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TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE HIBRIDOMA UTILIZANDO O SISTEMA DE FAGOS (Phage display)

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  • 1. TECNOLOGIA DE PRODUO DE HIBRIDOMA UTILIZANDO O SISTEMA DE FAGOS Arianna Lanxin Ivson Cassiano Mayla Abrahim Virginia Andrade

2. TECNOLOGIA DE PRODUO DE HIBRIDOMA UTILIZANDO O SISTEMA DE FAGOS Arianna Lanxin Ivson Cassiano Mayla Abrahim Virginia Andrade 3. Hibridomas 4. Anticorpos So protenas sintetizadas e excretadas por plasmcitos, derivadas dos linfcitos B, usadas pelo sistema imunolgico para identificar e neutralizar corpos estranhos como bactrias, vrus ou clulas tumorais. Realizando assim a defesa do organismo (imunidade humoral). 5. Anticorpo monoclonal Se liga a um determinado eptopo So imunoglobulinas geradas por uma populao geneticamente idntica de clulas B Formam anticorpos idnticos 6. Mecanismos de transcrio do genoma do bacterifago na clula hospedeira 7. Phage display O conceito de exposio em fagos foi introduzido pela primeira vez para fragmentos peptdicos curtos Expresso funcional de polipetdeos de E. coli em bacterifagos com atividade funcionalde enzimas George P. Smith, Science (1985) 8. Phage display Desde a sua descrio por Smith em 1985, a tecnologia de Phage Display, exposio de biomolculas em fagos, tem apresentado uma crescente utilizao em diversas reas das Cincias. Este autor foi pioneiro a conseguir a expresso da enzima de restrio Eco RI como uma fuso da protena trs (pIII) do capsdeo do fago. 9. Phage display Mtodos de estudos da interao entre biomolculas Com o uso desta tcnica, possvel selecionar e isolar vetores de clonagem gerados a partir de bibliotecas genmicas, juntamente com seu produto gnico (peptdeo). Por meio da utilizao de fagos infecciosos filamentosos, esta tcnica permite o rastreamento dos clones devido a ligao do fentipo (o peptdeo de interesse) com o gentipo (o vetor de clonagem) que o expressou. 10. Metodologia Imunizao 4 inoculaes Monitoramento com imunoensaios RNAs codificantes de imunoglobulinas Bao Medula ssea 11. Metodologia Insero de genes no bacterifago Panning Lavagens Eluio Amplificao dos fagos em cultivo bacteriano - Fagos expondo molculas especficas para o antigeno (ligao, eluio e amplificao) O processo monitorado por titulao dos fagos e imunoensaios 3 a 5 x 12. Metodologia O processo monitorado por titulao dos fagos e imunoensaios. O material ento isolado, sequenciado, analisad o quanto a afinidade e especificidade. Para ento serem obtidos na forma solvel, sem o fago, e destinadas a suas aplicaes. Ligao, eluio e amplificao 13. Fagos Bacterifagos, ou simplesmente fagos. A palavra fagos tem origem grega e mesmo traduzida como comer, no possui o significado preciso, pois bacterifagos no comem bactrias. Bacterifagos so vrus muito pequenos da famlia Inoviridae que infectam bactrias. Podem ser vrus de DNA ou de RNA que infectam somente organismos procariotos. So formados apenas pelo nucleocapsdeo, no existindo formas envelopadas. 14. Fagos filamentosos Protenas do capsdeo Permitem a apresentao de molculas. pVIII Grande quantidade de molculas pequenas, at 8 aas pIII Protenas grandes como o fragmento Fc Mas usados f1, fd e M13 Infectam enterobactrias, como E. coli. No causam infeco ltica. 15. Fagos 16. Transmisso do genoma A infeco de E. coli pelo fago filamentoso se inicia pela interao de pIII com o pilus sexual da clula e pela despolimerizao do capsdeo, processo que desencadeado pelo complexo bacteriano TolA. O genoma do fago penetra no citoplasma e convertido em DNA de fita dupla , que serve de molde para a replicao e a produo das protenas virais 17. Infeco 18. Fagomdeos Fagomdeos so vetores de clonagem constitudos por DNA, os quais apresentam propriedades tanto de bacterifago quanto de plasmdeo. Este vetores carregam, alm da origem de replicao plasmidial, uma origem de replicao derivada de bacterifago. Diferem de plasmdeos comuns por terem a capacidade de serem empacotados em capsdeos de fagos, em funo de possurem tambm uma sequncia gnica de sinalizao para empacotamento. Fago HELP empacota o fagomdeo 19. Bibliotecas de anticorpos possvel construir bibliotecas de fagos que expressam o anticorpo integral ou somente as pores Fab e scFv, que interferem minimamente na estabilidade da partcula viral 20. Aplicaes Mapeamento de eptopos de diversas protenas antignicas, constituintes de vrios agentes causadores de doenas. Reagentes para diagnsticos Desenvolvimento de vacinas Novas drogas Ativadores e inibidores enzimaticos Estudos moleculares na interao patogeno-hospedeiro Testes de imunogenicidade Quimioterpicos ou oligonucleotdeos, anti-senso para tumor. 21. Vantagem Poucos animais em teste Alta especificidade; Alta afinidade; Determinao de um s eptopo de um antignio; Alta homogeneidade; Ausncia de anticorpos no especficos; Maior facilidade de caracterizao; Reduzida variabilidade de lote para lote 22. Desvantagem Normalmente so extremamente caros; Reconhecimento de um s eptopo de um antignio. Esse eptopo pode estar destrudo (por ex: pela fixao) mesmo que exista a molcula total do antignio; Se o soro no foi produzido contra um eptopo especfico do antignio que se quer detectar e se existirem outros antignios com esse eptopo, a imensa vantagem da alta especificidade ser intil