Extração de nucleotideos

EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE DNA

Dra. Adriana Dantas

UERGS Bento Gonçalves

Objetivos

Mobilizar conhecimentos adquiridos sobre Estruturas celulares e função de DNA e de enzimas

Familiarizar os alunos com os procedimentos envolvidos na extração de DNA;

Exemplificar que a extração de DNA é o primeiro passo de muitas aplicações biotecnológicas: PCR Clonagem-transferênciade genes Tipagem molecular Marcadores moleculares

• O que é DNA?

•Aonde se localiza o DNA numa célula ?

•Do que são formadas as membranas celulares ?

• Qual a estrutura do DNA?

• DNA determina as características de todos os seres vivos.

• DNA é composto de um alfabeto de 4-letras (nucleotídeo/ molécula) referido como A, T, C, and G.

• A ordem do alfabeto determina as características do organismos, como as letras de nosso alfabeto determinam as palavras.

• Cada célula do corpo humano contém >3 BILHÕES de letras.

Cloroplasto

Mitocôndria

Vacúolo

Membrana celular

Parede celular

Citoplasma

Núcleo(DNA)

A única diferença entre os organismos vivos é a quantidade e ordem do alfabeto de DNA.

Componentes do DNA

DNA é um polímero, sendo os monômeros os nucleotídeos, chamado então de polinucleotídeo.

Cada nucleotídeo consiste de um açúcar de 5 carbonos(desoxiribose), uma base nitrogenada ligada ao açúcar e um

grupo fosfato.

Quatro nucleotídeos, que diferem somente na basenitrogenada.

A = adeninaG = guanina C = citosinaT = timina

Definições

A combinação de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleosídeo.

A combinação de um fosfato, de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleotídeo.

http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF

Adenina e Guanina são Purinas. As Purinas são as maiores bases.

9 átomos cada

http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF

Timina e Citosina são chamadas Pirimidinas.

6 átomos cada

A Hidroxila do carbono-3 da pentose do primeiro nucleotídeo se liga ao grupo fosfato ligado à hidroxila do carbono-5 da pentose do segundo nucleotídeo através de uma ligação fosfodiéster (ligação covalente)

http://www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/genetica/dna/Image27.gif

Com base na estrutura de dupla hélice do DNA e nas características de hidrofobicidade das moléculas, a estrutura do DNA fica da seguinte forma:

O grupo fosfato e o açúcar (parte hidrofílica) – estão localizados na parte externa da molécula. As bases nitrogenadas (parte hidrofóbica) – estão localizadas na parte interna da molécula.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/c/c8/FirstSketchOfDNADoubleHelix.jpg

Primeiro rascunho do Francis Crick da estrutura do DNA

Pontos importantes

•Por convenção, um polinucleotídeo é lido da extremidade 5´para a 3´.

•As orientações das duas fitas é antipararela: suas direções 5' - 3' são opostas.

•As duas fitas são mantidas unidas pela energia de muitas pontes de hidrogênio (A=T e G=C) e interações hidrofóbicas.

Ácidos Nucleicos

Extração e Quantificação

DNA Eletroforese

Extração Purificação Separação

Extração

O DNA pode ser extraído de diferentes materiais, desde fósseis e amostras herbarizadas a tecidos frescos:

raízes, folhas, sementes, embriões, endosperma, pólen, cultura de calos ou de células em suspensão

O objetivo de qualquer protocolo de extração consiste em obter DNA de alta qualidade, em quantidade, de forma rápida e eficiente.

Os protocolos de extração devem evitar a degradação do DNA pelas DNAses.

Eliminar os polissacarídeos que inibem a ação de enzimas Eliminar as substâncias fenólicas ou outros compostos

secundários que podem danificar o DNA.

Isolamento e purificaçao

Para o isolamento e purificação de ácidos nucléicos, é necessário separá-los efetivamente dos outros constituintes celulares.

No caso especial dos ácidos nucléicos, também é fundamental manter a integridade das moléculas, que devem permanecer inalteradas durante o procedimento de extração, pois as informações contidas tanto no DNA quanto no RNA dependem da sua sequência.

Existem vários métodos descritos na literatura, e a escolha depende do balanço entre a praticidade, qualidade requerida a finalidade de uso do ácido nucléico

DNA na minha comida???

DNA na minha comida???

CURIOSIDADE:

Cada célula contém cerca de 3 metros de DNA.

Refeição = 55.000.000 células ou Cerca de 150.000 km de DNA.

O processo de extração de DNA vegetal consta inicialmente, do rompimento da parede celular e membranas celulares, liberando a molécula de DNA.

O rompimento da parede celular e membranas celulares de grande quantidade de material pode ser feito por maceração após o congelamento do tecido em nitrogênio líquido ou diretamente no tampão de extração em tubo de microcentrífuga, quando a quantidade de tecido é pequena.

Todavia, junto à molécula de DNA, moléculas de proteínas, polissacarídeos, RNA e outras são extraídas.

Para que o DNA possa ser considerado de boa qualidade, essas moléculas devem ser eliminadas, utilizando tampões de extração, que são compostos por elementos que as eliminam da amostra de DNA.

Processo de extração

Ruptura dos tecidos

Detergentes

CTAB, Sarcosil e SDS são utilizados para auxiliar na liberação de componentes celulares por lise das membranas celulares.

Juntamente com NaCl, esses detergentes ajudam na precipitação do DNA ao final do processo e reduzem a contaminação da amostra com polissacarídeos.

Rompimento da membrana

Ação das DNAsesAção das DNAses

Para manter o pH em um valor que impeça a ação das nucleases que degradem o DNA, utiliza-se um tampão específico (geralmente Tris-Cl), para manter o pH em torno de 8,0.

A adição de EDTA inibe a ação das DNAses, pois esse composto é um quelante de cátions bivalentes, como o Mg+2 e o Ca+2, que são cofatores das enzimas.

A desnaturação de proteínas e eliminação de polifenóis oxidantes da molécula de DNA é feita pela adição de 2-mercaptoetanol e polivinilpirrolidona (PVP) ou polivinilpolipirrolidona (PVPP),pois possuem efeito antioxidante, assim como a eliminação dos polissacarídeos pela adição de PVP, PVPP ou soroalbumina bovina (BSA) e o RNA é eliminado pela adição de RNAse.

Recuperação dos ácidos nucléicosRecuperação dos ácidos nucléicos

A adição de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (CIA) promove a extração de lipídios, proteínas e polissacarídeos, que são dissolvidos nesse solvente orgânico (inferior), enquanto o DNA permanece na fase aquosa (superior), fases estas separadas após centrifugação.

Essas duas fases são então separadas por centrifugação e o sobrenadante contendo o DNA é retirado do tubo.

Alguns protocolos incorporam ainda fenol ou proteases (proteinase K) para facilitar a separação do DNA das proteínas da cromatina.

Recuperação dos ácidos nucleicos totais por precipitação em álcool (isopropanol e/ou etanol) desidratam a molécula de DNA e na presença de NaCl permitem sua precipitação ao final do processo, formando um sedimento visível na fase líquida do tubo.

Precipitação do DNA

A eliminação do RNA ë obtida por digestão com RNAse, ou separação de RNA e DNA por solubilidade diferencial em sais. Sob condições de alta concentração de sais (ex.: 7,5 M de Acetato de sódio), DNA e os RNA pequenos permanecem em solução, enquanto que o RNA (> que 60 bases) precipita.

Os ácidos nucléicos são poliânicos solúveis em água. Os sais de sódio e potássio de ácidos nucleicos são

insolúveis na maioria dos solventes orgânicos, incluindo numa mistura de etanol e água, mas eles não são desnaturados por solventes orgânicos.

O detergente catiônico CTAB solubiliza membranas celulares, e dependendo da concentração de NaCl no tampão, CTAB forma um complexo com o DNA, e é utilizado para precipitar DNA seletivamente.

Análise do DNA Para a análise de DNA, com a utilização da digestão por enzimas de

restrição (ex. RFLP, AFLP), existe a necessidade obter-se DNA de boa qualidade.

Contaminantes (polifenóis, polissacarídeos, etc.) interferem na atividade dessas enzimas, reduzindo a eficiência das mesmas.

A contaminação por polissacarídeos consiste na principal contaminação afetando a pureza do DNA extraído de plantas.

Esses carbohidratos podem inibir a atividade de várias enzimas usadas em manipulações biológicas de DNA, tais como ligases, polimerases e enzimas de restrição.

A maioria dos métodos de extração empregados não separam eficientemente o DNA dos polissacarídeos provavelmente devido a similaridade estrutural entre esses dois tipos de polímeros.

A contaminação de polissacarídeos depende da espécie, tecido, condições fisiológicas da planta. Certas espécies “produzem” um DNA muito contaminado por polissacarídeo, tomando difícil a ressuspensão do pellet. (DNA precipitado).

Quantificação de DNA

20 50 100

Quantificação DNA (gel agarose 0,8%)

Protocolos

A maior parte dos protocolos de extração disponíveis

derivam basicamente do método descrito por Dellaporta

et al. (1983) e aqueles que utilizam CTAB (brometo de

hexadeciltetrametilamônio) (Doyle e Doyle, 1987, 1990)

onde o DNA é solúvel sob altas concentrações de sal.

Para maiores detalhes consultar Brasileiro e Carneiro

(1998).

PROTOCOLO CTAB (DOYLE E DOYLE, PROTOCOLO CTAB (DOYLE E DOYLE, 1987)1987)

Este protocolo mais utilizado em espécies vegetais, pois possibilita a extração de DNA a partir de pequenas amostras de tecido, não exige preparação prévia do tecido e é adaptável a vários tipos de materiais.

O CTAB é um detergente catiônico (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) que solubiliza as membranas celulares, formando um complexo com o DNA, que facilita uma posterior precipitação diferencial desse complexo

Pode-se extrair o DNA, preparando-se uma solução de banana tratada com sal, água destilada, e shampoo (detergente) .

O detergente quebra a membrana celular, dissolvendo os lipídeos (moléculas de gordura) e proteínas da célula, além de quebrar as ligações que mantêm a membrana celular intacta.

Introdução

O detergente forma então um complexo com os lípídeos e proteínas, permitindo que sejam filtrados para fora da solução com um filtro de café.

O DNA das células ficam no filtrado.

O sal permite que o DNA precipite com a adição de álcool (íons Mg e Cl).

Introdução

Em um liquidificador, misturar uma banana com um copo de água destilada (250ml).

Extração de DNA

Bater por for 15-20 segundos, até a solução virar uma mistura.

Extração de DNA

Num copinho de café, fazer uma solução contendo 1 colher de chá de shampoo ou detergente e 2 pitadas de sal de cozinha.

Extração de DNA

Adicionar 20 ml (4 colheres de chá) de água destilada.

Dissolver o sal e o shampoo/ detergente mexendo devagar para evitar fazer espuma.

Extração de DNA

À solução do passo 2, adicionar 3 colheres cheias da solução de banana do passo 1.

Misturar a solução com a colher por 5-10 minutos.

Extração de DNA

Enquanto uma pessoa mistura a solução de banana, outra coloca um pedaço (cone) de filtro de café dentro do outro copo de plástico. Dobre as abas do filtro para fora para que não encoste no fundo do copo.

Extração de DNA

Filtre a mistura no filtro e deixe a solução drenar por vários minutos até ter cerca de 5 ml (cobrindo o fundo do copo) do filtrado para testar.

Extração de DNA

Pegar um tudo com álcool gelado. Para melhores resultados, o álcool deve estar o mais gelado possível.

Extração de DNA

Encher a pipeta de plástico com a solução de banana.

Extração de DNA

Adicionar a solução ao álcool.

Deixe descansar por 2 a 3 minutos sem mexer o tubo. É muito importante não agitar o tubo.

Extração de DNA

Você pode assistir o precitado branco de DNA na camada de álcool. O DNA tem uma aparência de um muco esbranquiçado e como se fosse uma nuvem.

Extração de DNA

Fenol é usado para desnaturar e remover proteínas de soluções que contêm ácidos nucléicos. 1. Homogeneização do material (nitrogênio líquido

ou banho de gelo seco e etanol), com tampão.2. Adicionar o mesmo volume de fenol à amostra,

colocar no vortex ou agitar.3. Centrifugar para separar 2 fases (de fenol

embaixo e aquosa acima). Transferir fase aquosa para novo tubo.

Repetir 2 e 3.

Extração com Fenol

Pontos Importantes

O fenol é usado para remover proteínas e outros contaminantes da solução aquosa do DNA.

• O clorofórmio ajuda desnaturar proteínas e a remover o fenol residual.

• O álcool isoamílico é geralmente adicionado ao clorofórmio para reduzir espuma.

Material + Tampão de Lise: Tris, EDTA, SDS, NaCl e proteinase K.

• Digestão a 37 ºC (células, 2-3 hs) ou 55 ºC (tecido, overnight) sob agitação.

• Precipitação com isopropanol

• Resgatar o precipitado (nuvem) e ressupender em água ou TE.

Extração simples

Extração de DNA plasmidial

•Plasmídeos: pedaços de DNA extracromossômicos, covalentemente fechados;

•Codificam genes de resistência à antibióticos ou metais pesados, produçãode pigmentos, de virulência, etc.Também possuem genes para sua própria replicação

• 1-20 kb x ~ 5000 kb em E. coli, sendo fácil a separação dos DNAs


•Depois de crescer o plasmídeo recombinante em bactéria, temos que nos livrar dos outros componentes das células bacterianas (membranas, parede celular, ribossomos, RNA e DNA cromossomal

• Então adicionamos uma solução com NaOH (que aumenta o pH e desnatura o DNA cromossomal e não o do plasmídeo) e SDS (que vai solubilizar as membranas e causar a lise das células).

•Centrifugar cultura e ressuspender pellet em tampão Tris EDTA (que liga divalentemente a cátions Ca e Mg e com isto ajuda a desestabilizar a membrana de E. coli).

5 min – 6000 rpm


•Decrescemos o pH com acetato de potássio (o DNA cromossomal não poderá a voltar a sua estrutura original e sairá de solução)

• Purificar o DNA com extração com fenol e clorofórmio, seguido de precipitação com etanol ou com uma membrana de sílica gel (o DNA vai se ligar à membrana sob altas concentrações de sais e se “desligar” com a redução da concentração de sais, ao contrário das proteínas e sais que passarão direto. Após lavagem com etanol para lavar os sais o DNA pode ser eluído

• Ao centrifugarmos, o DNA cromossomal precipitará e o plasmidial ficará em solução junto com proteínas e sais.

•O DNA pode se livrar do RNA pelo tratamento com RNAse A

Extração de RNA

Solução Desnaturante:

Tiocianato de Guanidina 4M

Citrato de Sódio 25 mM

0.5% Sarcosil

Beta-Mercaptoetanol 0.1 M

• Envolve lise das células, desnaturação das proteínas da membrana celular e depois os passos normais como em DNA

• Envolve desnaturante forte para quebrar células, solubilizar seus componentes e desnaturar RNAses endógenas simultaneamente.

Extração de RNA em tecido foliar liofilizado

A extração de RNA realizada em tecido foliar liofilizado

Utiliza-se 300 mg de tecido liofilizado. O tampão de extração: 100 mM Tris HCl pH 7,5; 10 mM EDTA pH 8,0; 1 M NaCl; 0,1% SDS ; 1% β Mercaptoetanol (colocado na hora de uso) e 1

mM ATA (solúvel em etanol). Completado o volume com água ultra-pura DEPC.

Quantificaçao do RNA

Espectrofotômetro em leitura de 260-280nm.

Corrida em gel de agarose 1,5% com 1µL brometo de etídeo (10 mg/mL)

Eletroforese em 200 Volts por ± 15 minutos.

O RNA está INTACTO???

Gel de agarose desnaturante: paradesfazer a estrutura secundária do RNA

Revelação da extração de RNA

G0 Gp F0 F p

DNA

RNA 28S

RNA 18S

RNA mensageiro(nuvens)

Gel de agarose 1,5% com 1 µL brometo de etídeo (10 mg/mL)

G0 - Gala sem inóculo; Gp - Gala com inóculo (pool de períodos);

F0 - Fuji sem inóculo; Fp - Fuji com inóculo (pool de períodos)

RNA 5.8S

mRNA

Extração de RNAm

Eucariotos: usa-se colunas de celulose e oligo dT ou magnetic beads e oligo dT (uma cadeia sintética de 20-30 timinas)

• Usada para RNAm raros, para fazer sondas ou para bibliotecas de cDNA.

• 1,5 a 5% do RNA celular

G0 Gp F0 F p

DNA

RNA 28S

RNA 18S

RNA mensageiro(nuvens)

Gel de agarose 1,5% com 1 µL brometo de etídeo (10 mg/mL)

G0 - Gala sem inóculo; Gp - Gala com inóculo (pool de períodos);

F0 - Fuji sem inóculo; Fp - Fuji com inóculo (pool de períodos)

RNA 5.8S

mRNA

Quantificação

Mais usada com EspectrofotômetroA260 dá estimativa da concentração

Leitura da absorbância a 260 e 280 nm• OD260 = 1.0, dsDNA = 50 µg/mL;

RNA = 40 µg/mL• Desvantagens: interferência com material para

extração, inabilidade de diferenciar entre DNA e RNA, sensibilidade: 50-250 ng DNA/ mL

• RNA e pH (>7,5): pH ácido afeta a absorção com A260, ajustar com Na2HPO4 (conc. final de1mM)

Tabela 2. Diluições com água DEPC para 2 µg / µL de mRNA para as reações de cDNA

0,5442,163,12Gala pool (inoc)

0,5484,326,2Gala zero

0,5418,710.0814Fuji pool (inoc)

0,54126,489Fuji zero

[ ] (µg/ 1 µL)

Diluições (µL)mRNA (µg/µL)RNA total (µg /µL)

Amostras

0,5442,163,12Gala pool (inoc)

0,5484,326,2Gala zero

0,5418,710.0814Fuji pool (inoc)

0,54126,489Fuji zero

[ ] (µg/ 1 µL)

Diluições (µL)mRNA (µg/µL)RNA total (µg /µL)

Amostras

Tabela 3. Quantificação do RNA total

3,121,690,230,39Gala pool (inoc)

6,21,730,450,78Gala zero

141,820,961,75Fuji pool (inoc)

91.760,641,13Fuji zero

µg / µL260/280280 nm260 nmAmostras

3,121,690,230,39Gala pool (inoc)

6,21,730,450,78Gala zero

141,820,961,75Fuji pool (inoc)

91.760,641,13Fuji zero

µg / µL260/280280 nm260 nmAmostras

Tabela 4. Análise de pureza do RNA (livre de polissacarídeos)

Sem resíduo2,00,340,68Gala pool (inoc)

Sem resíduo2,00,511,03Gala zero

Sem resíduo1,940,190,37Fuji pool (inoc)

Sem resíduo2,00,330,66Fuji zero

Resultado260/280280 nm260 nmAmostras

Sem resíduo2,00,340,68Gala pool (inoc)

Sem resíduo2,00,511,03Gala zero

Sem resíduo1,940,190,37Fuji pool (inoc)

Sem resíduo2,00,330,66Fuji zero

Resultado260/280280 nm260 nmAmostras

Tabela x. Calculo do RNA total no tubo e do mRNA

2,16 µg / µL0,12124,840 x 3,12Gala pool (inoc)

4,32 µg / µL0,2424840 x 6,2Gala zero

10,08 µg / µL0,5656040 x 14Fuji pool (inoc)

6,48 µg / µL0,3636040 x 9Fuji zero

mRNA (1,8%)mgµg / 40 µL40 x µg / µLAmostras

2,16 µg / µL0,12124,840 x 3,12Gala pool (inoc)

4,32 µg / µL0,2424840 x 6,2Gala zero

10,08 µg / µL0,5656040 x 14Fuji pool (inoc)

6,48 µg / µL0,3636040 x 9Fuji zero

mRNA (1,8%)mgµg / 40 µL40 x µg / µLAmostras

Cálculos

DNA [ ] (µg/µL) = OD260 x F. D. x 50 (µg/mL)

1000

F.D. = fator de diluição

Ex.: 3µl de DNA + 97µl H20; OD260 =0,0157

DNA [ ]= 0,0157 x 33,33 x 50 / 1000 = 26,16 ng/ µl

Pureza

DNA: Razão A260/A280 >= 1,75 - 1,80

< 1,75 contaminação com lipídeos ou proteínas

RNA: Razão A260/A280 ~ 2,0

< 2,0 contaminação com guanidina (da extração)

> 2,0 contaminação com fenol ou clorofórmio

OUTROS MÉTODOS

Fluorímetro: utiliza material fluorescente que se liga ao ácido nucléico sem problemas com proteínas (picoGreen; sondas de cianina). Seletivos para dsDNA.

• Vantagem maior é a sensibilidade: 0,5 ng/ mL (100 a 1000 vezes maior que o espectrofotômetro)

OUTROS MÉTODOS

Gel de agarose: aplicando-se as amostras de DNA juntamente com padrões de concentração conhecida

100 a 300 ng de plasmídeo

http://www.neb.com/nebecomm/productfiles/778/images/N3231.gif

Por meio decorrida juntoa um marcadorde DNA

Ácidos Nucléicos

Estabilidade DNA versus RNA

• Nucleases

• Cuidados: autoclavagem de materiais e tampões; estocagem (DNA e RNA).

• TE (10 mM tris-HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA) x nucleases e DEPC x RNAses

Armazenagem de DNA e RNA

DNA: 4°C (em TE) ou - 20°C (maior tempo) RNA: manter sempre no gelo quando manipulado e a -70°C (maior tempo)

Pontos Importantes Maioria das nucleases precisam de Mg para

atividade, o EDTA ajuda na inativação delas.

• RNA é normalmente armazenado em ddH20 que foi previamente tratada com DEPC (0,1%) para inativar as RNAses.

• Muitas RNAses sobrevivem à autoclavagem então DEPC deve ser usado também para soluções.

• Importante inativar DEPC antes de usar pois pode modificar o RNA e inativar enzimas (RT e quinases)

• DEPC é altamente tóxico para humanos !!!• DEPC é incompatível com TRIS !!!

ANIMAÇÃO

http://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/extraction/

http://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/extraction/

Extração de comida

Extração dos fungos: meio BDA sólido

Repicagem dos fungos: meio BD líquido

Liofilização dos fungos:

Schäfer and Wöstemeyer (1992) e modificada por Junghans et al. (1998)

Desestruturação das membranas celulares

1.5

0.5

0.1

1.0

1.5

0.5

0.1

1.0

Ressuspensão do Pellet

1.5

0.5

0.1

1.0

Adição de Etanol

1.5

0.5

0.1

1.0

Precipitação dos ácidos nucléicos

Precipitação das proteínas e

polissacarídeos

1.5

0.5

0.1

1.0

Ruptura dos tecidosMaterial

Quantificação do DNA: gel de agarose 0,8%

Quantificação do DNA extraído:

50 100 200 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 7 8 8 9 9 10 11 11 12 12 14 14 15 15 16 16 18 18 19

ηg/μLA

Figura 3. Gel de agarose 0,8% para quantificação do DNA micelial dos isolados de Colletotrichum spp. A – DNA extraído ainda com impurezas; B – DNA extraído limpo e já diluído para a concentração desejada (≈10ηg).

20 50 100 200 5 8 9 34 38 1 2 3 4 6 7 8 10 11 12 13 15 16 17 18 19 24 26 27 29 30 31 32 37 C1 C2 G9

ηg/μLB

Amplificação do rDNA:

Figura 4. A e B – Produto do PCR resultante da utilização dos iniciadores ITS1 e ITS4, em gel de agarose 2% (M – ladder 100 pb e CN – controle negativo).

A

B M 37 38 39 40 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10C1 C2 C3 ― CN

100 pb

200 pb

300 pb400 pb500 pb600 pb

100 pb

200 pb

300 pb

400 pb500 pb600 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

Quantificaçao em gel de agarose

Amostras padrão (20; 50; 100; 200 ng / µ L)

Amostras de DNA

Aplicar DNA - 2 µ L

Aplicar TC - 3 µ L

MÉTODO MÉTODO MINIGEL MINIGEL

Carregamento em gel de agarose 0,8%

COMPARAR A INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA DA AMOSTRA PADRÃO E ESTIMAR A QUANTIDADE DE DNA DA AMOSTRA

Amostras padrão

(50; 100; 200 ng/µL)

Amostras de DNA

bandas

50 100 200 1 2 3 4 5

Estimativa ( ng/µL)

Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3

Amostra 4

Amostra 5

300

50

50 - 100

mais de 300

200

Process Common procedure

Cell lysis

Protein removal

DNA precipitation

•SDS, sarcosyl•CTAB

•Proteinase K•Lysozyme

•Freezing•Sonication•Grinding

Chemical

Enzymatic

Mechanic

Alcohol •Ethanol•Iso-propanol

•Phenol•chloroform

•Sodium chloride•Sodium acetate

•Membrane•Beads

Organic solvents

Salt

DNA binding

Process Common procedure

Cell lysis

Protein removal

DNA precipitation




Chemical

Enzymatic

Mechanic




•Membrane•Beads

Organic solvents

Salt

DNA binding

Cell lysis

Protein removal

DNA precipitation

Cell lysis

Protein removal

DNA precipitation




Chemical

Enzymatic

Mechanic




Chemical

Enzymatic

Mechanic





•Membrane•Beads

Organic solvents

Salt

DNA binding



•Membrane•Beads

Organic solvents

Salt

DNA binding



•Membrane•Beads

Organic solvents

Salt

DNA binding

Education

Extração de nucleotideos