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Ministério da EducaçãoSecretaria de Educação Profissional e Tecnológica
Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia GoianoCurso de Tecnologia em Gestão Ambiental
GESIANE RIBEIRO GUIMARÃES
DIVERSIDADE E CARACTERIZAÇÃO MORFOCULTURAL, BIOLÓGICA,
BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE Colletotrichum spp.
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URUTAÍ - GO2011
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Ministério da EducaçãoSecretaria de Educação Profissional e Tecnológica
Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia GoianoCurso de Tecnólogo em Gestão Ambiental
GESIANE RIBEIRO GUIMARÃES
DIVERSIDADE E CARACTERIZAÇÃO MORFOCULTURAL, BIOLÓGICA,
BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE Colletotrichum spp.
Monografia apresentada para obtenção do grau de Tecnólogo em Gestão Ambiental ao Instituto Federal Goiano – CampusUrutaí. Orientador: Dr. Milton Luiz da Paz Lima.
URUTAÍ - GO2011
GESIANE RIBEIRO GUIMARÃES
DIVERSIDADE E CARACTERIZAÇÃO MORFOCULTURAL, BIOLÓGICA,
BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE ISOLADOS DE Colletotrichum spp.
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
D.Sc. Marcus Vinícius Vieitas Ramos (Revisor)
_______________________________________
M.Sc. Fernando Godinho de Araújo (Revisor)
_______________________________________
D.Sc. Milton Luiz da Paz Lima (Orientador)
Data da Defesa: Urutaí, 22 de dezembro de 2011.
Dedico a meus pais Geraci e Ana Maria e aos
meus irmãos Giselle, Geraci Junior, Germi e
Gelza,que sempre me apoiaram com todo seu
amor e carinho e me estimularam a nunca
desistir dos meus objetivos. E ao meu
orientador pelo esforço e dedicação.
“Seja a mudança que você quer ver no
mundo.”
Mahatma Gandhi.
AGRADECIMENTOS
A Deus.
Aos meus pais e irmãos pelo amor, carinho e compreensão que sempre me apoiaram e me
incentivaram a não desistir dos meus ideais. Ao Instituto Federal Goiano campus Urutaí em especial
o Laboratório de Microbiologia, agradeço não só a formação acadêmica, mas também a oportunidade
e todo apoio para realização desta monografia. Quero agradecer de modo especial ao meu orientador
Milton, por sua atenção, apoio, otimismo, confiança e amizade.
Obrigada por esta oportunidade de aprender e contribuir com a Ciência.
Aos membros da banca examinadora, M. Sc. Fernando Godinho de Araújo (Revisor), Dr. Marcus
Vinícius Vieitas Ramos (Revisor), Dr. Milton Luiz da Paz Lima (Orientador), por terem aceitado
participar da avaliação deste trabalho.
Aos professores do curso que contribuíram para minha formação profissional:
Leonice A. Carvalho, Sandra Zago, Carlos Alberto, Rogério C. Machado, Telma Moura, Lucas C. B.
de Azevedo, Sue Éllen Ester Queiroz, Guilherme Malafaia, Bruno G. A. da Veiga, Aline Sueli de L.
Rodrigues, Alexandre Igor de A. Pereira, Juliano Avelar, José Antônio, Muza do Carmo Vieira,
Marcos de Morais, Marcos Fernandes e Milton Luiz da Paz Lima.
A vocês que dedicaram seu tempo e sua experiência, o meu muito obrigado e eterno reconhecimento.
Obrigada especialmente aos eternos amigos Luiz Paulo, Fagner, Mirella, Gleciene e a todos que
torceram por mim.
Obrigada também aos amigos que passaram pelo Laboratório de Microbiologia, Michelle, Éder,
Jovan, Priscila, Ana Cristina, Sara, Aldemir, Edilson Silva, Maurílio, Felipe, Alessandra, Flávio,
Vânia, Lucas, Anelise, João Marcos e Gianne Amorim.
À minha amiga Gaby, por sempre somar entusiasmos e alegrias.
Obrigada por tantos momentos de alegria e amizade. Sentirei muito a falta de vocês!
RESUMO
GUIMARAES, G.R. Diversidade e caracterização morfocultural, bioquímica e molecular de isolados
de Colletotrichum spp. Projeto de Monografia de Final de Curso. 2011.
Estudos de diversidade de microrganismos evidenciam variações importantes que muitas vezes
questionam e desvalidam importantes conceitos de espécies. Aspectos morfológicos de muitas
espécies de Colletotrichum não são suficientes para sua perfeita identificação, principalmente para
C. gloeosporioides, que em literatura e considerado uma espécie-grupo. Isolados de Colletotrichum
spp. foram obtidos de várias hospedeiras, oriundos de diferentes regiões de coleta. Serão estudados
quatro critérios de diferenciação: i) aspectos morfoculturais, ii) aspectos morfológicos e
morfométricos das estruturas reprodutivas, iii) testes biológicos, iv) uso de fontes diferenciadoras de
C e N, v) identificação molecular. Os isolados foram obtidos através do isolamento em meio ágar-
agua (AA), preparando-se culturas monospóricas, sendo repicados para formação de culturas puras
em meio de cultura BDA. A partir destas culturas puras foram empregados os quatro marcadores de
diferenciação fenotípica. A coloração das colônias teve em seu verso coloração branca, salmão,
acinzentado, alaranjado e creme, e o reverso variando entre alaranjado e acinzentado. A classificação
do micélio variou de aéreo ou intermediário, e esta forma variou de cotonosa a rosácea. Avaliando o
crescimento micelial, o isolado oriundo de dracena teve melhor crescimento no primeiro dia de
avaliação chegando a atingir 18 mm No primeiro experimento a área abaixo da curva de progresso
do crescimento micelial (AACPCM) variou de 145 a 359 (isolados de mamão e dracena,
respectivamente), e a taxa de crescimento variou de 4,2 a12 mm.dia-1. No segundo experimento a
AACPCM variou de 160 a 262 mm.dia-1, e a taxa de crescimento variou de 4,2 a12 mm.dia-1
(isolados caqui e antúrio, respectivamente). O teste de patogenicidade cruzada revelou a
suscetibilidade dos frutos e das folhas testadas. Todos os isolados foram patogênicos em seus
hospedeiros de origem (exceção sem ferimento abacate, caqui, dracena e iuca). No tratamento com
ferimento as folhas da fruta do conde apresentaram maior porcentagem de infecção dos isolados
inoculados (95,8 %). No tratamento sem ferimento as folhas de abacate apresentaram maior
porcentagem de infecção pelos isolados testados (45,8 %). O isolado oriundo de conde foi o isolado
que apresentou maior gama de hospedeiras (total de 22 hospedeiros) nos tratamentos com ferimento;
e nos tratamentos sem ferimento os isolados de abacate, cana e mamão foram mais agressivos nos
hospedeiros testados. Os isolados com menos gama de hospedeiros e consequente maior
especificidade destacam-se os isolados de goiaba e falso massambará com ferimento e os isolados de
goiaba e soja sem ferimento. As principais fontes de carbono para os isolados testados continham em
suas combinações dextrose e sorbitol, pois os maiores valores de AACPCM e TC, foram para
tratamentos que continham essas fontes de C. A sacarose não demonstrou uma fonte de C eficiente
para a morfofisiologia dos isolados. Cinquenta % dos isolados (árvore-da-fortuna, banana fruto,
caqui e conde) apresentaram maiores valores de AACPCM para a combinação dextrose e nitrato de
potássio. Trinta e oito % dos isolados (banana folha, banana fruto e caqui (folha),) tiveram TC
maiores para isolados também submetidos a combinação de dextrose e nitrato de potássio. Os
isolados de conde, chuchu e árvore da fortuna apresentaram os menores valores médios de AACPCM
e TC. As características fenotípicas dos isolados de Colletotrichum permitiram desenvolver uma
análise comparativa para identificação do complexo grupo. Os melhores pares de oligonucleotídeos
importantes para amplificação de sequencias de isolados de Colletotrichum foram os pares de
oligonucleotídeos ITS e Actina. Através desse trabalho pode-se caracterizar uma população de
isolados de Colletotrichum spp. utilizando parâmetros fenotípicos e moleculares.
Palavras-chave: inoculação cruzada, antracnose, doenças foliares.
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ........................................................................................................................... 9
RESUMO ............................................................................................................................................. 10
LISTAGEM DE FIGURAS .................................................................................................................. 12
LISTAGEM DE TABELAS ................................................................................................................. 12
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 13
2. OBJETIVO ....................................................................................................................................... 13
2.1. OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................... 13
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................................. 13
3. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................................... 14
3.1. HOSPEDEIROS ............................................................................................................................ 14
3.1.1. Abacate (Persea americana Mill – Lauraceae) ................................................................. 14
3.1.2. Amora (Morus nigra Linneu - Moraceae) ......................................................................... 14
3.1.3. Antúrio (Anthurium andreanum Linden. - Araceae) ......................................................... 15
3.1.4. Árvore da Fortuna (Polyscias fructicosa Linneu – Araliaceae) ......................................... 15
3.1.5. Banana (Musa paradisíaca Linneu – Musaceae) .............................................................. 15
3.1.6. Cana (Saccharum officinarum Linneu - Poaceae) ............................................................. 15
3.1.7. Caqui (Diospyros kaki Linneu - Ebenaceae) ...................................................................... 15
3.1.8. Chuchu (Sechium edule Jacq. - Cucurbitaceae) ................................................................ 16
3.1.11. Dracena (Dracena fragans Linneu - Liliaceae) ................................................................ 16
3.1.12. Falso massambará (Sorghum arundinaceum Linneu- Poaceae) .................................... 16
3.1.13. Goiaba (Psidium guajava Linneu - Myrtaceae) .............................................................. 16
3.1.14. Iuca (Yucca elephantipes Regel - Agavaceae) ................................................................. 17
3.1.15. Mamão (Carica papaia Linneu - Caricaceae) ................................................................. 17
3.1.17. Manga (Mangifera indica Linneu - Anacardiaceae) ....................................................... 17
3.1.18. Mangaba (Hancornia speciosa Gomes - Apocynaceae) ................................................. 17
3. 1.19. Negramina (Siparuna guianensis Aublet - Siparunaceae) ............................................. 18
3.1.20. Soja (Glycine max Linneu - Fabacaeae) .......................................................................... 18
3.1. 21. Tomate (Lycopersicon esculentum Linneu - Solanaceae) ............................................... 18
3.1.22. Uva (Vitis vinifera Linneu - Vitaceae) .............................................................................. 18
3.2. A DOENÇA – ANTRACNOSE .................................................................................................... 19
3.3. GÊNERO COLLETOTRICHUM ............................................................................................................. 19
3.3.1. Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz e Sacc. (1884). ........................................... 20
3.3.2 COLLETOTRICHUM CAPSICI (H.SYD.) E. BUTL. E BISBY (1931) ....................................................... 21
3.3.3 COLLETOTRICHUM MUSAE (BERKELEY & M.A. CURTIS) ARX (1957) ............................................... 21
OS PRINCIPAIS HOSPEDEIROS DESTE PATÓGENO SÃO ESPÉCIES DE MUSA SPP. COMO M. TEXTILIS, CONTUDO FOI
REGISTRADA SUA OCORRÊNCIA EM MALUS PUMILA (MAÇA), MANGIFERA INDICA (MANGA), PERSEA AMERICANA
(ABACATE), PSIDIUM GUAJAVA (GOIABA) AND VIGNA SP. (ATRAVÉS DE NODULAÇÕES). ..................................... 21
APRESENTA COMO BAINÔMIO MYXOSPORIUM MUSAE BERK. & M.A. CURTIS 1874, E SINONÍMIA GLOEOSPORIUM
MUSARUM COOKE & MASSEE 1887. PARA ESTE ANAMORFO AINDA NÃO FOI IDENTIFICADO EM LITERATURA A SUA
FORMA TELEOMÓRFICA. .......................................................................................................................... 21
3.3.4 COLLETOTRICHUM FALCATUM (BERK. & CURT.) (1957) .................................................................. 21
4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................................. 21
4.1. CARACTERIZAÇÃO MORFOCULTURAL E MORFOLOGIA DE ESTRUTURAS REPRODUTIVAS. ................................ 22
4.2.CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA (TESTE DE PATOGENICIDADE CRUZADA) ..................................................... 22
4. 3. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA ....................................................................................................... 22
4.4. SELEÇÃO MOLECULAR DE PRIMERS ESPECÍFICOS PARA DETECÇAO ........................ 23
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................................... 24
5.1.CARACTERIZAÇÃO CULTURAL E MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS ................................................................. 24
5.2. CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA (TESTE DE PATOGENICIDADE CRUZADA) .............. 39
5.3. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA ......................................................................................... 41
5.4. IDENTIFICAÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR 44
6. CONCLUSÕES ................................................................................................................................ 46
7. ASPECTOS FORMATIVOS ............................................................................................................ 46
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................. 46
LISTAGEM DE FIGURAS
LISTAGEM DE TABELAS
1. INTRODUÇÃO
A antracnose em frutíferas é considerada uma doença economicamente importante, ela
ataca os ramos novos, folhas, inflorescências e frutos. Nas folhas, há o aparecimento de
manchas escuras e de contornos irregulares, que resultam em lesões ou perfurações quando os
tecidos necrosados se destacam. As inflorescências afetadas apresentam flores escuras,
tomando o aspecto de queimadas pelo fogo, morrendo em seguir. As lesões nos ramos podem
levar à queda dos frutos, antes da maturação fisiológica, ou mumificação quando ainda novos.
No período de maturação, há o aparecimento de lesões escuras e deprimidas na superfície do
fruto, que podem atingir também a polpa. A doença pode ocasionar prejuízos que variam em
função do grau de suscetibilidade da planta hospedeira e das condições ambientais (SERRA et
al., 2008).
Podem provocar perdas de até 100% na produção quando os fatores cultivar
suscetível, ambiente favorável e sementes infectadas estiverem simultaneamente presentes
durante o período de cultivo.
Entre as medidas de controle deste patógeno, destacam-se: o uso de sementes
certificadas, a rotação de culturas, o controle químico e a resistência genética, sendo esta
última mais eficaz, por minimizar os custos de produção e reduzir os danos causados ao
ambiente (SILVA, 2004). A disseminação do fungo de uma planta para outra se dá
principalmente através de respingos de chuva, pois os conídios estão aglutinados por uma
substância gelatinosa hidrossolúvel e não são facilmente carregados pelo vento. Os conídios
uma vez em contato com o hospedeiro, sob condições de umidade, germinam e o pró-micélio
resultante, com prévia formação de apressório, penetra diretamente através da cutícula pela
emissão do tubo de infecção (GALLI et al., 1978).
A taxonomia e nomenclatura do gênero Colletotrichum é bastante confusa. Hyde et al.
(2009) apontaram que existem 66 espécies de Colletotrichum válidas, e destas, 19
permanecem com a nomenclatura obscura.
A consequência da infecção por espécies de Colletotrichum é a podridão na pré e pós-
colheita, que limitam a produção, comercialização e exportação de frutas, hortaliças e culturas
perenes, incluindo diversas frutíferas de regiões tropicais e subtropicais (BAILEY e JEGER,
1992; SREENIVASAPRASAD e TALHINHAS, 2005; HINDORF, 2000; HYDE et al., 2009;
SERRA et al., 2008).
O gênero Colletotrichum é um dos mais importantes entre os fungos fitopatogênicos
do mundo, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais, envolve espécies que causam
doenças de expressão econômica em leguminosas, cereais, hortaliças e culturas perenes,
incluindo diversas frutíferas (SERRA et al., 2008). As espécies de Colletotrichum spp.
possuem como teleomorfos espécies de Glomerella spp. (SUTTON, 1992; ARMSTRONG-
CHO e BANNIZA, 2006; PFENNING et al., 2007) e os nomes C. gloeosporioides e
Glomerella cingulata, bastante utilizados para caracterização das espécies tipo dos gêneros de
anamorfos e teleomorfos. Entretanto, o conceito de espécies aplicado para anamorfos e
teleomorfos, nem sempre coincide entre si, dificultando a identificação dos táxons (CANNON
et al., 2000). Para o anamorfo e teleomorfo, a preferência é o uso de nomes mais antigos
(SHENOY et al.,2007; CROUS, 2009) e estes podem ser observados no Index Fungorun
(2011). Há necessidade de esclarecimentos sobre a real taxonomia deste importante patógeno
inespecífico e hipervariável. Cepas podem produzir teleomorfo (heterotálicas) com frequência
diferenciada em meios de culturas artificiais, ou seja, em condições artificiais desenvolvem-se
como homotálicas, dificultando a caracterização. Já alguns isolados parecem serem não tão
agressivos aos seus hospedeiros (GUERBER e CORRELL, 2001; ARMSTRONG-CHO e
BANNIZA, 2006).
Os conídios germinam de seis a nove horas após o contato inicial com o hospedeiro se
as condições forem favoráveis. Há formação do tubo germinativo, seguido do apressório, que
penetra mecanicamente pela cutícula e pela epiderme da planta. O aparecimento de sintomas
pode ser observado a partir do sexto dia após o início da infecção (KIMATI et al., 1997).
Esses fungos são os causadores de uma diversidade de doenças como antracnose, podridão de
pedúnculo e varicela (BAILEY & JEGER, 1992).
Espécies de Colletotrichum spp. são tradicionalmente diferenciadas com base em
caracteres morfológicos e culturais, que devem ser considerados simultaneamente nunca
isoladamente. Características tais como morfologia de conídios, presença de setas e do
teleomorfo, coloração de colônia, e taxa de crescimento têm sido usadas para diferenciar
espécies morfologicamente próximas (SILVA, 2004).
As dificuldades encontradas na identificação das espécies de Colletotrichum estão
relacionadas à grande diversidade fenotípica, influência de fatores ambientais na estabilidade
dos caracteres morfológicos e culturais, existência de formas intermediárias e falta de
padronização de condições culturais empregadas nos diferentes estudos (SUTTON, 1992;
FREEMAN et al., 1998; LOPEZ, 2001). A diferenciação entre espécies com base no círculo
de hospedeiros ou hospedeiro de origem também não é um critério confiável para espécies
como, por exemplo, C. gloeosporioides e C. acutatum que infectam diferentes hospedeiras
(FREEMAN et al., 1998; PERES et al., 2005). É frequente a ocorrência de mais de uma
espécie de Colletotrichum associada a uma mesma hospedeira e uma mesma espécie pode
atacar múltiplas hospedeiras (FREEMAN et al., 1998). O fungo Colletotrichum
gloeosporioides e C. acutatum causam, em geral, sintomas semelhantes como as podridões de
frutos em pós-colheita de morangueiro (PERES et al., 2002). O morangueiro (Fragaria x
ananassa Duch.), por exemplo, pode ser infectado por C. fragariae Brooks, C. acutatum e C.
gloeosporioides (GUNNEL & GUBLER, 1992). As três espécies causam antracnose, mas a
podridão do pedúnculo, inflorescências e frutos conhecida como "Flor Preta" é atribuída a C.
acutatum na cultura do citros. Outras culturas como a amêndoa (Prunnus amygdalu L.)
(FORSTER & ADASKAVEG, 1999), maçã (Malus domestica Borkh.) (BERNSTEIN et al.,
1995), abacate (Persea americana Mill.) (JONHSTON&JONES, 1997), pêssego (Prunnus
persica (L.) Batsch.) (ADASKAVEG&HARTIN, 1997); citros (BROWN et al., 1996; GOES
& KIMATI, 1997) e algumas solanáceas (TOZZE JR. et al., 2006) são infectadas por C.
acutatum e C. gloeosporioides.
Nutricionalmente carbono e nitrogênio exercem efeito nos processos fisiológicos de
fungos, principalmente aqueles relacionados ao crescimento, produção de conídios,
germinação e peso seco (Cochrane, 1958) e permitem também, estabelecer diferenças entre os
isolados de Colletotrichum spp., pela sua habilidade em usar determinada fonte de carbono e
nitrogênio. A identificação de fungos por metodologia tradicional baseia-se na morfologia
celular, seguindo as informações supracitadas. No entanto, estes estudos às vezes geram
resultados ambíguos, por causa da variabilidade intrínseca ao isolado de uma espécie e das
características fisiológicas na condição de cultivo. Atualmente, os estudos da diversidade,
taxonomia e identificação de microrganismos estão sendo realizados com base nos
conhecimentos atuais da taxonomia polifásica, a qual integra diferentes dados e informações
de análises, fenotípicas, genotípicas e filogenéticas, para caracterizar o microrganismo em
teste (VALE, 2009).
O desenvolvimento dos novos métodos para estudo da diversidade de existente entre
isolados de Colletotrichum spp. (YANG et al., 2009; DAMM et al., 2009; PRIHASTUTI et
al., 2009). As técnicas moleculares de amplificação são utilizadas devido a sua maior precisão
em comparação com os métodos convencionais.
Além dos métodos tradicionais de caracterização, análise cultural e morfológica,
outros métodos vêm sendo empregados recentemente com maior frequência, entre eles a
patogenicidade, os grupos de compatibilidade vegetativa, a análise isoenzimática, e os
métodos moleculares, como RAPD e RFLP. Recentemente, observa-se a necessidade de
utilizar diferentes métodos de caracterização aliados aos métodos moleculares principalmente
devido a grande variabilidade genética encontrada dentro do gênero Colletotrichum sp.
(MENEZES, 2002).
Técnicas moleculares têm sido utilizadas para caracterizar diversos táxons fungicos,
particularmente para Colletotrichum sp., e as têm auxiliado grandemente na demonstração da
variabilidade inter e intraespecífica. As técnicas mais empregadas com essa finalidade são o
“Restriction Fragment Length Polymorphism” (RFLP) e “Random Amplified Polymorfic
DNA” (RAPD). Braithwaite et al., (1990), utilizaram a técnica de RFLP para demostrar a
divergência genética entre C. gloeosporioides tipos A e B, duas populações com diferenças
morfológicas, patogênicas e bioquímicas que ocorrem em Stylosanthes spp., na Austrália.
Utilizando essa técnica, esses autores revelaram que ambas as populações são geneticamente
homogêneas, porém distintas entre si. O fato de não ocorrerem nas fases perfeitas de nenhuma
dessas populações na Austrália, explica a uniformidade genética intrapopulacional e descarta
a possibilidade de especialização patogênica dessa espécie. Dessa forma, os autores concluem
que a existência de duas populações tão diferentes só pode ser explicada por duas diferentes
introduções do patógeno no pais.
A técnica de RAPD foi utilizada no Brasil, numa série de trabalhos, para caracterizar
isolados de C. lindemuthianum do feijoeiro (VILARINHOS et al., 1995; ALZATE-MARIN et
al., 1997; MESQUITA et al., 1998). Nesses trabalhos, foram utilizados diversos isolados do
fungo, numa tentativa de discriminar as diferentes raças por meio da técnica de RAPD.
Apesar dos resultados não terem permitido o mesmo agrupamento obtido como os testes de
inoculação da variabilidade patogênica de C. lindemuthianum. Além dessa espécie, o RAPD
já foi utilizado, com sucesso, para caracterizar a variabilidade de C. graminicola (GUTHRIE
et al., 1992; BROWNING et al., 1999), C. orbiculare (CORRELL et al., 1993) e C.
gloeosporioides (ALAHAKONN et al., 1994; HAYDEN et al., 1994; KELEMU et al., 1999).
A taxonomia e a filogenia do gênero Colletotrichum é confusa (HYDE et al., 2009a;
CAI et al., 2009). Historicamente, a antracnose foi encontrada em um substrato para o qual
não há registros de que a relação fungo/hospedeiro era conhecida, então a espécie foi
interpretada como sendo nova, sendo formalmente descrita (CANNON et al., 2000). Esta
prática foi posteriormente rejeitada (von ARX 1957; SUTTON, 1980; BAXTER et al., 1983),
mas novas espécies são ocasionalmente, descritas e pertencentes ao gênero Colletotrichum sp.
(SIVANESAN et al, 1993;. NAKAMURA et al., 2006; LIU et al., 2007). Há agora mais do
que 706 táxons listados no Índex Fungorum (INDEX FUNGORUM, 2011). Baseado em um
estudo morfológico, von Arx (1957) incluiu mais de 600 sinônimos em C. gloeosporioides e
84 sinônimos em C. dematium. Sutton (1992) listou 39 espécies válidas de Colletotrichum
spp. Nos últimos anos, ferramentas moleculares têm sido empregadas para inferir a evolução
relações das espécies de Colletotrichum. Baseado em rDNA ITS dados de sequência e
morfológicas características, algumas espécies têm sido segregados do Colletotrichum
gloeosporioides complexas, como C. boninense Moriwaki, Toy. Sato & Tsukib. (MORIWAKI
et al., 2003). Embora a sua sequência de dados ajude na identificação das espécies
Colletotrichum, não pode ser usado sozinho por tratar-se que muitas espécies são
estreitamente relacionadas (CROUCH et al., 2009a). Pesquisadores recentemente tentaram
examinar genes múltiplos dados de sequência para distinguir espécies em Colletotrichum (DU
et al, 2005; JOHNSTON et al., 1997; CROUCH et al., 2009b; FARR et al., 2006; SHENOY
et al., 2007abc; QUE et al., 2008ab; MORIWAKI e TSUKIBOSHI, 2009). Usando estudos
filogenéticos, CROUCH et al. (2006, 2009b).
São conhecidos outros métodos como sequenciamento do material genético, ou
caracterização com utilização de marcadores moleculares, que vêm apresentando bons
resultados em estudos com o gênero Colletotrichum (CANNON et al., 2000; MENEZES,
2002).
2. OBJETIVO
2.1. Objetivo geral
O objetivo deste projeto é caracterizar um complexo de isolados de Colletotrichum
spp. utilizando marcadores morfo-culturais, biológicos, bioquímicos e moleculares.
2.2. Objetivos específicos
• Verificar aspectos culturais como coloração, esporulação e padrões de crescimento.
• Identificar a presença da forma teleomórfica.
• Verificar a morfologia do apressório a fim de adequar as morfologias das espécies
propostas por SUTTON (1992).
• Realizar uma análise morfométrica dos conídios e suas estruturas morfológicas a fim
de verificar divergências para a espécie.
• Caracterizar a fisiologia do crescimento utilizando como parâmetros a taxa de
crescimento e a área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial.
• Verificar a agressividade e patogenicidade de isolados de Colletotrichum spp. nos seus
hospedeiros de origem.
• Verificar a especificidade em avaliações de inoculação cruzada.
• Efeito da relação carbono/nitrogênio no crescimento micelial.
• Identificar a partir de oligonucleotídeos universais (primer) uma região gênica
exclusiva para isolados de Colletotrichum spp.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Hospedeiros
A seguir serão apresentadas algumas características gerais dos hospedeiros de origem
dos isolados de Colletotrichum estudadas neste trabalho.
3.1.1. Abacate (Persea americana Mill – Lauraceae)
Presente em regiões colonizadas pelos espanhóis (México, Guatemala e Antilhas), o
abacate se espalhou até a América do Sul e pode ser encontrado em todas as regiões do globo
que possuam solos férteis e onde haja calor que seja suficiente. Produtores e exportadores de
abacate distribuem-se entre os vários países da África e das américas do Sul e Central, além
de Israel, Espanha e Estados Unidos, na região da Califórnia.
Segundo Pio Corrêa, o abacate foi introduzido no Brasil como espécie cultivável
apenas no início do século XIX e, atualmente, encontra-se à venda nas feiras livres e
supermercados ao longo de quase todo o ano.
As plantações do interior dos estados de São Paulo e Minas Gerais são responsáveis
por quase dois terços do total da produção nacional (THOMSEN, 1999).
3.1.2. Amora (Morus nigra Linneu - Moraceae)
A amoreira é uma frutífera de grande potencial para as regiões brasileiras com período
de inverno marcante que propícia para pequenas propriedades agrícolas. Os frutos podem ser
utilizados para consumo in natura e para produção de geleificados e doces caseiros, sendo
assim, potencial para as famílias que trabalham com o ecoturismo regional. Além destas
características, praticamente não necessita de insumos químicos, sendo ótima opção para o
cultivo orgânico, além das propriedades nutricionais e medicinais dos frutos. Amora apresenta
duas espécies principais: a preta (Morus nigra L.) e a branca (M. alba L.). Ambas são
medicinais e alimentícias. A amoreira branca (Bombyx mori L.) é cultivada quase que
exclusivamente para a criação do bicho-da-seda muito comum no Oriente. Este inseto
alimenta-se das folhas da amoreira-branca. Também pertencem à família botânica, a jaca,
figo, a fruta-pão, fícus, umbaúba, entre outros (MIRANDA, 2010).
3.1.3. Antúrio (Anthurium andreanum Linden. - Araceae)
O antúrio, é uma das flores mais comercializadas do mundo, ainda é pouco difundida e
pode ser plantada em todo o país. Seu centro de origem abrange a Venezuela e Colômbia. No
Velho Mundo, passou pelos primeiros de muitos os programas de melhoramento, antes de se
tornar a segunda flor tropical mais comercializada no mundo, perdendo apenas para as
orquídeas. Existem mais de 500 espécies de antúrios, muitos deles nativos no Brasil, como o
A. harrisi (LORENZI & SOUZA, 2001).
Antúrio ou A. andreanum trata-se de uma planta semi-herbácea, ereta, perene, possui
de 0,30-1,0 m de altura, sua folhagem e inflorescência possui caráter ornamental. As flores
são formadas na primavera e verão. Suas brácteas possuem diversas cores e tamanhos.
Cultivadas sempre a meia-sombra em canteiros. Também são utilizadas para corte,
proporcionando flores muito duráveis (LORENZI & SOUZA, 2001).
3.1.4. Árvore da Fortuna (Polyscias fructicosa Linneu – Araliaceae)
Esta é uma planta originária da Polinésia e cercada por lendas urbanas curiosas,
existem duas espécies pertencentes ao gênero das Polyscias spp. que recebem o nome de
árvore-da-felicidade, a Polyscias guilfoylei e a P. fructicosa, que são respectivamente
chamadas de “macho” e “fêmea”, embora não sejam plantas da mesma espécie e que
necessitem trocar gametas entre si. Existe o hábito de sempre plantar essas duas plantas juntas
para atrair boa sorte. Embora o nome popular dessa planta faça-nos pensar em uma árvore,
devido a seu porte máximo de cinco metros ela é mais corretamente classificada como um
arbusto, podendo ser cultivada em lugares sem muito espaço (LORENZI, 2001).
3.1.5. Banana (Musa paradisíaca Linneu – Musaceae)
A banana é a fruta mais popular no Brasil, sendo consumida tanto sob forma fresca
quanto cozida, frita ou processada industrialmente como doces ou passas. Excetuando
algumas regiões sob baixo nível tecnológico, resultado em plantios onde os problemas
fitossanitários, especialmente doenças, ocorrem em elevadas intensidade, contribuindo para
uma baixa produtividade e qualidade dos frutos. Considerando-se que a bananeira é cultivada
em todas as regiões do País, sob diferentes condições de clima e solo, as doenças que ocorrem
nessa cultura assumem, portanto, importância regional, sendo também influenciadas pela
variedade cultivada. Dentre os fitopatogênicos que incita doenças na cultura da bananeira
destacam-se os fungos, por serem responsáveis pelo maior número de enfermidades que
ocorrem na cultura, por causarem perdas elevadas na produção e por depreciarem a qualidade
dos frutos. Outras enfermidades importantes para a cultura são também causadas por bactérias
e vírus.
A antracnose é a doença mais importante dos frutos da bananeira, ocorrendo infecções
tanto na pré quanto na pós-colheita. As lesões de antracnose originam-se de duas formas
distintas: lesões originadas de infecções que ocorreram em frutos verdes, permanecendo
latentes até seu amadurecimento; lesões oriundas de infecções ocorridas em pós-colheita,
decorrentes de ferimentos na superfície dos frutos, resultando em lesões não latentes
(STOVER, 1972; FEAKIN, 1977).
3.1.6. Cana (Saccharum officinarum Linneu - Poaceae)
A cana-de-açúcar é originária da Nova-Guiné e foi levada para o sul da Ásia onde foi
usada, de início, principalmente em forma de xarope. A primeira evidência do açúcar em sua
forma sólida, data do ano 500, na Pérsia (MOZANBANI et. al., 2006). A cana-de-açúcar é um
produto de suma importância econômica e social no Brasil, em virtude dos seus derivados,
principalmente o álcool e o açúcar. Atualmente, o Estado de São Paulo destaca-se por
contribuir com cerca de 60 % da produção nacional, o que equivale a aproximadamente 300
milhões de toneladas anuais (RAIZER, 1998).
Dentre as principais doenças que ataca a cana-de-açúcar destaca-se a podridão-
vermelha-da-cana-de-açúcar, doença essa que causa grandes prejuízos à cultura. Esta doença
ocorre em épocas quentes e chuvosas, podendo incidir de maneira drástica nas folhas, toletes
e principalmente em colmos, prejudicando a produção e a qualidade do produto para a
comercialização e a industrialização (RAGO e TOKESHI, 2005). A doença existe desde o
início do cultivo da cana e ocorre no mundo todo. A podridão vermelha causa prejuízos
importantes à cultura, sobretudo pela inversão de sacarose, o que diminui o rendimento no
processamento da cana. São frequentes os relatos de perdas de 50 % a 70 % de sacarose em
colmos atacados simultaneamente pelo fungo e pela broca-da-cana, pois ao perfurar o colmo
ela abre caminho para a entrada do fungo (SANTIAGO e ROSSETTO, 2010).
3.1.7. Caqui (Diospyros kaki Linneu - Ebenaceae)
O caqui é um fruto subtropical cuja cultura vem despertando grande interesse, devido
aos elevados rendimentos que proporciona aos produtores (SARRIA, 1998). O Brasil possui
8.322ha plantados com caqui com uma produção de 164.849 ton e produtividade de
19.839kg/ha (REETZ, 2007). No entanto, a produção brasileira se concentra na cv. Fuyu, que
tem sua colheita nos meses de março e abril. O curto período de colheita e o baixo tempo de
conservação pós-colheita (FAGUNDES et al., 2006) causam um excesso de oferta no período
de safra, ocorrendo queda do preço do produto. A maturação é concentrada em um curto
período de tempo e pode levar a perda de frutos no início da colheita, principalmente em
condições adversas de campo (MASIA et al., 1998).
3.1.8. Chuchu (Sechium edule Jacq. - Cucurbitaceae)
O chuchu, espécie da família das cucurbitáceas, é nativo da América Latina é uma
planta herbácea, perene e trepadeira, muito conhecida, sendo cultivado em várias regiões
tropicais e subtropicais no mundo. O Brasil é o maior produtor de chuchu do mundo que é
uma das dez hortaliças mais consumidas no país, sendo cultivado em várias regiões tropicais e
subtropicais e é usado como alimento, na indústria de compotas de frutas, forragem e
remédio. (FILGUEIRA, 2003).
A família Cucurbitaceae compreende cerca de 118 gêneros e 825 espécies, com uma
distribuição predominantemente tropical. Mais de 90 % das espécies estão localizadas na
África, América Latina e Ásia. Aproximadamente nove gêneros e 30 destas espécies são
utilizadas com fins econômicos, destacando-se as abóboras, buchas vegetais, porongos,
chuchus, melancias, melões e pepinos (BARBIERI, 2007).
Antracnose causada pelo fungo Colletotrichum pode ser considerada a principal
doença do chuchu no Brasil. O fungo ataca diversas outras cucurbitáceas, causando
principalmente podridões de frutos. No chuchu, o ataque se dá principalmente nas folhas e
frutos, em qualquer estádio de desenvolvimento. Nas folhas são formadas lesões circulares
grandes, que podem coalescer (juntar-se) e provocar queima das mesmas. No caule ou nos
frutos as lesões são elípticas deprimidas. Ataques severos causam queda de folhas e
apodrecimento dos frutos. A doença também é muito comum em pós-colheita em frutos de
chuchu, que são colhidos aparentemente sadios e desenvolvem os sintomas após alguns dias
da colheita. Nas lesões, pode aparecer um mofo de coloração pálido-róseo, que são os esporos
do fungo. A doença é favorecida por chuvas ou irrigações excessivas, alta temperatura e alta
umidade relativa do ar (REIS, 2008).
3.1.9. Coco (Cocus nucifera Linneu - Arecaceae)
O coco pertencente à família Arecaceae, da ordem das Arecales, possui mais de 240
gêneros e cerca de 2.600 espécies. São elementos importantes na composição do paisagismo
nacional, pois, juntamente com as árvores, arbustos, gramados e plantas rasteiras, são
satisfatoriamente utilizadas pelos paisagistas na formação de parques e jardins. São as plantas
mais características da flora tropical, podendo transmitir ao meio onde são cultivadas, algo do
aspecto luxuriante e do fascínio das regiões tropicais O mercado das palmeiras ornamentais
cresceram consideravelmente nos últimos anos, sendo cultivadas as mais diferentes espécies
por viveiristas e produtores (LORENZI et al., 2004).
3.1.10. Conde (Annona squamosa Linneu - Annonaceae)
A pinha, conde, ata ou fruta-do-conde, pertence à família das Anonáceas e
possivelmente originária da ilha de Trindad, nas Antilhas. Essa família compreende mais 120
gêneros e 2.000 espécies, sendo o gênero Annona sp. um dos mais importantes, com
aproximadamente 90 espécies, das quais se destacam: pinha (A. squamosa L.), cherimóia (A.
cherimoia Mill.), graviola (A. muricata L.), condessa (A. reticularta L.), araticum-do-campo
(A. dioca) e a atemóia (híbrido de A. cherimoia Mill. com A. squamosa L.). Vegeta melhor em
clima quente, com poucas chuvas e estação seca bem definida, como ocorre no Nordeste. A
fruta-do-conde começa a produzir três anos após o plantio. O período de colheita vai de
fevereiro a junho, podendo estender-se um pouco mais em culturas irrigadas. A produção
varia de 150 a 200 frutos por pé/ano, sendo consumidos ao natural (LOPEZ, 2005).
3.1.11. Dracena (Dracena fragans Linneu - Liliaceae)
A dracena, coqueiro-de-vênus ou pau-d’agua é uma planta oriunda da África é
amplamente cultivada no mundo. Possui porte arbustivo, podendo alcançar de 3 a 6 metros.
Apresenta tronco colunar e geralmente nu, com rosetas de folhas ornamentais coriáceas,
lanceoladas e arqueadas em seu ápice (LORENZI & SOUZA, 1995).
3.1.12. Falso massambará (Sorghum arundinaceum Linneu- Poaceae)
O gênero Sorghum apresenta duas espécies representativas S. arundinaceum e S.
halepense. No Brasil a distribuição ainda está restrita em algumas regiões, mas nos países
onde mais ocorrem causam grandes prejuízos. Com o avanço de cultura tem se deparado com
infestações onde estas espécies predominam. O capim-falso-massambará é uma planta anual,
herbácea, cespitosa, ereta com inflorescências grandes do tipo panícula aberta do tipo
pendente com 40 a 60 cm de comprimento e coloração marrom-avermelhada quando maduras
(LORENZI, 1991). O capim-massambará é muito similar, mas é uma planta perene e
entouceirada que apresenta inflorescência menor (15 a 30 cm). Além disso, apresenta rizomas
subterrâneos que auxiliam no seu alastramento (LORENZI, 1991).
3.1.13. Goiaba (Psidium guajava Linneu - Myrtaceae)
De origem asiática ou americana a goiabeira é um assunto muito discutido. Durante o
período entre 1514-1557, o cronista espanhol Oviedo escreveu “as goiabeiras”, utilizando o
nome de “guayabo” e fazendo considerações sobre o seu comportamento vegetativo em
algumas regiões das Índias (RUEHLE, 1964, KOLLER 1979) refere-se à goiabeira como
sendo originárias de regiões de clima tropical “Américas”. A goiabeira é a espécie mais
importante do gênero Psidium sp., onde estão agrupadas mais de 150 espécies, sendo todas
consideradas plantas nativas da América, com espécies produtoras de frutos com grande
número de sementes. Os frutos da goiabeira são bagas de tamanho, forma e coloração da
polpa variável, em função da variedade (KOLLER, 1979)
No Brasil, um dos maiores produtores mundiais de goiaba, destaca-se a produção
paulista com 60% da produção nacional, com mais de um milhão de pés de goiaba que
ocupam 2,7 mil hectares, produzindo 51 mil toneladas ano e empregando 3812 pessoas. Os
principais municípios produtores são Mirandópolis (32%) e Valinhos (16%). Maior produtor e
consumidor, o Estado de São Paulo é o centro de origem (95%) e destino (77%) das 4,3 mil
toneladas de goiaba recebidas anualmente pela CEAGESP (IRRIGAR, 2009).
3.1.14. Iuca (Yucca elephantipes Regel - Agavaceae)
A família é constituída de mais de 18 gêneros, distribuída em regiões tropicais e
subtropicais de todo o mundo, especialmente nas regiões áridas. É originário do México e
Guatemala. Faz parte da ordem Asparales, da classe Liliopsida (LORENZI et al., 2001). São
plantas herbáceas ou lenhosas, possuem folhas carnosas. Em geral, grande e longa,
paralelinérvea, muitas vezes nota-se a presença de fibras. As flores são pequenas em geral
reunidas em grandes inflorescências brancas muito utilizadas em arranjos e na arborização
urbana é uma planta tolerante a solo árido. Tem folhas verde-brilhante, rígidas, eretas ou
curvadas, e possuem até 2 m de comprimento (JOLY, 2002).
3.1.15. Mamão (Carica papaia Linneu - Caricaceae)
O mamão pertence à família Caricaceae, é a espécie mais cultivado em todo o mundo,
tendo sido descoberto pelos espanhóis no Panamá. É uma planta herbácea, tropical, com
origem proveniente da América do Sul. O mamão é uma fonte importante de papaína, enzima
proteolítica de ação semelhante à da pepsina, usados na indústria têxtil, farmacêuticas de
alimentos e de cosméticos (DANTAS, 2002).
O Brasil possui cerca de 22.820 ha cultivados com mamoeiro, destaca-se por ser o
maior produtor de mamão, 29 % da oferta mundial sendo o Estado do Espírito Santo um dos
seus principais produtores (SEAGRI, 2002). O Brasil exporta menos de 1 % de sua produção,
que correspondeu a 11 % do comércio internacional de mamão, em 1999 (FAO, 2000). Um
dos fatores limitantes à exportação de mamão são as doenças pós-colheita, principalmente a
antracnose causada por Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) e a podridão peduncular,
causada por diversos outros fungos (ALVAREZ & NISHIJIMA, 1987).
3.1.16. Mandioca (Manihot esculenta - Euphorbiaceae)
A antracnose da mandioca ocorre em vários países produtores. No Brasil, a doença
esta presente em todas as regiões produtoras, porém é mais severa no Nordeste e no Sudeste,
onde as condições ambientais são mais favoráveis à sua ocorrência (Embrapa 2010).
Originária da América do Sul, a mandioca constitui um dos principais alimentos
energéticos para cerca de 500 milhões de pessoas, sobretudo nos países em desenvolvimento,
onde é cultivada em pequenas áreas com baixo nível tecnológico. Mais de 80 países produzem
mandioca, sendo que o Brasil participa com mais de 15% da produção mundial (Embrapa
2010).
De fácil adaptação, a mandioca é cultivada em todos os Estados brasileiros, situando-
se entre os nove primeiros produtos agrícolas do País, em termos de área cultivada, e o sexto
em valor de produção (Embrapa 2010).
3.1.17. Manga (Mangifera indica Linneu - Anacardiaceae)
A cultura da manga foi introduzida no Brasil durante o século XVI e logo em seguida
disseminou-se por todas as regiões do país. No nordeste brasileiro a fruteira encontrou as
melhores condições para o seu desenvolvimento atingindo altas produtividades e frutos com
alta qualidade. A manga é hoje a principal fruta exportada para países europeus e os Estados
Unidos, que são os maiores consumidores, mas na sua grande maioria a manga é absorvida
pelo mercado interno que não possui muitas exigências de qualidade e variedade, tão
rigorosas como o consumidor europeu e americano, que exige frutos com alta qualidade
fitossanitária e isento de resíduos químicos (GENÚ e PINTO, 2002).
3.1.18. Mangaba (Hancornia speciosa Gomes - Apocynaceae)
É nativa dos tabuleiros costeiros, baixada litorânea e cerrados do Brasil, constitui-se
em uma das mais importantes matérias primas para a indústria de sucos e sorvetes do
Nordeste e está entre as dez espécies selecionadas como de altíssima prioridade pelo
programa Plantas do Futuro do CNPq/World Bank/GEF/MMA/Probio, com maior potencial
de uso imediato entre as fruteiras nativas da região Nordeste (FERREIRA et al., 2005). A
mangabeira é agrupada botanicamente nos táxons, segundo classificação de Cronquist (1988),
citado por Silva Junior & Lêdo (2006): Reino Platae, Divisão Magnoliophyta, Classe
Magnoliopsida, Subclasse Asteridae, Ordem Gentianales, Família Apocynaceae e Gênero
Hancornia sp.
O gênero Hancornia sp. é considerado monotípico e, assim, constituído de sua única
espécie é H. speciosa Gomes (SILVA JUNIOR & LÊDO 2006). A mangabeira é uma árvore
de porte médio, com 2 a 10 m de altura, podendo chegar até 15 m, e copa ampla, às vezes
mais espalhada que alta (LEDERMAN et al., 2000), sendo que as mangabeiras do Cerrado
possuem de 4 a6 m de altura e de diâmetro da copa (SILVA et al., 2001).
É uma planta originária Brasil e encontrada em várias regiões. Apresenta frutos
aromáticos, saborosos e nutritivos, com ampla aceitação de mercado, tanto para o consumo in
natura, quanto para a indústria. Apesar disso, pelo fato da cultura ainda continuar sendo
mantida no habitat natural, sua exploração é feita de modo extrativista. As áreas em que se
prática o cultivo tecnificado, são quase inexistentes. Os maiores produtores da fruta são os
Estados de Sergipe, Minas Gerais e Bahia, com produções respectivas de 524, 478 e 170
toneladas de mangaba no ano de 2000 (SOUSA et al., 2005).
3. 1.19. Negramina (Siparuna guianensis Aublet - Siparunaceae)
Apesar da Siparuna sp. ser reconhecida por muitos taxonomistas como pertencente a
família Monimiaceae e citada sob essa classificação em inúmeros artigos, o sistema APG II
(Grupo para a Filogenia das Angiospermas), de 2003, segregou o gênero Siparuna sp.,
reconhecendo-o como sendo da família Siparunaceae, o que será também adotado nesta
revisão. Siparunaceae consiste em dois gêneros, Glossocalyx sp., uma espécie da África
Ocidental, e Siparuna sp., com aproximadamente 65 espécies nos neotrópicos, a maior parte
nos Andes (RENNER,1997). A única espécie de Glossocalyx sp., reconhecida é uma arvoreta,
que geralmente não ultrapassa 12 metros de altura. O gênero Siparuna sp. compreende
espécies de arbustos e arvoretas, exceto para 15 espécies que são árvores de 20 a 40 metros de
altura, com troncos com diâmetros maiores que 120 cm, que ocorrem geralmente na
Amazônia (RENNER & HAUSNER, 2005).
O gênero Siparuna sp. ocorre na maioria dos tipos de vegetação neotropical em
elevações entre o nível do mar e 3800 metros (RENNER & HAUSNER, 2005). Comparando
a escassa presença no Velho Mundo Tropical (uma espécie), Siparunaceae tem se
diversificado de forma impressionante nos Andes (45 espécies). Baseado nesta atual
distribuição, Siparunaceae poderá ser uma grande família ocidental. As espécies
filogeneticamente basais desta família ocorrem em todas as áreas da planície Amazônica e nas
áreas protegidas das Guianas, sugerindo que este grupo inicialmente diversificou depois da
adaptação em grandes altitudes, como nas elevações dos Andes.
3.1.20. Soja (Glycine max Linneu - Fabacaeae)
A cultura da soja é originária da Ásia, mais precisamente da China e, somente no
século passado, iniciou-se o seu cultivo na América Latina. Um dos principais produtos
agrícolas nacionais ocupa lugar de destaque no país, gerando importante fonte de divisas (ITO
& TANAKA, 1993). Nas últimas cinco décadas, a soja tem apresentado uma taxa de
crescimento superior à taxa de crescimento populacional, ocupando papel fundamental na
alimentação humana e animal nos cinco continentes (CARRARO, 2003).
Segundo Black (2000), do total mundial de produção das sete oleaginosas: soja,
algodão, amendoim, girassol, colza, linho e palma, estimada em 280 milhões de toneladas, a
soja participa com cerca de 56 % ou seja, cerca de 157 milhões de toneladas, sendo a
leguminosa de maior expressão econômica do planeta, com teor de óleo compreendido entre
20 e 22 % e apresentando alto teor de proteína, de 40 a 42 % nas variedades difundidas,
características essas que levaram à formação de um complexo industrial destinado ao seu
processamento.
Nos últimos vinte anos foi surpreendente o desenvolvimento do complexo soja em
todo o planeta, a produção global, da ordem de 62 milhões de toneladas, no início da década
de 1980, atingiu o recorde de 196 milhões de toneladas na safra de 2002/2003. Esse aumento
de produção se deveu à elevada expansão da demanda nos principais países consumidores do
grão de soja e seus derivados. O consumo, no mesmo período, saltou de 68 milhões para 192
milhões de toneladas (AGRIANUAL, 2004). Acredita-se que no território brasileiro existam,
atualmente, cerca de 120 milhões de hectares cultiváveis, dos quais somente 50 milhões de
hectares são atualmente explorados. Assim, a produção poderá apresentar um crescimento de
69 % no período subsequente, atingindo o volume de 89 milhões de toneladas.
3.1. 21. Tomate (Lycopersicon esculentum Linneu - Solanaceae)
O tomateiro tem como centro de origem as ilhas Galápagos (DARWIN et al., 2003;
PERALTA et al., 2005), Chile, Peru, Bolívia, Equador e Colômbia (RICK & HOLLE, 1990;
ESQUINAS-ALCÁZAR & NUEZ, 1995; FONTES & SILVA, 2002). Este gênero abrange 13
espécies que podem ser agrupadas em dois complexos de acordo com a presença de barreiras
de cruzamento com a espécie cultivada S. lycopersicum: o complexo Esculentum e o
complexo Peruvianum (PERALTA et al., 2005). O cultivo do tomateiro foi introduzido em
quase todos os países (FONTES & SILVA, 2002) e em poucos anos a tomaticultura espalhou-
se em todos os continentes. A cultura apresenta grande importância econômica no país pelo
volume e valor da produção.
Atualmente, o Brasil ocupa a nona posição no ‘ranking’ mundial, com produção de 3,4
milhões de toneladas, sendo a região Sudeste a maior produtora, responsável por 43% do total
produzido (CNPH, 2011). O cultivo do tomateiro em quase todas as regiões brasileiras e
praticamente o ano todo propicia condições favoráveis ao desenvolvimento de pragas e
patógenos, tanto em lavouras destinadas ao consumo in natura como para indústria (SOUZA
& REIS, 2003).
3.1.22. Uva (Vitis vinifera Linneu - Vitaceae)
A videira, vinha ou parreira tem sua origem no Oriente, no árido Cáucaso. É uma das
frutas mais antigas e mais cultivadas no mundo com uma produção que se espalha desde a
antiguidade. Mas só a partir do descobrimento da poda em 600 a.C é que o cultivo obteve-se
melhores frutos. No Brasil o cultivo predomina desde 1532, introduzido por Martim Afonso
de Souza, onde se registram o transporte de bacelos das videiras portuguesas para o Brasil,
sendo os estados da Bahia e Pernambuco os pioneiros (TODA FRUTA, 2007).
No Estado de Goiás a produção de uva está se iniciando, mas já podemos destacar
produções com sucesso. Em Goiás a cultura esta restrita a vinhedos no sul (Goiatuba), no
sudoeste (Santa Helena) e centro do Estado (Anápolis e Hidrolândia). A produção
predominante é a de uva de mesa, destinada ao consumo in natura. A produção goiana pode
reforçar o abastecimento do mercado interno de uva de mesa que está em expansão. Nos
últimos dez anos, quase dobrou. Saltou de cerca de 300 mil toneladas ao ano pra 580 mil
toneladas. O consumo da fruta in natura passou de 2,79 quilos por pessoa em 1993 para 3,42
quilos por pessoa em 2002. Além dessa demanda, o país exporta 20,5 mil toneladas de uva de
mesa (VAZ, 2008).
3.2. A doença – Antracnose
A antracnose é uma doença causada por fungos pertencentes principalmente ao gênero
Colletotrichum. Contudo existem registros em Kimati et al.,( 2005), são doenças de grande
importância para muitas plantas cultivadas. Parmagnani (2004) relata que esta doença pode
ser considerada comum, de ocorrência generalizada no Brasil, especialmente quando o
período de cultivo coincide com chuvas e a incidência de clima quente e úmido. O fungo é
disseminado pela água de chuva e vento, e pode ser transmitido por sementes, sobrevivendo
ainda em restos de cultura.
O patógeno pode afetar toda a parte aérea da planta, porém, sua ação mais importante
se dá nos frutos. Em um ataque severo, até 100 % dos frutos podem ser afetados, ocasionando
perda total para o produtor. As hastes afetadas têm lesões escuras em forma de estrias, e as
folhas manchas necróticas, secas, irregulares e de coloração parda. Nos frutos, onde as lesões
são mais típicas, essas são deprimidas, circulares, de bordos elevados e de diferentes
tamanhos (VIANA et al., 2007). A antracnose é responsável também por antracnose pós-
colheita, a infecção que ocorre no campo dificilmente é detectada até a colheita, pois os
sintomas da doença normalmente surgem durante ou após o transporte dos frutos para os
mercados consumidores (TATAGIBA et al., 2002). A sobrevivência e a atividade da maioria
dos fungos fitopatogênicos depende das condições predominantes de temperatura e umidade
ou da presença de água em seu meio ambiente (MICHEREFF, 1997).
Dentre as espécies deste gênero, C. gloeosporioides é considerada a mais disseminada,
heterogênea e importante, principalmente nos trópicos. Seus conídios são hialinos e
unicelulares produzidos no interior de acérvulos subepidérmicos dispostos em círculos
(REZENDE et al., 2005), geralmente formados em conjuntos de coloração salmão, retos e
cilíndricos, com ápices obtusos e bases às vezes truncadas, medindo 12-17 x 3,5-6 µm. Os
apressórios formados por esta espécie são clavados, ovóides, obovados ou lobados, de
coloração castanha e medindo 6-20 x 4-12 µm. Forma colônias variáveis, de coloração
branco-gelo a cinza escuro e micélios aéreos geralmente uniformes–aveludado ou repleto de
conidiomas (SUTTON, 1992).
O gênero Colletotrichum engloba os fungos imperfeitos pertencentes à ordem
Melanconiales da classe Coelomycetes, os quais apresentam uma associação teleomófica com
estirpes homotálicas ou heterotálicas de ascomicetos do gênero Glomerella (SKIPP et al.,
1995). As espécies de Colletotrichum apresentam uma ampla distribuição geográfica,
particularmente em ambientes quentes e úmidos dos trópicos (JEFFRIES et al., 1990;
WALLER, 1992) e são extremamente diversas, incluindo saprófitas e fitopatógenos. Os
patógenos ocorrem em diversas espécies de hospedeiros, desde culturas agrícolas e plantas
medicinais, aos arbustos e árvores silvestres, causando podridões de colmos, caules e frutos,
seca de ponteiros, manchas foliares, infecções latentes e antracnoses. O último termo descreve
doenças caracterizadas por lesões necróticas profundas e delimitadas nos tecidos
(AINSWORTH, 1971).
A antracnose (Colletotrichum gloeosporioides Penz.) ou podridão-negra-dos-frutos é
considerada a moléstia mais importante da fruteira do conde, chegando a provocar até 70 %
de perdas de frutos quando as chuvas são prolongadas durante a floração e a formação de
frutos. Ocorrem em todos os países que cultivam anonáceas. Incide, preferencialmente nos
tecidos jovens de folhas, ramos, folhas e frutos. Na folhagem, produz lesões irregulares no
limbo ou nas nervuras, sendo inicialmente pardo-escuras e, depois, esbranquiçadas no centro e
cercadas de pontuações pretas e salientes. As folhas atacadas podem cair. Em frutos maduros
observam-se pontos escuros que coalescem. O resultado é uma podridão de rápida (LOPEZ,
2005). Além do Brasil, houve relatos do Colletotrichum gloeosporioides no fruto-do-conde,
na China, Cuba, EUA, Índia, Porto Rico e nas Ilhas Virgens (FARR e ROSSMAN, 2010).
A doença é causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides Penz. que na forma
perfeita ou teleomorfa, corresponde ao fungo Glomerella cingulata (ston.) Spauld e Scherenk.
Esse fungo sobrevive de um período ambiental favorável para outro em ramos secos, lesões
antigas, frutos e partes afetados remanescentes no chão ou na planta, sobre os quais esporula
quando há calor e umidade. A disseminação é feita principalmente pelo vento e por respingos
de chuva. A umidade é o principal fator determinante da gravidade da doença. Longos
períodos de chuva e de dias nublados, bem como o orvalho noturno intenso são condições
favoráveis ao desenvolvimento da doença. Alta umidade, aliada a temperaturas noturnas de 20
ºC a 24 ºC, adubações inadequadas da planta ou ataque de pragas, favorece a doença que se
encontra disseminada em todas as regiões produtoras de fruta-do-conde e de outras anonáceas.
(BERGAMIN FILHO et al., 1995).
A antracnose é considerada uma das mais graves doenças em frutos de goiabeiras,
causada pelo fungo Colletotrichum (Penz) (FRUPEX, 1996). O patógeno pode afetar folhas
em qualquer fase de desenvolvimento, ramos novos, flores e frutos. Os sintomas nas folhas e
frutos são geralmente áreas mais ou menos circulares e de coloração escura. Quando a
infecção se dá pelo botão floral, o fruto apresenta podridão, ocorrendo escurecimento a partir
do pedúnculo em parte ou em toda a fruta. Nos frutos com ataque precoce, na fase inicial,
aparecem manchas circulares, secas, elevadas. Em ataques mais severos, as lesões são
deprimidas, encharcadas, de coloração marrom, principalmente em locais danificados por
insetos, podem coalescer resultando em uma grande mancha de formato irregular. A área
atacada não acompanha o crescimento do fruto e se rompe. A infecção não penetra na polpa,
mas inutiliza os frutos para o mercado de consumo. No caso de infecção severa, os frutos
tornam-se mumificados e pretos. A penetração do fungo se dá por meio de ferimentos
causados por insetos, lesões durante o manuseio e pela cavidade floral. Pela superfície intacta
do fruto, ocorre a penetração direta pela prévia formação de apressórios (JUNQUEIRA,
2000).
Dentre as doenças que ataca a cultura da mandioca, podemos citar a antracnose. Ainda
não se teve registro de danos econômicos, porém está presente em todos os Estados
produtores do Brasil, e é mais severa no Nordeste e no Sudeste, onde as condições ambientais
são mais favoráveis à sua ocorrência (MASSOLA et al., 2005).
A antracnose é uma das doenças mais sérias do mamoeiro e não só ataca os frutos
como também causa amarelecimento e danos aos pecíolos das folhas. Ainda que os frutos
colhidos não apresentem sintomas da doença, ela se manifesta na fase de embalagem,
transporte, amadurecimento e comercialização (OLIVEIRA et al., 2000).
O mamão se caracteriza por uma série de doenças ou podridões que surgem após a
colheita, devido a sua pouca resistência e por ser desprovido de uma casca em maior
resistência barreira natural à penetração de fungos e bactérias (GAYET et al., 1995).
Em geral, os agentes causadores de podridões em pós-colheita apresentam uma
característica comum, que é a capacidade de se estabelecerem no fruto imaturo e
permanecerem em estado latente, sem o aparecimento de sintomas, até que haja condições
para que o processo de infecção tenha lugar (NERY-SILVA, 2001). Na cultura da manga, no
Brasil, já foram descritas 56 patógenos associados à cultura (CENARGEN, 2010),
provocando danos ao seu desenvolvimento e rendimento potencial, o que nos traz a
necessidade de um controle eficiente dos patógenos na cultura, diminuindo as injúrias
provocadas pelos mesmos.
As doenças mais importantes da cultura da manga são devidas só ataque de fungos e
bactérias, não sendo conhecidas doenças causadas por vírus e similares ou por nematóides. As
flores e os frutos são órgãos mais prejudicados pelas doenças, destacando-se a antracnose, a
seca-da-mangueira, a morte-descendente, a mancha-angular e os distúrbios fisiogênicos,
embonecamento ou malformação e colapso interno. Essas doenças, além de reduzirem a
quantidade de frutos produzidos, interferem a quantidade de frutos produzidos, interferem na
sua qualidade onerando, sobremaneira, os custos de produção, principalmente, para a
obtenção de frutos destinados á exportação (SINGH, 1978).
A antracnose causa perdas consideráveis em panículas florais, diminuindo a produção
de frutos. Nestes, os sintomas podem aparecer em qualquer estádio, porém as maiores perdas
se verificam em condições ambientais favoráveis ao patógeno durante o período de
amadurecimento do fruto, com reflexos posteriores durante o armazenamento e transporte.
Nos frutos jovens, causa podridões e abscisão (SINGH, 1978). Além de reduzir a
produtividade e desqualificar comercialmente os frutos, a antracnose provoca ferimentos ou
lesões nos frutos que beneficiam a infestação de fungos oportunistas e insetos (pragas), os
quais podem provocar rapidamente a morte da planta ou parte desta que foi afetada (CUNHA
et al., 2000).
No Brasil, em torno de 40 doenças causadas por fungos, bactérias, nematóides e vírus
já foram relatadas (identificadas). Esse número tende a aumentar devido à expansão da soja
para novas áreas de cultivo e também como consequência da monocultura. Atualmente as
doenças mais comuns são: ferrugem asiática, oídio, mofo branco, doenças de final de ciclo,
podridão negra da raiz (ou podridão de carvão), podridão de fitóftora, mancha alvo e
antracnose (HENNING, 2009).
3.3. Gênero Colletotrichum
A história da taxonomia de Colletotrichum spp. envolve vários outros gêneros a qual
tem sido descritos como deuteromicetos tal como 11 sinonímias genéricas descritas. Alguns
desses são sinônimos taxonômicos e outros sinônimos nomenclaturais. A evolução dos
diferentes sistemas de classificação para identificação das espécies em 200 anos tem sido
modificado devido trocas de conceitos de espécies, agregando elementos que ressaltam a
importância dos diferentes aspectos da morfologia dos fungos, combinados com os avanços
dos conhecimentos da interação patógeno-hospedeiro e círculo de hospedeiros (SUTTON et
al., 1992).
O fungo Colletotrichum spp. e seu teleomorfo Glomerella spp. tem sido apresentado
no mundo especialmente causando doenças pós-colheita nos trópicos, no entanto, pode ser
encontrado causando tombamentos e manchas foliares. Com sua infecção pode causar
infecções locais latentes ou quiescentes representando o mais importante patógeno pós-
colheita. O conceito de espécie é baseado na morfologia do fungo, no substrato natural,
cultivo em meio de cultura e especificidade no seu hospedeiro (SUTTON et al., 1992).
O teleomorfo de Colletotrichum é um coelomiceto que engloba muitas espécies
causadoras de doenças em possui uma ampla e extensiva gama de hospedeiros (BAILEY &
JEGER, 1992).
Fungos do gênero Colletotrichum são tidos como modelos para processos de
infecções, sendo o gênero patogênico mais estudado (BAILEY & JEGER, 1992).
Estes patógenos desenvolvem uma série de estruturas de infecção especializadas,
incluindo tubos germinativos, apressórios, haustórios, hifas intracelulares necrotróficas
secundárias e acérvulos (SUTTON, 1980).
Trata de um fungo mitospórico sensu Kirk et al., (2001), pertencente ao grupo dos
Coelomicetos muito estudado por Sutton (1980) e Nag Raj (1993) que apresenta micélio bem
desenvolvido, septado e ramificado (AGRIOS, 2005).
O processo de infecção no gênero Colletotrichum é composto por uma sequência
comum de eventos: adesão do conídio, germinação, elongação do tubo germinativo, formação
do apressório, desenvolvimento de peg de infecção, penetração de células epidérmicas,
crescimento das hifas intracelularmente, necrose celular e desenvolvimento de lesões
(JEFFRIES et al., 1990 apud PEREIRA, 2009).
Este fungo é frequentemente relatado em diferentes espécies de plantas cultivadas em
todo o mundo causando doenças em plantas vivas e/ou de sobrevivendo em condições de
saprofitismo (LOPEZ, 2001). Representa um patógeno que causa destruição de órgãos de
reserva sendo expressa através de podridões moles, além de ocasionar manchas foliares. A
sintomatologia típica das podridões moles efetiva-se devido à produção de enzimas
pectolíticas e toxinas pelo patógeno, as quais promovem desorganização a nível celular
correspondente às lesões de aspecto encharcado que se desenvolvem com rapidez, além de
deprimidas apresentam massa cotonosa constituída de hifas e estruturas de frutificação
(BEDENDO, 1995).
O fungo Colletotrichum gloeosporioides é conhecido como um dos patógenos mais
importantes, pois infecta pelo menos 1000 espécies de plantas (PHOULIVONG et al., 2010).
A consequência da infecção por espécies de Colletotrichum é a podridão na pré e pós-colheita,
que limitam a produção, comercialização e exportação de frutas, hortaliças e culturas perenes,
incluindo diversas frutíferas de regiões tropicais e subtropicais (BAILEY e JEGER, 1992;
SREENIVASAPRASAD E TALHINHAS, 2005; HINDORF, 2000; HYDE et al., 2009a;
SERRA et al., 2008).
O número de espécies validas de Colletotrichum é variável sendo apontadas 11 por
von Arx (1957), 22 por Sutton (1980), cerca de 40 espécies por Sutton (1992), mais de 60 no
“Dictionary of Fungi” (KIRK et al., 2008), enquanto que há 706 espécies, variedades e
formae speciales deste fungo (INDEX FUNGORUN, 2011). Além disso, este fungo pertence
ao Reino Fungi, grupo dos Fungos Mitospóricos e sub-grupo dos Coelomicetos. Sua fase
teleomórfica pertencente ao gênero Glomerella sp., Reino Fungi, Divisão Ascomycota (KIRK
et al., 2001).
O gênero Colletotrichum é um dos mais importantes entre os fungos fitopatogênicos
do mundo, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais, envolve espécies que causam
doenças de expressão econômica em leguminosas, cereais, hortaliças e culturas perenes,
incluindo diversas frutíferas (SERRA et al., 2008). As espécies de Colletotrichum spp.
possuem como anamorfos Glomerella spp. (SUTTON, 1992; ARMSTRONG-CHO e
BANNIZA, 2006; PFENNING et al., 2007) e os nomes C. gloeosporioides e Glomerella
cingulata, bastante utilizados, para caracterização das espécies tipo dos gêneros de anamorfos
e teleomorfos. Entretanto o conceito de espécies aplicado para anamorfos e teleomorfos, nem
sempre coincide entre si, dificultando a identificação dos táxons (CANNON et al., 2000).
Para anamorfo e teleomorfo, a preferência é o uso de nomes mais antigos (SHENOY et al.,
2007; CROUS, 2009) e estes encontram-se listados no Index Fungorun (2011). Há
necessidade de esclarecimentos sobre a real taxonomia deste importante patógeno até o nível
de espécie. Cepas podem produzir teleomorfos (heterotálicas) com frequência diferenciada em
meios de culturas artificiais, ou seja, em condições artificiais desenvolvem-se como
homotálicas, dificultando a caracterização. Já alguns isolados parecem serem não tão
agressivos aos seus hospedeiros (GUERBER e CORRELL, 2001; ARMSTRONG-CHO e
BANNIZA, 2006).
Os conídios germinam de seis a nove horas após o contato inicial com o hospedeiro se
as condições forem favoráveis. Há formação do tubo germinativo, seguido do apressório, que
penetra mecanicamente pela cutícula e pela epiderme da planta. O aparecimento de sintomas
pode ser observado a partir do sexto dia após o início da infecção (KIMATI et al.,1997). Esses
fungos são os causadores de uma diversidade de doenças como antracnose, podridão de
pedúnculo e varicela (BAILEY & JEGER, 1992).
Espécies de Colletotrichum spp. são tradicionalmente diferenciadas com base em
caracteres morfológicos e culturais, que devem ser considerados simultaneamente nunca
isoladamente. Características tais como morfologia de conídios, presença de setas e do
teleomorfo, coloração de colônia, e taxa de crescimento têm sido usadas para diferenciar
espécies morfologicamente próximas (SILVA, 2004).
As dificuldades encontradas na identificação das espécies de Colletotrichum estão
relacionadas à grande diversidade fenotípica, influência de fatores ambientais na estabilidade
dos caracteres morfológicos e culturais, existência de formas intermediárias e falta de
padronização de condições culturais empregadas nos diferentes estudos (SUTTON, 1992;
FREEMAN et al., 1998; LOPEZ, 2001). A diferenciação entre espécies com base no círculo
de hospedeiros ou hospedeiro de origem também não é um critério confiável para espécies
como, por exemplo, C. gloeosporioides e C. acutatum que infectam diferentes hospedeiras
(FREEMAN et al., 1998; PERES et al., 2005). É frequente a ocorrência de mais de uma
espécie de Colletotrichum associada a uma mesma hospedeira e uma mesma espécie pode
atacar múltiplas hospedeiras (FREEMAN et al., 1998). O fungo Colletotrichum
gloeosporioides e C. acutatum causam, em geral, sintomas semelhantes como as podridões de
frutos em pós-colheita de morangueiro (PERES et al., 2002). O morangueiro (Fragaria x
ananassa Duch.), por exemplo, pode ser infectado por C. fragariae Brooks, C. acutatum e C.
gloeosporioides (GUNNEL & GUBLER, 1992). As três espécies causam antracnose, mas a
podridão do pedúnculo, inflorescências e frutos conhecida como "Flor Preta" é atribuída a C.
acutatum. Outras culturas como a amêndoa (Prunnus amygdalus L.) (FORSTER &
ADASKAVEG, 1999), maçã (Malus domestica Borkh.) (BERNSTEIN et al., 1995), abacate
(Persea americana Mill.) (JONHSTON & JONES, 1997), pêssego (Prunnus persica (L.)
Batsch.) (ADASKAVEG & HARTIN, 1997); citros (BROWN et al., 1996; GOES & KIMATI,
1997) e algumas solanáceas (TOZZE JR. et al., 2006) são infectadas por C. acutatum e C.
gloeosporioides.
Nutricionalmente carbono e nitrogênio exercem efeito nos processos fisiológicos de
fungos, principalmente aqueles relacionados ao crescimento, produção de conídios,
germinação e peso seco (COCHRANE, 1958) e permitem também, estabelecer diferenças
entre os isolados de Colletotrichum spp., pela sua habilidade em usar determinada fonte de
carbono e nitrogênio. A identificação de fungos por metodologia tradicional baseia-se na
morfologia celular, seguindo as informações supracitadas. No entanto, estes estudos às vezes
geram resultados ambíguos, por causa da variabilidade intrínseca ao isolado de uma espécie e
das características fisiológicas na condição de cultivo. Atualmente, os estudos da diversidade,
taxonomia e identificação de microrganismos estão sendo realizados com base nos
conhecimentos atuais da taxonomia polifásica, a qual integra diferentes dados e informações
de análises, fenotípicas, genotípicas e filogenéticas, para caracterizar o microrganismo em
teste (VALE, 2009).
O desenvolvimento dos novos métodos para estudo da diversidade de existente entre
isolados de Colletotrichum spp. (YANG et al., 2009; DAMM et al., 2009; PRIHASTUTI et
al., 2009). As técnicas moleculares de amplificação são utilizadas devido a sua maior precisão
em comparação com os métodos convencionais.
Além dos métodos tradicionais de caracterização, análise cultural e morfológica,
outros métodos vêm sendo empregados recentemente com maior frequência, entre eles a
patogenicidade, os grupos de compatibilidade vegetativa, a análise isoenzimática, e os
métodos moleculares, como RAPD e RFLP. Recentemente, observa-se a necessidade de
utilizar diferentes métodos de caracterização aliados aos métodos moleculares principalmente
devido a grande variabilidade genética encontrada dentro do gênero Colletotrichum
(MENEZES, 2002).
Técnicas moleculares tem sido utilizadas para diversos fungo, porém, na
particularidade para o gênero Colletotrichum, e as têm auxiliado grandemente na
demonstração da variabilidade inter e intraespecífica. As técnicas mais empregadas com essa
finalidade são o “Restriction Fragment Length Polymorphism” (RFLP) e “Random Amplified
Polymorfic DNA” (RAPD). Braithwaite et al. (1990), utilizaram a técnica de RFLP para
demostrar a divergência genética entre C.gloeosporioides tipos A e B, duas populações com
diferenças morfológicas, patogênicas e bioquímicas que ocorrem em Stylosanthes spp., na
Austrália. Utilizando essa técnica, esses autores revelaram que ambas as populações são
geneticamente homogêneas, porém distintas entre si. O fato de não ocorrerem nas fases
perfeitas de nenhuma dessas populações na Austrália, explica a uniformidade genética
intrapopulacional e descarta a possibilidade de especialização patogênica dessa espécie. Dessa
forma, os autores concluem que a existência de duas populações tão diferentes só pode ser
explicada por duas diferentes introduções do patógeno no pais.
A técnica de RAPD foi utilizada no Brasil, numa série de trabalhos, para caracterizar
isolados de C. lindemuthianum do feijoeiro (VILARINHOS et al., 1995; ALZATE-MARIN et
al., 1997; MESQUITA et al., 1998). Nesses trabalhos, foram utilizado diversos isolados do
fungo, numa tentativa de discriminar as diferentes raças por meio da técnica de RAPD.
Apesar dos resultados não terem permitido o mesmo agrupamento obtido como os testes de
inoculação da variabilidade patogênica de C. lindemuthianum. Além dessa espécie, o RAPD
já foi utilizado, com sucesso, para caracterizar a variabilidade de C. graminicola (GUTHRIE
et al., 1992; BROWNING et al., 1999), C. orbiculare (CORRELL et al., 1993) e C.
gloeosporioides (ALAHAKONN et al., 1994; HAYDEN et al., 1994; KELEMU et al., 1999).
A taxonomia e a filogenia do gênero Colletotrichum é confuso (Hyde et al., 2009; Cai
et al., 2009). Historicamente, antracnose encontrada em um substrato para o qual não há
registros de que a relação fungo/hospedeiro era interpretada como uma nova espécie
(CANNON et al., 2000). Esta prática foi posteriormente rejeitado (von ARX 1957; SUTTON,
1980; BAXTER et al., 1983), sendo as descrições para o gênero Colletotrichum apresentadas
por muitos autores em literaturas (SIVANESAN et al., 1993; NAKAMURA et al., 2006; LIU
et al., 2007).
Mais do que 706 táxons encontram-se listados no Índex Fungorun (Index Fungorum,
2011).
Baseado em um estudo morfológico, von Arx (1957) incluiu mais de 600 sinônimos
em C. gloeosporioides e 84 sinônimos em C. dematium. Sutton (1992) listou 39 espécies de
Colletotrichum. Nos últimos anos, ferramentas moleculares têm sido empregadas para inferir
a evolução relações das espécies de Colletotrichum. Baseado em nu-rDNA ITS dados de
sequência e morfológicas características, algumas espécies têm sido segregados do
Colletotrichum gloeosporioides complexas, como C.boninense Moriwaki, Toy. Sato &
Tsukib. (MORIWAKI et al., 2003). Embora a sua sequência de genes importantes do genoma
pode ajudar na identificação das espécies Colletotrichum, não pode ser usado sozinha por se
tratar adequadamente da delimitação das espécies estreitamente relacionadas (CROUCH et
al., 2009a).
Inúmeras sequencias foram estudadas em literaturas para distinguir espécies de
Colletotrichum spp. (DU et al, 2005; JOHNSTON et al, 1997; CROUCH et al., 2006,2009bc;
FARR et al, 2006; SHENOY et al., 2007ab; QUE et al, 2008ab; MORIWAKI e
TSUKIBOSHI, 2009; Crouch et al. 2006; 2009b).
A seguir serão apresentados alguns elementos morfológicos essenciais para a
identificação de espécies de Colletotrichum spp. identificadas nesse trabalho.
3.3.1. Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz e Sacc. (1884).
Esta espécie bastante polífaga e presente e muitas hospedeiras é considerado uma
espécie complexo devido apresentar imensa variabilidade genética dentre os isolados
analisados, contudo apresenta imensa variabilidade biológica e molecular.
Este táxon pertencente ao subgrupo dos coelomicetos apresenta como teleomorfo o
ascomiceto Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. e Von Schrenk (1903).
Em meio de cultura possui colônias variáveis, de coloração cinza claro a cinza escuro,
seu micélio é aéreo, formando aglomerações associadas ao acérvulo, no lado reverso da placa
também possui coloração branca acinzentada com a idade. As setas podem ou não estarem
presentes. Escleródios são ausentes. Apressórios clavados, sua forma pode apresentar-se como
ovados, obovados, algumas vezes lobados, de coloração marrom escura, apresenta dimensões
de 6-20 x 4-12 µm, seus conídios formados em massas de colorações salmão, possuem
formato reto, cilíndrico, ápice obtuso, base truncada, 12-17 x 3,5-6 µm. A produção de
conídios é bastante heterogênea em meio de cultura (SUTTON, 1992).
A variabilidade fisiológica de C. gloeosporioides é representada por 21 formae
specialis e variedades [C.gloeosporioides (C.g.) f.sp. alatae, C.g. f.sp. gloeosporioides, C.g.
f.sp. heveae, C.g. f.sp. melongenae, C.g. f.sp. nectrioides, C.g. f.sp. aeschynomenes, C.g. f.sp.
clidemiae, C.g. f.sp. cucurbitae, C.g. f.sp. cuscutae, C.g. f.sp. manihotis, C.g. f.sp. pilosae,
C.g. f.sp. uredinicola, C.g. var. aleritidis, C.g. var. cephalosporioides, C.g. var.
gloeosporioides, C.g. var. gomphrenae, C.g. var. hederae, C.g. var. minus, C.g. var. minus,
C.g. var. nectrioidea] registradas em literatura (INDEX FUNGORUM, 2011).
3.3.2 Colletotrichum capsici (H.Syd.) E. Butl. e Bisby (1931)
Possuem colônias densas, de coloração branca a cinza escuro, marrom reversos,
escleródios ausentes, setas abundantes, apressórios abundantes de formato clavado a ovado,
marginado, forma cadeia irregular, de 14 x 6,5-11,5 µm. Conídios formados em massas de
coloração salmão, de forma falcada, fusiforme, gradualmente afilada nas extremidades,
apresentam dimensões de 18-23 x 3,5-4 µm. Considerando o sinônimo de C. dematium por
von Arx. (1957) e mais tarde uma distinta espécie em Capsicum sp. Sutton (1980) distinguiu
P. capsici de C. dematium pela espessura do conídio e a patogenicidade em pimentão.
A variabilidade fisiológica de C. capsici é representada por duas formae specialis C.
capsici f. sp. capsici e C. capsici f.sp. Cyamopsidicola (INDEX FUNGORUM, 2011).
3.3.3 Colletotrichum musae (Berkeley & M.A. Curtis) Arx (1957)
Este patógeno produz acérvulos em frutos, caules, pecíolos e ocasionalmente folhas.
Produz lesoes esfericas ou alongadas de 400 µm de diâmetro, e nesta lesão pode apresentar
finas setas. Os conidióforos formados a partir de um pseudo-parenquima, são cilíndricos, e no
topo da célula conidiogênica podem apresentar um estreitamento, são hialinos, septados,
apresentam 30 µm de comprimento, 3-5 µm de largura, na sua porção terminal possui uma
abertura fialídica. O conídio é hialino, asseptado, de formato oval a elíptico ou cilíndrico,
muitas vezes achatado na base, seu ápice é obtuso, variavelmente gutulado, suas dimensões
são de 11-17 x 3-(4,5)-6 µm, os esporos são produzidos em massas de coloração marrom a
laranja. As colônias em meio de cultura batata-dextrose-ágar possuem coloração branca.
Cinza ou oliváceas com micélio aéreo flocoso. Os acérvulos podem ser marrons escuros ou
negros, abundantes distribuídos uniformemente, as setas raramente são formadas em meio de
cultura; os conídios também podem ser produzidos por fiálides produzidas pelo micélio
vegetativo; o apressório possui formato navicular a ovado, tornando-se ao final lobado,
marrom escuro, e apresenta de 6-12 µm de comprimento por 5-10 µm de largura.
Os principais hospedeiros deste patógeno são espécies de Musa spp. como M.
textilis, contudo foi registrada sua ocorrência em Malus pumila (maça), Mangifera
indica (manga), Persea americana (abacate), Psidium guajava (goiaba) and Vigna
sp. (através de nodulações).
Colônias muitas vezes com micélio branco abundante aéreo tornando-se cinza com a
idade, a canela, ocre, abundante massas de conídios, geralmente coalescentes ausentes. Cerdas
escleróticas ausentes, conídios reto, cilíndrico, com lóbulos grandes ou profundos, 9-13 x 9-
11,5 µm, muitas vezes tornando-se complexa. (SUTTON 1980).
Apresenta como bainômio Myxosporium musae Berk. & M.A. Curtis 1874, e
sinonímia Gloeosporium musarum Cooke & Massee 1887. Para este anamorfo
ainda não foi identificado em literatura a sua forma teleomórfica.
3.3.4 Colletotrichum falcatum (Berk. & Curt.) (1957)
Colônias acinzentadas com micélio aéreo esparsas e pequenas manchas densa, em
outros lugares reverter cinza branco, salmão massas de conídios (corrida leve) rosa algumas
culturas abundante micélio branco acinzentado aérea com esporulação pobres e não acérvulo
distintos (raça escura). Escleródios ausentes ambas as raças. Cerdas esparsas. Conídios
falciformes (mas não muito), fusiformes, ápices obtusos, 15,5 26.5 x 4-5 µm. esparsas
apressórios, clavado parda ou circular, borda inteira, 12,5-14.5 x 9.5-12 µm (SUTTON, 1980).
4. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Microbiologia. Os isolados foram
obtidos folhas e frutos com sintomas de diversos locais. Os hospedeiros analisados foram:
(Persea americana) abacate (Urutaí-GO), (Morus nigra) amora (Urutaí-GO), (Anthurium
andraeanum) antúrio (Ipameri-GO), (Polycias frusticosa) árvore da fortuna (Urutaí-GO),
(Musa paradisiaca ) banana (Brasília-DF), (Musa paradisiaca) banana (folha) (Brasília-DF),
(Saccharum officinalis) cana (Urutaí-GO), (Diospyros kaki) caqui (Urutaí-GO), (Sorghum
arundinaceum) cevadilha (falso massambará) (Urutaí-GO), (Sechium edule) chuchu (Brasília-
DF), (Cocos nucifera) coco (Urutaí-GO), (Annona coriacea) conde (Urutaí-GO), (Dracena
fragans) dracena (Urutaí-GO), (Psidium guajava) goiaba (Brasília-DF), (Psidium guajava)
goiaba(folha) (Brasília-DF), (Yucca elephantipes) iuca (Brasília-DF), (Carica papaia) mamão
(Brasília-DF), (Manihot esculenta) mandioca (folha) (Urutaí-GO), (Anacardium mangiferae)
manga (Brasília-DF), (Hancornia speciosa) mangaba (Goiânia-GO), (Sipurana guianensis)
negramina (Urutaí-GO), (Glycine max) soja (Urutaí-GO), (Solanum lycopersicum) tomate
(Urutaí-GO), (Vitis vinifera) uva (Brasília-DF) (Tabela 1).
Tabela 1. Informações dos hospedeiros por onde os isolados foram obtidos considerando o nome científico, família botânica e local de coleta.
Nome científico Família botânica Local de coleta1 Abacate Persea americana Lauraceae Urutaí/GO2 Amora Morus nigra Moraceae Urutaí/GO3 Antúrio Anthurium andraeanum Araceae Ipameri/GO4 Árvore da Fortuna Polycias frusticosa Araliaceae Urutaí/GO5 Banana Musa paradisiaca Musaceae Brasília/DF6 Banana (folha) Musa paradisiaca Musaceae Brasília/DF7 Cana Saccharum officinalis Poaceae Urutaí/GO8 Caqui Diospyros kaki Ebenaceae Urutaí/GO9 Chuchu Sechium edule Cucurbitaceae Brasília/DF
10 Coco Cocos nucifera Arecaceae Urutaí/GO11 Conde Annona coriacea Annonaceae Urutaí/GO12 Dracena Dracena fragans Liliaceae Urutaí/GO13 Falso Massambará Sorghum arundinaceum Poaceae Urutaí/GO14 Goiaba Psidium guajava Myrtaceae Brasília/DF15 Goiaba (folha) Psidium guajava Myrtaceae Brasília/DF16 Iuca Yucca elephantipes Agavaceae Brasília/DF17 Mamão Carica papaia Caricaceae Brasília/DF18 Mandioca Manihot esculenta Euphorbiaceae Urutaí/GO19 Manga Anacardium mangiferae Anacardiaceae Brasília/DF20 Mangaba Hancornia speciosa Apocynaceae Goiânia/Go21 Negramina Sipurana guianensis Siparunaceae Urutaí/GO22 Soja Glycine max Fabacaeae Urutaí/GO23 Tomate Solanum lycopersicum Solanaceae Urutaí/GO24 Uva Vitis vinifera Vitaceae Brasília/DF
Hospedeiro
4.1. Caracterização morfocultural e morfologia de estruturas reprodutivas.
Fragmentos de tecidos foram retirados das regiões marginais, desinfestados
superficialmente em solução de hipoclorito de sódio [1%] e, em seguida, lavados com água
destilada e esterilizada. Os fragmentos foram depositados em meio de cultura ágar-água (AA)
e, incubados à temperatura ambiente por dois dias. As colônias que se desenvolveram a partir
dos tecidos lesionados foram transferidas para novas placas de Petri contendo meio BDA, e
incubadas em uma câmara com temperatura a 25°C por sete dias. A multiplicação do inóculo
foi feita por repicagem de fragmentos de micélio (cultura monospórica) que se encontravam
em placas de Petri em meio BDA (batata-dextrose-ágar) e transferidas para novas placas.
Logo após, discos de meio de cultura de aproximadamente 10 mm contendo fragmentos
miceliais, foram acondicionados em câmara de incubação sob temperatura de 25°C por sete
dias. O experimento foi constituído de 24 tratamentos, três repetições, totalizando 72 unidades
experimentais.
A avaliação do crescimento das colônias foi determinada medindo-se os dois diâmetros
ortogonais da colônia, com auxilio de uma régua. Fez-se a média destas leituras, as medidas
foram realizadas a partir do segundo dia de crescimento, sendo avaliada com intervalos de 24
horas, totalizando sete avaliações.
Discos de micélios de aproximadamente 10 mm foram transferidos para outra placa de
Petri contendo BDA. As placas foram mantidas à temperatura de 25°C. Após sete dias foram
realizadas observações do tipo de micélio (cotonoso, rosáceo e crisantêmico), altura do
micélio (elevado, intermediário e raso), coloração das colônias no verso e reverso da placa
(acinzentado, branca, creme, salmão e vermelho), presença de esporulação, foram borda do
micélio (irregular ou lisa) (Tabela 2).
Os conídios foram submetidos ao teste de germinação para indução de formação de
apressórios e preparo de laminas semi-permanentes. Os conídios e apressórios (total de 50)
foram medidos em microscópio ótico.
4.2.Caracterização biológica (Teste de patogenicidade cruzada)
Utilizou-se o método da folha destacada no teste de patogenicidade. Depositou-se
frutos e folhas sadios de seus respectivos hospedeiros (Tabela 1), assepticamente
desinfestados com álcool (70%), por dois minutos e depois em hipoclorito de sódio, 1%,
durante dois minutos, e então, lavados em água destilada (3 vezes).
Após a secagem, os frutos e folhas foram dispostos em potes de polietileno de baixa
densidade (PPEBD), previamente desinfestadas com as soluções anteriores. No fundo dos
respectivos potes, foram colocados papel mata-borrão umedecidos om água destilada, em
quantidade suficiente para manter o papel umedecido sem excesso.
Em cada embalagem, folhas ou estruturas vegetativas das hospedeiras de origem
foram adicionadas. Depositou-se um bloco de meio de cultura (10 mm2) contendo micélio dos
isolados nas áreas da folha com ferimento (CF) e sem ferimento (SF) com um perfurador
flambado com pontas. Após este procedimento os potes foram cobertos, identificados com
filme de polietileno para a formação de câmara úmida, por um período de sete a dez dias em
temperatura entre 25 a 30 ºC. A avaliação da infecção foi realizada com o aparecimento de
lesões formadas nas superfícies. O delineamento experimental utilizado foi o delineamento
inteiramente casualizado (DIC) constituído de 24 tratamentos e 24 repetições, totalizando 576
unidades experimentais (UE).
4. 3. Caracterização bioquímica
As fontes de carbono utilizadas neste estudo (dextrose, sacarose e sorbitol) foram
combinadas com três fontes de nitrogênio (asparagina, peptona e nitrato de potássio), na
proporção de 10:1 (10 g de C para 1 g de N). O meio basal para adição das combinações
carbono/nitrogênio foi composto de: 0,5 g de MgSO4.7H2O; 1,0 g de KH2PO4; 17 g de ágar,
q.s.p. 1.000 mL de água destilada (LILLY & BARNETT, 1951), sendo o pH ajustado para 5,5.
Após a autoclavagem, os meios foram vertidos em placas de Petri, em volume aproximado de
20 mL/placa. Discos de micélio (10 mm2 de diâmetro) dos 24 isolados, oriundos de colônias
jovens (cinco dias de crescimento), foram transferidos para o centro das placas de Petri, e as
culturas foram incubadas em condições de claro contínuo e temperatura de 25 °C, durante sete
dias. A avaliação do crescimento micelial consistiu na determinação do diâmetro das colônias
de cada isolado usando-se a média de duas leituras efetuadas em dois sentidos diametralmente
opostos. O experimento foi constituído de nove (dextrose x asparagina, dextrose x peptona,
dextrose x nitrato de potássio, sacarose x asparagina, sacarose x peptona, sacarose x nitrato de
potássio, sorbitol x asparagina, sorbitol x peptona, sorbitol x nitrato de potássio)tratamentos
para cada isolado, duas repetições repetições, totalizando 432 unidades experimentais.
A determinação da esporulação foi realizada logo após a avaliação do crescimento
micelial, mediante o preparo de uma suspensão de conídios de cada placa de Petri, contendo
as diferentes combinações carbono/nitrogênio. Para o preparo da suspensão, foram
adicionados 20 mL de água destilada esterilizada em cada placa de Petri, para facilitar a
remoção dos conídios do micélio, foi utilizado uma lâmina de vidro, cuidadosamente passada
na superfície da colônia. O material removido foi filtrado em duas camadas de gaze, e a
concentração de conídios determinada em câmara de Neubauer, obtendo-se uma média de
duas leituras para cada repetição dos tratamentos.
Para a determinação do peso seco, os isolados serão cultivados individualmente
durante cinco dias em frascos de Erlenmeyer, sem agitação das culturas, contendo 50 mL de
cada combinação C/N, adicionados ao meio líquido basal. As condições de incubação serão as
mesmas anteriormente citadas. Ao final do período de incubação, as culturas serão filtradas
em gaze dupla, e a massa micelial coletada será depositada em caixas de papel alumínio, com
peso previamente determinado e isentas de umidade. As caixas serão colocadas em estufa a 50
°C, durante quatro dias e, ao final deste período, serão determinadas por diferença, o peso
seco da massa micelial de cada isolado, o qual será expresso em miligrama.
4.4. Seleção molecular de primers específicos para detecçao
Isolados de Colletotrichum spp.: Vinte e quatro isolados de Colletotrichum spp. foram
selecionados da coleção de fungos do laboratório Microbiologia do Instituto Federal Goiano
campus Urutaí. Dentre estes destacam-se os isolados tidos como “espécie-tipo” de
C.gloeosporioides, C. dematium e C. falcatum para comparação entre os isolados.
Crescimento dos isolados para extração de DNA: Discos de micélio (aproximadamente
nove mm) foram retirados da margem de culturas, aos sete dias de idade, sendo adicionados
em Erlemeyers contendo meio de cultura líquido de ervilha (100 g de ervilha, 1,5 g CaCO3 e 1
L água destilada), num volume de 100 mL por Erlemeyer com capacidade de 250 mL. Após
incubação por um período de 10 dias o micélio foi coletado, retirado assepticamente e
congelado a –70ºC para conservação e posterior extração de DNA.
Extração do DNA: Isolados de Colletotrichum spp. foram submetidos à extração de DNA
segundo protocolo CTAB + Solventes.
Identificou-se os tubos (EPPENDORF), com o número de acesso, sendo as espécies
estudadas Persea americana, Morus nigra, Anthurium andraeanum, Polyscias fructicosa,
Musa paradisiaca, Saccharum officinalis, Diospyros kaki, Sorghum arundinaceanum,
Sechium edule, Cocos nucifera, Annona coriacea, Dracena fragans, Psidium guajava, Yucca
elephantipes, Carica papaia, Manihot esculenta, Anacardium mangiferae, Hancornia
speciosa, Siparuna guianensis, Glycine max, Solanum lycopersicon e Vitis vinifera., cujo
número de acesso era 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,9, 10, 11,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24.
Deste modo, foram pesadas de cada amostra, aproximadamente 0,2 g a 0,5 g.
Em seguida foi feita a maceração da amostra utilizando-se pistilos (bastão) devidamente
autoclavados, assim, após a adição de Nitrogênio líquido, o material foi macerado.
Em seguida adicionou-se CTAB + β-mercaptaetanol, sendo este um agente redutor que
desnatura peroxidases e polifenoloxidases, impedindo a ação destas enzimas sobre ao DNA.
Após a adição do mesmo misturou-se para que ocorresse a homogeneidade.
Na sequência todas as amostras foram levadas para o banho-maria a 65 ºC por 30
minuto (agitando a cada 10 minutos as amostras manualmente até completar 30 minutos).
Após o banho-maria adicionou-se 600 µl de CIA (Clorofil-24-Clorofórmio para 1 álcool
isoamílico)
Agitou-se com auxílio do agitador, em seguida as amostras foram levadas para a
centrifuga á 12000 rpm por 10 minutos.
Extraiu-se o sobrenadante de cada amostra com o auxílio de pipetas de 1000 µL e em
seguida transferiu para um novo microtúbulo.
Adicionou aos tubos de sobrenadante a 400 µL de isopropanol para proporcionar o
aparecimento do pellet.
Deixou precipitar por pelo menos 1 hora no freezer.
Em seguida, foi centrifugado novamente todas as amostras por um período de 10 a 15
minutos a 12.000 rpm.
Lavou-se o pellet com 600 µL de etanol a 70 % e depois com o álcool 95 %.
Descartou-se o etanol, tendo sempre o cuidado para não descartar o pellet juntamente
com o etanol.
Deixou secar e depois ressuspendeu o pellet com água destilada ou MilliQ.
Reação de PCR: As reações de amplificação foram preparadas para um volume final de 552
µL, contendo, 2 µL de cada primer ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), ITS5 (5’-
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’), ACT 512F(ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC),
ACT 783R (TACGAGTCCTTCTGGCCCAT), CL1 (GARTWCAAGGAGGCCTTCTC),
CL2 (TTTTTGCATCATGAGAGTTTGAC), BT2b (ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC)
57,5 µL de tampão 10X; 18,4 µL de MgCl2; 46 µL de dNTP; 5,75 µL de Taq DNA
polimerase; 2 µL de DNA. A reação foi realizada utilizando um termociclador com o ciclo de
35 a 94 ºC 30 segundos, a 58 ºC por 30 segundos a 72 ºC a 1 minuto.
M 9 13 14 15 17 21 2424211715141310 1093311
Figura 1.Gel de agarose do DNA total de isolados de Colletotrichum spp. quantificados inicialmente.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1.Caracterização cultural e morfológica dos isolados
A maioria dos isolados identificados foram oriundos de plantas pertencentes a 20
famílias botânicas, demonstrando a imensa gama de hospedeiras e pouca especificidade
perante famílias botânicas ou grupos de hospedeiros. Jerger (1992) apontou também que o
gênero Colletotrichum sp. é polígafo e algumas espécies possuem variabilidades fisiológicas
(INDEX FUNGORUN, 2011).A maioria dos isolados foram coletados na região Centro-oeste
do Brasil, sendo principalmente coletados nos estados do Distrito Federal e Goiás (Tabela 1).
Os 24 isolados de Colletotrichum spp. cultivados em meio BDA, obtidos a partir dos
frutos e folhas de plantas com sintomas de antracnose, coletadas na região de Brasília-DF,
Ipameri-GO, Urutaí-GO, de acordo com as características observadas todos foram
identificados como sendo pertencentes ao gênero Colletotrichum e ainda a maioria dos
isolados pertencem a espécie-tipo Colletotrichum gloeosporioides sensu Sutton (1992).
Foi observado heterogeneidade na coloração da colônia variando de tons entre branco,
acinzentado, salmão, vermelho e creme com o reverso da placa variando entre as cores
salmão, branco, vermelho, creme e acinzentado (Figura 8 e Figura 9). Foi verificada
diferenciações entre as cores na frente e reverso das placas de Petri. Em relação à altura do
micélio foi classificado como micélio elevado e o tipo de micélio foi identificado como
micélio cotonoso, e sua borda variou entre irregular e lisa (Tabela 2). Apenas 17 % dos
isolados tiveram esporulação em procedimentos padrões de cultivo (meio de cultura BDA),
confirmando a dificuldade esporulativa de algumas cepas em condições de crescimento
artificial (Tabela 2).
A taxa de crescimento micelial entre os isolados apresentou uma amplitude de 2,9
mm.dia-1(isolado mangaba) a 8,4 mm.dia-1 (isolado chuchu), demonstrando maior e menor
atividade fisiológica, respectivamente, dos isolados em condições artificiais (Figura 8 e
Tabela 3). Os isolados tomate e abacate são fortes candidatos em programas de seleção de
plantas resistentes a antracnoses, devido ao fato de oferecer rápido crescimento e produção
micelial (Tabela 3), e ainda mais além e mais importante os isolados de banana, coco, mamão
e negramina, merecem destaque por produzirem em abundância conídios em condições
artificiais sendo importantes para processos de inoculação e estudos de resistência (Tabela 2).
Os isolados de mangaba (2,9 mm.dia-1 121,8) e abacate (11,6 mm.dia-1 271,6) que
apresentaram as maiores taxas de crescimento apresentaram os maiores valores de AACPCM,
representando que estes, em condições artificiais apresentaram maior atividade fisiológica
(Tabela 3 e Figura 2).
A partir do terceiro dia de incubação os isolados divergiram quanto à velocidade de
crescimento merecendo destaque o isolado oriundo de abacate, acompanhado pelo isolado de
chuchu, por apresentarem maiores crescimentos miceliais (Figura 1 e 2).
Ao primeiro (Figura 4A) e segundo (Figura 4B) dia os isolados não apresentaram
diferenças significativas do diâmetro da colônia. Somente a partir do terceiro dia (Figura 3A)
o isolado abacate diferiu numericamente dos demais isolados quanto ao diâmetro da colônia,
não igualando-se sua média ao demais isolado ao sexto dia (Figura 4B).
Houve uma diversidade da atividade fisiológica dos isolados provavelmente associada à
característica genéticas e de interação com o substrato para crescimento.
A diversidade da colônia pode ser observada pelos aspectos coloniais e diâmetro da
colônia podem ser observados na Figura. 8 e 9.
Tabela 2. Características morfo-culturais dos isolados de Colletotrichum spp., de acordo com seu hospedeiro de origem, presença de esporulação, cor do micélio na frente e verso da placa de Petri, forma do micélio, borda micelial e altura da colônia, observadas em meio BDA após 7 dias incubados a 25°C.
Hospedeiro Esporulação Cor do micelio frente cor do micelio reverso Forma micelio Borda AlturaAmora - salmão salmão cotonosa irregular elevadoAbacate - branco/azincentado azincentado cotonosa lisa elevadoAntúrio - salmão salmão cotonosa lisa elevado
Árvore da Fortuna - branca/salmão/claro salmão cotonosa lisa elevadoBanana + branco/salmão salmão cotonosa lisa elevado
Banana (folha) - branco/salmão salmão cotonosa irregular elevadoCana - branco/salmão salmão cotonosa lisa elevadoCaqui - branco branco cotonosa lisa elevado
Chuchu - vermelho vermelho cotonosa lisa elevadoConde - azincentado azincentado cotonosa lisa elevadoCoco + creme/salmão salmão cotonosa lisa elevado
Dracena - azincentado azincentado cotonosa irregular elevadoFalso Massambará - branco salmão cotonosa lisa elevado
Goiaba - branco creme cotonosa lisa elevadoGoiaba (folha) - branco/salmão salmão cotonosa lisa elevado
Iuca - branco/salmão salmão cotonosa lisa elevadoMamão + branco/salmão salmão cotonosa lisa elevado
Mandioca - branco/salmão salmão cotonosa irregular elevadoManga - creme salmão cotonosa lisa elevado
Mangaba - branco creme cotonosa irregular elevadoNegramina + branca/salmão salmão cotonosa irregular elevado
Soja - branco salmão cotonosa lisa elevadoTomate - salmão salmão cotonosa lisa elevado
Uva - salmão salmão cotonosa irregular elevado
Tabela 3. Média do diâmetro da colônia (expressa em mm) dos isolados de Colletotrichum spp. avaliados em sete dias após a inoculação, valores de área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM), e taxa de crescimento (Tx. Cresc.).
Ordem Isolados AACPCM Tx Cresc1 Abacate 271,6 11,62 Amora 147,4 4,63 Antúrio 181,0 5,44 Árvore da Fortuna 184,9 6,65 Banana 149,2 5,46 Banana (folha) 154,1 5,27 Cana 148,5 4,88 Caqui 155,8 5,79 Chuchu 233,4 8,410 Coco 158,7 5,411 Conde 197,6 7,012 Dracena 124,9 3,113 Falso Massambará 152,2 5,314 Goiaba 157,4 5,615 Goiaba (folha) 150,2 5,016 Iuca 197,4 6,017 Mamão 146,4 4,318 Mandioca 175,3 4,619 Manga 151,8 5,320 Mangaba 121,8 2,921 Negramina 158,0 5,522 Soja 183,2 6,223 Tomate 224,4 7,524 Uva 188,2 5,2
Dias de Incubação
Os conídios, oriundos de cada isolado, quando observados ao microscópio ótico,
apresentaram-se hialinos, unicelulares, retos e gutulados. Com exceção dos isolados de cana-
de-açúcar e cevadilha, todos os isolados mostraram praticamente o mesmo comprimento, não
diferindo entre si (Tabela 4). Quanto à largura, não houve variação (Tabela 4), com o tamanho
dos conídios dentro dos limites estabelecidos para C. gloeosporioides, e nem para o C.
falcatum e C. dematium (SUTTON, 1980). Pela relação comprimento e largura (C/L), pode-se
observar que os isolados produziram conídios relativamente semelhante. A avaliação do
tamanho dos conídios pela relação C/L parece ser uma boa medida, indicando que quanto
maior o quociente dessa relação, os conídios são mais longos e delgados e vice-versa
(VERAS, 1997).
Um fato relatado por Menezes & Hanlin (1996) ao trabalharem com C.
gloeosporioides. Essa segregação pode estar relacionada à condição nuclear dos conídios.
Estudos realizados por Tebeest et al., (1989), em três espécies de Colletotrichum, mostraram a
existência de conídios uninucleados (97%), binucleados (2,2%) e trinucleados (1%). Segundo
esses autores, o número de núcleos variou com o meio de cultura (líquido ou sólido) e que, em
geral, os conídios com mais de um núcleo eram maiores em relação àqueles típicos da espécie
de C. gloeosporioides.
Todos os isolados produziram apressórios de formato, circular, lobado e fracamente
lobado, sendo possível a utilização dessas estruturas para diferenciá-los. A pigmentação dos
apressórios do gênero Colletotrichum está relacionada com a capacidade de penetração no
tecido do hospedeiro. Deising et al., (2000), citaram que isolados de Colletotrichum spp.
tratados com inibidores da biossíntese de melanina são incapazes de penetrar no tecido
hospedeiro. Do mesmo modo, Kubo et al. (1982) trabalhando com isolados de C. lagenarium
observaram uma relação entre a falta de capacidade para penetrar numa membrana de
nitrocelulose com a pigmentação dos apressórios. Em alguns isolados foi visível a produção
de massas de conídios na superfície da colônia, de cor laranja. As colônias variaram, também,
quanto à formação de micélio aéreo, desde flocoso sem conídios aparentes, até micélio
escasso, submerso e bem esporulado, sete dias após à incubação. Ferraz (1977) classificou
isolado de espécies do gênero Colletotrichum em grupos e subgrupos, em função da variação
observada nas características culturais. Mesmo os isolados pertencentes à mesma espécie
apresentaram entre si grande variabilidade no mesmo substrato, admitindo estar este fato
relacionado com a presença de raças fisiológicas. Considerando que uma espécie fúngica é
representada por populações de biótipos, e tendo em vista que estes não tenham a mesma
constituição genética, ou seja, encontre-se em condição heterozigótica para um dado caráter,
possivelmente ocorrerá a segregação de biótipos de comportamento variável, de acordo com o
ambiente de cultivo da espécie.
Tabela 4. Média de crescimento micelial (cm), morfologia e morfometria de conídios e identificação de isolados de C. gloeosporioides, C. dematium e C. falcatum em meio BDA.
*média das dimensões de 50 conídios, produzidos em BDA, após 7 dias de cultivo (25 ºC, 12 h fotoperíodo); média das
dimensões de 50 apressórios; formato dos conídios: cilíndrico; fusiforme; formato dos apressórios: frac. lobado= fracamente
lobado.
Com base em caracteres morfológicos e morfométricos, observou-se a prevalência de
isolados de C. gloeosporioides [22/24; retos, cilíndricos, obtusos no ápice, dimensões de 9-24
Crescimento Mice lial (cm)
7diasForma de conídios Dimensões de conídios (µm) Dimensões de
apressórios (µm)Formato de apressório Táxon
1 Abacate 79,2 Cilíndrico 17,5-(15)-12,5x2,5-(4,75)-5 12-(8)-7,2x7,2-(4)-9,6 circular/liso C. gloeosporioides2 Amora 41,2 Cilíndrico 17,5-(13,3)-7,5x5-(5)-7,5 6-(4,1)2x4-(2,1)-4 lobado C. gloeosporioides3 Antúrio 45,5 Cilíndrico 15-(13,4)-10x5-(5)-7,3 10-(6,6)-4x2-(3,5)-5 lobado C. gloeosporioides4 Árvore da Fortuna 52,3 Cilíndrico 20-(14,7)-10x5-(5)-7,5 6-(4,4)-3x2-(3,6)-4 frac. Lobado C. gloeosporioides5 Banana 40,5 Cilíndrico 25-(16,3)-10x2,5-(5)-7,5 5-(3)-3x4-(3)-3 circular C. gloeosporioides6 Banana (folha) 41,7 Cilíndrico 22,5-(13,0)-5x0-(5)-7,5 5-(3)-3x4-(3)-3 lobado C. gloeosporioides7 Cana 38,7 Fusiforme 50-(31,1)-17,5x5-(5)-5 6-(4,2)-3x4-(4)-4 lobado C. facaltum8 Caqui 45,2 Cilíndrico 17,5-(10,5)-2,5x2,5-(4)-5 10-(6)-4x2-(3)-5 frac. Lobado C. gloeosporioides9 Chuchu 64,0 Cilíndrico 25-(17,0)-7,5x5-(5)-7,5 7-(4,5)-2x2-(2,1)-4 circular/liso C. gloeosporioides10 Coco 43,3 Cilíndrico 25-(9,5)-5x2,5-(2,9)-5 6-(4,2)-3x4-(4)-4 frac. Lobado C. gloeosporioides11 Conde 53,0 Cilíndrico 20-(12,1)-5x2,5-(4,4)-5 6-(4,4)-3x2-(3,6)-4 frac. Lobado C. gloeosporioides12 Dracena 31,2 Cilíndrico 22,5-(9,5)-2,5x2,5-(3,4)-5 3-(2,5)-2x2-(2)-2 lobado C. gloeosporioides13 Falso Massambará 41,7 Fusiforme 20-(9,1)-2,5x2,5-(3,4)-5 3-(2,5)-2x2-(2)-2 lobado C. dematium14 Goiaba 43,3 Cilíndrico 22,5-(6,7)-2,5x2,5-(3,3)-5 5-(3,8)-3x4-(3,4)-3 frac. Lobado C. gloeosporioides15 Goiaba (folha) 38,8 Cilíndrico 22,5-(17,0)-12,5x12,5-(5)-7,5 5-(3,8)-3x4-(3,4)-3 circular/liso C. gloeosporioides16 Iuca 49,2 Cilíndrico 22,5-(17,5)-7,5x5-(5)-5 7-(5,6)-4x2-(2,4)-2 circular C. gloeosporioides17 Mamão 36,5 Cilíndrico 22,5-(14,2)-5x5-(5)-5 7-(4,5)-2x2-(2,1)-4 lobado C. gloeosporioides18 Mandioca 41,3 Cilíndrico 22,5-(16)-5x5-(5)-5 6-(4,1)2x4-(2,1)-4 lobado C. gloeosporioides19 Manga 42,2 Cilíndrico 22,5-(16,7)-7,5x5-(5)-7,5 7-(5,6)-4x2-(2,4)-2 frac. Lobado C. gloeosporioides20 Mangaba 30,8 Cilíndrico 25-(16,4)-7,5x5-(5)-5 3-(2,5)-2x2-(2)-2 lobado C. gloeosporioides21 Negramina 44,7 Cilíndrico 22,5-(13,2)-2,5x2,5-(4,8)-5 6-(4)-3x3-(4)-4 lobado C. gloeosporioides22 Soja 47,3 Cilíndrico 22,5-(15,3)-2,5x5-(5)-5 5-(4)-3x2-(3)-4 frac. Lobado C. gloeosporioides23 Tomate 57,2 Cilíndrico 25-(15,4)-2,5x5-(5)-5 9-(6)-4x3-(4)-5 circular/liso C. gloeosporioides24 Uva 46,3 Cilíndrico 22,5-(13,1)-2,5x2,5-(4,8)-5 7-(4,5)-2x2-(2,1)-4 circular/liso C. gloeosporioides
Isolados
x 2-5 µm], contudo foi observado C. dematium [1/24; conídios fusiformes, dimensões de 19-
24x2-2,5 µm] e C. falcatum [1/24; fusiforme, dimensões de 15-26x4-5 µm]. Os isolados mais
predominantes (C. gloeosporioides), (sensu Sutton 1992), apresentaram conídios hialinos,
gutulados e/ou obclavados, sendo o isolado de cana-de-açúcar identificado como sendo C.
falcatum, e o isolado oriundo de cevadilha como C. dematium (Tabela4).
As características que melhor distinguiram os isolados foram o formato dos conídios e
a produção de apressórios lobados ou fracamente lobados. A diferenciação entre espécies com
base nas dimensões de conídios e apressórios foi dificultada pela sobreposição dos valores
descritos por Sutton (1992), pois a maioria dos isolados apresentou dimensões dentro da faixa
de variação descrita para as duas espécies, C. gloeosporioides e C. acutatum. O telemorfo é
também um critério usado para a definição de espécie Jerger (1992). No entanto, no presente
estudo, dos 24 isolados, apenas um (isolado antúrio) apresentou a fase teleomórfica
(Glomerella cingulata).
O isolado 24 apresentou características intermediárias, com apressórios de margens
lisas e conídios elipsóides, e foi identificado como C. gloeosporioides por possuir tamanho
dos conídios e apressórios que se enquadram na descrição desta espécie (além da coloração de
colônia branca). Apesar dos isolados terem os apressórios circulares e lisos, apresentaram
conídios predominantemente cilíndricos, típicos de C. gloeosporioides (Tabela 4).
A predominância do formato reto e/ou cilíndricos (SUTTON, 1980) foi a característica
mais útil para a identificação dos isolados como C. gloeosporioides. Baseado principalmente
nesse critério e levando em consideração o crescimento micelial a 28 ºC e o comprimento de
conídios, os 22 isolados foram identificados como da espécie C. gloeosporioides. Os demais
foram identificados com C. falcatum e C. dematium (Tabela 4).
Figura 2. Curvas de progresso do crescimento micelial dos isolados de Colletotrichum spp. oriundos de diferentes hospedeiros.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
1 2 3 4 5 6 7
Amora
Antúrio
Árvore da Fortuna
Banana
Banana (folha)
Cana
Caqui
Chuchu
Coco
Conde
Dracena
Falso Massambará
Goiaba
Goiaba (folha)
Iuca
Mamão
Mandioca
Manga
Mangaba
Negramina
Soja
Tomate
Uva
Abacate
Figura 3. Área abaixo da curva de crescimento progresso micelial (AACPM) de diferentes isolados do Colletotrichum sp. analisados (sete dias de incubação).
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
AACPM
.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
20,0 ADiâmetro da colônia em (mm)
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
Diâmetro da colônia em (mm)
B
Figura 4. Diâmetro médio da colônia dos isolados de Colletotrichum spp. oriundos de diferentes hospedeiros ao primeiro (A) e segundo (B) dia após a inoculação (dap) .
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
ADiâmetro da colônia em (mm)
B
Diâmetro da colônia em (mm)
Figura 5. Diâmetro médio da colônia dos isolados de Colletotrichum spp. oriundos de diferentes hospedeiros ao terceiro (A) e quarto (B) dia após a inoculação (dap) .
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
ADiâmetro da colônia em (mm)
B
Diâmetro da colônia em (mm)
Figura 6. Diâmetro médio da colônia dos isolados de Colletotrichum spp. oriundos de diferentes hospedeiros ao quinto (A) e sexto (B) dia após a inoculação (dap) .
.
Figura7. Diâmetro médio da colônia dos isolados de Colletotrichum spp. oriundos de diferentes hospedeiros ao sétimo (A) dia após a inoculação (dap) .
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
ADiâmetro da colônia em
mm
BA D
SR
E
Q
POM
LKJI
HGF
N
T
XU WV
C
Q
Figura 8. Aspecto micelial de colônias fúngicas de Colletotrichum spp. A. amora verso B. amora reverso, C. antúrio (inflorescência) verso D. antúrio (inflorescência) reverso, E. árvore da fortuna (folha) verso F. árvore da fortuna (folha) reverso, G. banana (fruto) verso H. banana (fruto) reverso, I. banana (folha) verso J. banana (folha) reverso K. cana (folha) verso L. cana (folha) reverso, M. caqui (folha) verso N. caqui (folha) reverso, O. chuchu (folha) verso P. chuchu (folha) reverso, Q. coco (fruto) verso R. coco (fruto) reverso, S. conde (fruto) verso T. conde (fruto) reverso U. dracena (folha) verso V. dracena (folha)reverso, W. falso massambará (folha) verso X. falso massambará (folha) reverso.
B CA D
F HGE
JI LK
NM O
RQ
P
U
S
V
T
Figura 9. Aspecto micelial de colônias fúngicas de Colletotrichum spp. A. goiaba (fruto) verso B. goiaba (fruto) reverso, C. goiaba (folha) verso D. goiaba (folha) reverso, E. iuca (folha) verso F. iuca (folha) reverso G. mamão (fruto) verso H. mamão (fruto) reverso I. mandioca (folha) verso J. mandioca (folha)reverso, K. manga (folha) verso L. manga (folha) reverso M. mangaba (inflorescência) verso N. mangaba (inflorescência) reverso O. negramina (inflorescência) verso P. negramina (inflorescência)reverso Q. soja (folha) verso R. soja (folha)reverso S. tomate (fruto) verso e T. tomate (fruto) reverso U. uva (folha) verso V. uva (folha)reverso.
5.2. Caracterização biológica (Teste de patogenicidade cruzada)
Para o teste de patogenicidade, aos sete dias após a inoculação, todas as plantas
apresentavam sintomas da infecção pelo patógeno.
O teste de patogenicidade cruzada revelou a suscetibilidade dos frutos e das folhas
testadas. Todos os isolados foram patogênicos em seus hospedeiros de origem (exceção sem
ferimento abacate, caqui, dracena e iuca, Tabela 6). No tratamento com ferimento as folhas da
fruta do conde apresentaram maior porcentagem de infecção dos isolados inoculados (95,8 %;
Tabela 5). No tratamento sem ferimento as folhas de abacate apresentaram maior porcentagem
de infecção pelos isolados testados (45,8 %; Tabela 6.).
O isolado oriundo de conde apresentou maior gama de hospedeiras (total de 22
hospedeiros sintomáticos) nos tratamentos com ferimento; e nos tratamentos sem ferimento os
isolados de abacate, cana e mamão mostraram-se mais agressivos. Peres et al., (2003) relatam
que isolados de C. gloeosporioides possuem o potencial de afetar diversas frutas tropicais por
meio de infecções cruzadas, sendo o mesmo potencial não verificado para outras espécies de
Colletotrichum spp. Os isolados com menor gama de hospedeiros e consequente maior
especificidade destacam-se os isolados de goiaba e falso-massambará com ferimento e os
isolados de goiaba e soja sem ferimento.
Os resultados deste trabalho, aliados aos resultados de Tozze-Júnior et al. (2006)
apontam para uma certa especificidade por hospedeiro por parte dos isolados de
Colletotrichum. Estudos envolvendo inoculação cruzada, com vários isolados e diferentes
hospedeiras são necessários para determinar reações diferenciais (Tabela 5 e 6).
Tabela 5. Patogenicidade cruzada dos 24 isolados inoculados nos 24 hospedeiros de origem e porcentagem de patogenicidade cruzada (%) nos experimentos onde procedeu-se ferimento (CF).
*Os números ordenados no cabeçalho representam os isolados fúngicos e seus hospedeiros de origem indicados na primeira coluna vertical
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 %1 Abacate + + + + + + + - - - + - + + + + + + + + + + - - 75,02 Amora + - + + + + - - + - + - + + + + + + + + - + - - 66,73 Antúrio + - - + + + + - - - + - + - + - - + + + - + - - 50,04 Árvore da Fortuna + + - + - + + + + + - + - + + - + + + + + + + + 79,25 Banana + + - + + + - + + - + - + - + - + + + + - + - - 62,56 Banana (folha) + + - + - + - + - + + - + - + - - + + + + + + - 62,57 Cana + + - + + + + - + - + - + - - - + + + + - + - - 58,38 Caqui + + - + + + + + - - - - - + + - + - + + - + - - 54,29 Chuchu + + - + + + + - + + - + - + + - - + + + + - + + 70,810 Coco + + - - + + + - + - - - + + - - + + + + - + - + 58,311 Conde + + + + + + + + + + + - + + - + + + + + + + + - 87,512 Dracena + + - + + + + + + + + - + + - - - + + + + - + - 70,813 Falso Massambará + - - + + + - + - - - - + + + - - + + + - + - - 50,014 Goiaba + - - + - + + - - - - - + - + - + + + + + + - - 50,015 Goiaba (folha) + - + + + + + + + + - - + + - + + + + + + + + - 79,216 Iuca + + - + + + + - + + + - - + + - + + - + + + + + 75,017 Mamão + - - + + + + + + - + - - + + - - + + + - + - - 58,318 Mandioca - + + + - + + + + - - - + - + + + + + + - + - - 62,519 Manga + - + + + - - - + - - - - + + + + + + + - + - - 54,220 Mangaba + - - + + + - + + + + + + + - - - + + + + + + - 70,821 Negramina + + - + + - - + + - + - + + - - + + + + - + - + 62,522 Soja + - + + - + + + - - - - - + + + + + + + - + - - 58,323 Tomate + - - + - + + - + + + - - - - - + + + + + + + - 58,324 Uva + - + + + + + + + + + - - + + + - + + + + + + - 79,2
HospedeirosIsolados de acordo com sua procedência (hospedeiros)
Tabela 6. Patogenicidade cruzada dos 24 isolados inoculados nos 24 hospedeiros de origem e porcentagem de patogenicidade cruzada (%) nos experimentos onde não procedeu-se ferimento (SF).
*Os números ordenados no cabeçalho representam os isolados fúngicos e seus hospedeiros de origem indicados na primeira coluna vertical.
Características culturais são bastante difundidas para distinguir isolados de
Colletotrichum sp. mas esses fatores são muitas vezes insuficientes e contraditórios, em
decorrência da elevada diversidade genética e molecular do gênero.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 19 20 22 23 24 %1 Abacate - - - + - - + - + - + - + + - - - + + + + + - - 45,82 Amora - - - - - - - - - - + - - + + - - - - + - + - + 25,03 Antúrio - - - - - + - - - - - - - - + - - + - - + + - - 20,84 Árvore da Fortuna - - - - - - + - + - - - - + - - - - + + + + - + 33,35 Banana - - - - + - - - + - - - + - + - - - - + + + - - 29,26 Banana (folha) - - - - - - - - - - - - - - + - - + - + - + - - 16,77 Cana - - - - - + + - - - - - + - - - - + + + + + - - 33,38 Caqui - - - - + - - - - - - - - + - - - - - + + + - + 25,09 Chuchu - - - + - - - - + - - - - + + - - - - - + - - + 25,010 Coco - - - - - - - - + - - - - + - - + + - + + + - + 33,311 Conde - - - - - - - - - - - - + + - - - + + - + + - + 29,212 Dracena - - - - - - - - - + + - - + - - + + - - + - + - 25,013 Falso Massambará - + - - - - - - - - - - + - + - - - - - + + - - 20,814 Goiaba - + - - - - - - - - - - + - + - - - - - - + - - 16,715 Goiaba (folha) - - - - - - - - - - - - - + + - - + - - + + - - 20,816 Iuca - - - - - - - - - - - - - + + - - - + + + + - - 25,017 Mamão - - - - + - + - + - - - - + + - + + - - + + - - 37,518 Mandioca - - - - - - - - + - - - + - + - + + - + + + - - 33,319 Manga - - - - - - - - + - - - - + + - - + + - + + - - 29,220 Mangaba - - - - - - - - + - - - + + - - - + - - + + - - 25,021 Negramina - - - - + - - - + - - - - - + - - - - - + + - - 20,822 Soja - - - - - + - - - - - - - + + - - + - - + + - - 25,023 Tomate - - - - - - - - - + - - - - - + - - - + + + - 20,824 Uva - - - - - - - - - + + - - + - - - + + - + + + - 33,3
HospedeirosIsolados de acordo com sua procedência (hospedeiros)
As características que melhor distinguiram os isolados foram às dimensões do conídio,
formato dos conídios e a produção de apressórios lobados ou fracamente lobados. A
diferenciação entre espécies com base nas dimensões de conídios e apressórios foi dificultada
pela sobreposição dos valores descritos por Sutton (1992), pois a maioria dos isolados
apresentaram dimensões dentro da faixa de variação descrita para as duas espécies, C.
gloeosporioides e C. acutatum.
O isolado 24 apresentou características intermediárias, com apressórios de margens lisas
e conídios elipsóides, e foi identificado como C. gloeosporioides por possuir tamanho dos
conídios e apressórios que se enquadram na descrição desta espécie (além da coloração de
colônia branca). Apesar dos isolados terem os apressórios circulares e lisos, apresentaram
conídios predominantemente cilíndricos, típicos de C. gloeosporioides (Tabela 4).
5.3. Caracterização bioquímica
É o efeito da relação carbono/nitrogênio no crescimento micelial, esporulação e peso
seco de Colletotrichum spp. Em geral, as médias do crescimento micelial dos isolados nas
combinações das fontes de carbono (dextrose, sacarose, sorbitol) e como fontes de nitrogênio
(asparagina, peptona e nitrato de potássio). Esta diferença também foi observada por Tandon
& Chandra (1962), para C. gloeosporioides.
As combinações dextrose/ peptona e sacarose/peptona foram as que induziram maiores
médias de peso seco da massa micelial, 5,3 e 5,4 mg, respectivamente, destacando-se
significativamente das médias das demais fontes C/N. Na combinação sacarose/peptona, não
ocorreram diferenças significativas entre os isolados, o mesmo acontecendo nas combinações
de dextrose/asparagina(T1) e sorbitol/peptona(T8). (Tabela 7, 8 e 9). Analisando-se os dados
do crescimento micelial, esporulação e peso seco do micélio, constatou-se uma correlação
positiva entre o crescimento micelial e o peso seco do micélio, r(Pearson) = 0,5121, ou seja,
os isolados que demonstraram maior habilidade de crescimento no meio sólido, tiveram
também maior peso seco da massa micelial no meio líquido.
Segundo Tandon & Chandra (1962), um bom crescimento micelial está associado a
uma boa esporulação. No presente estudo foi verificado que alguns isolados apresentaram boa
produção de conídios, aliada a elevado crescimento em meio sólido e líquido, confirmando os
dados dos autores mencionados. Às vezes, um meio ótimo para o crescimento rápido resulta
na exaustão dos nutrientes e os metabólitos secundários liberados pelo fungo nesse meio,
inibem a produção de esporos (GRIFFIN,1994). Por outro lado, o crescimento micelial
reduzido pode estimular a esporulação naquele substrato. As principais fontes de carbono para
os isolados testados continham em suas combinações dextrose e sorbitol, pois os maiores
valores de AACPCM e TC foram para tratamentos que continham essas fontes de Carbono. A
sacarose não demonstrou uma fonte de C eficiente para a morfofisiologia dos isolados.50 %
dos isolados (árvore-da-fortuna, banana fruto, caqui e conde) apresentaram maiores valores de
AACPCM para a combinação dextrose e nitrato de potássio. Trinta e oito % dos isolados
(banana folha, banana fruto e caqui (folha), tiveram maiores taxas de crescimento para
isolados também submetidos a combinação de dextrose e nitrato de potássio. Os isolados de
conde, chuchu e árvore da fortuna apresentaram os menores valores médios de AACPCM e
TC.
Tabela 7. Valores F da analise de variância dos fatores hospedeiros de origem e tratamentos e os valores dos parâmetros das variáveis dependentes peso seco de micélio e área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM).
Fatores Valor FPeso Seco AACPCM
Hospedeiro de origem 1,48ns 8,35**Tratamentos (C/N) 7,52** 3,23**Interação 0,000002ns 3,27 ns
A análise de variância para o arranjo fatorial para os fatores (variáveis independentes)
hospedeiros de origem, tratamentos com carbono e nitrogênio e a interação das variáveis
independentes analisou-se as medias e os desvios padrões das variáveis dependentes peso
seco de micélio e dos valores de área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial
(AACPCM), sendo que rejeitou-se a hipótese de nulidade (~0,01) para a variável
independentes apenas para o fator tratamento C/N (F=7,52**), não rejeitando para diferenças
entre hospedeiros de origem (F= 1,48ns) e interação (F=0,000002ns). Para a variável
dependente AACPCM rejeitou-se a hipótese de nulidade para as variáveis hospedeiros de
origem (F=8,35**) e tratamentos C/N (F=3,23**), não rejeitando-se a hipótese de nulidade
para interação entre os dois fatores (Tabela 7)
Tabela 8. Médias dos pesos secos de micélio (PS) e dos calores de área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM) dos isolados submetidos a diferentes concentrações de carbono e nitrogênio (C/N).
Or. Hospedeiros de origem PS (g)* Hospedeiros de origem AACPCM*1 Mangaba 3,16 a Iuca 16,4 a2 Negramina 3,16 ab Mandioca 15,89 a3 Conde 3,16 ab Antúrio 15,7 ab4 Abacate 3,16 ab Tomate 15,6 bc5 Banana 3,16 ab Uva 15,6 bc6 Manga 3,16 ab Chuchu 15,5 bc7 Goiaba (folha) 3,16 ab Soja 15,3 bc8 Falso massambará 3,16 ab Árvore da fortuna 16,3 cd9 Caqui 3,16 ab Abacate 15,1 de10 Antúrio 3,16 ab Coco 14,8 ef11 Árvore da Fortuna 3,16 ab Manga 14,6 fg12 Uva 3,16 ab Cana 14,3 fg13 Cana 3,16 ab Dracena 14,3 gh14 Mandioca 3,16 ab Negramina 14,1 gh15 Goiaba (Fruto) 3,16 ab Conde 13,4 gh16 Amora 3,16 ab Mangaba 13,4 gh17 Banana (fruto) 3,16 ab Amora 13,1 gh18 Iuca 3,16 ab Goiaba (fruto) 12,8 gh19 Chuchu 3,16 ab Falso massambará 12,8 gh20 Soja 3,16 ab Goiaba 12,7 gh21 Tomate 3,16 ab Mamão 12,5 gh22 Coco 3,16 ab Banana (fruta) 12,2 gh23 Mamão 3,16 ab Banana 12,2 gh24 Dracena 3,16 ab Caqui 11,9 h
*Médias seguidas de mesma letra na vertical na diferem entre si ao teste Tukey (P~0,05) medias transformadas
por √ x+ 10
Tabela 9. Médias dos pesos secos do micélio (PS) e área abaixo da curva de progresso do crescimento micelial (AACPCM).
Trat. Descrição PS(g)* Trat. Descrição AACPCMT3 Dextrose-nitrato de potássio 3,16 a T2 Dextrose-triptona 15 aT2 Dextrose-triptona 3,16 ab T1 Dextrose-asparagina 14,5 abT6 Sacarose-Nitrato de potássio 3,16 ab T9 Sorbitol-Nitrato de potássio 14,4 abT5 Sacarose-Triptona 3,16 ab T3 Dextrose-nitrato de potássio 14,4 abT1 Dextrose-asparagina 3,16 ab T8 Sorbitol-Triptona 14,3 abT4 Sacarose-Asparagina 3,16 bc T7 Sorbitol-Asparagina 13,9 abT8 Sorbitol-Triptona 3,16 bc T5 Sacarose-Triptona 13,8 bT7 Sorbitol-Asparagina 3,16 c T4 Sacarose-Asparagina 13,5 bT9 Sorbitol-Nitrato de potássio 3,16 c T6 Sacarose-Nitrato de potássio 13,4 b
*Médias seguidas de mesma letra na vertical na diferem entre si ao teste Tukey (P~0,05); medias transformadas
por √ x+ 10
5.4. Identificação de oligonucleotídeos para caracterização molecular
A amplificação utilizando-se os oligonucleotídeos ITS 4, ITS 5,ACT 512F,ACT 783R,
CL1, CL2, T1 e BT2b obteve reações positiva para a amplificação de DNA de 20 dos 24
isolados em estudo. Quando se utilizou CL BT2b, não detectou-se amplificação dos isolados
de caqui, mamão e mandioca (isolados nº7,16e 17). (Tabela10)Com o isolado de cana (nº 6)
não foi obtida amplificação com nenhum dos oligonucleotídeos testados, mesmo após serem
testadas variações nas condições da reação de PCR (temperaturas de anelamento de 55 e 60
°C) e diferentes concentrações de DNA. Com o oligonucleotídeos CL, a reação de
amplificação foi negativa com os isolados de chuchu e conde (nº 9 e 11). (Tabela 10)
Diferentes regiões do genoma e a região ITS do rDNA, foram amplificadas com os
oligonucleotídeos universais ITS 4, ITS 5,ACT 512F,ACT 783R, CL1, CL2, T1 e BT2b,
geraram um fragmentos de diferentes tamanho (~ 600 pb) região (ITS) para todos os 24
isolados (Figura 1).
Observado a presença de DNA na amostra após a extração, o isolado de cana-de-açúcar
não mostrou resultados positivos para nenhum do quatro pares de oligonucleotídeos
utilizados. As PCRs com os oligonucleotídeos ITS4/ITS5, ACT512F/ACT783R, CL1/CL2 e
T1/Bt2b apresentaram reações positiva para a amplificação de DNA de 20 dos 24 isolados em
estudo.
M 6 7 9 10 11 14 15 16 6 7 10 11 14 15 169 6 7 10 11 15 16149 6 7 11 16149 15
ITS ACTACT CL1 BT2B
M 17 18 2219 20 21 23 24 17 18 2219 20 21 23 24 17 18 2219 20 21 23 24 17 18 2219 20 21 23 24
ITS ACT CL1 BT2B
ITSM 1 2 3 4 5 B 1 2 3 4 5 B 1 2 3 4 5 B 1 2 3 4 5 B
ACT CL1 BT2B
Figura 10. Gel de agarose do produto de PCR dos isolados de Colletotrichum spp., utilizando os oligonucleotídeos universais ITS 4, ITS 5,ACT 512F,ACT 783R, CL1, CL2, T1 e BT2b.
Os isolados que apresentaram bandas com a utilização de oligonucleotídeos especifico
para Colletotrichum spp., apresentaram características culturais, morfológicas ou patogênicas
comuns entre si, todos os isolados são oriundos de sua hospedeira de origem. Da mesma
forma, os isolados não apresentaram reação positiva com oligonucleotídeos CAL e BT2B,
apresentaram características comuns entre si, que não pudessem explicar os resultados obtidos
(Tabela10).
No processo de extração de DNA os isolados oriundo de antúrio, chuchu, conde,
mangaba e soja tiveram os melhores rendimentos na produção de micélio (matéria prima para
extração (Tabela 10). Os amplicons gerados a partir do ITS e ACT amplificaram 87,5% dos
isolados, já 75% dos isolados foram amplificados com oligonucleotídeos gerados a partir do
gene BT, e por fim, 62,5% dos isolados produziram amplicons a partir dos genes CAL.
Tabela 10. Resultados da amplificação do DNA utilizando primer universais para Colletotrichum spp.
Ordem HospedeiroProdução
de MicélioITS ACT CAL BT
1 Amora ++ + + + +2 Antúrio +++ + + + +3 Árvore da Fortuna + + + + +4 Banana + + + + +5 Banana (folha) + + + + +6 Cana ++ - - - -7 Caqui ++ + + - -8 Cevadilha (F.M) - - - -9 Chuchu +++ + + - +10 Coco + + + + +11 Conde +++ + + - +12 Dracena - - - -13 Goiaba + + + + +14 Goiaba (folha) + + + + +15 Iuca ++ + + + +16 Mamão ++ + + - -17 Mandioca + + + - -18 Manga + + + + +19 Mangaba +++ + + + +20 Negramina + + + + +21 Soja + + + + +22 Abacate +++ + + - +23 Tomate + + + + +24 Uva ++ + + + +
PCR
6. CONCLUSÕES
Foi observado através dos isolados uma grande variabilidade fenotípica molecular. A
espécie tipo C. gloeosporioides, foi a mais freqüentemente identificada perante os isolados
analisados Contudo, esta espécie apresenta grande variabilidade de acordo com os critérios
aplicados.
Os isolados apresentam comportamentos fisiológicos diferenciais ligados a
particularidades dos isolados Os comportamentos diferenciados e a agressividade promovida
pelo isolados de Colletotrichum permitiram verificar o amplo e restrito espectro de virulência
ligado aos isolados estudados.
As características fenotípicas dos isolados de Colletotrichum permitiram desenvolver
uma análise comparativa para identificação do complexo grupo. As espécies de
Colletotrichum spp. oriundas de diversas hospedeiras foram identificadas considerando
características morfológicas e morfométricas, sendo o fungo C. gloeosporioides a espécie
predominante.
Foi verificado uma variabilidade quanto ao uso de fontes de C e N, evidenciando a
combinação dextrose e nitrato de potássio, excluindo o uso de sacarose. Os melhores pares de
oligonucleotídeos importantes para amplificação de sequencias de isolados de Colletotrichum
foram ITS e Actina.
7. ASPECTOS FORMATIVOS
Dentre as atividades curriculares de publicação as atividades desenvolvidas foram:
Participação do XXXIII Congresso Paulista de Fitopatologia 2010 de 02 a 04 de fevereiro de
2010 em Ituverava-SP, apresentado os trabalhos i) Anamorfo e teleomorfo da mancha foliar
de antúrio (Anthurium andraeanum - araceae), ii) Patogenicidade do Colletotrichum
gloesporioides em folhas de uva, Iii) Cercospora ipomoeae incidente em campainha
(Ipomoea nil.), vi) Pseudocercospora sp. Incidente em folha de mutambo (Guanxuma
ulmifolia - sterculiaceae) no Rio de Janeiro, v) Fase sexual e assexual de ferrugem de erva-de-
santa-luzia (Chamaesyce hirta-Euphorbiae), vi) Incidência manchas foliares na cultura da uva
recebidas na clínica fitopatológica do IFG, vii) Ferrugem branca (Albugo spp.) incidentes em
plantas invasoras no centro-oeste, viii) Doenças incidentes em plantas daninhas, ix)
Levantamento de doenças em plantas no campus do IFG, x) Ocorrência de Phoma sp
incidente em folha de Buva (Coryza bonariensis - Asteraceae), xi) Incidência de Uromyces sp.
em folhas de Guanxuma (Sida cordifolia- Malvaceae) na cidade de Urutaí, (CD-Room Grupo
Paulista de Fitopatologia), Resumo publicado no XXXIII Congresso Paulista de
Fitopatologia). xi) Participei do mini curso Doenças causadas por vírus bactérias e fungos e
plantas ornamentais. No período de 15 a 19 de agosto de 2010 participou do 43º Congresso
Brasileiro de Fitopatologia. Neste Congresso houve apresentação dos trabalhos científicos: i)
Diversidade de fungos associados a sementes e frutos de plantas do Cerrado. Tropical Plant
Pathology35(suplemento):176, 2010; ii) Sanidade, fisiologia e verificação da
transmissibilidade de fungos associados a sementes, frutos e inflorescências de plantas do
Cerrado. Tropical Plant Pathology 35(suplemento):s176, 2010; iii) Estudos fisiológicos e
morfo-culturais de isolados de Colletotrichum spp. Tropical Plant Pathology
35(suplemento):s175, 2010; iv) Morfometria e patogenicidade de isolados de Colletotrichum
spp. Tropical Plant Pathology 35(suplemento):s175, 2010;
Participação VI Congresso Brasileiro de Micologia de 29 de novembro a 02 de
dezembro de 2010 em Brasília-DF, apresentando o trabalho “Análise da aerobiota micológica
da biblioteca do Instituto Federal Goiano Campus Urutaí”, resultado de estudos realizados no
Instituto Federal Goiano, Campus Urutaí (29/11/2010 a 02/12/2010).
Participou no ano de 2011 da I Semana de Ciências Agrárias, Ambientais, Alimentos e
Administração (I SICAAAA) e III Semana de Ciências Agrárias (III SECIAGRI) dos mini-
cursos Recuperação de matas ciliares e áreas degradadas e Diagnose de Viroses de Plantas e
ministrei o mini-curso Práticas em Microbiologia de solo.
No período de 14 a 19 de agosto de 2010 participou do 44º Congresso Brasileiro de
Fitopatologia neste, Congresso houve apresentação dos trabalhos científicos: i) Aspectos
morfológicos de isolados de Colletotrichum spp.; ii) Patogenicidade cruzada de isolados
Colletotrichum gloeosporioides, C. falcatum e C. dematium, iii) Cercosporiose (Cercospora
bidenticola) em picão preto (bidens pilosa) incidente na cidade de Urutaí, Go, iv) Uso de
fontes de carbono e nitrogênio no crescimento de isolados de Colletotrichum spp
Participei da II Jornada de Iniciação do Instituto Federal Goiano campus Urutaí, nos dias 19 e
20 de outubro de 2011, com a apresentação de trabalhos i) Identificação molecular de
diferentes pares de oligonucleotídeos para amplificação e reconhecimento de isolados de
Colletotrichum sp. ii) Patogenicidade cruzada de isolados Colletotrichum gloeosporioides, C.
falcatum e C. dematium. iii) Cercosporiose (Cercospora bidenticola) em picão preto (Bidens
pilosa) incidente na cidade de Urutaí, Go. iv)Uso de fontes de carbono e nitrogênio no
crescimento de isolados de Colletotrichum spp. As temáticas destes trabalhos refletem os
temas abordados pelo projeto de PIBIC e atividades desenvolvidas com colegas do
laboratório.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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