Exigências nutricionais e meio de cultura em microorganismos

Prof. Dra. Adriana DantasUERGS, Bento Gonçalves, RS

Fisiologia microbianaFisiologia microbiana

Nutrição e crescimentoNutrição e crescimento

Nutrição microbianaComponentes necessários às célulasMeios de culturaCondições ambientais

Crescimento populacionalVelocidade de crescimentoTempo de geraçãoMedidas do crescimento

Proliferação de MicrorganismosProliferação de Microrganismos As bactérias são microrganismos unicelulares

com uma estrutura muito simples, o que lhes permite replicarem-se muito rapidamente caso encontrem nutrientes, temperatura, pH, humidade e concentração de oxigénio favoráveis.

Alguns casos, apenas 20 minutos são suficientes para que o número de bactérias duplique, o que significa que um número inicial de 10 bactérias num determinado local em condições favoráveis, se multiplicará de tal modo que se terão aproximadamente 16000000 bactérias ao fim de 8 horas.

Proliferação exponencialProliferação exponencial Esta proliferação

exponencial aliada à sua resistência faz com que as bactérias se espalhem muito rapidamente, estando presentes em todos os locais, não só à nosso volta, no meio ambiente, como também no nosso próprio corpo: nas nossas mãos, nariz, boca, tracto gastrointestinal, etc.

Artificial x NaturalArtificial x Natural

Meios de culturaMeios de cultura

Até cerca de 1880, os microrganismos eram cultivados em meios líquidos

Robert Koch e a sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras), separando-as de espécies contaminantes.

Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural.

Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural.

Condições favoráveis de crescimento Tendo em vista a ampla diversidade

metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais.

Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, pressão osmótica, humidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, micro aeróbia ou anaeróbia), entre outras...

Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, pressão osmótica, humidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, micro aeróbia ou anaeróbia), entre outras...

Consistência dos meios Sólidos, quando contêm agentes solidificantes,

principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %); Semi-sólidos, quando a quantidade de ágar ou

gelatina é de 0,075 a 0,5 %, obtendo assim uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade;

Líquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para activação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, entre outros.

Procedência dos constituintes Procedência dos constituintes Podem ser naturais ou complexos:

Ingredientes com composição química não definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.), de animais (carne, cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura);

Artificiais, sintéticos ou ainda quimicamente definidos: Composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e

os seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, azoto, vitaminas, energia, sais minerais, entre outros, quando são conhecidas as necessidades nutricionais específicas.

Meios de cultura básicos São os que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo

nenhuma exigência em especial;

Meios de cultura complexos: Cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos,

como meio de infusão de cérebro e coração, ágar sumo de tomate, ágar sangue, etc.

Funções dos meios de cultura

Meios de pré-enriquecimento: Permitem a dessensibilização de microrganismos injuriados, i.e., para

amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água peptonada.

Meios de enriquecimento: Proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos

presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros.

Meios Diferenciais: Contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entre

microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), Ágar MacConkey para a diferenciação de enterobactérias, Ágar sangue, agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).

Seletivos são os que contém substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. A maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colónias (sólidos) dos microrganismos.

Meios de triagem são os meios que avaliam determinadas actividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos.

Identificação, prestam-se para a realização de provas bioquímicas e  verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos a identificação.

Dosagem, são empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos

Contagem, são empregados para a determinação quantitativa da população microbiana.Estocagem ou manutenção são utilizados para conservação de microrganismos no laboratório, i.e., garantem a viabilidade de microrganismos.

Funções dos meios de cultura

Meios de proliferação naturais

No nosso dia-a-dia convivemos com bactérias, dormimos com bactérias, comemos bactérias, e não conseguimos viver sem elas.

Elas estão por todo o lado e reproduzem-se em todo o lado, apenas querem um local com condições propícias.

Por isso, há que ter muito cuidado nas nossas casas, pois apresentam-se como os melhores locais para a proliferação das bactérias, tendo em conta que nelas podem encontrar alimento, calor, humidade.

Nutrição de microrganismos

Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados. Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas,

enquanto outros são tão exigentes quanto o homem.

Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e

bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório:

- Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais.

- Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas.

Ex: Mycobacterium leprae (causador da hanseníase)

precisa de hospedeiro para ser cultivado.

Meios de cultura adequadosMeios de cultura adequados

Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados

meios de cultura que simulam e até melhoram as

condições naturais.

Os elementos químicos principais para o crescimento

das células são denominados macronutrientes (C, N,

H, O, S, P).

O carbono é um dos elementos mais importantes

para o crescimento microbiano.

Com exceção para CO2, os compostos orgânicos são

os que contém carbono

Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade.

- Tem papel importante na estrutura e metabolismo.

Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas.

- Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas

Matéria seca

Água

C

N

H

P, S, K, Na ...

célula

Fonte de carbono:

- Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): carboidratos

lipídeos proteínas

- Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos):

É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz

ou compostos inorgânicos.

Fonte de Nitrogênio:

- É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.

(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)

moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos)

moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2)

A capacidade de algumas bactérias em utilizar o nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental importância para a vida

de todos os seres.

Componentes necessários a célulaComponentes necessários a célula

Hidrogênio:

- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos. (água, sais e gases)

Função:

Manutenção do pHFormação de ligações de H entre moléculas Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração

• Oxigênio:

- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos)

- É obtido a partir das proteínas e gorduras.

Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de

geração de energia.

P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP

S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas

K – Atividade de enzimas

Mg – Estabilidade dos ribossomos

Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos

Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos.

Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal.

Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das

proteínas envolvidas no transporte de elétrons.

Outros macronutrientes:

Metais em quantidades muito pequenas (traços) necessários na composição de

um meio de cultura:

Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B

► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)

- Nem sempre sua adição é necessária

- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra

pura podem apresentar deficiências desses elementos.

Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte

o N2 para NH3 durante a FBN.

Outros componentes

Água:

- Componente absolutamente indispensável

(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)

No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.

Aditivos:

Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH:

Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos

EDTA, ácido cítrico, polifosfatos.

Inibidores

Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger

Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico

Água e aditivos

Outros aditivos Tampões

- Carbonato de cálcio

- Fosfatos- Proteínas (peptona)

Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.

Ex: celulose induz a celulasepectina induz a pectinaseamido induz a amilase

Antiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma Remoção de células, perda do produto, contaminação Redução do volume do meio

álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas

ClassesQuimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)

Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, leite, solo e rúmem de bovino)

Não existe um meio de cultura universal, mas

Existem vários tipos meios para diversas finalidades

Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporção adequada.

Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.

Meios de cultura

Meios de cultura

Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as necessidades nutricionais

Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais. 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.

Meio de cultura

solidificado com

1,5 % de ágar.

Até 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos.Robert Koch introduziu os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras).

Meios de cultura

Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades.

Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies

Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex.

Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey

Microplacas com diferentes meios de cultura para identificação de enterobactérias.

Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado no meio de cultura.As bactérias podem ser autotróficas ou heterotróficas.

Meio definido para quimioautotróficas

Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas

Meios de cultura para fungos

• Todos os fungos são heterotróficos

Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja.

Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactérias.

Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.

Elemento Bactéria Fungo

Carbono 52 51

hidrogênio 7 7

Nitrogênio 13 8,5

Fósforo 2,5 0,4-4,5

Enxofre 0,6 0,1-0,5

Potássio 2,5 0,2-2,5

Sódio 0,75 0,02-0,5

Cálcio 0,55 0,1-1,4

Magnésio 0,25 0,1-0,5

Cloro 0,5 -

Ferro 0,1 0,15

Relação C:N média 4:1 6:1

Relação C:N:P:S 85:23:4:1

Composição elementar média (% do peso seco)

Passo 1: utilizar dados da composição elementar

Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de Nou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N)

Obs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles.

Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos)

Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C)

Fração para energia e manutenção (45%): YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose

Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1

e assim por diante.

Passo 2: otimização

Passo 1: utilizar dados da composição elementar

Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de Nou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N)

Obs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles.

Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos)

Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C)

Fração para energia e manutenção (45%): YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose

Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1

e assim por diante.

Passo 2: otimização

Como determinar a composição inicial?

Temperatura Oxigênio pH Pressão osmótica,

atmosférica, hidrostática Radiação eletromagnética

Condições ambientais (fatores abióticos)

Temperatura Grupos

1. Psicrófilos – temperatura ótima

abaixo de 15 oC, suscetíveis de

crescer a 0 oC.

2. Mesófilos – temperatura ótima 20o -

40 oC, maioria dos patógenos

humanos.

3. Termófilos – temperatura ótima

acima de 45 oC.

Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante

Efeito do oxigênio no crescimento microbiano

Meio gelatinoso com indicador redox:Rosa quando oxidado

Incolor quando reduzido

Durante as reações de redução do O2 são formados vários intermediários tóxicos.

Ex: H2O2, OH°, O2-

Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas

Sistema para cultivo de anaeróbios

Sistema para cultivo de aeróbios

Equipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura

pH

Ao contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento encontra-

se no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá,

Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto

em todas as condições de pH.

Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os

metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos.

Necessário a adição de um tampão ao meio.

Pressão osmótica

Não devem existir grandes diferenças na concentração de solutos dentro e fora da célula, pois podem desidratar-se ou romper-se.

Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.