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Doseamento microbiologico

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Treinamento sobre doseamento microbiológico.

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A potência (atividade) de um agente antimicrobiano é determinada comparando-se

a dose que inibe o crescimento do microrganismo sensível com a dose da

preparação padrão do agente que produz inibição similar.

INTRODUÇÃO

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MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA DOSAGEM DE ANTIBIÓTICOS

o Método da diluição em sérieo Macrodiluiçãoo Microdiluição

o Método turbidimétrico

o Método de difusão em ágar

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DILUIÇÃO EM SÉRIE - MACRODILUIÇÃO

Resposta: “tudo ou nada”

MIC

MIC

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DILUIÇÃO EM SÉRIE - MICRODILUIÇÃO

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PotênciaTesta-se concomitantemente padrão e amostra:

P = CIMA

CIMP

Para maior precisão, ensaia-se concentrações intermediárias entre o tubo com concentração inibitória mínima e o imediatamente anterior.

DILUIÇÃO EM SÉRIE

X 100

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DILUIÇÃO EM SÉRIE

Vantagenso Mais sensível a baixas concentrações que outros métodoso Fornece a CIM ativa da substância analisada

Desvantagenso A precisão está relacionada ao intervalo de concentração utilizadao Há interferência de soluções turvas ou coradaso Há necessidade do padrão e amostra serem estéreis

NÃO É MUITO UTILIZADO

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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

o Baseia-se na inibição do crescimento microbiano medido através da turbidez (transmitância ou absorvância) da suspensão de microrganismos adequados/sensíveis ao composto contido em um meio com o antibiótico.

o A resposta do microrganismo é função direta da concentração da substância.

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MÉTODO TURBIDIMÉTRICOPadronização do microrganismo para utilização no doseamento

35 ± 2 ºC20-24 h

Sol. fisiológica35 ± 2 ºC20-24 h

+

25% transmitância

530 nm

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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

Triplicata

Progressão geométrica

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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO35 ± 2 ºC3 a 4 horas

Λ = 530 nm

0,5 mL de formaldeído 12%

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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

P

Potência

Calcula-se a potência através de métodos estatísticos

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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

Vantagens

Mais rápido

Desvantagens

o O pH pode influenciar o crescimento do microrganismoo Há interferência de soluções turvas ou coradas (padrão e amostra não

devem precipitar em contato com o meio)o Padrão e amostra devem ser solúveis em água ou em solventes miscíveis

em concentração tal que não interfira no crescimentoo Há necessidade do padrão e amostra serem estéreis (substâncias

termolábeis não podem ser ensaiadas por esta técnica)

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DIFUSÃO EM ÁGARConsiderações gerais

Relaciona o tamanho da zona de inibição com a dose da substância ensaiada.O método emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído em placas, em sistema de bicamada, através do qual a substância teste se difunde. É fundamentalmente um método físico, no qual o microrganismo é usado como revelador.

Mas está sujeito a muitos outros fatores físicos e químicos além da simples interação entre o fármaco e o microrganismo:

Natureza do meioCapacidade de difusãoTamanho da moléculaEstabilidade da amostra

É essencial que se trabalhe com réplicas, de forma a compensar os desvios, inerentes ao ensaio ou acidentais.

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DIFUSÃO EM ÁGARMétodo- Testes preliminares

A partir de parâmetros especificados em ensaios anteriores e referentes a determinação da potência de antibióticos descritos pela Farm. Bras. IV, USP e FDA, são realizados testes preliminares para padronizar as condições a serem utilizadas verificando parâmetros como:

MicrorganismoMeio de culturaSolução diluente

Concentração do inóculoConcentração do fármaco

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DIFUSÃO EM ÁGAREnsaio do tipo quantitativo:

P1 P2

A1 A2

P

A1

P1

P3 P2

A1

A2

A3

A5

A2 A4

A3

5 X 1

3 X 3

2 X 2

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DIFUSÃO EM ÁGAR

Cultura de manutenção

Repique deve ser feito a cada 7 dias

Conservação: refrigerador a 4 ºC

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DIFUSÃO EM ÁGARRepique do microrganismo para utilização no doseamento

35 ± 2 ºC20-24 h

Sol. fisiológica35 ± 2 ºC20-24 h

+

25% transmitância

580 nm

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DIFUSÃO EM ÁGARPreparo das placas

Ágar

Papel de filtro

21 mL

Ágar inoculado (47 ºC)

Camada base

4 mL

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DIFUSÃO EM ÁGAREnsaio

Utilizando placas de Petri, em capela de fluxo laminar, transfere-se 21,0 mL de meio para cada placa (camada base).

Após a solidificação desta camada, adiciona-se 4,0 mL de meio inoculado. Assim que esta camada se solidificar, distribuir os cilindros ou templates de aço inoxidável.

Com auxílio de pipetador automático transfere-se as alíquotas de padrões e amostras, 200 µL, para cada orifício.

P1

P3 P2

A1

A2

A3 As placas devem ser incubadas a 35ºC ± 2ºC e após 18-20 horas medem-se os diâmetros dos halos de inibição com auxílio de um paquímetro.

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DIFUSÃO EM ÁGARPreparo das placas

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DIFUSÃO EM ÁGAR

Preparo das soluções padrão e amostra10mg do padrão primário ou o

equivalente em relação ao peso médio

BV 100mL

[100µg/mL]

BV 10mL BV 10mL BV 10mL[32µg/mL][8µg/mL] [16µg/mL]

0,8mL 1,6mL 3,2mL

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DIFUSÃO EM ÁGAR

E. coli

S. luteus

Diâmetro do halo é função da concentração do antibiótico• Relação linear: diâmetro do halo

(mm) X log da concentração

B. subtilis

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DIFUSÃO EM ÁGAR

A maneira como o antibiótico é colocado em contato com o meio de cultura define as seguintes técnicas utilizadas para difusão em ágar:

técnica de cilindros em placastécnica de orifícios ou poçinhostécnica de disco ou papeltécnica de gotas ou depósito em superfície

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DIFUSÃO EM ÁGAR – CILINDROS EM PLACA

Cilindros de vidro, porcelana, aço inoxidável, alumínio etc

Diâmetro interno: 6,0 mm ± 0,1 mmDiâmetro externo: 8,0 mm ± 0,1 mmAltura: 10,0 mm ± 0,1 mm

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DIFUSÃO EM ÁGAR – TEMPLATE OU MOLDES DE AÇO

o São moldes de aço inoxidável com orifícios nos quais são colocados as soluções padrão e amostra

o É o mesmo princípio da técnica cilindros em placa, porém o manuseio é mais prático

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DIFUSÃO EM ÁGAR – ORIFÍCIOS OU POÇINHOS

o São perfurados pequenos poços no meio de cultura através de instrumento adequado de maneira que forme um cilindro embutido no meio sólido

o Os halos podem ser irregulares se o instrumento que servirá para a construção dos orifícios não for padronizado

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DIFUSÃO EM ÁGAR – DISCO DE PAPEL

o Discos de papel com 13 mm de diâmetroo 60 µLo Solução P e A com pipeta ou imersão por tempo pré definidoo Os discos podem ser colocados manualmente com auxílio de pinça estéril

sobre a superfície do meio ou através de equipamento apropriado sobre o meio inoculado

o Amostra com alta concentração de solvente orgânico

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DIFUSÃO EM ÁGAR – GOTAS OU DEPÓSITO EM SUPERFÍCIE

o Adiciona-se 2 a 3 µL da solução P e A na superfície do ágar com microsseringa

o Permite automaçãoo Pouco utilizadoo A superfície do gel deve estar seca

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DIFUSÃO EM ÁGAR

Vantagenso Em todas as técnicas deste método as amostras não precisam estar

estéreiso As técnicas de cilindro e de orifício mostram-se mais sensíveis à

pequenas concentrações que a de discoo Técnica de disco é mais simples, rápida e de melhor precisão, além de

permitir o ensaio com altas concentrações de solvente orgânicoDesvantagenso As técnicas de cilindro e de orifício são mais trabalhosas e necessitam de

cuidados extremos no manuseio das placaso Suspensões interferem nas técnicas de cilindro e de disco

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DIFUSÃO EM ÁGARFatores que interferem no ensaio:

Conteúdo de água presente no meioQualidade do ágarDensidade do inóculopH do meio e das soluções utilizadasTempo e temperatura de incubaçãoForma ativa da substânciaCoeficiente de difusão da substância e velocidade de crescimento do microrganismo

Halos pequenos: deixar a substância difundir antes de incubarHalos grandes: incubar as placas antes de colocar as amostras

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DIFUSÃO EM ÁGAR

Cálculo dos resultados

Pot = Antilog M x 100

M = F/b b = E/I I = log R

E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)]

F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)]

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P1 P2 P3 A1 A2 A3

I 14,0 15,5 16,4 13,2 15,2 17,0

II 13,0 15,3 16,6 13,3 15,0 16,3

III 13,0 15,2 16,4 13,2 15,0 16,0

IV 13,2 15,4 16,6 13,1 15,3 16,4

V 13,0 15,0 16,6 13,2 15,2 16,2

VI 13,2 15,4 16,2 13,2 15,1 16,6

Soma 79,4 91,8 98,8 79,2 90,8 98,5

Média 13,23 15,30 16,47 13,20 15,13 16,42

DIFUSÃO EM ÁGARCálculo dos resultados

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DIFUSÃO EM ÁGARCálculo dos resultados - exemplo

I = log R (R=2)

I = log 2

I = 0,301

E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)]

E = ¼[(32,88-26,43)]

E = 1,6125

F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)]

F = 1/3[(44,75-45,00)]

F = -0,0833

b = E/I

b = 1,6125/0,301

b = 5,3571

M = F/b

M = -0,0833/5,3571

M = -0,01556

Pot = Antilog M x 100

Pot = Antilog -0,01556 x 100

Pot = 96,49%

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CONCLUSÃO

o A necessidade de confirmação da eficácia terapêutica dos produtos medicamentosos constitui-se em aspecto de preocupação. E ainda há que se considerar o aspecto econômico, assim como o de falsificação com moléculas estruturalmente similares.

o Os bioensaios são extremamente necessários para que se tenha um controle de qualidade eficaz destes antimicrobianos de uso tão difundido.

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