MUTAÇÕES EM MICROORGANISMOSTipos, isolamento, caracterização e a natureza da variação

Como é os microorganismos evoluem?

Alterações na sequência dos genes podem ocorrer e resultar em alterações no fenótipo.

Importantes para gerar variabilidade e contribuir, assim, para o processo de evolução dos microrganismos.

Evolução requer variabilidade Requerendo a evolução variabilidade, face a uma mudança brusca

no meio ambiente, as bactérias e outros microrganismos possuem um conjunto de mecanismos geradores de alterações genéticas que conduzem a variantes, fornecendo-lhes assim a possibilidade de ultrapassar situações que ponham em risco a sua sobrevivência.

As variantes com características que melhor se adaptam à nova situação são selecionadas e sobrevivem em detrimento das menos adaptadas.

Principais mecanismos que geram variabilidade, contribuindo assim para a evolução

Variações no Genótipo: Mutações Recombinações Aquisição de novos genes Rearranjos intramoleculares (translocação e inversão)

Variações no Fenótipo (características visíveis): Indução enzimática As recombinações do DNA e as mutações são os

mecanismos que mais contribuem para a evolução.

Obtenção de mutantes

Como estudar um ser vivo geneticamente? Tipo original (tipo selvagem) x mutantes

Importante para estudo genético em microorganismos

Diferentes tipos com caracteristicas hereditárias distintas e bem definidas

Clones em microorganimso

Origem de uma única célula Divisão celulares Progressão geométrica Muitas células = colônias em meio de cultura

sólidos; Colônia visível a olho nu = clone = grupo de células

todas iguais geneticamente

Mutações em microorganismos

Mutações letais, quando expressas, resultam na morte do microrganismo.

Mutações condicionadas, são as que são expressas apenas em determinadas condições ambientais, por exemplo, mutações de letalidade condicionada na E. Coli, podem ser expressas a altas temperaturas, mas não a baixas temperaturas; esse hipotético mutante (termossensível) crescerá então normalmente a baixas temperaturas, mas a altas temperaturas poderá morrer.

U tilizam-se mutantes termossensíveis quando se quer atingir um gene que é essencial à integridade e viabilidade da célula. Ex. gene da DNA polimerase.

Mutações Bioquímicas

Mutações bioquímicas são mutações que causam uma mudança na bioquímica da célula, causando frequentemente deficiência ou mesmo inativando uma via biossintética da bactéria, ou seja, é eliminada a capacidade da bactéria sintetizar uma macromolécula essencial, como aminoácidos ou nucleótidos.

Os microrganismos que sofrem esta alteração são chamados mutantes auxotróficos, dizem-se auxotróficos para a molécula que não conseguem sintetizar.

Um outro tipo de mutantes bioquímicos são os chamados mutantes resistentes. Estes organismos sofrem mutações e adquirem resistência a agentes antimicrobianos, como antibióticos.

Tipos de mutantes

Mutantes auxotróficos Mutantes incapazes de utilizar certas fontes de carbono e nitrogenio Mutantes resistentes a agentes inibidores Mutantes morfológicos Mutantes para produção de substancias liberadas pelas celulas Mutantes para locomoção e comportamento Mutantes para patogenicidade Mutantes mais sensíveis a agentes inibidores Reversões Mutantes em vírus

Crescimento em meio definido ou mínimo – sais minerais, fonte de carbono, aminoácidos, vitaminas e outros componentes de natureza conhecida.

Crescimento em meio completo – peptona, extrato de levedura, caseína hidrolisada, extrato de carne

Microrganismos que não crescem em meio mínimo, em oposição à linhagem original, chamada de prototrófica.Se um mutante auxotrófico não for capaz de crescer em meio mínimo, mas crescer em meio completo ou mesmo em meio mínimo adicionado de um aminoácido, por exemplo, triptofanotriptofano, esse mutante é chamado de deficiente nutricional para a síntese de triptofano, triptofano – ou trp- .

Mutantes auxotróficos

Mutantes deficiente por sinteses

Convenciona-se três letras minúsculas:Lisina – lys¯

Prolina – pro ¯Biotina - bio ¯

Vários genes para mesma síntese: 1 letra maiúscula é adicionada Ex. 3 genes que afetam a síntese de triptofano: trpA, trpB e trpC

Vários mutantes do mesmo gene: designados por números:trpA1, trpA2, trpA3, etc.

Essa nomenclatura é convencionada para todos os tipos Essa nomenclatura é convencionada para todos os tipos de mutantes em microorganimosde mutantes em microorganimos

Auxotróficos parciais

“leaky” = sintetiza somente uma pequena quantidade do componente essencial, parte é ´vazada` para fora da célula.

Estratégia para a geração de clones condicionalmente gene alvo. CDNAs Ts mutante de um gene de interesse pode ser projetado com base nas informações dos mutantes ts fermento, se disponível. Seguindo o protocolo padrão para gerar ts células mutantes, cada cDNA mutação é introduzido por uma integração orientada para o locus endógenas do gene em células DT40 heterozigotos (+/-) mutante. As células resultantes devem ser homozigotos (-/-) células mutantes e expressa apenas as proteínas mutantes

Mutantes incapazes de utilizar certas fontes de carbono e nitrogênio

Bacterias e fungos capazes de utilizar varias fontes de carbono: glicose, galactose, lactose, maltose, acetato e outras.

Mutantes para fontes de C em bactérias têm a vantagem de serem distinguíveis morfologicamente em certos meios especiais com adição de corantes. adição de corantes.

Mutantes são incapazes de usar galactose (gal¯) tipo selvagem (gal+)

Mutante que não usa lactose

Mutantes lac- em E. coli apresentam coloração rosada em meio com eosina e azul em meio de metileno, enquanto os selvagens são colônias de coloração vermelho-brilhante

Tipo seilvagem : lac+

Mutantes incapazes de utilizar fontes de nitrogenio

Utilizados em fungos Incapazes de utilizar nitrato ou amonia A classificação dos mutantes, de acordo com a via de utilização do nitrato,

em nit1, nit2, nit3 e nitM, será realizada de acordo com BROOKER et al. (1991)

Hipoxantina Xantina Ácido úrico

Purina desidrogenase

Nitrato Nitrito Amônio

Co-fator Molibdênio

Nitrato redutase

nit1

Nitrito redutase

nit3

nitM

Via de utilização de nitrato no metabolismo de fungos

Obtenção e caracterização dos mutantes não utilizadores de nitrato (mutantes nit)

6 mm

Extrato de malte 3,5% + KClO3 1,5%

10 dias

Meio mínimo

Isolados com crescimento ralo, com

pouco ou nenhum micélio aéreo

Mutantes nit

Mutantes nit

Meio básico + NaNO3

Meio básico + hipoxantina

Meio básico + NaNO2

Meio básico + tartarato de amômio

Nit1

nit2

nit3

nitM

Mutantes resistentes a agentes inibidores

Em bactérias, os mutantes resistentes a antibióticos e quimioterápicos são largamente utilizados não só para estudos básicos de genética como pela sua importância aplicada.

Mutantes resistentes: Estreptomicina – strR Tetraciclina: tetR Cloranfenicol: chlR

Inibidores de crescimento de microorganismos

Em fungos, são bem conhecidos os mutantes resistentes a acertos fungicidas: Benomil: benR Cloronel: chlR Corantes como acriflavina AcrR

Os inibidores ainda incluem outros componentes : Metais pesados (mercúrio, arsênio, cobre, zinco, cálcio, etc.) Agentes biológicos (vírus) Agentes físicos (luz UV, temperaturas elevadas)

Mutantes morfológicosMutantes morfológicos

Mutações morfológicas modificam a morfologia (forma) da colônia ou da célula do microrganismo.

Aqueles que apresentam modificações: Coloração Tamanho Formato da colônia Formação de estruturas Formação de conídeos

Mutantes “minute” ou “petite

Colônias menores que a linhagem original, largamente empregados em fungos, leveduras

Eletromicrografia de Células leveduras.(A) estrutura das mitocôndrias normais.(B) mitocôndria em um mutante petite. Em mutantes petite, todos os produtos de genes mitocondriais codificadas estão faltando, a organela construida inteiramente a partir de proteínas do núcleo-codificado.

(A) Teste da gota para testar o efeito do tratamento TPT sobre o crescimento do fermento. O indicador foram expressas sob controle do promotor GAL1 e as células foram cultivadas em placas com ou sem 20 mg / ml TPT. Note-se que petite induzida em galactose pela expressão de mt125Top1-103 sob o controle do GAL1p cresceu mais lentamente do que petite induzida em galactose pela expressão de mt125Top1-103 sob o controle do MET25p.

(B) Localização intracelular da CPT e TPT. Usando as configurações para a detecção de DAPI, a TPT intracelular e localização CPT foi determinada pela sua auto-fluorescência. pRWE129 foi expressa para GFP-local do núcleo. CPT é principalmente enriquecido em vacúolos, enquanto TPT a coloração de fluorescência (seta branca). Barra branca representa 5 mM. de la Loza M C D , Wellinger R E Nucl. Acids Res.

2009;37:e26-e26

© 2009 The Author(s)©

Topotecano (TPT) é capaz de induzir petite e se acumula na mitocôndria.

Mutantes com colônias com bordos enrrugadosMutantes com colônias com bordos enrrugados

Experimento sobre a transformação pneumocócica: (a) ratos são resistentes ao tipo de bactéria Streptococcus pneumoniae R, (b) são mortos por injeção com virulência de bactérias do tipo S; (c) com injeção de calor bactérias virulentas mortas não matam ratos, mas (d) Tipe S bactérias são misturados com bactérias não-virulenta Tipo R, eles têm a capacidade de transformar não-virulenta Tipo R em virulenta Tipo S .

Mutantes com baixo crescimento de hifas e Mutantes com baixo crescimento de hifas e não formação de conídiosnão formação de conídios

Fenótipo de um Neurospora crassa rho-4 mutante. (A) Hifas de N. crassa do tipo selvagem e conídios após 5 dias de crescimento em placas. (B) Um mutante rho-4 na forma de micélio fino com manchas de vazamento de citoplasma (setas pretas) e sem conídios. (C) Hifas N. crassa do tipo selvagem corados com calcofluor (1 mg / ml), mostram coloração brilhante nas paredes e septos celulares. Uma seta aponta para um conídio. (D) rho-4 mutante hifas coradas com calcofluor (1 mg / ml) da parede celular mostram coloração, mas não septadas e sem coloração. rho-4 mutantes sofrem fusão celular. Área marcada de evento recente fusão celular. Coloração de calcofluor não apresenta um septo, mas a parede celular das hifas intervir de fusão, que é degradada após a conclusão da fusão de hifas. Bar, 10 mM.

Neurospora crassa

Fenótipos úteis em Genética BacterianaFenótipos úteis em Genética Bacteriana

Sabe-se que, mudanças na estrutura das proteínas podem levar a mudanças nas suas funções que, por sua vez, podem alterar o fenótipo de um organismo (as suas propriedades visíveis).

Aspecto das colônias.Esta figura evidencia como o aspecto das colônias da mesma bactéria é diferente consoante se trate de um WT (wild type) – organismo não mutante – ou de umorganismo mutante.Wild type (WT) é a forma prevalente de um gene e o seu fenótipo associado

Serratia marcescensSerratia marcescens

Fotografia de estirpes do tipo selvagem de Serratia marcescens ATCC 274, Serratia sp. ATCC 39006 e Serratia sp diferente. ATCC 39006 mutantes biossintéticos cultivados em meio peptona glicerol. As cepas são indicados (a partir do topo, em sentido horário), Serratia 39006 mutante biossintético, Serratia 39006 tipo selvagem, três Serratia 39006 mutantes biossintéticas e S. marcescens ATCC 274 do tipo selvagem. As bordas pigmentadas dos três mutantes biossintéticos na metade inferior do resultado da placa de ágar a partir de onde ocorre a alimentação cruzada de intermediários.

WT

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus

Formação de biofilmes por estirpes de

S. aureus em poliestireno:

(C) Em pocinhos de vidro

(D) Biofilme bacteriano formado durante o cultivo de noite em placas de poliestireno foram coradas com safranina.

(E) Poços: 1) S. aureus ATCC 35556 do tipo selvagem, 2) icaADBC mutante; 3) dltA mutante; 4) dltA mutante complementada com pRBdlt1 plasmídeo, 5) S. TM300 carnosus.

Aspergillus nidulansAspergillus nidulans

Fungo com conídios de coloração verde, os mutantes amarelos, brancos

Aspergillus nidulans oferece um excelente sistema experimental.

É fácil de cultivar em laboratório, gera mutantes haplóides e podem ser facilmente isoladas e tem um bom sistema genético.

Uma variedade de ferramentas moleculares, incluindo um sistema de transformação nos permitem manipular sequências in vitro e então re-introduzir o DNA no organismo.

A seqüência do genoma de Aspergillus nidulans já está disponível.

Mutantes para produção de substâncias liberadas pelas células.

Bacillus, Streptomyces, brevibacterium e fungos do genero Penicilliume Aspergillus: liberam antibióticos, ácidos orgânicos, enzimas , aminoácidos, vitaminase outras usbtanciuas

Mutantes incapazes de liberar ou que liberam em excesso certos componentes (ácidos orgânicos, enzimas, amino-ácidos, vitaminas).

São de grande importância par estudos genéticos e para a indústria.

Ex. Penicillium – produção de penicilina

Mutantes para locomoção e comportamentoMutantes para locomoção e comportamento

Ausência de flagelos:

Mutantes mot¯: perdem a capacidade de locomoção

Mutantes che¯: têm comportamento alterado em comparação com o tipo original em relação à quimiotaxia

Mutantes para patogenicidade

Isolamento de microorganismos não patogênicos obtidos de formas patogênicas

Mutantes de Meganasporte grisea I-22 cultivados em meio completo

Reversões

Mutação reversa pode ocasionar a volta das características originais.

Pode ser verdadeira ou ocasionada por supressão dentro do gene mutado (intragênica) ou por outro gene que não o mutado (intergênica)

Reversão de auxotrofia para prototrofia é usada para detecção de substâncias mutagênicas, pratico para estimar o numero dessas reversões.

Utiliza-se o meio mínimo que não possibilita o surgimento de mutante original, mas permite o aparecimento e contagem de colônias reversas.

Detecção, Seleção e Isolamento de mutantes

Gerar e isolar microrganismos mutantes revela-se muito importante, pois o seu uso e estudo no laboratório e na indústria é de grande interesse.

As bactérias são excelentes modelos para estudar os mecanismos moleculares subjacentes ao aparecimento de mutações, devido ao fato de serem organismos haplóides, isto é, possuem uma única cópia de cada um dos genes que formam o seu genoma.

Assim, qualquer mutação adquirida é imediatamente expressa na geração descendente conduzindo diretamente a uma alteração fenotípica, ou seja, uma mudança de uma característica observável numa espécie, como já foi referido.

Como estudar os microrganismos?

Primeiro têm de ser detectados isolados eficientemente dos organismos wild type e de outros mutantes sem interesse.

Passa-se agora à descrição de algumas técnicas usadas na sua detecção, seleção e isolamento.

Como o código genético é degenerado, há mutações que não modificam as propriedades de uma estirpe bacteriana.

A detecção de mutantes numa população Mutantes auxotróficos

Fenótipo condicionado à presença ou ausência da macromolécula não sintetizada

Mutantes resistentes a agentes antimicrobianos

Caracterizar mutantes

Quando se pretende obter mutantes de um determinado microrganismo, é necessário a partida, ou seja, as suas características normais – as características do wild type – para assim se reconhecer o fenótipo alterado.

Os mutantes podem ser detectados muitas vezes de uma forma direta – através da observação visual da cor da colônia, ou de uma forma mais complexa, como é o caso da técnica utilizada para detectar e isolar mutantes auxotróficos.

A técnica deve permite a distinção entre mutantes e linhagem wild type, tendo por base a sua capacidade de crescimento na ausência de um produto final biossintético particular.

Os mutantes lisina auxotróficos, como não têm a capacidade de sintetizar o aminoácido lisina, não vão crescer num meio mínimo sem lisina (meio sem quantidades adequadas de lisina) mas vão crescer num meio mínimo com este aminoácido.

Técnicas para isolamento e caracterização demutantes

Como se procede então para isolar os mutantes lisina auxotróficos?

Geram-se os mutantes tratando a cultura com um agente mutagênico; Semeia-se a cultura contendo mutantes auxotróficos e Wild Type numa

placa de Petri com meio completo e deixa-se incubar; Depois das colônias se desenvolverem, coloca-se um veludo estéril na

superfície da placa de Petri e transferem-se as bactérias para duas placas de petri diferentes.

As bactérias são semeadas para as duas placas na mesma posição que se encontravam na primeira placa;

Após incubação, verifica-se que há colônias que cresceram no meio mínimo com lisina, mas que não cresceram no meio mínimo sem lisina – são lisina negativas (mutantes);

Determina-se então a localização destes mutantes (Lys -) e são depois isolados.

Isolamento de mutantes auxotróficos. (Lisina negativos)Nas culturas em especial, alguns gêneros de enterobactérias.

Isolamentos dos mutante

A retirada dos mutantes é efetuada após a sua detecção, pode apresentar alguns problemas práticos, pelo que se deve recorrer a eficientes sistemas de seleção, que utilizam fatores ambientais para separar os mutantes da linhagem wild type.

As técnicas utilizadas para efetuar a seleção envolvem condições de incubação que favorecem o crescimento do mutante, enquanto que o wild type não é favorecido.

Muitas vezes, as células wild type são susceptíveis ao ataque de vírus (Figura 1), ou ao tratamento com antibióticos (Figura 2), sendo assim possível fazer crescer a bactéria na presença de um desses agentes e observar microrganismos sobreviventes.

Resistência aos Bacteriófagos

Figura 1 – Resistência aos Bacteriófagos.

Bacteriófagos (Fagos) são vírus que lisam e portanto, matam as bactérias.

Ao expor-se uma cultura de E.Coli num meio contendo o agente seletor Fago T2 e incubando-se depois, verifica-se que resistem 4 clones - são os mutantes resistentes a esse fago

Resistência a antibióticos

Considerando o exemplo de bactérias wild type sensíveis ao antibiótico estreptomicina:

Como se procede para selecionar mutantes resistentes a esse antibiótico?

Figura 2. Mutantes resistentes ao antibiótico estreptomicina.

Seleção de mutantes resistentes a antibiótico Coloca-se em contato com o antibiótico (estreptomicina neste caso) a

cultura de microrganismos contendo mutantes resistentes ao mesmo; morrem todas as colônias exceto as resistentes ao antibiótico;

Faz-se a seleção positiva dos mutantes bacterianos com um agente de seleção – estreptomicina - ou seja, põe-se de novo em contacto o antibiótico com os mutantes resistentes ao mesmo e incuba-se.

Apenas se desenvolve a linhagem de microrganismos que não reverteu à mutação, ou seja, apenas se desenvolvem os microrganismos que continuaram com a mutação após contacto sucessivo com o antibiótico – são os resistentes ao mesmo.

Assim, selecionam-se os mutantes resistentes em detrimento dos mutantes que, nalguma geração, reverteram à mutação, ou seja, nalguma geração deixaram de a ter.

Quebra de resistência

Esta técnica é importante na Quimioterapia, uma vez que, como é sabido, não se deve abusar dos antibióticos pois, como demonstrado nesta técnica, ao expor-se o antibiótico aos microrganismos de um modo sucessivo, vão-se eliminando os que não são resistentes, ficando apenas os que resistem, que poderão então crescer e multiplicar-se de uma forma mais eficaz.

Também pode ser utilizada esta técnica de seleção no isolamento de reversíveis à lisina auxotróficos (Lys -). Coloca-se uma população destes microrganismos num meio sem lisina e deixa-se incubar. Examinando depois o desenvolvimento e formação das colônias, verifica-se que apenas as células que reverteram à mutação cresceram, pois têm a capacidade de sintetizar lisina.

Teste de flutuação

As mutações ocorrem independentemente ou dependentemente do agente seletor?

Será que é necessário o contacto com o agente seletor para surgir a mutação, ou esta surge espontaneamente, acontece?

Para se saberem estas respostas realiza-se o teste de flutuação.

Figura 5 – Teste de Flutuação: 1a experiência (controle) e 2a experiência

1a experiência

Tem-se um caldo de bactérias do qual se tiram alíquotas iguais e semeiam-se em vários meios iguais com o mesmo agente seletor (Fago T1);

Incuba-se. Após incubação, observa-se que houve formação de colônias, mas a sua quantidade é constante ao longo de todas as placas, ou seja, houve pouca flutuação no número de colônias.

2a experiência:

Em vários tubos coloca-se a bactéria, onde a replicação de cada um é independente;

Fazem-se espalhamento dos tubos onde existe 109 bactérias para placas com fago T1;

Incuba-se. Após incubação obtém-se

uma flutuação do número de colônias resistentes nas placas.

Não se obtém o mesmo resultado em todas as placas ou seja, o resultado é diferente em cada tubo. Isto mostra então que as mutações ocorrem independentemente do contacto com o agente seletor (neste caso o fago T1). Não é por não haver contacto com o agente seletor que deixa de haver mutações de resistência. Então, a que se deve a variação?

As mutações ocorrem espontaneamente, quando ocorre a replicação do DNA durante o crescimento. São variáveis, aleatórias, não precisam do agente seletor, é uma questão de probabilidade. Neste caso, ocorreram várias mutações de 103 bact./mL para 109 bact./mL.

Figura 6 – Teste deflutuação. Quanto maiscedo ocorre a mutação,maior será o númerode mutantes nasCaixas.

Avaliações de mutações

Taxa de mutação é o número de mutações de um fenótipo particular que ocorreram numa cultura em crescimento, dividido pelo número total de gerações celulares (divisões) no mesmo intervalo de tempo.

TM = número de bactérias resistentes (mutantes) /Número de gerações celulares

a – taxa de mutação m – número médio de mutações que ocorreram na cultura N – número total de divisões celulares

Informações sobre a taxa de mutações

O conceito de taxa de mutação é muito importante porque nos dá a probabilidade de ocorrência de mutações.

Perceber esta probabilidade é também muito importante para detectar bactérias resistentes a um antibiótico e prever, assim, a sua eficácia.

Se a probabilidade é baixa, o antibiótico é bom, se por outro lado, a probabilidade de ocorrência de mutações é elevada, o antibiótico não é muito bom.

Conclui-se assim que a taxa de mutação é muito útil para se avaliar a performance de um futuro antibiótico.

Mutantes em vírus