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DNA Microarrays
O que é DNA Microarray?
• Também conhecido como chip de DNA
• Permite a medida do nível de transcrição de cada gene no genoma (expressão dos genes)
• Transcrição?– Processo de cópia do DNA em RNA
mensageiro– Dependente do meio
• Microarray detecta mRNA
O que é DNA Microarray?
Cheung et al. 1999
Como fazer um microarray?
• Começa-se com genes individuais (p. ex. ~6,200 genes do genoma de fungos)
• Amplifica-se todos eles por PCR
• “Spot” todos em um meio, como por exemplo lâmina de vidro de microscopia.
• Cada spot tem 100 µm de diâmetro
• Spotting feito por um robô.
• Etapa complexa e crítica do processo.
Como fazer um microarray?
Cheung et al. 1999
Exemplo
• Fungo
• Cresce em ambientes aeróbicos e anaeróbicos
• Diferentes genes serão ativados no intuito de se adaptar a cada ambiente.
• Extrai-se o mRNA
• Converter o mRNA em cDNA marcado com fluorescência
Exemplo
• Misturar o cDNA
• Hibridizar com a sonda
• Cada sequência hibridiza com o gene correspondente no array
• Lavar o cDNA não hibridizado
• Ler com laser
• Analisar a imagem
Brown & Botstein, 1999
Lendo um array
• O laser escaneia o array e produz imagens
• Um laser para cada cor (um para verde, outro para vermelho)
• Análise da imagem:– Supressão de background– Localização e detecção dos spots, incluindo a
redução da intensidade de background, posição do spot e tamanho deste.
Lendo um array (cont.)Block Column Row Gene
NameRed Green Red:Green
Ratio
1 1 1 tub1 2,345 2,467 0.95
1 1 2 tub2 3,589 2,158 1.66
1 1 3 sec1 4,109 1,469 2.80
1 1 4 sec2 1,500 3,589 0.42
1 1 5 sec3 1,246 1,258 0.99
1 1 6 act1 1,937 2,104 0.92
1 1 7 act2 2,561 1,562 1.64
1 1 8 fus1 2,962 3,012 0.98
1 1 9 idp2 3,585 1,209 2.97
1 1 10 idp1 2,796 1,005 2.78
1 1 11 idh1 2,170 4,245 0.51
1 1 12 idh2 1,896 2,996 0.63
1 1 13 erd1 1,023 3,354 0.31
1 1 14 erd2 1,698 2,896 0.59
Real DNA Microarray
Y-fold
– Fold – quantas vezes– Expressão como repressão ou indução Y-fold
– Calculado como o inverso da razão• Razão de 0.33 = repressão 3-fold• Razão de 10 = indução de 10-fold
Codificação de cor
• Dados apresentados em escala de cor• Esquema:
– Verde: reprimido (menos mRNA)– Vermelho = induzido (mais mRNA)– Preto = sem mudança (1:1 ratio)
• Ou– Verde - controle (e.g. aeróbico)– Vermelho = experimento (e.g. anaeróbico)
• Somente usada razão
Complicação: Série em Tempo
• Medida a cada 2 horas por 10 horas (depleção de oxigênio)
• 31,000 razões da expressão de genes
• 6,200 diferentes gráficos com 5 pontos cada
• Alguns genes respondem de maneira igual a depleção de oxigênio?
Exemplo: mudança de ratios (razão)Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours
Gene C 1 8 12 16 12 8
Gene D 1 3 4 4 3 2
Gene E 1 4 8 8 8 8
Gene F 1 1 1 0.25 0.25 0.1
Gene G 1 2 3 4 3 2
Gene H 1 0.5 0.33 0.25 0.33 0.5
Gene I 1 4 8 4 1 0.5
Gene J 1 2 1 2 1 2
Gene K 1 1 1 1 3 3
Gene L 1 2 3 4 3 2
Gene M 1 0.33 0.25 0.25 0.33 0.5
Gene N 1 0.125 0.0833 0.0625 0.0833 0.125Campbell & Heyer, 2003
Exemplo: transformação em logName 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours
Gene C 0 3 3.58 4 3.58 3
Gene D 0 1.58 2 2 1.58 1
Gene E 0 2 3 3 3 3
Gene F 0 0 0 -2 -2 -3.32
Gene G 0 1 1.58 2 1.58 1
Gene H 0 -1 -1.60 -2 -1.60 -1
Gene I 0 2 3 2 0 -1
Gene J 0 1 0 1 0 1
Gene K 0 0 0 0 1.58 1.58
Gene L 0 1 1.58 2 1.58 1
Gene M 0 -1.60 -2 -2 -1.60 -1
Gene N 0 -3 -3.59 -4 -3.59 -3Campbell & Heyer, 2003
Examplo: Coeficiente de Pearson
Gene C Gene D Gene E Gene F Gene G Gene H Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N
Gene C 1 0.94 0.96 -0.40 0.95 -0.95 0.41 0.36 0.23 0.95 -0.94 -1
Gene D 0.94 1 0.84 -0.10 0.94 -0.94 0.68 0.24 -0.07 0.94 -1 -0.94
Gene E 0.96 0.84 1 -0.57 0.89 -0.89 0.21 0.30 0.43 0.89 -0.84 -0.96
Gene F -0.40 -0.10 -0.57 1 -0.35 0.35 0.60 -0.43 -0.79 -0.35 0.10 0.40
Gene G 0.95 0.94 0.89 -0.35 1 -1 0.48 0.22 0.11 1 -0.94 -0.95
Gene H -0.95 -0.94 -0.89 0.35 -1 1 -0.48 -0.21 -0.11 -1 0.94 0.95
Gene I 0.41 0.68 0.21 0.60 0.48 -0.48 1 0 -0.75 0.48 -0.68 -0.41
Gene J 0.36 0.24 0.30 -0.43 0.22 -0.21 0 1 0 0.22 -0.24 -0.36
Gene K 0.23 -0.07 0.43 -0.79 0.11 -0.11 -0.75 0 1 0.11 0.07 -0.23
Gene L 0.95 0.94 0.89 -0.35 1 -1 0.48 0.22 0.11 1 -0.94 -0.95
Gene M -0.94 -1 -0.84 0.10 -0.94 0.94 -0.68 -0.24 0.07 -0.94 1 0.94
Gene N -1 -0.94 -0.96 0.40 -0.95 0.95 -0.41 -0.36 -0.23 -0.95 0.94 1
Campbell & Heyer, 2003
Exemplo: reorganização de dados
Campbell & Heyer, 2003
Name 0 hours 2 hours 4 hours 6 hours 8 hours 10 hours
Gene M 1 0.33 0.25 0.25 0.33 0.5
Gene N 1 0.125 0.0833 0.0625 0.0833 0.125
Gene H 1 0.5 0.33 0.25 0.33 0.5
Gene K 1 1 1 1 3 3
Gene J 1 2 1 2 1 2
Gene E 1 4 8 8 8 8
Gene C 1 8 12 16 12 8
Gene L 1 2 3 4 3 2
Gene G 1 2 3 4 3 2
Gene D 1 3 4 4 3 2
Gene I 1 4 8 4 1 0.5
Gene F 1 1 1 0.25 0.25 0.1
Exemplo:
Campbell & Heyer, 2003
Genoma inteiro do fungo
Campbell & Heyer, 2003
Tecnologia do DNA Microarray
DNA Microarrays
O que é Microarray?
• Coleção de sondas de DNA marcadas em meio sólido de forma ordenada.
PAra que é utilizado?
• Análise de expressão• Genotipagem de SNP• Profile de cromatina• Identificação de inserções• Análise de metilação de DNA
Por que usar Microaaray para análise de expressão?
• Análises de expressão convencionais somente permite o estudo de um gene em um experimento
• Permite o estudo da expressão de milhares de genes em um único experimento
• Permite a análise da expressão global de genes o que não é possível em técnicas convencionais
Análise de Expressão Convencional
Electrophoresis and Blotting
Labeled probe –gene “X”
RNA
ControlCells
TreatedCells
RNA
Hybridization
Análise de expressão usando Microarray
TreatedCells
RNARNA
ControlCells
Label with Cy3 Label with Cy5
Hybridize, wash, and scan
Microarray containing 16 probes
Tipos de Microarrays
• Spotted Arrays– cDNA ou DNA genômico– Oligonucleotídeos
• Affymetrix
• Homemade• Desenhado• Mais barato?• Máximo de 24.000
análises por experimento
• Susceptível a variabilidade
• Disponível comercialmente
• Definido anteriormente• Mais caro?????• Maximo de 500.000
análises por experimento
• Menos variável
Spotted Arrays Affymetrix Arrays
Produção de Spotted Arrays
• Sondas de DNA preparadas em placas de 384• Lâminas de vidro compradas comercialmente ou
homemade mesmo• Arrays são spoted com um robô comercial• Replicatas• Controles
384-well plate
1” x 3” glass slide
Water bath
Wash
Sonicator
Spotted Array Printing
Sonicate
Pick up
384-well plate
1” x 3” glass slide
Water bath
Wash
Sonicator
Spotted Array Printing
Sonicate
Pick up
Preparação da amostra alvo, marcação, hibridização, scaning e
aquisição de dados
• Isolamento de RNA– Total RNA– mRNA
• Transcrição reversa• Marcação
• Hibridização e lavagem
• Scaning
TreatedCells
ControlCells
RNARNA
Label with Cy3 Label with Cy5
Hybridize
Isolate RNA
Reverse transcription
cDNAcDNA
Microarray containing 16
probes
Wash and Scan
Bibliografia
• Hedge, P., et al. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques 29, 548-562 (2000).
• Lipshutz, R.J., et al. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nature Genetics Supplement 21, 20-24 (1999).
• Pritchard, C.C., Project normal: Defining normal variance in mouse gene expression. PNAS 98, 13266-13271 (2001).
