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INSTITUTO FEDERAL GOIANO
CAMPUS URUTAÍ
ALESSANDRA RODRIGUES REIS
Trabalho de Conclusão de Curso:
PATOGENICIDADE, VOLUME DE SUSPENSÃO E FORMAS DE
INOCULAÇÃO DE ISOLADO DE Phytophthora capsici ORIUNDO DE
BERINJELA (Solanum melongena)
URUTAÍ – GOIÁS
2015
ALESSANDRA RODRIGUES REIS
PATOGENICIDADE, VOLUME DE SUSPENSÃO E FORMAS DE
INOCULAÇÃO DE ISOLADO DE Phytophthora capsici ORIUNDO DE
BERINJELA (Solanum melongena)
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
ao curso de Licenciatura em Ciências
Biológicas do Instituto Federal de Educação,
Ciências e Tecnologia Goiano – Câmpus
Urutaí, como requisito parcial para a obtenção
do título de Licenciado em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Milton Luiz da Paz Lima
URUTAÍ – GOIÁS
2015
ALESSANDRA RODRIGUES REIS
PATOGENICIDADE, VOLUME DE SUSPENSÃO E FORMAS DE
INOCULAÇÃO DE ISOLADO DE Phytophthora capsici ORIUNDO DE
BERINJELA (Solanum melongena)
Trabalho de Curso aprovado como requisito parcial para a conclusão do curso de
Licenciatura em Ciências Biológicas do Instituto Federal de Educação, Ciências e
Tecnologias Goiano – Câmpus Urutaí, pela banca examinadora composta pelos membros
a seguir:
Prof. Dr. Milton Luiz da Paz Lima (IF Goiano – Campus Urutaí)
Presidente da banca examinadora
Prof. Dr. Pabline Marinho Vieira (IF Goiano – Campus Urutaí)
Membro titular da banca examinadora
Prof. Dr. Gleina Costa Silva Alves (IF Goiano – Campus Urutaí)
Membro titular da banca examinadora
Data da defesa do Trabalho de Curso: 23 de março de 2015.
Dedico este trabalho aos meus
pais André Luiz Vieira dos
Reis e Sandra Vaz Rodrigues
Reis que sempre acreditaram
em mim e sempre me
encorajaram de enfrentar os
momentos difíceis da minha
vida.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus pela força e perseverança para vencer os obstáculos
Aos meus pais pelo amor, carinho, apoio, incentivo, dedicação, companheirismo, fazendo
tudo o que era possível e impossível para me ajudar durante toda a minha vida e por
mais essa etapa da minha vida, acreditando e aceitando minhas decisões.
As minhas irmãs Andrea Rodrigues Reis e Yasmin Rodrigues Reis que sempre me
ajudavam quando eu precisava, pelo apoio, amor, companheirismo e sempre estavam
do meu lado quando eu precisava.
Ao meu orientador Milton Luiz da Paz Lima, pelas orientações, ensinamentos, paciência,
pela ajuda na monografia no pouco tempo que tivemos, obrigada por tudo, serei
eternamente grata!
A minha prima Illana Reis Pereira que sempre estendeu a mão quando necessário, aos
seus ensinamentos.
As minhas amigas Camila Ferreira Vaz e Maria Cristina de Araújo Vaz, que
acompanharam, choraram, riram junto comigo. Que fizeram parte de toda a minha
vida acadêmica e tornando-a mais fácil.
A todos os mestres que me ensinaram, incentivaram e ajudaram, direta ou indiretamente,
contribuindo assim, para que eu pudesse crescer.
A capes pela concessão da bolsa do PIBID durante minha formação acadêmica.
“Eu aprendi que a coragem não é a
ausência de medo, mas o triunfo
sobre ele. O homem corajoso não é
aquele que não sente medo, mas
aquele que conquista por cima do
medo.”
Nelson Mandela
RESUMO
REIS, A.R. Patogenicidade, volume e formas de inoculação de Phytophthora capsici em
diferentes hospedeiros. Trabalho de conclusão de curso, Urutaí, GO, 2015.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a patogenicidade, volume e formas de
inoculação de Phytophthora capsici em diferentes hospedeiros. Fruto de berinjela
expressando sintomas (oriundo Pires do Rio, GO) foram recebidos no laboratório para
análise sendo identificado través de lâminas semipermanentes que se tratava de uma
infecção causada por Phytophthora capsici. A partir deste fruto sintomático foram
realizados os seguintes ensaios: i) descrição sintomática e obtenção de cultura pura do
patógeno, ii) estabelecimento das etapas do teste de patogenicidade (a partir de uma
cultura pura) utilizando a técnica de discos de micélio, iii) avaliar o volume de inóculo na
concentração 104 zoósporos/mL, iv) avaliar as formas de inoculação. O volume de
inóculo de 150 µL para uma concentração de 1.104 zoósporos por mL, é o melhor volume
de inóculo, que apresenta a quantidade de zoósporos suficientes para desencadear a
podridão-de-fitóftora da berinjela. Independente do volume de inóculo o tempo de sete
dias foi o principal componente da relação de patogenicidade de berinjela com zoósporos
de Phytophthora capsici. Esse trabalho mostrou as a virulência do isolado, o volume de
inóculo de 50-150 µL ideais e a forma de inoculação tanto discos de micélio sem
ferimento quanto palito de dente contaminado mais apropriados para estudos de interação
berinjela Phytophthora capsici.
Palavras chave: pós colheita, podridão de frutos, esporângio, zoósporos, cromista.
ABSTRACT
REIS, A.R. Patogenicity, bulk and inoculation ways of Phytophthora capsici in other
hosts. Final paper, Urutaí, GO, 2015.
The objective of this study was to evaluate the pathogenicity, bulk and forms of
Phytophthora capsici inoculation on other hosts. Eggplant fruit expressing symptoms
(coming from Brasilia, DF) were received in the laboratory for analysis and identified at
slant of semi-permanent slides that it was an infection caused by Phytophthora capsici.
From this result symptomatic the following tests were performed: i) symptomatic
description and obtaining a pure culture of the pathogen, ii) the establishing of pathogenic
test steps (from a pure culture) using the technique of mycelial disks iii) assess the volume
of inoculum concentration in 104 zoospores / mL, iv) to evaluate the forms of inoculation.
The results showed that inoculation by eggplant fruits caused a change of color. The
volume of inoculum of 150 µL to a concentration of 1.104 zoospores per mL, is the best
volume of inoculum, which shows the amount of zoospores sufficient to trigger the rot of
Phytophthora on eggplant. Regardless of the time of inoculum volume is the main
component of eggplant pathogenic relationship with zoospores of Phytophthora capsici.
This study demonstrated the virulence isolate in eggplant, the appropriate volume of
inoculum, and the most suitable form of inoculum for eggplant interaction studies with
Phytophthora capsici.
keywords: post harvest, rot fruit, sporangia, zoospores, chromist, stramenopila.
SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................................................... 7
ABSTRACT .................................................................................................................... 8
LISTAGEM DE TABELAS ........................................................................................ 10
LISTAGEM DE FIGURAS ......................................................................................... 10
2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 13
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 18
3.1. ISOLAMENTO, SELEÇÃO E TESTE DE PATOGENICIDADE DE ISOLADOS
FITOPATOGÊNICOS EM BERINJELA E JILÓ. ..................................................................... 18
3.2. CARACTERIZAÇÃO E PATOGENICIDADE UTILIZANDO DISCO DE MICÉLIO EM
DIFERENTES HOSPEDEIROS. .......................................................................................... 18
3.3 EFEITO DE DIFERENTES VOLUMES DE SUSPENSÕES DE ZOÓSPOROS NA EXPRESSÃO DE
SINTOMAS .................................................................................................................... 19
3.4. INOCULAÇÃO DE FRUTOS DE BERINJELA UTILIZANDO DISCO DE MICÉLIO E PALITO
DE DENTE. .................................................................................................................... 21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 22
4.1 TESTE DE PATOGENICIDADE E SELEÇÃO DOS ISOLADOS PATOGÊNICOS ORIUNDOS DO
ISOLAMENTO. ............................................................................................................... 22
4.2. TESTE DE PATOGENICIDADE UTILIZANDO DISCO DE MICÉLIO. ............................... 25
4.3. EFEITO DE DIFERENTES QUANTIDADES DE SUSPENSÕES DE ZOÓSPOROS NA
EXPRESSÃO DE SINTOMAS ............................................................................................ 27
4.4. INOCULAÇÃO DE FRUTOS DE BERINJELA UTILIZANDO DISCO DE MICÉLIO E PALITO
DE DENTE. .................................................................................................................... 30
5. CONCLUSÕES ......................................................................................................... 31
6. LITERATURA CITADA ......................................................................................... 32
LISTAGEM DE TABELAS
Tabela 1. Patogenicidade dos quatro isolados de culturas mistas com Phytophthora
capsici obtidos a partir de sintomas de frutos de berinjela sintomáticos oriundo de Pires
do Rio, GO (2014). ......................................................................................................... 23
Tabela 2. Teste de patogenicidade, produção de micélio superficial e esporângios,
descrição sintomática de Phytophthora capsici inoculado em diferentes hospedeiros .. 27
Tabela 3. Patogenicidade de Phytophthora capsici em frutos partidos de berinjela de
diferentes volumes de zoósporos (µL) sob a concentração de 104 zoósporos/mL em
diferentes dias de avaliação. ........................................................................................... 29
LISTAGEM DE FIGURAS
Figura 1. Condições experimentais de atividades de inoculação de Phytophthora capsici.
A. fruto com diferentes volumes de inóculo, B. granulações representam os esporângios
na superfície do tecido do fruto de berinjela .................................................................. 20
Figura 2. Aspecto colonial de cultura de Phytophthora capsici. ................................... 21
Figura 3. Sintomas obtidos a partir de inoculações de culturas mistas de Phytophthora
capsici. A. fruto de berinjela com mudança de coloração; B. fruto de jiló apodrecido com
mudança de coloração; C. fruto de berinjela em estágio avançado de desenvolvimento
demonstrando a presença de zoósporos e mudança de coloração. ................................. 24
Figura 4. Aspecto simtomológico após a inoculação em diferentes plantas hospedeiras
de Phytophthora capsici oriundo de berinjela (Solanum melongena). A. Frutos de tomate
recobertos de micélio superficial; B. Fruto de berinjela com ausência de micélio
superficial e abundante de esporulação; C. Frutos de abóbora de pescoço verde repletos
de micélio superficial, expressando sintomas diferenciais em áreas do tecido com
ferimento; D. Frutos de abóbora de pescoço seca repletos de micélio superficial, tanto em
tratamentos com como sem ferimentos. ......................................................................... 25
Figura 5. Sintomatologia de Phytophthora capsici em frutos de berinjela inoculada com
diferentes volumes de inóculo na concentração de 104 zoósporos mL-1. ....................... 28
11
1. INTRODUÇÃO
A berinjela (Solanum melongena L. – Solanaceae) é originária da Índia e foi
introduzida no Brasil no século XVI pelos portugueses. Os árabes, os orientais
(principalmente os japoneses) e seus descendentes são os maiores consumidores desta
olerícola. É cultivada em maior escala nos estados de São Paulo, seguido de Minas Gerais
e da região Sul do País (CHOUDHURY, 1976). A pesquisa científica com esta espécie
teve início em 1937 no Instituto Agronômico de Campinas (IAC), com a introdução de
sementes de alguns materiais comerciais. Em 1940, foram instalados os primeiros ensaios
para avaliação das variedades de berinjela recém-introduzidas (FILGUEIRA, 2000).
Há disparidade entre os dados de produção e área cultivada com berinjela no Brasil.
A partir de 2001, houve um “boom” da cultura em função da divulgação dos benefícios
pelos quais ela responde na prevenção e tratamento do diabetes. De acordo com
informações fornecidas por entidades estaduais de extensão rural, a área cultivada em
2005 foi de 700 ha, em MG, PR e DF com produção de 18.500 t e produtividade média
de 27,4 t/ha. Entretanto, somente no estado de São Paulo, segundo o Instituto de
Economia Agrícola, a área plantada em 2004 foi de 1,3 mil ha, com produção de 46,0 mil
t, perfazendo a produtividade média de 35,4 t/ha (BRASIL, 1988; RIBEIRO et al., 1998).
A murcha-de-fitóftora (Phytophthora capsici) geralmente é observada nas horas mais
quentes do dia. As plantas afetadas apresentam podridão de raiz e da base do caule. A
doença ocorre em reboleiras (padrão comum de doenças de solo), sendo a disseminação
realizada pela água da chuva ou de irrigação. Em condições de alta umidade, o patógeno
pode afetar os frutos, causando podridão dos mesmos, formando um micélio abundante
de cor branca a marrom na sua superfície, representada por micélio e esporângios. A
doença é favorecida por altas temperaturas (25 a 30 oC) e umidade elevada do solo. E
também afetam frutos nas lavouras em condições de alta umidade. Os frutos apodrecem
de maneira rápida no campo ou pós-colheita, quando preservada a alta umidade
(EMBRAPA, 2007).
Apresenta como hospedeiros inúmeras plantas superiores, sendo a maioria
pertencentes as famílias Solanaceae e Cucurbitaceae (LUZ e MATSOUKA, 2001). A
espécie P. capsici é um importante patógeno de hortaliças, causando grandes perdas em
12
todo o mundo. Causa a murcha ou requeima do pimentão, bem como murchas e podridões
de frutos em outras hortaliças solanáceas e em cucurbitáceas (ZAMBOLIM et al., 2000).
Em alguns patossistemas como citros (DAVIS, 1982), seringueira (CHEE, 1969), entre
outros hospedeiros arbóreos são também infectados por espécie de Phytophthora.
O patógeno P. capsici descrito originalmente por Leonian em 1922 (Phytopathology
12(9): 403, 1922) pertence ao Reino Chromista, Classe Oomycota, subclasse
Peronosporea, Ordem Peronosporales, Família Peronosporaceae, Peronosporidae
(INDEX FUNGORUM, 2015). Esta espécie na sua fase assexuada é representado por
esporangióforos, esporângios limoniformes e papilados, e massa plasmodial
indiferenciada; no interior do esporângio por ação artificial de choque térmico pode
induzir a formação de zoósporos biflagelados e móveis. A fase sexuada é representada
por dois tipos de gametângios, o oogônio e o anterídio que por fertilização originam o
oósporos, esporo de resistência formado geralmente no final do ciclo da hospedeira
(ERWIN e RIBEIRO, 1996). O objetivo deste trabalho é verificar as formas de
inoculação e patogenicidade de Phytophthora capsici em frutos de berinjela.
13
2. REVISÃO DE LITERATURA
O pseudo-fungo Phytophthora capsici foi primeiramente descrito por Leonian (1922)
como o agente causal da murcha da pimenta – Capsicum annuum L., no Novo México,
Estados Unidos. Embora originalmente descrito como um patógeno que apresentava
especificidade de acordo com Tucker (1931), a especificidade não é um critério
taxonômico robusto para Phytophthora capsici devido infectar um número de outras
espécies vegetais, incluindo frutos de berinjela (KATSURA e TOKURA, 1955), capulhos
de algodão (GARBER et al., 1986), pimenta-do-reino (TSAO,1991), cacau
(ZENTMYER et al., 1977), tomate (JONES et al., 1991), e muitas outras hospedeiras. As
doenças são representadas por sintomas de manchas foliares, podridões de colo, caule e
raízes. Este patógeno foi redescrito para acomodar uma ampla gama de biótipos, tais
como incluir Phytophthora palmivora MF4 isolado que causa podridão-parda-do-cacau
e murcha-de-pimenta-do-reino (TSÃ, 1991).
Farr e Rossman (2014) apontaram que existem no mundo 102 registros de ocorrência
de espécies de Phytophthora que infectam espécies de plantas pertencentes a
espécie Solanummelongena. As espécies de Phytophthora que
infectam Solanummelongena são P. arecae = P. palmivora (Índia), P. boehmeriae
(Japão), P. cactorum (Itália e Estados Unidos), P. capsici (Austrália, Brasil, Bulgária,
França, Havai, Coréia, Taiwan e Venezuela), P. cryptogea (Grécia, Irã e Espanha), P.
drechsleri (EUA), P. hibernalis (Israel), P. infestans (China, República Dominicana,
França, Alemanha, Índia, Itália, Rússia, EUA, Zimbabwe), P. iranica (Irã), P. meadii
(Índia), P. megasperma (Japão), P. melongenae = P. nicotianae (Filipinas, Taiwan,
Tanzânia, Tailândia), P. nicotianae (Brasil, China, Grécia, Índia, Indonésia, Irã, Itália,
Coréia, Malásia, Mauritus, Papoa Noca Guiné, Filipinas, Porto Rico, Taiwan, EUA,
Índias Oeste), P. nicotianae var. nicotianae = P. nicotianae (Austrália, Porto Rico, Ilhas
Virgens), P. nicotianae var. parasitica = P. nicotianae (Austrália, Barbados, Brasil, Porto
Rico, Ilhas Virgens), P. palmivora var. palmivora = P. palmivora (Cote d’Ivoire,
Indonésia, Filipinas, Porto Rico), P. parasitica = P. nicotianae (Cote d’Ivone, Grécia,
Guadalupe, Havai, Índia, Martinica, Mauritus, EUA, Tailândia, Venezuela, Zimbabwe),
P. phaseoli (Filipinas), Phytophthora sp. (Brasil, EUA, México), P. taihokuensis = P.
nicotianae ( China, Taiwan), P. tropicalis (Havai).
14
A doença causada por Phytophthora capsici
O patógeno expressa sintomas em todos os estádios de desenvolvimento. Em viveiro,
causa murcha e tombamento de mudas e, em campos causa murcha, podridão e necrose,
dependendo do órgão afetado da planta (LUCAS et al., 1991).
Por ser um microrganismo que sobrevive no solo, geralmente os sintomas se iniciam
pelo sistema radicular, ocasionando a murcha na parte aérea da planta. A murcha pode
ocorrer em plantas individualizadas, mas, em questão de poucos dias, o ataque se estende
em reboleira (LUZ et al., 2001). Nas aboboreiras (C. maxima) infecta diretamente os
frutos expressando sintomas iniciais representados por uma mancha aquosa que, durante
dois a três dias, torna-se acinzentado pela numerosa quantidade de micélio,
esporangióforos e esporângios. As folhas, raízes e caule podem ser afetados, embora em
frutos as lesões aquosas e amolecidas seja mais notável. As sementes são atingidas através
dos frutos contaminados, assumindo um coloração pardo-escura (MELO, 1987).
Eventualmente em berinjela, jiló e tomateiro (Solanum melogena, S. gilo e S. esculentum),
os sintomas surgem como no pimentão (ANSANI et al.,1987). Em pimentão o sintoma
também é de apodrecimento de frutos e variação entre as cultivares da produção de
micélio versus produção de esporângios.
Agrios (1997) descreve que na fase pós-colheita, os sintomas incluem apodrecimento
dos frutos acompanhado por um rápido crescimento micelial, como ocorre em abóboras,
pepinos e pimentões. Em frutos como o tomate, as lesões são marrons ou castanhos e
muitas vezes, com anéis concêntricos. Em berinjela, o sintoma é conhecido como
“podridão-algodão”, devido ao aspecto cotonoso do desenvolvimento do micélio e dos
esporângios na superfície do fruto, no qual esses sintomas podem confundir com Pythium.
No verão brasileiro e nas regiões onde predominam a temperatura e umidade relativa
elevadas, os surtos de Phytophthora spp. na fase pós-colheita são frequentes em
pimentão, berinjela, abóbora de pescoço seca e abóbora de pescoço verde. O fungo é
considerado um grande causador de perdas em virtude da infecção latente que ocorre no
campo até a fase de colheita, cujos sintomas se tornam evidentes na fase de
comercialização, depois de os produtos terem sido colhidos, classificados, embalados e
transportados (AGRIOS,1997).
15
Devido as elevadas umidades e temperaturas acima de 24ºC, as infecções por
Phytophthora ocorrem geralmente em campos, associados a pouca ventilação ou
microclimas excessivamente úmidos, favorecendo a liberação de zoósporos e sua
penetração no hospedeiro, onde permanece latente até a doença se manifestar. A
disseminação de Phytophthora ocorre principalmente em condição de alta umidade
relativa e a presença de água livremente do orvalho ou da chuva, ou de respingos de água
de irrigação. Podem ocorrer disseminação por meio de contato direto de um órgão doente
com os sadios, durante o transporte e o armazenamento. O fungo sobrevive no solo em
restos de cultura (na forma de oósporos por no máximo 10 anos), em caixas e armazéns
(HENZ, 2006).
Até o ano de 2015 os registros de ocorrência de P. capsici infectando espécies de
Solanum spp. no mundo abrangem jiló no Brasil (MENDES et al., 1998), tomate (S.
lycopersicon nos EUA e Perú por DONAHOO e LAMOURE (2008), em S. marginatum
na Itália por ERWIN e RIBEIRO (1996), e oportunamente na berinjela registrado na
Austrália (SHIVAS, 1989), no Brasil (MENDES et al., 1998), na Bulgária (VANEV et
al., 1993), na França (OUDEMANS e COFFEY, 1991; OUDEMANS et al., 1994;
DONAHOO e LAMOURE, 2008), no Hawai (OUDEMANS e COFFEY, 1991), na
Coréia (CHO e SHIN, 2004), em Taiwan (ANONYMOUS, 1979) e na Venezuela
(DENNIS, 1970). Infectando Solanum melongena var. esculentum foi identificado na
Argentina (ERWIN e RIBEIRO, 1996), na Itália (ERWIN e RIBEIRO, 1996), no Japão
(ERWIN e RIBEIRO, 1996), em Taiwan (ERWIN e RIBEIRO, 1996), e na Venezuela -
(ERWIN e RIBEIRO, 1996).
Agente etiológico
Segundo Erwin e Ribeiro (1991) algumas espécies de Phytophthora produzem
esporos assexuais em condições ambientais adequadas, que geralmente incluem
temperatura ideal e umidade, como exibidos em condições de câmara úmida (Fig. 3) e
exibem uma transição de crescimento vegetativo rápido em um meio relativamente rico
para retardar o crescimento.
A estrutura mais comum, a assexual, é denominada de esporângio (plural:
esporângios) ou zoosporângio, devido conter em seu interior zoósporos biflagelados e
móveis. Os esporângios são suportados em esporangióforos que emergem através da base
16
do esporângio que contém em seu interior um número de zoósporos variáveis entre as
espécies de Phytophthora. Em outras espécies, novos esporangióforos proliferam logo
abaixo as bases do antigo esporângio (ou seja, eles são simpodiais, o que significa
"compartilham da mesma base") ocasionando uma maior produção de esporângios por
esporangióforos (ERWIN e RIBEIRO, 1996).
Para se reproduzir de maneira sexuada, o patógeno necessita de dois talos (isolados)
compatíveis, denominados de A1 e A2. O oósporo, fruto dessa combinação, é um esporo
de origem sexual, globoso, que representa a principal estrutura de sobrevivência de P.
capsici. Sob condições favoráveis, pode germinar diretamente, emitindo um tubo
germinativo, que pode ser infectivo. Também pode germinar indiretamente quando o tubo
germinativo produz um ou mais esporângios em sua extremidade. Tanto o grupo A1 como
o A2 foram encontrados no Brasil em epidemias com solanáceas e cucurbitáceas (PAZ-
LIMA, 2006).
Os esporângios variam em forma e tamanho. As formas são um tanto diferentes para
uma espécie em particular, mas são muitas vezes variáveis e vão desde esférico, sub-
esférica, ovóide, obovóide, elipsóide, limoniforme (forma de limão), piriforme (como
uma pêra), obpiriforme (de cabeça para baixo forma de pêra), obturbinado (como um ovo
de cabeça para baixo). Esporângios apresentam coloração hialina (ERWIN e RIBEIRO,
1996).
A partir dos oósporos presentes no solo e em restos de culturais, o fungo germina
e produz micélio e esporângios, que representam os propágulos de infecção (Fig. 1B). Em
condição ambiental favorável, os esporângios liberam os zoósporos, que, na presença de
água livre no solo e na superfície da planta hospedeira, movimentam-se rapidamente, até
encistar e iniciar o processo de infecção. As lesões causadas pelo fungo desenvolvem-se
rapidamente em clima úmido e quente, provocando o apodrecimento completo dos órgãos
suculentos do hospedeiro. A partir dessas lesões, numerosos esporângios e zoósporos são
produzidos, levando à ocorrência de infecções secundárias ou a surtos em reboleiras. Em
pós-colheita, a infecção primária ocorre quando estruturas de fungo presentes em
produtos, embalagens ou ambiente encontram condições ideais de germinação e
penetração na hospedeira. A seguir, os tecidos são colonizados e passam a produzir novos
propágulos, que iniciam novos ciclos da doença (ZAMBOLIM et al., 2000).
Manejo
17
Para controle desta doença no mundo têm utilizado fungicidas que possuem como
ingrediente ativo Metalaxyl ou Mefenoxam. Entretanto, seu uso no Brasil é ilegal pelas
normas do Ministério da Agricultura, uma vez que este fungicida ainda não está registrado
para esta doença em solanáceas (REIS e HENZ, 2008). No ano de 2015, para a cultura da
berinjela o único produto registrado é o oxicloreto de cobre (Cupravit Azul Br®), não
havendo nenhum produto recomendado para controle de P. capsici (AGROFIT, 2015).
Outras medidas de manejo das doenças causadas por P. capsici em hortaliças
devem ser adotadas para reduzir a incidência, medidas de manejo da irrigação, culturais
incluindo redução da quantidade do inóculo inicial (ZITTER et al. 1996).
De acordo com Zambolim (2000) a doença deve ser controlada ainda na fase de
cultivo, pela adoção de práticas culturais, como: escolher solos de textura mais leve para
o plantio; evitar plantios em épocas chuvosas; irrigar somente quando necessário; adotar
rotação de culturas com gramíneas, alface, beterraba e aliáceas. O manejo de água de
irrigação é um dos fatores mais importantes no controle. Na fase final de cultivo, os frutos
de muitas hortaliças podem ser facilmente infectados por estarem em contato direto com
o solo, no caso das abóboras, ou então muito próximos, no caso do pimentão e da
berinjela. Como o fungo causa infecção latente, medidas tomadas depois da colheita são
apenas paliativas.
18
3. MATERIAIS E MÉTODOS
O experimento foi conduzido nos Laboratórios de Microbiologia e Fitopatologia
do Instituto Federal Goiano - Campus Urutaí no segundo semestre de 2014.
3.1. Isolamento, seleção e teste de patogenicidade de isolados fitopatogênicos em
berinjela e jiló.
O isolado de Phytophthora capsici foi obtido de frutos de berinjela coletados no
município de Pires do Rio, GO, apresentando sintomas de podridão, onde notou-se a
presença de sinais do patógeno na superfície dos frutos. Utilizando o método de pescagem
direta transferiu-se propágulos do fungo dentro da câmera de fluxo laminar, inoculando-
se diretamente em meio de cultura BDA contendo antibióticos (Amoxicilina).
Após 48 horas repicou-se discos de micélio para placas de Petri contendo meio de
cultura suco de tomate - ST (200 mL de suco de tomate, 3 g de carbonato de cálcio, 20 g
de ágar, 800 mL de água destilada [20%]). Os isolamentos resultaram em 4 cepas ou
isolados que foram selecionados utilizando como parâmetro o teste de patogenicidade.
Após repicagens visando purificação do isolado quatro isolados (cepa I, II, III e IV) e
seus discos de micélio foram inoculados em frutos de berinjela e jiló (inoculado somente
cepa II), com e sem ferimentos, representados por três repetições, para selecionar os
isolados patogênicos e purificados.
Após a inoculação, os isolados permaneceram sob condições de câmara úmida, que
consiste em pulverizar o fruto e o pote plástico com água destilada (ambos previamente
desinfestados), forrando o fundo com papel mata borrão, em seguida vedando com filme
plástico para manutenção das condições de 100 % de saturação de umidade. Após a sete
dias, com a manifestação dos sintomas fragmentos do tecido interno de frutos de berinjela
foram repicados diretamente para meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA). Desta
forma, obteve-se as culturas puras utilizadas nos próximos experimentos.
3.2. Caracterização e patogenicidade utilizando disco de micélio em diferentes
19
hospedeiros.
Foram realizados dois ensaios que seguem descritos a seguir: A cepa II obtida da
seleção prévia realizada no item 2.1. foi cultivado por um período de sete dias em câmara
de crescimento (25 oC, 12 horas de fotoperíodo). Sobre esta cultura matriz, no interior da
câmara de fluxo laminar, foram realizados recortes de discos de micélio (9 mm de
diâmetro). Estes discos foram transferidos para a superfície dos frutos de tomate,
berinjela, jiló, abóbora de pescoço seca e abóbora de pescoço verde, sob duas condições
de inoculação: i) com ferimento e ii) sem ferimento.
Estes frutos inoculados (dois a quatro repetições conforme Tab. 2) permaneceram
sob condições de câmara úmida conforme descrito no item anterior. Após sete dias os
frutos (com número de repetições de 2-4) foram avaliados quanto a presença de sintomas
(+ positiva ou - negativa patogenicidade) (Tab. 2), quantidade de micélio superficial
(ausente, abundante, mediana), produção de esporângio (ausente, raro, abundante) e
descrição sintomática. Através desses parâmetros qualitativos descreve-se o tipo de
reação dos tratamentos com e sem ferimento que os hospedeiros apresentaram com a
inoculação.
No intuito de confirmar os resultados descritos acima o mesmo ensaio foi repetido
e os procedimentos de avaliação resumidos na Tabela 2.
3.3 Efeito de diferentes volumes de suspensões de zoósporos na expressão de
sintomas
Frutos de berinjela de ensaios anteriores que apresentavam na sua superfície
abundante esporulação (Fig. 1B) foram coletados e, através de uma raspagem e
consequente lavagem com água destilada estéril, produzindo uma suspensão de
esporângios e hifas. Estas foram submetidas ao choque térmico cobrindo-se com água
destilada estéril, sendo depositadas em geladeira (+8-18 oC) por um período de 1 hora.
Após esse período, retirou-se a suspensão e deixou-as sobre a bancada por 30 minutos
para diferenciação da área plasmodial do esporângio em zoósporos. Após verificado, em
microscópio estereoscópio a movimentação dos zoósporos liberados na suspensão,
utilizou-se a câmara de Newbauer ou hematocitômetro para contagem de zoósporos
chegando a concentração de 1.104 zoósporos.mL-1(conforme testes estabelecidos por Paz-
Lima, 2006). Após realização da contagem, alíquotas nas concentrações de 50 µL, 100µL,
20
150 µL e água pura (Fig. 1A) foram depositadas na superfície de um fruto de berinjela
previamente perfurado. Antes da inoculação os frutos foram pulverizados com álcool e
água destilada.
Figura 1. Condições experimentais de atividades de inoculação de Phytophthora capsici.
A. fruto com diferentes volumes de inóculo, B. granulações representam os esporângios
na superfície do tecido do fruto de berinjela
Foram utilizados quatros frutos de berinjelas com ferimentos feitos com a pinça
esterilizada, cada fruto havia quatro pontos diferentes com ferimentos. Os frutos foram
mantidos em câmara úmida. Após cinco dias foram avaliados a expressão de sintomas.
A mesma metodologia descrita no experimento acima foi repetida, diferindo que
os frutos (duas repetições) foram avaliados aos cinco e sete dias após a inoculação.
B
A
21
3.4. Inoculação de frutos de berinjela utilizando disco de micélio e palito de dente.
Nesta etapa utilizou-se como inóculo o micélio fúngico. Utilizando a cepa II de P.
capsici, utilizou-se duas formas de inoculação para expressar a virulência do isolado em
frutos de berinjela, pimentão verde e pimentão vermelho representadas por: i) inoculação
através de discos de micélio, ii) inoculação por palito de dente.
A inoculação através de discos de micélio foi realizada a partir de uma cultura
padrão (Fig. 2) utilizando o cortador de discos de micélio (9 mm de diâmetro)
transferindo-se sob a superfície de frutos de berinjela, pimentão verde (Capsicum
annuum) e pimentão vermelho (Capsicum annuum), duas repetições, nas regiões
previamente perfuradas. Após sete dias a inoculação os frutos inoculados foram avaliados
quanto a presença de sintomas.
A inoculação através de palito de dente foi realizada, depositando os palitos ao meio
aos dois dias após a inoculação do disco de micélio na cultura, após o período de sete dias
retirou-se os palitos e inoculou nos tratamentos propostos.
Figura 2. Aspecto colonial de cultura de Phytophthora capsici.
.
22
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Teste de patogenicidade e seleção dos isolados patogênicos oriundos do
isolamento.
Os isolados I e IV foram negativos em berinjela tanto na forma de inoculação com
ou sem ferimento (Tabela 1). Este patógeno é muito agressivo e seu mecanismo de
infecção classicamente utiliza-se de veículo de infecção direta ou por ferimentos (LUZ et
al., 2001).
Após sete dias de inoculação, o teste de patogenicidade foi positivo para os
isolados de cultura II e III em berinjela; e para o isolado de cultura II em jiló, tanto na
forma de inoculação com como sem ferimento (Tab. 1). Frutos aos quais artificialmente
induziu-se a formação de portas de entrada (ferimento), o patógeno expressou a reação
com os hospedeiros, não conceitual para fungos fitopatogênicos tipicamente agressivos
(BERGAMIN FILHO et al., 1995; AGRIOS, 1997).
Durante os isolamentos, as culturas eram mistas, não continham apenas
Phytophthora. Foram verificados somente estruturas vegetativas, não formando
estruturas reprodutivas essenciais para identificação do patógeno, por isso realizou-se o
teste de patogenicidade, para verificar a reprodução dos sintomas iniciais e seleção e
purificação do isolado original. Erwin e Ribeiro (1996) também propuseram como
alternativa de recuperação de cepas a inoculação e a repicagem de tecidos de plantas
inoculados com o isolado misto (mais de uma espécie de fungo na cultura e não
identificado.
É comum outras cepas de espécies como Fusarium sp. em isolamentos
(considerado contaminante) sendo facilmente confundidos como isolamentos de
Phytophthora. O teste de patogenicidade permitiu identificar através da reação
sintomática quais cepas da culturas obtidas eram fitopatogênicas e, consequentemente, os
isolados de Phytophthora.
23
Tabela 1. Patogenicidade dos quatro isolados de culturas mistas com Phytophthora
capsici obtidos a partir de sintomas de frutos de berinjela sintomáticos oriundo de Pires
do Rio, GO (2014).
Ord. Código da CEPA Hospedeiro inoculado
Tipo de
inoculação Patogenicidade
1 Cepa I
Berinjela (Solanum
melongena) CF -
Berinjela (S.melongena) SF -
2 Cepa II Berinjela (S.melongena) CF +
Berinjela (S.melongena) SF +
3 Cepa III Berinjela (S.melongena) CF +
Berinjela (S.melongena) SF +
4 Cepa IV Berinjela (S.melongena) CF -
Berinjela (Solanum
melongena) SF -
5 Cepa II Jiló (Solanum gilo) CF +
Jiló (Solanum gilo) SF +
* CF (com ferimento), SF (sem ferimento), - (patogenicidade negativa), +
(patogenicidade positiva).
24
A inoculação em frutos de berinjela (Fig.3) desencadeou sintomas de
apodrecimento de frutos em berinjela, provocando a mudança da coloração do arroxeado
ou negra da superfície do fruto, para uma coloração castanha. A alteração da coloração
na superfície do fruto é um dos principais marcadores morfológicos da virulência e
colonização do isolado.
Figura 3. Sintomas obtidos a partir de inoculações de culturas mistas de Phytophthora
capsici. A. fruto de berinjela com mudança de coloração; B. fruto de jiló apodrecido com
mudança de coloração; C. fruto de berinjela em estágio avançado de desenvolvimento
demonstrando a presença de zoósporos e mudança de coloração.
B C
A
25
4.2. Teste de patogenicidade utilizando disco de micélio.
Após sete dias a inoculação, em tomate (Solanaceae), jiló (Solanaceae), berinjela
(Solanaceae) e abóbora de pescoço verde (Cucurbitaceae) a abóbora de pescoço seca
(Cucurbitaceae), a patogenicidade foi positiva com agressividades diferenciais aos sete
dias após a inoculação (Figura 4).
Figura 4. Aspecto simtomológico após a inoculação em diferentes plantas hospedeiras
de Phytophthora capsici oriundo de berinjela (Solanum melongena). A. Frutos de tomate
recobertos de micélio superficial; B. Fruto de berinjela com ausência de micélio
superficial e abundante de esporulação; C. Frutos de abóbora de pescoço verde repletos
de micélio superficial, expressando sintomas diferenciais em áreas do tecido com
ferimento; D. Frutos de abóbora de pescoço seca repletos de micélio superficial, tanto em
tratamentos com como sem ferimentos.
O isolado de berinjela cepa II foi fitopatogênico em todos os hospedeiros testados
nos tratamentos com ferimento, no entanto, em pelo menos uma repetição de tomate,
abobrinha e jiló, nos tratamentos sem ferimento (Tab. 2), a cepa foi avirulenta (sensu
ANDRIVON, 1993). No hospedeiro de origem - a berinjela, o patógeno foi virulento tanto
nos tratamentos com como sem ferimentos (Tab. 2). A porta de entrada representada pelos
ferimentos representa um veículo de infecção para muitos patógenos, com elevada ou
reduzida agressividade, ou com especificidade,ou ainda ampliação da capacidade
A B
C D
26
patogênica e de expressão da virulência nos tecidos das plantas (AGRIOS, 1997;
AMORIM et al., 2011). Uma das características de P. capsici é de ser um patógeno em
que a variação de agressividade e expressão de sintomas está fortemente ligado as
condições de umidade (ERWIN e RIBEIRO, 1991; ERWIN e RIBEIRO, 1996;),
apresentando apenas sintomatologia diferenciada (Tab. 2).
A produção de micélio superficial (Tab. 2) nas inoculações foi ausente para o jiló,
abundante para a berinjela (esperado para o hospedeiro de origem do isolado) e abóbora
de pescoço seca, mediano para a cultura do tomate. A produção de estruturas reprodutivas
no ciclo das relações patógenos hospedeiros pode representar um tipo de reação planta-
patógeno (AGRIOS, 1996; BERGAMIN FILHO et al., 1995), permitindo classificar a
reação de resistência-suscetibilidade, pois hospedeiros resistentes apresentam pouca
abundância de micélio superficial e pouca área de tecido necrosado, e hospedeiros
suscetíveis apresentam tanto abundância de micélio superficial como presença de
esporulação. É importante ressaltar que a produção massal apenas de micélio, é uma
indicação de fonte de carbono para desenvolvimento de estrutura micelial na superfície
do tecido que o hospedeiro está fornecendo.
Assim como Ansani (1987), foi verificado a virulência, agressividade e
patogenicidade de P. capsici em jiló, berinjela e tomate, sendo este um registro desta
endemia na cidade de Urutaí, GO.
A verificação da produção de esporângios quando órgãos inoculados
artificialmente, é uma medida relacionada com o grau de suscetibilidade, pois os ciclos
de infecção-colonização-reprodução, nos hospedeiros com máxima suscetibilidade (LUZ
et al., 2001; AMORIM et al., 2011), como ocorreu com jiló e berinjela, a esporulação do
patógeno foi verificada em microscópio estereoscópico com maios intensidade do que os
demais tratamentos testados (Tab. 2).
A descrição sintomática visual é uma representação técnica e descritiva do da
reação patógenos-hospedeiro nas inoculações realizadas artificialmente, permitindo
reconhecer detalhes da patogenicidade e da relação patógeno hospedeiro (Tab. 2)
27
Hospedeiros
inoculação Rep CF SF
Micélio
superficial
Produção de
esporângios Descrição sintomática
1 + + Ausente Abundante
Frutos com sintoma de podridao de coloracao
marron chocolate, não há observação de
esporução recobrinco a superficie do fruto, frutos
com dimensaoes de 3,5 x 6 cm com toda supercie
apodrecida aos 7 dap.
2 + - Ausente Abundante
1 + + Abundante Abundante
Fruto totalmente apodrecido, havendo mudança da
coloração do negro para paleo-marron, observou-
se abundância de micélio superficial produzido.
2 + + Abundante Abundante
3 + + Abundante Abundante
4 + + Abundante Abundante
1 + + Abundante Ausente
1. Fruto parcialmente apodrecido, não havendo
mudança da coloração do verde, observou-se
abundancia de micélio superficial produzido.
2 + - Abundante Ausente dimensões 5 x 7,5 cm
3 + + Ausente
2. Apodrecimento parcial, não havendo produção
de micélio superficial, sintoma de necrose, lesão
chocolate-marron na metade do diâmetro da lesão
1 + + Mediano Ausente
Furto parcialmente apodrecido, não havendo
mudança de coloração do rajado verde, produção
de micélio apenas na metade do diametro da lesão.
2 + - Mediano Ausente
3 + - Mediano Ausente
Sintoma de apodrecimento tomando o fruto inteiro
somente nos tratamentos com ferimento, produz
micélio superficial, nas extremidades da lesão
observa-se uma mancha aquosa sem a presença de
micélio (halo
1 + - Mediano Ausente
2 + + Abundante Rara
Produção de micélio abundante, de coloração
branca e superficial, pouca esporulação.
Abóbora cabeça seca
(Cucurbita moschata )
Jiló (Solanum gilo )
Berinjela (S.
melongena )
Tomate (S.
lycopersicon )
Abobrinha de cabeça
verde (Cucurbita pepo )
Tabela 2. Teste de patogenicidade, produção de micélio superficial e esporângios,
descrição sintomática de Phytophthora capsici inoculado em diferentes hospedeiros.
* CF (com ferimento), SF (sem ferimento), - (patogenicidade negativa), + (patogenicidade positiva).
4.3. Efeito de diferentes quantidades de suspensões de zoósporos na expressão de
sintomas
O volume de suspensão de zoósporos 150µL permitiu verificar a expressão do
sintoma de apodrecimeto. O maior volume contendo inóculo foi decisivo para ocorrência
do encistamento e infecção pelo patógeno, e que no solo a dinâmica de movimentação no
perfil do solo dá-se pela movimentação dos zoósporos nos filmes d’água até o
reconhecimento de seu hospedeiro (DAVIS, 1982). A agressividade de muitos patógenos
é favorecida pela presença de portas de entrada, como ferimentos (Figura 5), acelerando
28
a expressão de sintomas e aumentando a agressividade, principalmente em condições
artificiais, como apontam Bergamin Filho et al. (1995) e Agrios (1997). Erwin e Ribeiro
(1996) apontaram que ambas as formas de infecção mais clássicas representadas pela
“direta – penetração através de dissolução da parede celular por enzimas do patógeno” e
por “ferimento”, sendo este último uma ampliação da zona de favorabilidade.
Figura 5. Sintomatologia de Phytophthora capsici em frutos de berinjela inoculada com
diferentes volumes de inóculo na concentração de 104 zoósporos mL-1.
O teste foi negativo para os inóculos de 50 µL, 100µL de suspensão de zoósporos,
possivelmente porque o volume não carregava consigo o número proporcional de células
zoospóricas capazes de intectar e desencadear o sintoma de podridão.
No segundo ensaio, quando inoculou-se uma solução de água destilada não houve
a expressão de sintomas obviamente porque não havia o inóculo do patógeno capaz de
reagir.
Bergamin Filho et al. (1995) e Amorim et al. (2011), apontaram que a
agressividade das doenças no campo é ampliada com a interferência do tempo como fator
de ampliação da expressão e patogenicidade, como foi verificado na avalição aos 7 dias
em que todos os volumes de inóculo foram precursores da expressão de sintomas e
consequente patogenicidade (Tabela3).
O estado de maturação de frutos pode ser uma explicação da virulência da
suspensão de zoósporos aos cinco dias após a inoculação no tratamento de 150 µL, além
Água
29
da condição de escape na interação planta-patógeno amplamente discutido por Bergamin
Filho et al. (1995).
Tabela 3. Patogenicidade de Phytophthora capsici em frutos partidos de berinjela de
diferentes volumes de zoósporos (µL) sob a concentração de 104 zoósporos/mL em
diferentes dias de avaliação.
Dias de avaliação
Água
destilada 50 µL 100 µL 150 µL
5d - - - +
5d - - - -
5d - - - -
7d - + + +
7d - + + +
7d - + + +
* (-) não expressão de sintomas; (+) expressão de sintoma; d = dias
30
4.4. Inoculação de frutos de berinjela utilizando disco de micélio e palito de dente.
A inoculação de discos de micélio do isolado de P. capsici de berinjela em
berinjela, pimentão verde e pimentão vermelho demonstrou reação de virulência do
isolados para todos os hospedeiros. O método de inoculação de disco de micélio foi
eficiente para expressão de sintomas (Figura 6).
Figura 6. Formas de inoculação de Phytophthora capsici por discos de micélio e palito
de dente. A. frutos de berinjela inoculados com discos de micélio; B. frutos de pimentão
vermelho e verde inoculados com discos de micélio; C. fruto de berinjela inoculado com
palito de dente, D. fruto de pimentão verde e vermelho inoculado com palito de dente.
O uso de palito de dente como veículo de inoculação demonstrou reação virulência
do isolado positiva tanto em berinjela, pimentão vermelho e pimentão verde. Tanto a
técnica de discos de micélio como palito de dente apresentadas por Alfenas e Mafia
(2007) foram eficientes para desencadear a podridão-de-fitóftora nos hospedeiros
testados.
A
D C
B
31
5. CONCLUSÕES
A inoculação em frutos de berinjela provocou uma alteração morfológica de cor. O
tempo também é uns dos principais componentes da relação de patogenicidade de
berinjela com zoósporos de P. capsici. Esse trabalho mostrou as a virulência do isolado,
o volume de inóculo adequado e a forma de inoculação mais apropriada para estudos de
interação berinjela P. capsici.
32
6. LITERATURA CITADA
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