ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS

BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

por ELIANA SÁNCHEZ MOREANO

(2385)

DOCENTE: Ing. PAOLA CHILUIZA

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

ABRIL- AGOSTO 2015

TÉCNICAS MOLECULARES

Las técnicas moleculares desde la década de los 70 han sido empleadas como

herramientas para identificar distintos organismos, e incluso emparentarlos y así

conocer su línea evolutiva (mutaciones). En la actualidad, las técnicas moleculares han

permitido resolver un sinnúmero de incógnitas en el campo microbiológico y clínico,

puesto que han sido fundamentales en la detección de microorganismos de desarrollo

tardío o difícil en medios de cultivo, o aquellos que no sean detectables con pruebas

tradicionales como la serología. En tal virtud, el objetivo del presente trabajo es exponer

las principales técnicas moleculares que son aplicadas a nivel global.

Las Técnicas Moleculares pueden ser definidas como un conjunto de procedimientos o

metodologías cuya finalidad es detectar el material genético (ADN y ARN) y

caracterizarlo (mutaciones, translocaciones, etc.).

En términos generales, las ventajas y desventajas que se derivan de este tipo de técnicas

propias de biología molecular son:

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Desventajas:1) Falta de estandarización

(protocolos).2) Costosos

Ventajas:1) Alta sensibilidad.

2) Específicos3) Rapidez.

PCR es una reacción de amplificación del ADN; para este método se emplea la enzima

ADN polimerasa, la cual sintetiza el ADN de forma natural.

ELEMENTOS IMPORTANTES:

1) Sustrato: En base al sustrato que usemos en la PCR se distingue:

PCR: El sustrato es el ADN genómico.

RT-PCR: El sustrato es ADN complementario (ADNC) originado a partir del

ARNm (Transcripción inversa: Retrovirus)

2) Templado o molde: Generalmente ADN o ADNC

3) Enzima: ADN polimerasa (extraída de un microorganismo termófilo: Thermus

aquaticus).

4) Primers: Secuencias de oligonucleótidos.

5) Desoxirribonucleótidos tri-fosfatados.

6) Otros: Cofactor enzimático como es el Mg2+ (0,5 a 2,5 mM), solución buffer y agua.

ETAPAS DEL PROCESO:

a) Desnaturalización: Se calienta el ADN y las cadenas se separan (a 95°C durante

aproximadamente 20 a 30 s). A mayor contenido de C-G en el templado mayor

tiempo para romper los enlaces (C-G: 3 enlaces covalentes mientras A-T: 2).

Repetición de 30 a 35 ciclos de 3

pasos:

b) Hibridación: Alineación de los primers y posterior formación del complejo:

templado- primers (Temperatura: 50-60 °C).

c) Extensión: Actúa la ADN polimerasa en el complejo templado-primers

(Temperatura óptima para la actividad enzimática: 72 °C). (TAMAY DE DIOS et al,

2013)

VARIANTES:

Las variantes de este método son:

 

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

Touchdown PCR: Disminución gradual de la temperatura en cada

ciclo.

Hot start PCR: PCR que se lleva a cabo a altas

temperaturas, para evitar amplificar productos no deseados.

ADN polimerasa se activa a dichas temperaturas.

Colony PCR:PCR de colonias bacterianas, con el objetivo de identificar colonias que

contengan la secuencia de nucleótidos de interés.

Nested PCR: PCR que comprende  dos rondas

de amplificación con distintos pares de primers en cada una. Alta

sensibilidad de detección.

Multiplex PCR:Incluye más de dos primers en la

misma reacción o proceso.

PCR inverso: Reacción que amplifica las regiones flanquedas de un

fragmento de ADN, del cual se conoce su secuencia interna

RT-PCR: Emplea fragmentos pequeños de

ARN para obtener ADNc

PCR en tiempo real:Combina dos métodos: PCR

tradicional y las sondas fluorescentes (identificación)

AFLP: Detecta polimorfismos debido a

modificaciones en la secuencia de ADN que comprende los sitios de

corte de las enzimas de restricción.

PCR asimétrica: PCR que amplifica de manera

preferencial a una de las cadenas del ADN .

Mediante las técnicas de hibridación se sintetizan ácidos nucleicos bicatenarios a partir

de cadenas individuales mediante la complementariedad de sus bases nitrogenadas.

Consecuentemente, permite identificar el grado de relación existente entre los diferentes

tipos de ácidos nucleicos. (FERNÁNDEZ, s.f.)

SONDA DE HIBRIDACIÓN:

Fragmento de ácido nucleico de longitud variable que se utiliza para analizar las bases

complementarias de otra cadena de ácido nucleico.

TIPOS DE SONDAS: ADN, ARN y nucleótidos.

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN:

TÉCNICA DE

HIBRIDACIÓN

DESCRIPCIÓN

POR FILTRACIÓN

1) Se desnaturaliza el ADN o ARN.

2) Se lo inmoviliza en una superficie

inerte: nitrocelulosa.

3) Hibridación con una sonda marcada

(detección)

VARIANTES

SOUTHERN BLOT: Se transfiere el

ADN del gel sacarosa a una superficie

de nitrocelulosa y se lo hibrida con

sondas radioactivas o coloridas.

NORTHERN BLOT: Transfiere ARN

del gel de sacarosa a un medio inerte

adecuado para la hibridación.

DOT BLOTTING: Transferencia del

ADN al filtro de manera eficiente

debido a que emplea adaptadores.

IN SITU (HIS) 1) Se desnaturaliza el ADN a 95°C.

2) Se añade una solución que contiene la

sonda con el ADN o ARN marcado

3) Hibridación.

IN SITU CON

FLUORESCENCIA (FISH)

Procedimiento similar al anterior, pero emplea

sondas específicas para cromosomas o una

secuencia de ellos.

GENÓMICA COMPARATIVA

(CGH)

Detecta las amplificaciones o pérdidas de un

fragmento de ADN, mediante las

comparaciones de dos muestras de ADN

genómico (tumoral y normal).

GENE ARRAYS

Es otra variante de la hibridación con sondas.

Su objetivo es analizar el genoma completo de

un organismo (secuencia de genes,

mutaciones).

Se emplean membranas de blotting o placas de

micro titulación

TÉCNICA DEL ADN RECOMBINANTE: Clonación

Es una técnica que consiste en separar o

aislar una secuencia de ADN, para

posteriormente introducirla en un

plásmido. Para aislar la secuencia o gen

de interés se emplean enzimas de

restricción que cortan la cadena de ADN

por los grupos fosfato sin dañar las bases.

ETAPAS:

SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Es una técnica que permite conocer la secuencia exacta de nucleótidos de una muestra

de ácido nucleico.

FRAGMENTACIÓN: Se aisla el fragmento de interés mediante una enzima de restricción.

LIGACIÓN: Mediante la enzima ligasa, uniral ADN de interés al vector (plásmido o ADN circular)

TRANSFERENCIA: Una vez que se haya unido el vector al gen de interés, se los introduce en la célula (clonación).

SELECCIÓN: Escogemos las células que hayan manifestado el gen de interés

La secuenciación se puede dar de dos formas:

Directa: Se secuencia el producto de la PCR.

Indirecta: Se secuencia el producto de una clonación.

Para realizar una secuenciación se requiere de: una plantilla para copiar, un primer,

ADN polimerasa.

MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN:

En conclusión, las técnicas moleculares tienen un gran alcance en el análisis de

biomoléculas importantes como son los ácidos nucleicos, no obstante esa tecnología es

costosa y al no ser difundida ampliamente tiene una escasa estandarización. Las

técnicas moleculares poseen una alta sensibilidad y especificidad, y nos ayudan en la

solución de problemas asociados a organismos, ya que en base a su información

genética podemos entender su evolución (mutaciones), desarrollo y metabolismo, y

aprovechar las sustancias o metabolitos que producen o inhibir los tóxicos (silenciar un

gen).

MÉTODO ENZIMÁTICO O DE SANGER* Se separa la muestra en 4 alícuotas.* Consiste en emplea ADN polimerasa

para sintetizar cadenas de ADN con una terminación específica.

* Se realizan 4 reacciones de naturaleza enzimática: con menos contaminantes.

Se realizan en pocos días(FERNÁNDEZ, sf)

MÉTODO QUÍMICO* La muestra de ADN se fragmenta por

medio de 4 reacciones: Corte de purinas, adeninas, pirimidinas y

citosinas.* Permite distinguir los nucleótidos en

cada corte y deducir la secuencia.(NECOCHEA y CANUL, 2004)

PIROSECUENCIACIÓN*Enzimas adicionales: ATP- sulfurilasa, luciferasa y apirasa

* Sustratos adicionales: adenosin-fosfosulfato (APS) y luciferina * Mediante el empleo de estas enzimas vamos a tener reacciones

que generan señales luminosas y hace el proceso más rápido y barato (ahorramos en marcas luminosas).

(SANTAMARÍA, s.f.)

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Páginas web:

FERNÁNDEZ, P. Hibridación de los ácidos nucleicos. Fundamento teórico. Barcelona.

http://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-

bcfb-d75fd6b2ee9f

LLEONART, M et al. Técnicas de hibridación, clonación y secuenciación de ácidos

nucleicos en el diagnóstico anatomopatológico. Madrid.

http://www.conganat.org/seap/revista/v30-n3/13.pdf

NECOCHEA, R. y CANUL, J. (2004). Secuenciación de ácidos nucleicos.

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pd

f

PALOMINO, C y GONZALEZ, Y. Técnicas moleculares para la detección e

identificación de patógenos en alimentos: ventajas y limitaciones.

http://www.scielosp.org/pdf/rpmesp/v31n3/a20v31n3.pdf

PROUST, P. Clonación, ya nadie es único.

http://www.eiq.cl/pproust/ciencia/clonacion.pdf

SALAZAR, L. (2004). Técnicas de biología molecular.

SANTAMARÍA, R. Secuenciación.

http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/temas/8_Secuenciaci

%C3%B3n.pdf

STRAMBOULIAN. Técnicas Moleculares de microbiología en la práctica.

http://www.stamboulian.com.ar/pdf/tecnicas_moleculares.pdf

TAMAY DE DIOS, L et al. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.

http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf

Técnicas moleculares de detección de patógenos y de sus factores de virulencia.

http://cvb.ehu.es/open_course_ware/castellano/salud/tecnicasmol/tema-9-

tecnicas-moleculares-de-deteccion-de-patogenos-y-sus-genes-de-

virulencia.pdf

Variantes PCR. http://www.espanol.pcrlinks.com/barra/variantes.htm