ocorre
também como os isômeros pirofosfato de nerila (NPP) (9) e pirofosfato de linalila (LPP)
(10). Esses três por sua vez, através de reações enzimáticas diversas dão origem aos
mais variados tipos de monoterpenos (DEWICK, 2002).
Observando-se a estrutura do GPP percebe-se que sua estereoquímica não
favorece a ciclização, desta forma para este precursor são esperados apenas
monoterpenos acíclicos, como por exemplo, o geranial (11) e geraniol (12), que podem
sofrer redução e produzir citronelal (13) e citronelol (14), respectivamente. Por sua vez,
para NPP e LPP são esperados monoterpenos tanto monocíclicos como o α-felandreno
(15) e o mentol (16), como também bicíclicos como a fenchona (17) e a cânfora (18)
OPP OPP
OPP Monoterpenos
IPP
OPP Sesquiterpenos
IPP
OPP Diterpenos
IPP
IPP
Tetra terpenos
1 21
31
43
53
Triterpenos
63
73
(DEWICK, 2002).
FIGURA 2: Exemplos de monoterpenos e seus precursores.
Vale ressaltar que muitos monoterpenos são opticamente ativos e por isso
ocorrem como enantiômeros, podendo ser encontrados na mesma espécie, como no caso
dos enantiômeros (R)-limoneno (19) (Figura 3) e (S)-limoneno (20) encontrados no óleo
das folhas de Mentha x piperita. Ou em espécies diferentes, como no caso da carvona,
onde os enantiômeros (S)-carvona (21) e (R)-carvona (22) são encontrados isoladamente
nos óleos das sementes de cominho e das folhas de hortelã (Mentha spicata),
respectivamente (DEWICK, 2002).
FIGURA 3: Estrutura dos enantiômeros (S) e (R) dos monoterpenos limoneno e
carvona.
OPP
OPP
O OH
O
OH
OOOH
OPP
8 9 10
11 12
13 14
15 16
17 18
19
O
20 21 O
22
1.1.4 - Sesquiterpenos
Os sesquiterpenos são derivados do pirofosfato de farnesila (FPP) e apresentam
15 átomos de carbono. A extensão da cadeia carbônica, bem como a insaturação
adicional, quando comparado ao GPP, torna possível diferentes modos de ciclização
para o FPP, dos quais resultam sesquiterpenos mono, bi e tri-cíclicos, como o α-
bisaboleno (23) (Figura 4), α-cadineno (24) e o α-gurjuneno (25), respectivamente
(DEWICK, 2002).
FIGURA 4: Exemplos de sesquiterpenos mono, bi e tri-cíclicos.
β-cariofileno (26) (Figura 5) e α-humuleno (27) estão entre os sesquiterpenos
mais encontrados na natureza, cujas principais fontes são os óleos de cravo e lúpulo,
respectivamente. Sesquiterpenos como a α-vetivona (28) e o álcool de patchuli (29),
por sua vez são menos comuns. Entretanto, são importantes componentes de óleos
essenciais de interesse para a perfumaria, como os óleos de vetiver e patchuli,
respectivamente (SELL, 2010).
FIGURA 5: Estrutura dos sesquiterpenos β-cariofileno, α-humuleno, α-vetivona e
álcool de patchuli.
23 24 25
O
OH
26 27 28 29
1.1.5 - Atividade sobre insetos
Diversas atividades biológicas são atribuídas aos óleos voláteis, dentre elas,
adstringente, antidepressiva, analgésica, antiviral, bactericida, fungicida, dentre outras.
Entretanto, os óleos voláteis são reconhecidos principalmente por suas atividades
inseticida e repelente (KNAAK & FIUZA, 2010).
Considerando-se que diversas doenças são transmitidas por insetos, grandes são
os esforços na busca por substâncias naturais com potenciais inseticida e/ou repelente
em alternativa aos sintéticos de uso difundido (DE PAULA et al., 2004).
Embora a descoberta de repelentes sintéticos tenha tornado o controle de insetos
mais prático e eficiente, devido aos riscos ambientais e à saúde humana causados por
determinados repelentes os olhares têm se voltado para produtos de origem natural, em
especial óleos voláteis obtidos de diferentes espécies vegetais (REHMAN et al., 2014).
Os vegetais representam uma excelente fonte de metabólitos secundários com
propriedades inseticida e repelente e desta forma são utilizados historicamente para
exterminar ou repelir insetos (MACIEL et al., 2010).
Desta forma estudos avaliando as atividades inseticida e repelente de produtos
naturais têm aumentado significativamente, principalmente sobre espécies dos gêneros
Aedes, Anopheles e Culex, já que estão relacionadas à transmissão de doenças
importantes como: febre amarela, dengue e malária (NERIO et al., 2010).
Embora a atividade inseticida possa ser determinada em diferentes fases do
desenvolvimento do inseto, a atividade larvicida é de longe a mais comumente avaliada,
e envolve a determinação do potencial larvicida de extratos, óleos voláteis e/ou
substâncias puras (SANTOS et al., 2011).
Estudos como o de Mendonça et al., (2005) que avaliaram a atividade larvicida
de extratos e óleos voláteis de 17 plantas brasileiras sobre larvas de Aedes aegypti,
verificando elevado potencial larvicida para seis deles, sendo cinco deles óleos voláteis,
dentre os quais Anacardium occidentalis e Copaifera langsdorffii foram os mais ativos,
com valores de LC50 de 14,5 µg/mL e 21 µg/mL, respectivamente.
Por apresentarem alta volatilidade os óleos voláteis e seus principais
componentes têm sido avaliados também como repelente em estudos diversos, sendo
observada em alguns casos atividade comparável à apresentada por repelentes sintéticos
(GEORGE et al., 2014).
Desta forma o uso de óleos voláteis como repelente já é mais que consolidado e
permanece ao longo do tempo. Um bom exemplo trata-se do óleo de citronela que foi
descoberto em 1901 e até a década de 40 foi o repelente mais utilizado, principalmente
no controle de pulgas e piolhos. Entretanto, perdeu força no mercado devido ao curto
período de ação, que varia geralmente entre 20 a 30 minutos. Sendo posteriormente
substituído por óleos que promovem ação mais prolongada como no caso de
Eucalyptus citriodora utilizado como princípio ativo em repelentes como o Repel, cujo
período de ação varia entre 4 e 7 horas (KATZ et al., 2008).
A atividade repelente dos óleos essenciais é tão relevante que óleos voláteis
comuns como o de citronela, limão e eucalipto têm sido registrados pela US
Environmental Protection Agency como repelentes de uso tópico, devido à alta eficácia
e baixa toxicidade (GEORGE et al., 2014).
Uma das vantagens dos óleos voláteis é que seu uso prolongado geralmente não
induz à resistência, pelo simples fato de atuarem sobre alvos diversos. Ao contrário dos
inseticidas sintéticos, cujo uso prolongado além da indução da resistência está em
muitos dos casos associado ao surgimento de novas pragas e de desequilíbrios
ecológicos (KNAAK & FIUZA, 2010).
Uma das desvantagens do uso de óleos voláteis como repelentes é que alguns
óleos por apresentarem alta volatilidade têm sua atividade repelente reduzida, em
especial sobre espécies de mosquitos, onde geralmente atuam sob a fase de vapor. Para
prolongar a ação destes óleos são desenvolvidas formulações baseadas em cremes,
misturas de polímeros ou microcápsulas. É comum ainda a adição de fixadores como
parafina líquida, óleo de coco, bem como vanilina que é o fixador mais utilizado para
prolongar o período de ação de óleos voláteis (NERIO et al., 2010).
Os óleos voláteis são promissores como inseticidas e/ou repelentes. Entretanto,
seus mecanismos de ação não estão ainda bem estabelecidos. Devido a alta diversidade
química, estudos apontam que os mesmos atuam como pesticidas por diferentes
mecanismos, tais como: mortalidade, deterrência, repelência ou inibição do
desenvolvimento dos insetos (RATTAN, 2010).
Uma importante consideração deve ser feita, por consistirem de uma mistura de
compostos diversos, jamais se deve descartar a possibilidade de ocorrência de
sinergismo entre os componentes dos óleos voláteis, bem como a possibilidade de
compostos minoritários modularem a atividade do(s) componente(s) responsável (eis)
pela atividade observada. Tais particularidades dificultam ainda mais o estabelecimento
dos mecanismos de ação pelos quais atuam os óleos voláteis (BAKKALI et al., 2008).
1.1.6 - Importância comercial
Os óleos voláteis devido as suas propriedades aromatizante, flavorizante e
terapêutica são de grande interesse para a perfumaria e as indústrias farmacêutica e
alimentícias, respectivamente, demandando produção em escala de toneladas e
movimentando bilhões de dólares todos os anos. No ano de 2008 o Brasil atingiu a
marca de maior produtor mundial de óleos voláteis (Figura 6) seguido por Índia e EUA
(SCHMIDT, 2010).
FIGURA 6: Produção mundial de óleos voláteis em 2008. Fonte: Schmidt, 2010.
O Brasil aparece como 3° maior exportador mundial de óleos voláteis, atrás
apenas de França e EUA. Entretanto a maior parte da exportação brasileira atual
consiste de óleos voláteis de cítricos, principalmente de laranja e limão, que são
subprodutos da indústria de sucos, e de menor valor comercial. Entretanto, no passado
exportávamos óleos de maior valor comercial como pau-rosa, menta e sassafrás,
atualmente nosso país ocupa a condição de importador destes dois últimos óleos
(BIZZO et al., 2009).
Segundo relatório enviado ao BNDES os mercados nacionais de "Aromas e
Sabores" e de "Fragrâncias" aos quais os óleos voláteis estão diretamente relacionados,
movimentaram juntos em 2012 cerca de 1,2 bilhão de dólares, sendo o óleo de laranja o
responsável por 79% (30 mil toneladas) das exportações, movimentando sozinho 125
milhões de dólares. Há entretanto uma discrepância entre os valores de exportação e
importação, já que o Brasil enquanto exporta óleo de laranja de baixo valor comercial
(média de US$4,1/Kg em 2012), importa óleos de alto valor comercial como o óleo de
menta japonesa (média de US$31,2/Kg em 2012), responsável por 14% das
importações, o que provoca grandes oscilações na balança comercial (BAIN &
COMPANY, 2014).
1.2 - O gênero Eucalyptus
1.2.1 - Características, ocorrência e importância econômica
Eucalyptus é nativo da Austrália e o principal gênero da família Myrtaceae,
abrangendo cerca de 700 espécies. Embora a maioria das espécies de Eucalyptus seja
nativa da Austrália e Tasmânia, devido ao interesse econômico e a fácil adaptação
climática, espécies diversas têm sido introduzidas em diferentes países, tornando
Eucalyptus um dos gêneros mais cultivados no mundo, principalmente como fonte de
madeira e óleos voláteis (BATISH et al., 2008; ZRIRA et al., 2004).
O nome Eucalyptus deriva do Grego (eu, "bem" + kalyptós, "coberto"),
referindo-se à estrutura globular arredondada de seu fruto, que protege bem as sementes
e esconde o botão floral em seu interior. As espécies de Eucalyptus ocorrem como
árvores de grande porte e apresentam odor característico, devido aos óleos voláteis
exalados por suas folhas (CHENG et al., 2009).
A madeira de Eucalyptus spp. encontra aplicações variadas, sendo utilizada na
construção civil, marcenaria, indústria do papel, bem como biomassa para produção de
energia. As folhas por sua vez representam uma excelente fonte de óleos voláteis de
grande interesse para as indústrias farmacêutica, alimentícia e da perfumaria
(FIGUEIREDO et al., 2013).
No Brasil, espécies de Eucalyptus foram introduzidas visando seu cultivo
primariamente como fonte de matéria prima para a indústria de celulose, a produção de
carvão e a obtenção de óleos voláteis, esta última, por sua vez é a atividade mais
lucrativa. Somente no período de 2005-2008 as exportações brasileiras de óleos voláteis
de Eucalyptus spp. somaram US$ 9,6 milhões, sendo a União Européia o maior
importador do nosso produto (BIZZO et al., 2009).
As espécies de Eucalyptus mais cultivadas para obtenção de óleos voláteis no
Brasil são E. globulus, E. citriodora e E. staigeriana, que produzem óleo rico em 1,8-
cineol. E. globulus foi a espécie pioneira, introduzida em 1855 visando primariamente a
produção de madeira, mas somente em 1903 grandes populações foram difundidas. Já a
extração do óleo volátil de suas folhas iniciou-se durante a 2ª guerra mundial, onde a
importação deste tipo de óleo era impraticável (VITTI & BRITO, 2003).
1.2.2 - Óleos voláteis de Eucalyptus
1.2.2.1 - Composição química
Em Eucalyptus spp. além das folhas os óleos voláteis podem ser encontrados nas
cascas, brotos e frutos. Entretanto, o óleo mais comum e de maior valor comercial, é
obtido das folhas e apresenta elevado teor de terpenos (ZRIRA et al., 2004).
Devido à importância econômica e medicinal dos óleos voláteis de Eucalyptus
spp. diversos são os estudos avaliando sua composição química. No entanto, das
aproximadamente 700 espécies de Eucalyptus já descritas, cerca de apenas 200 foram
avaliadas quanto à produção e ao teor de óleos voláteis. Estudos que em geral revelam a
predominância de mono e sesquiterpenos (DORAN, 1991).
Os óleos voláteis das folhas de Eucalyptus spp. são constituídos por uma mistura
complexa de cerca de 50-100 ou até mais componentes, principalmente terpenos,
álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos e ésteres. Embora os terpenos sejam geralmente os
componentes principais, a composição bem como a proporção dos constituintes do óleo
varia de acordo com cada espécie (BROOKER & KLEINIG, 2006).
Dentre os principais componentes dos óleos voláteis de Eucalyptus spp. o
monoterpeno 1,8-cineol (30) (Figura 7) merece destaque, já que ocorre como
componente majoritário da maior parte das espécies já estudadas. Conforme apontado
por Zrira et al., (2004) que avaliaram a composição química dos óleos voláteis de nove
espécies de Eucalyptus cultivadas no Marrocos e observaram o 1,8-cineol como
componente majoritário de todas elas, sugerindo tais espécies como excelentes fontes de
óleos de alto valor comercial.
Além do 1,8-cineol monoterpenos como o β-ocimeno (31), α-pineno (32) e β-
pineno (33) são também bastante comuns, ocorrendo como componente majoritário dos
óleos voláteis de espécies como E. curtissi, E. rubiginosa e E. tenuipes respectivamente
(BROPHY et al., 1999). Outros exemplos são (R)-limoneno (19), α-thujeno (34) e
citronelal (13), componentes majoritários dos óleos voláteis de E. staigeriana, E. alba e
E. citriodora respectivamente (RIBEIRO et al., 2013; OYEDEJI et al., 1999; MACIEL
et al., 2010).
FIGURA 7: Monoterpenos comumente observados como componente majoritário dos
óleos voláteis de Eucalyptus spp.
Na tabela 1 são apresentados alguns exemplos de terpenos majoritários
observados nos óleos voláteis de Eucalyptus spp. coletadas em regiões variadas.
TABELA 1: Compostos majoritários observados em Eucalyptus spp. coletadas em regiões diversas.
Espécie Composto (%) País da coleta Referência E. camaldulensis α-pineno 22.52 Taiwan Cheng et al., (2009)
E. tenuipes β-pineno 31.0 Austrália Brophy et al., (2009) E.cinerea 1,8-cineol 87.8 Marrocos Zrira et al., (2004) E. alba α-tujeno 32.9 Nigéria Oyedeji et al., (1999)
E. camaldulensis p-cimeno 28.6 Montenegro Grbovic et al., (2010) E. staigeriana (+) - limoneno 72.9 Brasil Ribeiro et al., (2013) E. citriodora 1,8-cineol 54.0 Tunísia Elaissi et al., (2011) E. globulus 1,8-cineol 89.9 Brasil Vilela et al., (2009)
E. camaldulensis 1,8-cineol 69.5 Irã Medhi et al., (2010) E. saligna α-pineno 39.5 Camarões Tapondjou et al., (2005)
Por sua vez monoterpenos como o timol (35) (Figura 8), mirceno (36),
terpinoleno (37), α-terpineol (38), linalol (39) e pinocarvona (40), embora bastante
comuns, ocorrem geralmente como componentes minoritários dos óleos voláteis de
Eucalyptus spp. dentre elas E. smithii, E. camaldulensis e E. alba, respectivamente
(ZRIRA et al., 2004; CHENG et al., 2009; OYEDEJI et al., 1999).
O
30 31
32 33
34
FIGURA 8: Exemplos de monoterpenos encontrados como componentes minoritários
nos óleos voláteis de Eucalyptus spp.
Com relação aos sesquiterpenos, globulol (41) (Figura 9), β-cariofileno (42),
aromadendreno (43) e espatulenol (44) são seus representantes mais comuns e ocorrem
como componentes minoritários em espécies como E. camaldulensis, E. rubiginosa, E.
curtisii e E. alba, respectivamente, (CHENG et al., 2009; BROPHY et al., 1999;
OYEDEJI et al.; 1999).
Os componentes majoritários dos óleos voláteis de Eucalyptus spp. são via de
regra monoterpenos. Há entretanto espécies cuja composição química foge do habitual e
apresentam sesquiterpenos como componentes majoritários, a exemplo de E. varia e E.
deglupta que apresentam como componente majoritário os sesquiterpenos germacreno
D (45) e trans-nerolidol (46), respectivamente (BROPHY et al., 1999; OYEDEJI et al.,
1999).
OH
OH
OHO
35 36 37
38 39 40
FIGURA 9: Sesquiterpenos comumente encontrados nos óleos voláteis de Eucalyptus
spp.
Segundo Bizzo et al.; (2009) e Vitti & Brito (2003) quanto ao uso, os óleos
voláteis de Eucalyptus spp. são divididos em três tipos principais: medicinais,
industriais e para a perfumaria.
óleos medicinais - apresentam como componente majoritário o 1,8-cineol (mínimo de
70%) e são destinados à fabricação de produtos farmacêuticos, como inalantes,
estimulantes da secreção nasal, produtos para higiene bucal ou como aromatizante e
flavorizante de medicamentos diversos. E. dumosa, E. camaldulensis, E. sideroxylon, E.
globulus estão entre as principais fontes de obtenção deste tipo de óleo, sendo que no
Brasil E. globulus é de longe a espécie mais cultivada para este fim.
óleos industriais - apresentam como componente principal o felandreno ou a
piperitona. O felandreno é usado como solvente e matéria prima de desinfetantes, a
piperitona, por sua vez, é utilizada como base para a obtenção de timol e mentol, que
apresentam utilidades diversas. São fontes deste tipo de óleo: E.dives, E. elata, E.
radiata, dentre outras.
óleos para a perfumaria - apresentam como componente majoritário geralmente citral
ou citronelal, são utilizados como essências na fabricação de produtos diversos como
sabões, desinfetantes, velas aromáticas, dentre outros. São obtidos principalmente de E.
citriodora, E. macarthurii e E. staigeriana.
OH
OH
OH
41 42 43
44 45 46
1.2.2.2 - Atividade inseticida e repelente
Aos óleos voláteis de Eucalyptus spp. são atribuídas atividades diversas, dentre
elas as atividades antibacteriana, antifúngica e anti-séptica, que são bem descritas na
literatura e conhecidas há centenas de anos (BROOKER & KLEINIG, 2006).
Entretanto, tais óleos são mais reconhecidos por seu potencial pesticida, atuando
principalmente sobre insetos, como inseticidas ou repelentes. A potencialidade como
pesticida, somada à baixa toxicidade para mamíferos e facilidade de obtenção fazem
com que os óleos voláteis de Eucalyptus spp. sejam os mais utilizados no controle de
pragas diversas (BATISH et al., 2008).
Vários estudos demonstram o potencial dos óleos voláteis de Eucalyptus spp. no
controle de insetos, desde simples invasores como a baratinha germânica (Blatella
germanica) à espécies de Aedes, Anopheles e Culex vetores de importantes doenças
como a dengue, malária e filariose, respectivamente (ALZOGARAY et al., 2011;
NERIO et al., 2010).
Na tabela 2 são apresentados alguns exemplos de estudos avaliando a atividade
de óleos voláteis de Eucalyptus spp. sobre espécies variadas de insetos.
TABELA 2: Atividade de Eucalyptus spp. sobre diferentes espécies de insetos.
Embora os óleos voláteis de Eucalyptus spp. possam atuar sobre as diferentes
fases de desenvolvimento dos insetos, observa-se que a maior parte dos estudos se atém
à avaliação da atividade sobre uma única fase, sendo bastantes escassos estudos como o
de Yang et al., (2004) que demonstraram a atividade de Eucalyptus globulus sobre as
fases adulta, larval e de pupa de Pediculus humanus capitis, o piolho humano,
apresentando maior atividade que a delta-fenotrina e a piretrina, potentes inseticidas.
Espécie Atividade avalidada
Espécie alvo Referência
E. camaldulensis Adulticida Ectomyelois ceratoniae Jemâa et al., (2013) E. elata Repelente Tetranychus urticae Roh et al., (2013)
E. citriodora Repelente Aedes aegypti Sritabutra & Soonwera (2013) E. camaldulensis Larvicida Anopheles stephensi Medhi et al., (2010)
E. globulus Pupicida Musca domestica Kumar et al., (2012) E. grandis Fumigante Aedes aegypti Lucia et al., (2009) E. globulus Ovicida Pediculus humanus Yang et al., (2004) E. dunnii Ninficida Blattella germanica Alzogaray et al., (2011)
E. globulus Larvicida Aedes aegypti Manimaran et al., (2013)
1.2.2.3 - Atividade sobre Aedes aegypti
No controle de A. aegypti os inseticidas mais comumente utilizados são o
temefós, usado como larvicida no tratamento focal e os piretróides usados para controlar
o mosquito na fase adulta, em casos de epidemia (LUCIA et al., 2013).
Considerando-se o potencial inseticida dos óleos voláteis de Eucalyptus spp. e
Aedes aegypti como principal vetor da dengue, são bastante comuns estudos avaliando a
atividade de Eucalyptus spp. sobre esta espécie. Dentre as atividades mais avaliadas
destacam-se as atividades larvicida, adulticida e repelente (MACIEL et al., 2010).
Estudos como o de Lucia et al., (2007) que avaliaram a atividade larvicida do
óleo volátil das folhas de E. grandis, bem como dos terpenos 1,8-cineol, α-pineno e β-
pineno, seus componentes principais, sobre larvas de Aedes aegypti de 3° e 4° estádio.
Todas as amostras apresentaram atividade larvicida. No entanto, os terpenos α-pineno e
β-pineno, para os quais foram respectivamente observados valores de CL50 de 15.4 e
12.1 ppm, foram mais ativos que o óleo bruto (CL50 = 32.4 ppm). A menor atividade foi
observada para o 1,8-cineol, LC50 = 57,2 ppm.
A mistura do óleo volátil das folhas de Eucalyptus globulus (16%) com os óleos
voláteis de Acorus calamus (3%), Cinnamomum verum (13%), Cymbopogon nardus
(12%), Myrtus caryophyllus (24%), Citrus lemon (7%), Citrus sinensis (25%) resultou
em uma formulação com potente atividade larvicida sobre Aedes aegypti (LC50 = 40,17
ppm), Anopheles stephensi (LC50 = 42,17 ppm) e Culex quinquefasciatus (LC50 = 35,95
ppm). Sugerindo que os óleos voláteis de Eucalyptus spp. sejam ativos também quando
associados à outros óleos (MANIMARAN et al., 2013).
Cheng et al., (2009) avaliaram a atividade larvicida dos óleos voláteis das folhas
de E. camaldulensis e E. urophylla, bem como de seus componentes principais sobre
larvas de 3° estádio de Aedes aegypti e Aedes albopictus. E. camaldulensis apresentou
atividade superior a de E. urophylla, com valores de LC50 = 31 ppm e 55,3 ppm, para A.
aegypti e A. albopictus, respectivamente. Em relação aos componentes isolados, o γ-
terpineno, terpeno presente em ambos os óleos, foi o mais ativo, com LC50 = 14,7 ppm,
para ambas as espécies de Aedes.
Lucia et al., (2009), avaliaram a atividade fumigante dos óleos voláteis das
folhas de treze espécies de Eucalyptus sobre a fase adulta de Aedes aegypti. Os testes
foram realizados em câmara fechada para permitir a concentração do vapor e a atividade
foi estabelecida com base nos valores de KT50, que expressa o tempo necessário para
paralisar 50% dos mosquitos, baseado no chamado efeito knockdown provocado por
piretróides que causam a paralisia dos insetos e consequente morte. Dentre as espécies
avaliadas as mais ativas foram E. viminalis (KT50 = 4,2 minutos), E. globulus maidenii
(KT50 = 4,3 min.) e E. sideroxylon (KT50 = 4,8 min.). Foi observada ainda forte
correlação entre a atividade fumigante e o teor de 1,8-cineol, de forma que óleos com
maiores teores deste terpeno foram os mais ativos sobre A. aegypti.
A atividade fumigante do α-terpineol, γ-terpineno, 4-terpineol, p-cimeno, α-
pineno e 1,8-cineol, terpenos bastante comuns nos óleos voláteis de Eucalyptus spp. foi
avaliada sobre a fase adulta de A. aegypti. O 1,8-cineol (KT50 = 1,34 min.) foi o mais
ativo, seguido pelo α-pineno (KT50 = 5,36 min.) e p-cimeno (KT50 = 5,82 min.). Foi
observada forte correlação entre atividade adulticida e a pressão de vapor dos terpenos,
quanto maior a volatilidade maior foi a atividade observada (LUCIA et al., 2013).
Os repelentes são substâncias que atuam localmente ou a distância afastando os
insetos. Entretanto, o uso de repelentes se dá principalmente pelo emprego de
substâncias sintéticas que podem trazer riscos à saúde, provocando desde ardência na
pele à erupções cutâneas e/ou alergias (DAS et al., 2003).
Diversos óleos de Eucalyptus são utilizados como repelentes e dependendo da
concentração podem fornecer até 8 horas de proteção contra a picada de insetos e por
isso seu uso popular é bastante difundido, na África, por exemplo, é comum a queima
das folhas de Eucalyptus spp. com a finalidade de repelir espécies diversas de
mosquitos (BATISH et al., 2008).
A atividade repelente do óleo volátil das folhas de E. globulus foi avaliada sobre
A. aegypti e Anopheles dirus, através do teste repelência em superfície impregnada, na
qual os braços de voluntários foram tratados com o óleo e expostos às fêmeas adultas
das duas espécies de mosquito. A atividade foi determinada considerando-se o tempo de
proteção provocado pelo óleo, que demonstrou alta atividade contra ambas as espécies
com tempos de proteção de 82 minutos e 95 minutos para A. aegypti e Anopheles dirus,
respectivamente. O óleo de E. globulus foi avaliado ainda como mistura binária com os
óleos das flores de Syzigium aromaticum (cravo da Índia), das folhas de Mentha x
piperita (hortelã-pimenta) e das folhas de Ocimum basilicum (manjericão), sendo este
último o mais ativo, apresentando tempos de proteção de 99 minutos e 210 minutos
contra A. aegypti e Anopheles dirus, respectivamente (SRITABUTRA et al., 2011).
Óleos voláteis de Eucalyptus spp. além de atuarem como inseticidas e/ou
repelentes apresentam como vantagem a baixa toxicidade sobre mamíferos, a exemplo
do óleo volátil das folhas de E. citriodora bem como o 1,8-cineol, seu componente
majoritário, que apresentam toxicidade aguda em ratos de 4440 mg/Kg e 2480 mg/Kg,
respectivamente, sendo ambos muito menos tóxicos que as piretrinas (350-500 mg/Kg),
componentes principais de produtos inseticidas diversos (BATISH et al., 2008).
Embora sejam eficientes como inseticidas e/ou repelentes poucos são os
inseticidas à base de Eucalyptus disponíveis no mercado. O primeiro produto foi
registrado nos EUA em 1948 e até 2007 outros 29 produtos haviam sido registrados,
destes apenas 4 estão disponíveis no mercado, dentre eles o Mosi-guard, repelente que
contém 50% do óleo volátil das folhas de E. citriodora (JAENSON et al., 2006). Desta
forma, a realização de estudos avaliando a atividade inseticida e/ou repelente de óleos
voláteis de Eucalyptus spp. se faz necessária.
1.3 - Dengue
A dengue é uma doença viral que ocorre em mais de 100 países, com uma
estimativa anual de 50 a 100 milhões de casos de infecção, além disso mais de 2,5
bilhões de pessoas vivem em áreas com alto risco de contaminação (WHO, 2002).
A dengue é causada por um arbovírus, que inclui quatro sorotipos distintos
DENV-1, DENV-2. DENV-3 e DENV-4. O vírus é transmitido principalmente pela
picada de fêmeas infectadas do mosquito A. aegypti, originário do continente africano e
introduzido na América do Sul através de navios negreiros que transportavam escravos
provenientes da África, no período colonial (BARRETO & TEIXEIRA, 2008).
O controle da dengue atualmente consiste de três estratégias principais: controle
vetorial, vigilância e desenvolvimento de vacinas eficazes. Entretanto, como não há
ainda uma vacina validada, as duas primeiras estratégias são as mais comumente
empregadas. O controle vetorial como o próprio nome sugere, visa à redução dos
vetores do vírus, através da eliminação dos criadouros dos mosquitos, bem como
aplicação de inseticidas (LIGON, 2005). Por sua vez, cabe aos sistemas de vigilância
determinar e/ou acompanhar os níveis de infestação vetorial, monitorar áreas com maior
incidência de casos, bem como promover campanhas de sensibilização popular, neste
caso atuando de modo preventivo (BRASIL, Ministério da Saúde, 2005).
No Brasil, desde 1967, os programas de saúde pública empregam principalmente
organofosforados no controle do Aedes aegypti. O controle das larvas é feito utilizando-
se temefós a 1 ppm geralmente adsorvido em grãos de areia numa formulação contendo
1% desse organofosforado, que devido à baixa toxicidade oral para mamíferos pode ser
aplicada em água para consumo humano. O controle da fase adulta, por sua vez,
consiste na aplicação de inseticidas organofosforados e piretróides, geralmente durante
os quadros de epidemia (LIMA et al., 2006).
Devido ao uso prolongado de organofosforados, a resistência a estes inseticidas
já foi detectada em diversos estados brasileiros, dentre eles São Paulo, Rio de Janeiro,
Mato Grosso do Sul, Sergipe, Alagoas e Ceará. Lima et al., (2003), avaliaram a
resistência de larvas e adultos de A. aegypti provenientes de sete municípios do estado
do Rio de Janeiro e três municípios do Espírito Santo, aos organofosforados temefós
(larvas e adultos) e malathion (adultos) e ao organofosfato fenitrothion (adultos). As
larvas e adultos apresentaram alta resistência ao temefós, sendo menos resistentes ao
malathion e fenitrothion. Desta forma é essencial a busca por formas de controle
alternativas que possam minimizar os problemas causados pelas substâncias atualmente
disponíveis.
1.4 - Área de coleta de Eucalyptus spp.
Luz é um município mineiro que está localizado na região conhecida por Alto
São Francisco, estando a 197 quilômetros de distância da capital Belo Horizonte. O
município abrange uma área de 1.171,670 km2, em sua maior parte rural, ocupada pelas
grandes fazendas da cidade. Em 2010 a população era de 17.486 pessoas, sendo a
estimativa da população residente para 2014 de 18.230 pessoas. A cidade apresenta
índice de desenvolvimento humano (IDH) de 0,801, considerado muito alto, estando
entre os mil municípios com maior IDH do país (IBGE, Censo demográfico - 2010).
FIGURA 10: Localização da cidade de Luz no estado de Minas Gerais.
LUZ
Agricultura e pecuária são as bases da economia luzense. O município destaca-
se como um dos maiores produtores de leite do país, sendo também referência no
fornecimento de gado da raça Girolando para o Brasil e diversos países da América
Latina. Na agricultura destaca-se o cultivo de cana-de-açúcar para abastecimento de
indústrias sucroalcooleiras da região, bem como culturas diversas como milho, abóbora
e feijão. O eucalipto é também bastante cultivado, como fonte de madeira utilizada
principalmente na construção civil e na fabricação de postes que sustentam os arames
nas cercas que delimitam a área das fazendas (IBGE, Censo Agropecuário - 2006).
O município de Luz, assim como grande parte dos municípios mineiros vem
sofrendo todos os anos com a dengue. Minas Gerais ocupa atualmente o topo do ranking
dos estados brasileiros com maior incidência de casos de dengue, seguido por São Paulo
e Rio de Janeiro (BRASIL, Ministério da Saúde, 2014).
Um levantamento junto à Secretaria Municipal de Luz revelou que nos últimos
cinco anos foram registrados um total de 3.761 casos de dengue, sendo 11 óbitos
(Tabela 3), valores expressivos, considerando-se a pequena população do município.
Em 2009 e 2013, por exemplo, os casos registrados, superaram a marca de 10% da
população.
TABELA 3: Casos de dengue notificados no Brasil, Minas Gerais e Luz, de 2009-2013.
Notificações de casos de dengue (óbitos)
Ano Brasil a Minas Gerais b Luz c 2009 528.883 (298) 83.838 (24) 36 (1) 2010 1.004.392 (673) 268.440 (106) 1.765 (3) 2011 764.032 (482) 66.596 (22) 25 (1) 2012 565.510 (284) 46.681 (18) 43 (2) 2013 1.468.873 (545) 337.840 (198) 1.898 (4) Total 4.331.690 (2.282) 803.395 (368) 3.767 (11)
Fonte: a Organização Mundial da Saúde; b Secretaria de Estado de Saúde de Minas Gerais; c Secretaria Municipal de Saúde de Luz.
Os casos são registrados principalmente durante o verão, período durante o qual
é feita a aplicação de inseticida utilizando-se um veículo do tipo fumacê que percorre
diariamente as áreas com maior incidência de casos. Tratamento que não ocorre,
entretanto, nas propriedades rurais e em áreas com menores índices de infecção. Nestes
casos especificamente, a população adotou práticas alternativas para controlar a
transmissão da doença, a mais comum é o uso das folhas de espécies de Eucalyptus que
são coletadas diariamente nas áreas urbana ou rural e utilizadas como repelente do A.
aegypti. As folhas são geralmente colhidas no período da tarde, são amassadas e
colocadas em forma de "chumaço" ao entardecer no interior das residências, que
permanecem fechadas até o período da noite. É comum ainda o uso do sumo das folhas
Eucalyptus no preparo de velas, que são também utilizadas como repelentes.
Baseado no uso popular de Eucalyptus spp. como repelente pela população da
cidade de Luz e considerando-se o potencial inseticida e repelente dos óleos voláteis de
espécies deste gênero, o trabalho ora apresentado propõe o estudo da composição
química bem como a avaliação das atividades inseticida e repelente dos óleos voláteis
das folhas de E. pilularis, E. pelitta e E. saligna, espécies cultivadas como fonte de
madeira mas também utilizadas popularmente no combate ao principal vetor da dengue.
2 - JUSTIFICATIVA
Considera-se de grande importância a realização do presente estudo devido aos
seguintes fatores:
I) Grande interesse científico e popular sobre espécies de Eucalyptus, já que
possuem usos etnofarmacológicos diversos e considerável valor comercial;
II) Elevado potencial dos óleos voláteis como fonte de substâncias com propriedades
inseticidas;
III) Escassez de estudos avaliando a composição química e a atividade inseticida
dos óleos voláteis de determinadas espécies de Eucalyptus, principalmente de E.
pellita e E. pilularis, cujos trabalhos se restringem a estudos agronômicos;
IV) Importância da busca por substâncias naturais eficazes no controle de insetos,
como alternativa aos inseticidas sintéticos, cujo uso nem sempre é considerado
seguro;
V) Necessidade da busca por alternativas eficazes no controle do Aedes aegypti,
principal vetor da dengue, doença que têm causado freqüentes epidemias em
nosso país e cujas técnicas de controle disponíveis são ainda ineficazes;
VI) Importância de estudos que visem à confirmação científica das propriedades
relatadas pelo uso popular de espécies vegetais.
3 - OBJETIVOS
Geral
Estudo da composição química dos óleos voláteis obtidos das folhas de E.
pellita, E. pilularis e E. saligna, bem como avaliação de sua atividade sobre diferentes
fases do desenvolvimento de Aedes aegypti.
Específicos
I ) Obtenção dos óleos voláteis das folhas de Eucalyptus spp. através da
hidrodestilação utilizando-se extrator do tipo Clevenger com modificações;
II) Análise da composição química dos óleos obtidos, por CGAR-EM;
III) Determinação das principais propriedades físicas dos óleos obtidos, segundo
metodologias preconizadas pela Farmacopéia Brasileira no controle de qualidade
de óleos essenciais;
IV) Avaliação da atividade in vivo dos óleos obtidos, sobre ovos, larvas, pupas e
insetos adultos de Aedes aegypti;
4 - METODOLOGIA
O presente trabalho consiste no estudo fitoquímico dos óleos voláteis das folhas
de três espécies de Eucalyptus bem como a avaliação de sua atividade inseticida sobre
diferentes fases do desenvolvimento de Aedes aegypti. Todos os experimentos
envolvidos serão realizados no laboratório de Fitoquímica do NPPN, que dispões de
toda a infra-estrutura necessária à realização do estudo. As análises cromatográficas e de
determinação da rotação óptica dos óleos serão realizadas na Central Analítica do
NPPN.
4.1 - Coleta, identificação botânica e herborização
O presente estudo visa à obtenção dos óleos voláteis das folhas de espécies do
gênero Eucalyptus cultivadas no município de Luz-MG como fonte de madeira e
utilizadas pela população no combate ao mosquito da dengue. Para tanto as espécies E.
pellita, E. pilularis e E. saligna foram selecionadas.
Cerca de 5 Kg de folhas de cada uma das espécies serão coletadas em diferentes
propriedades rurais particulares. As folhas de E. pellita serão coletadas na fazenda Araçá
de propriedade do Sr. Geraldo Alves Sobrinho. Folhas de E. pilularis por sua vez serão
coletas na fazenda Rancho Velho de propriedade do Sr. Bruno Paolinelli Macedo. Por
fim as folhas de E. saligna serão coletadas em área da fazenda Recanto dos Guimarães
de propriedade do Sr. Ueslei Mendes Guimarães.Todas as plantações com cerca de 15-
20 anos de cultivo. A confirmação da identidade das espécies será realizada pela
taxonomista Profª Cassia Sakuragui do Instituto de Biologia da UFRJ, sendo uma
exsicata de cada espécie depositada no Herbário do mesmo instituto.
4.2 - Secagem das folhas, extração e tratamento dos óleos voláteis
As folhas de cada uma das espécies coletadas serão secas à sombra pelo período
de 5 dias e posteriormente submetidas à hidrodestilação em aparato do tipo Clevenger
por 3 horas. Período após o qual o óleo obtido será coletado e tratado com sulfato de
sódio anidro (Na2SO4) para a remoção da água remanescente. Após esse processo o óleo
será finalmente recolhido, acondicionado em frascos de vidro âmbar e mantido sob
refrigeração até o momento das análises.
4.3 - Análises por CG-EM
A fim de se avaliar a composição química de cada um dos óleos obtidos, os
mesmos serão analisados por CG-EM. As análises serão realizadas na Central Analítica
do IPPN-UFRJ, utilizando-se um cromatógrafo CG 2010 acoplado a um espectrômetro
CG-MS QP2010 Plus (Shimadzu) equipado com coluna capilar de sílica fundida DB-
5ms (25m x 0.25mm x 0.25 µm). Serão empregadas as seguintes condições de análise:
volume de injeção de 2 µl; injetor a 260°C; detector a 290°C; gás hélio como gás de
arraste a um fluxo de 1 mL/min; programação da temperatura da coluna de 60-290°C a
3°C/min. Os espectros de massa por sua vez serão obtidos a 70 eV com varredura na
faixa de m/z 30-700.
A fim de se determinar o índice de Kovats dos componentes das amostras, para
cada amostra de óleo analisada uma mistura de n-alcanos (C9-C30) será injetada sob as
mesmas condições de análise. A identificação dos constituintes será realizada através da
comparação dos espectros de massas obtidos, com os espectros das bibliotecas NIST 21
e NIST 107, além da comparação dos índices de Kovats calculados com os valores
constantes na literatura especializada, utilizando-se como base o livro "Identification of
essential oil components by gas cromatography/mass spectrometry" (ADAMS, 2007).
Por fim a análise percentual dos constituintes principais será realizada com base nas
áreas relativas de seus respectivos sinais no cromatograma.
4.4 - Determinação da densidade específica, rotação óptica, índice de refração e
teor de cineol dos óleos
A fim de se verificar se os óleos voláteis obtidos das folhas de E. pellita, E.
pilularis e E. saligna atendem às especificações recomendadas pela norma ISO 3044
para óleos comerciais de Eucalyptus, será determinado a densidade específica, rotação
óptica, índice de refração e teor de 1,8-cineol de cada um dos óleos.
Densidade relativa - será avaliada através do método do picnômetro a 20°C. Para tanto
a amostra será transferida para um picnômetro de 1 mL dotado de termômetro,
ajustando-se a temperatura para 20°C. A massa da amostra será obtida pela diferença de
massa entre o picnômetro cheio e vazio, valor este que será utilizado para calcular a
densidade relativa, que é expressa pela razão entre a massa do óleo e a massa da água
ambas a 20°C.
Rotação óptica - a rotação óptica de cada óleo será determinada a partir dos ângulos de
rotação observados em um polarímetro Acatec PD-5000 a 20°C, utilizando-se um tubo
de 1.05 dm. Para tanto será preparada uma solução de concentração conhecida de cada
uma das amostras, em clorofórmio. A rotação óptica será calculada empregando-se a
equação de Biot:
α = [α]20 x L x c onde : α = rotação óptica; [α]20 = rotação observada a 20°C; L=
comprimento do percurso óptico em dm; c = concentração g/100 mL.
Índice de refração - o índice de refração dos óleos serão determinados utilizando-se um
refratômetro de Abbe modelo 2WAJ com escala de refração 1,300-1,720 nD e
compensação automática de temperatura (ATC).
Teor de cineol - o teor de cineol de cada óleo será determinado por CG-EM, com base
nas áreas relativas dos sinais de 1,8-cineol em cada cromatograma.
4.5 - Avaliação da atividade inseticida sobre Aedes aegypti
4.5.1 - Condições gerais de cultivo da colônia
A fim de se avaliar a ação inseticida dos óleos voláteis de Eucalyptus spp. sobre
as diferentes fases de desenvolvimento de Aedes aegypti, serão realizados testes ovicida,
larvicida, pupicida, adulticida e de repelência. Para tanto, ovos de Aedes aegypti
Linneaus 1762 (Diptera: Culicidae) da linhagem Rockfeller e livre de resistência serão
obtidos do Instituto de Biologia do Exército e utilizados na implementação de uma
colônia a ser cultivada no laboratório durante a realização dos experimentos. Colônia
esta que será mantida em sala climatizada a 27±2°C, com umidade relativa entre 75-
85% e fotofase de 12 horas. Para a eclosão, tiras de papel contendo os ovos serão
transferidas para bandejas brancas contendo água sem cloro. Após a eclosão dos ovos as
bandejas serão cobertas com telas de malha fina e as larvas alimentadas com ração
canina e cultivadas até a pupação. As pupas por sua vez serão transferidas em copos
plásticos para as gaiolas de criação de adultos, onde irão emergir. Para a reprodução e
posterior deposição dos ovos, um total de 150 mosquitos na proporção de duas fêmeas
para cada macho serão mantidos em gaiolas construídas com armação de madeira e
tecido tipo organza. Os machos serão alimentados diariamente com solução aquosa de
sacarose a 10% e às fêmeas será permitido repasto sanguíneo em camundongos por 6
horas, três vezes por semana. Após o repasto, em cada gaiola serão colocados potes
plásticos descartáveis dotado de um funil envolto com papel filtro e água para estimular
a ovoposição. Finalmente as cartelas de papel filtro contendo os ovos serão recolhidas e
os ovos prontos para serem usados nos testes e/ou iniciar um novo ciclo de cultivo.
Esta etapa do trabalho será realizada com o auxílio do biólogo Celso
Evangelista, que tem longa experiência com Aedes aegypti e ajudará tanto no cultivo
quanto na realização de todos os testes envolvidos.
4.5.2 - Atividade ovicida
A atividade ovicida será avaliada segundo metodologia proposta por
Govindarajan et al., (2011) com algumas modificações. Os óleos voláteis de Eucalyptus
spp. serão avaliados à diferentes concentrações (150, 125, 75, 50, 25 e 12.5 ppm)
utilizando-se Tween 80 (0,01%) como emulsificante. Para cada concentração, tiras de
papel filtro com no mínimo 100 ovos (contados com o auxílio de uma lupa) serão
imersas em placas de Petri (15 cm de diâmetro x 2 cm de altura) contendo 3 mL de água
destilada (suficiente para cobrir os ovos). O controle consistirá do tratamento com
Tween 80 (0,01%). Após 48 horas, os ovos de cada tratamento serão transferidos para
copos plásticos com água onde será feita a contagem das larvas eclodidas e posterior
determinação da porcentagem da mortalidade.
4.5.3 - Atividade larvicida
A atividade larvicida será determinada de acordo com metodologia proposta pela
Organização Mundial da Saúde (OMS, 2005) com modificações. Os óleos serão
avaliados nas concentrações finais de 200, 175, 125, 100, 75 e 25 ppm. Para tanto em
um copo plástico com 99 mL de água sem cloro (um copo para cada concentração
avaliada) será acrescentado 1 mL da amostra a ser testada. Em seguida 25 larvas de 3°
estádio recém transferidas com o auxílio de uma pipeta de Pasteur plástica para copos
descartáveis contendo 5 mL de água sem cloro serão transferidas para os copos
contendo cada tratamento. O controle negativo consistirá de solução aquosa de Tween
80 (0,01%), como controle positivo, por sua vez, será usado temefós a 6 ppm. A leitura
da mortalidade será realizada após 24 horas de tratamento.
4.5.4 - Atividade pupicida
A avaliação da atividade pupicida será realizada de acordo com a metodologia
utilizada por Panneerselvam et al., (2012) com modificações, com os óleos voláteis nas
concentrações de 250, 225, 175, 150, 125 e 75 ppm. Para cada tratamento 25 pupas
recém emergidas serão transferidas para copos plásticos contendo 249 mL de água sem
cloro e tratadas com 1mL da amostra. O controle negativo consistirá de solução aquosa
de Tween 80 (0,01%), como controle positivo, assim como nos ensaios de atividade
larvicida, será usado temefós a 6 ppm. A leitura da mortalidade das pupas será realizada
após 24 e 48 horas do tratamento. Os copos plásticos contendo os tratamentos serão
cobertos com tecido tipo organza, a fim de se evitar a fuga caso haja emergência dos
mosquitos.
4.5.5 - Atividade adulticida
A atividade adulticida será determinada de acordo com metodologia proposta
pela Organização Mundial da Saúde para avaliar a resistência de mosquitos adultos à
inseticidas, através do uso de papéis impregnados (OMS, 1981). Os testes serão
conduzidos utilizando-se um kit experimental fornecido pela OMS, que consiste de dois
tubos plásticos cilíndricos (tubo de exposição e tubo de retenção) separados por uma
porta móvel. No tratamento, o tubo de exposição recebe uma tira de papel filtro (140 x
120 mm) impregnada com a amostra, enquanto que no controle o papel filtro
acrescentado é livre de tratamento. O tratamento consistirá da exposição dos mosquitos
à tiras de papel filtro impregnadas com os óleos de Eucalyptus spp. à diferentes
concentrações (500, 450, 350, 300, 250 e 150 ppm) que após secagem por 5 minutos
serão introduzidas dentro do tubo de exposição, em seguida 20 fêmeas de A. aegypti
com 5-6 dias de idade serão adicionadas e expostas por 60 minutos, após este período os
mosquitos serão transferidos para o tubo de retenção (através da porta móvel) e
mantidos por 24 horas, período após o qual será realizada a leitura da mortalidade.
4.5.6 - Atividade repelente
A atividade repelente será avaliada através do teste de repelência em superfície
impregnada (OMS, 2009), que consiste na exposição dos braços de voluntários à fêmeas
adultas de Aedes aegypti sem repasto sanguíneo (alimentadas somente com solução de
sacarose) e portanto ávidas por sangue. Antes do teste os voluntários lavam os braços e
as mãos com água destilada e sabão neutro e após secagem por 10 minutos um volume
de 0.1 mL do óleo volátil de Eucalyptus spp. à diferentes concentrações (0.5, 1 e 2
mg/cm2) é aplicado e espalhado em uma área de 50 cm2 do antebraço direito do
voluntário (tratamento) enquanto o antebraço esquerdo não recebe tratamento
(controle). Em seguida o voluntário veste uma luva em cada mão e os antebraços são
envolvidos por uma faixa de papel com uma abertura de 25 cm2, que expõe parte da
área tratada com a amostra ou o controle. São utilizadas duas caixas de madeira
(30x30x30 cm) com as partes lateral e frontal de tecido. Cinquenta fêmeas adultas de
Aedes aegypti com 4 a 8 dias de idade são transferidas para cada uma das caixas e em
seguida os braços contendo a amostra e controle são expostos simultaneamente nas
caixas da direita e esquerda, respectivamente. Os braços são mantidos nas caixas por 5
minutos e a exposição é repetida 1, 2, 4, 6 e 8 horas após tratamento, após cada leitura
novas fêmeas são colocadas em cada uma das caixas. Durante o período de exposição
anota-se a cada minuto quantos mosquitos pousam e quantos picam a pele do
voluntário. Como controle positivo será utilizado o spray OFF! (SC Johnson) produto
repelente à base de DEET (N,N-dietil-toluamida) e um dos repelentes comerciais mais
eficientes disponíveis no mercado. A atividade repelente será determinada com base na
proteção oferecida pela amostra contra a picada dos mosquitos e calculada pela seguinte
fórmula:
% de proteção = [(PBC - PBT)/ PBC] x 100; onde PBC = número de picadas no
braço controle; PBT = número de picadas no braço tratado.
4.5.7 - Análise estatística
Os resultados serão expressos como média±desvio-padrão, bem como
percentuais de mortalidade no caso dos ensaios ovicida, larvicida, pupicida e adulticida
e percentuais de proteção no caso da atividade repelente. Quando observada alta
mortalidade no controle negativo a fórmula de Abbott: mortalidade corrigida = [1 -
(MT/MC) x 100] onde MT = mortalidade no tratamento e MC = mortalidade no
controle; será empregada para corrigir a mortalidade (ABBOTT, 1925). Os resultados
serão analisados por análise de variância (ANOVA) segundo teste de Tukey ao nível de
5% de significância, utilizando-se o software Graph Pad Prism versão 5.0.1 . As
atividades ovicida, larvicida, pupicida e adulticida serão determinadas com base nos
valores das concentrações necessárias para 50% e 90% da mortalidade (LC50 e LC90)
que serão calculadas através da análise de Probit com intervalo de confiança de 95%,
utilizando-se o software SPSS Statistics versão 16.0 . Serão considerados
estatisticamente significantes resultados com P<0.05.
5 - ORÇAMENTO GLOBAL DO PROJETO
Para a execução do projeto será indispensável a aquisição de materiais de
consumo e materiais permanentes, cujos gastos envolvidos, são detalhadamente
apresentados nos quadros 1 e 2, respectivamente
QUADRO 1: Gastos com material de consumo.
Material de consumo (valores expressos em reais)
Material Finalidade Valor unitário
Quantidade Valor total
Dichlorvos Teste inseticida 50,00 250 mg 50,00 Temephos Teste larvicida 95,00 250 mg 95,00 OFF! spray Teste de repelência 18,00 200 mL 18,00 Tween 80 Testes biológicos 45,00 2 x 50 mL 90,00
Tubos eppendorf Testes biológicos 53,00 Pct. 500 unidades 53,00 Rack para tubos Testes biológicos 16,00 3 unidades 48,00 Ração canina Cultivo dos insetos 7,95 500 g 7,95
Pipetas descartáveis Cultivo dos insetos 24,80 Pct. 100 unidades 24,80 Ponteiras micropipeta Testes biológicos 64,00 Pct. 1000 unidades 64,00 Copos descartáveis Teste larvicida 2,10 6 Pcts. 100 unid. 12,60
Na2SO4 anidro Tratamento dos óleos 33,70 250 g 33,70 Padrão de n-alcanos Cromatografia 109,00 2 ml 109,00
Material de escritório Diversas 100,00 - 100,00 Sacarose Cultivo dos insetos 10,45 500 g 10,45
Gasto total com material de consumo R$ 671,50
QUADRO 2: Gastos com material permanente.
Material permanente (valores expressos em reais)
Material Finalidade Valor unitário
Quantidade Valor total
Agit. tubos tipo vórtex Testes biológicos 370,00 1 370,00 Micropipeta monocanal Testes biológicos 400,00 3 1200,00 Podão e cabo extensor Coleta do material vegetal 369,00 1 369,00 Refratômetro de Abbe Det. índice de refração 1940,00 1 1940,00
Picnômetro Det. da densidade 158,00 1 158,00 Bandeja plástica Cultivo dos insetos 6,90 5 34,50
Aparato tipo Clevenger Hidrodestilação 349,00 1 349,00 Manta aquecedora Hidrodestilação 346,00 1 346,00
Termômetro Hidrodestilação 74,00 1 74,00 Suporte universal Hidrodestilação 102,00 2 204,00
Gasto total com material de consumo R$ 5044,50 Total solicitado para a realização do projeto R$ 5761,00
6 - CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DO PROJETO
Propõe-se a execução deste trabalho em nível de mestrado, com previsão de
execução, portanto, de 24 meses, sendo as atividades principais distribuídas em um total
de oito trimestres, conforme apresentado no quadro 3.
QUADRO 3: Cronograma de execução do projeto.
TRIMESTRES
ATIVIDADE 1 2 3 4 5 6 7 8
Pesquisa e levantamento bibliográfico
X
Coleta e identificação de Eucalyptus spp.
X
Obtenção dos óleos voláteis das folhas
X X
Determinação das propriedades físico químicas
X X
Análise da composição química dos óleos
X X X
Implementação da colônia de A. aegypti
X X
Avaliação das atividades inseticida e repelente
X X X
Análise dos resultados obtidos
X X X X X
Apresentação em eventos científicos
X X X X
Elaboração de artigos e relatórios científicos
X X X X X
7 - RESULTADOS ESPERADOS E PERSPECTIVAS
Após a completa execução do projeto espera-se não somente conhecer a
composição química dos óleos voláteis das três espécies de Eucalyptus avaliadas, como
também concluir se o uso popular de suas folhas como repelente do A. aegypti foi de
fato cientificamente comprovado sob condições de laboratório.
A determinação das propriedades fisico-químicas dos óleos voláteis de
Eucalyptus spp. revelarão se os mesmos atendem às especificações recomendadas para
óleos comerciais de Eucalyptus, e tenham portanto, valor e interesse comercial.
A avaliação da atividade inseticida em diferentes fases de desenvolvimento de A.
aegypti será importante tanto para a obtenção de resultados mais completos, quanto
para o estabelecimento do tratamento mais eficiente, caso o(s) óleo(s) de Eucalyptus
spp. ou seus derivados sejam promissores e possam ser utilizados futuramente como
uma alternativa no controle do A. aegypti.
Caso seja observada atividade larvicida, pretende-se aprofundar os estudos, a
fim de se observar os prováveis modos de ação pelos quais os óleos atuam. Para tanto
sugere-se a realização de uma análise por microscopia eletrônica de varredura, a fim de
se avaliar a ocorrência de modificações estruturais nas larvas tratadas.
Se confirmada a atividade adulticida dos óleos de Eucalyptus spp. uma das
perspectivas é a avaliação da composição química do vapor destes óleos empregando-se
a microextração em fase sólida no modo headspace e posterior análise por CG-EM, já
que os mesmos serão avaliados por fumigação sobre mosquitos adultos.
Por fim, caso seja observada atividade repelente para os óleos de Eucalyptus
spp., pretende-se ainda avaliar a atividade repelente das velas produzidas com o sumo
das folhas destas espécies e que são também comumente utilizadas como repelente pela
população da cidade de Luz.
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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