Sessão Científica Bolsista Camila Lima 2015.2

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE EDUCAÇÃO TUTORIAL

Camila Lima Silva

TRATAMENTO DE BIOFILMES ORAIS MULTIESPÉCIES COM PEPTÍDEO

ANTI-BIOFILME

Wang Z, de la Fuente-Núñez C, Shen Y, Haapasalo M, Hancock REW (2015) Treatment of Oral Multispecies Biofilms by an Anti-Biofilm Peptide. PLoS ONE 10(7): e0132512. doi:10.1371/journal. pone.0132512

Salvador – BA – BrasilSetembro, 2015

IntroduçãoBactérias organizadas em comunidade.

Erradicação dos microorganismos responsáveis pelas infecções como principal objetivo do tratamento.

Desafio clínico

(Scott et al., 2007; Fuente Núñez et al., 2013)

CÁRIE

INFECÇÕES NA POLPA

DOENÇA PERIAPICAIS

(Xiao et al., 2012; Chau et al., 2014)

(Haapasalo et al., 2005; Wang et al. 2012)

65% das infecções bacterianas, incluindo doenças orais

Introdução

ORGANIZAÇÃO COMPLEXA E

HETEROGÊNEA

DIFERENTES EXPRESSÕES

GÊNICAS

SUBSTÂNCIAS POLIMÉRICAS EXTRACELU-

LARES

RESISTÊNCIA À ANTIBIÓTICOS

DESENVOLVIMENTO DE NOVOS COMPOSTOS ANTI-BIOFILME E

NOVAS ABORDAGENS

(Kim et al., 2014; Hirt e Gorr 2013; Love 2001)

Introdução

Peptídeos anti-biofilme como alternativas aos agentes de desinfecção tradicionais.

Peptídeos isolados de fontes microbianas com efeitos anti-biofilme contra diferentes espécies presentes na placa bacteriana (S. sanguinis e E. faecalis)

Habilidade para alvos específicos das bactérias

Prevenção da formação do biofilme

(Fuente Núñez et al., 2012 e 2015; Kim et al., 2003; Leung et al., 2005)

(Fjell et al., 2012; Wiradharma et al., 2011)

Introdução

Peptídeo imunoduladorPotente composto anti-biofilme de amplo espectroDesencadeia a perda de nucleotídeos de sinalização de estresse (ppGpp)

Adota diferentes estruturas a depender do ambienteCandidato promissor para tratamento de infecções orais ou componente ativo em produtos odontológicos

PEPTÍDEO 1018

ppGppImportante no

desenvolvimento de múltiplas espécies

presentes no biofilme.

(Fuente Núñez et al., 2014)

(Zhang et al., 2014; Wieczorek et al., 2010; Hosoya et al., 2010)

ObjetivoTestar o(s) efeito(s) do peptídeo anti-biofilme 1018 contra a placa bacteriana oral se formando na presença e ausência dos constituintes da saliva, para avaliar se o peptídeo é adequado para o uso na Odontologia, e a sua atividade em combinação com a Clorexidina.

Materiais e Métodos

O peptídeo 1018 foi sintetizado pelo GenScript, utilizando a fase sólida do 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)

Estocado e armazenado de forma estéril

SÍNTESE DO PEPTÍDEO


Método de microdiluição em caldo para medir a concentração inibitória miníma (MIC) em caldo de carne (BHI) e caldo lysogeny (LB)

Três amostras de placa bacteriana foram cultivadas nos meios BHI e LB, e o peptídeo 1018 adicionado em concentrações crescentes (0, 10, 20, 40 e 80µg/ml)

Placas incubadas à 37°C durante 24 horas

CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MINÍMA

MIC menor concentração do peptídeo em que nenhum crescimento foi observado

(Fuente Núñez et al., 2012; Wiegand et al., 2008)


Discos de hidroxiapatita (HA) estéril utilizados como substrato para o biofilme

Discos de hidroxiapatita revestidos por saliva (sHA) foram preparados para permitir a formação da película de saliva

Placa supragengival coletada da região de primeiros ou segundos molares superiores de três voluntários adultos saudáveis (24-45 anos) caldo BHI

Discos HA e sHA 1,8 ml caldo BHI 0,2 ml placa

MODELO DE BIOFILME

Condições anaeróbias a 37°C por 3 dias


Três diferentes concentrações do peptídeo 1018 (10µg/ml, 5µg/ml e 1µg/ml) foram adicionadas as placas no início do desenvolvimento do biofilme

Grupo controle: água estéril adicionada ao meio de cultura

Três discos HA e sHA foram submetidos a cada um dos grupos

TESTE DE INIBIÇÃO DO BIOFILME

Condições anaeróbias a 37°C por 3 dias


Após 3 dias de formação do biofilme, o meio de cultura foi substituído por 1,98ml de BHI fresco

9 discos de HA e sHA cobertos de biofilme foram submetidos a cada um dos grupos de diferentes concentrações do peptídeo (10, 5 e 1µg/ml)

EFEITO ANTI-BIOFILME A LONGO PRAZO EM BIOFILMES PRÉ-FORMADOS

3 HA e sHAINCUBAÇÃO

ANAERÓBICA 37°C24h


ANAERÓBICA 37°C72h


ANAERÓBICA 37°C48h1X 3X2X

O grupo controle (água estéril + BHI) foi avaliado em cada ponto de tempo (24, 48 e 72h)


Doze discos HA e sHA com formação de placa de 3 dias, lavadas e preparadas com soluçao tampão pH 7,0 (PBS) e em seguida imersos em 1ml do peptídeo 1018 (10µg/ml)

- 1 a 3 minutos -1 ou 3 vezes

EFEITO ANTI-BIOFILME A CURTO PRAZO EM BIOFILMES PRÉ-FORMADOS


24 discos HA e sHA com formação de biofilme de 3 dias preparadas com a solução PBS

I. ÁGUA ESTÉRILII. DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA 2%III. 10µg/ml PEPTÍDEO 1018IV. DIGLUCONATO DE CLOXERIDINA 2% + µg/ml

PEPTÍDEO 10182ml da solução por 1 ou 3 minutos

PEPTÍDEO 1018 COMBINADO Á CLOREXIDINA


Coloração de viabilidade bacteriana e microscopia confocal de varredura a laser

Dois componentes de corante:o SYTO 9 : 480/500 nm CÉLULAS VIVASo IODETO DE PROPÍDO : 490/635 NM CÉLULAS MORTAS

Imagens confocais analisadas e quantificadas (proporção vivas/mortas) Software Imaris 7.2

Proporção florescência verde/vermelha

EXAME MICROSCÓPICO COM LASER CONFOCAL DAS AMOSTRAS


Três placas adicionais de biofilme tratadas com 10µg/ml do peptídeo (24, 48 e 72h) e examinadas pela microscopia eletrônica

Amostras submetidas á concentrações de etanol (50%, 70%, 80% e 100%) para desidratação.

EXAME DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Materiais e MétodosCURVAS DE MORTE DO E. faecalis, S. mutans E PLACA BACTERIANA

Enterococcus faecalisÁGAR SANGUEAERÓBIO

Streptococcus mutansÁGAR SANGUEANAERÓBIO

MEIOS BHI E LB

Placa bacteriana coletadas de voluntário se desenvolvendo em discos HA

1,8 ml BHI 0,2 ml suspensão bacteriana (E. faecalis e S.mutans)


Software SPSS 16.0 para Windows

Padrão desvio das proporções de volume de células mortas e vivas calculados

Homogeneidade da variância determinada por teste Levene

Univariate ANOVA para significância dos resultados (nível 5%)

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Resultados

Potente inibidor de biofilme por atingir ampla variedade de espécies bacterianas

Seguindo o MIC (≥ 80µg/ml), não inibiu o crescimento bacteriano substancialmente

O tratamento com 10µg/ml reduziu significantivamente e quase completamente o biovolume 10x após 72h

ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018

(Wieczorek et al., 2010)

Resultados

10µg/ml


DISCOS HÁ9% 24h 7% 48h8% 72h

DISCOS sHA8% 24h8% 48h 6% 72h

Resultados

Efeito inibitório do peptídeo reflete a morte de bactérias presentes no biofilme

10µg/ml 70% morte celular após 48h de incubação

Aumento similar foi observado na concentração de 5µg/ml entre o 1º e 2º dia


Maior número de mortes em todos os grupos comparado ao grupo controle (água estéril)

Resultados

Sob todas as condições testadadas, 5µg/ml reduziu à 50% o biovolume e 1µg/ml à 54%, comparado ao grupo controle


Resultados

Ativo contra biofilmes pré-formados em ambos os tratamentos (curto e longo prazo) e em ambas as superfícies (HA e sHA)


ResultadosATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018

MORTE BACTERIANA

TEMPO DE EXPOSIÇÃO

CONCENTRAÇÃO DO PEPTÍDEO

FREQUÊNCIA DE APLICAÇÃO

Resultados

Tratamento de curto prazo para avaliar a rapidez com que o peptídeo 1018 age


44%61% 64%

42%

VALORES DE BIOVOLUME ESTATISTICAMENTE SIGNFICATIVOS MAIS BAIXOS QUE OS CONTROLES NÃO

TRATADOS

Resultados

Reduzido biovolume relacionado a aumento de morte celular (microscopia confocal):

39% (3 tratamentos de 3 minutos em discos HA)

Porcentagem de morte celular menor comparada ao tratamento de longo prazo


Resultados

A microscopia eletrônica de biofilmes formados durante 3 dias revelou cocos, hastes e filamentos


Resultados

Curvas de morte num período de 120 minutos para avaliar a atividade de morte celular do peptídeo

O peptídeo conduziu a morte celular de forma tempo-dependente em ambos os meios de cultura (BHI E LB)

Morte substancial do S. mutans e E. faecalis


Resultados

O efeito do peptídeo + clorexidina foi testado a curto prazo

COMBINAÇÃO DO PEPTÍDEO 1018 E CLOREXIDINA

⇩73%

⇩ 64%

* *

DiscussãoAgentes de desinfecção tradicionais QUÍMICOS

inibem o desenvolvimento do biofilme e afetam o metabolismo bacteriano

O modelo in vitro utilizado no presente estudo mimetiza o modelo de biofilme in vivo:- Multiespécies- Interação com a película de saliva

(Baehni e Takeuchi, 2003)

(Shen et al., 2009 e 2011)

DiscussãoRecentemente desenvolvidos e identificados, peptídeos anti-biofilme sintéticos, oferecem nova abordagem para controle do biofilme

Potente atividade anti-biofilme - Inibição do desenvolvimento- Estimula morte de microorganismos

Amplo espectro atua através da ligação e degradação de nucleotídeos envolvidos na formação e manutenção do biofilme

(Fuente Núñez et al., 2012; Leung et al., 2005; Tao et al., 2011)

(Fuente Núñez et al., 2014)

DiscussãoNo presente estudo, o peptídeo 1018 desencadeou a morte celular em biofilmes formados durante 3 dias com concentrações abaixo da MIC (80µg/ml)

10µg/ml peptídeo 1018 suprimiu crescimento em

75%

AMPLO ESPECTRO E ATIVIDADE

DIVERSIFICADA vs. PLACA BACTERIANA

(Fuente Núñez et al., 2014; Baehni e Takeuchi 2003)

Espécies específicas e bactérias residuais após tratamento, não foram identificadas.

Não houve diferença significativa na porcentagem de volume de células mortas e biovolume nos discos HA e sHA

PELÍCULA DE SALIVA NÃO DEGRADA O

PEPTÍDEO 1018

PEPTÍDEO LL-37 COM ATIVIDADE REDUZIDA

PELA SALIVA E FLUÍDOS CORPORAIS

Discussão

(Bucki et al., 2008)

DiscussãoCom relação a aplicabilidade, o peptídeo 1018 tem sido demonstrado atóxico na concentração de 200µg/ml para fibroblastos e 375µg/ml para células vermelhas do sangue

(Steinstraesser et al., 2012; Wieczorek et al., 2010)

DiscussãoAtividade de espectro bacterianoDesinfectante oral mais utilizadoAção não específicaConcentração associada à efeitos colaterais

Shen et al., 2009 e 2010 demonstrou a morte de 46% do biofilme pela ação da clorexidina à 2% durante 3 minutos. Atividade menor comparada ao peptídeo 1018

Clorexidina

DANOS À MEMBRANA E

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

PERDA IRREVERSÍVEL DE CONSTITUINTES

CITOPLASMÁTICOS

REAGE COM GRUPOS NEGATIVOS

NO ENVELOPE CELULAR

(Shen et al., 2011; Athanassiadis et al., 2007)

(Brown et al., 1986)

DiscussãoKim et al., 2003, relatou efeito inibitório sinérgico de peptídeos catiônios e CHX no crescimento de Streptococcus orais usando o teste MIC

No estudo, a combinação do peptídeo 1018 + CHX não reduziu o biovolume ao comparar a ação isolada de cada componente, porém o tratamento combinado levou a um aumento significativo na quantidade de célular mortas no biofilme

A saliva não interfere na ação isolada ou combinada da CHX e peptídeo 1018

DiscussãoLimitações do estudo:

Espécies coletadas dos voluntáriosPeptídeo 1018 mais efetivo contra espécies específicas (S. mutans)Contagem de células mortas (bactérias em suspensão)Efeito inibitório do peptídeo preservado a longo prazo?

Aplicação múltipla para melhores resultados

Pasta de dentes, colutório, goma de mascar

Atividade anti-biofilme dentro de 3 minutos

POTENTE ATIVIDADE ANTI-

BIOFILME

EFEITO DE MORTE CELULAR COM A

CHX

TERAPIA ANTIMICROBIANA

CONTRA INFECÇÕES

DiscussãoPEPTÍDEO 1018

Remoção mecânica diária para controle do crescimento ainda é necessária, porém a aplicação do peptídeo 1018 pode contribuir para controle eficaz do biofilme.

Referências

Health & Medicine

Sessão Científica Bolsista Camila Lima 2015.2