Anticorpos monoclonais e policlonais

[1]

Adriana Lima 85047 Barbara Tagé 85084

Anticorpos policlonais

• Anticorpos policlonais (como diz o nome) possuem vários clones, ou seja, se originam de diferentes linfócitos B, o que significa que reagem com vários epítopos do antígeno (por exemplo, várias partes de uma proteína).

Figura 1. : Anticorpos policlonais [2]

Anticorpos monoclonais

• Anticorpo específico pra um antígeno e produzido por um hibridoma de células B (linhagem celular resultante da fusão de uma única célula B normal com uma linha imortalizada de tumor de células B).

Figura 2. : Anticorpos monoclonais [2]

Anticorpos policlonais

Figura 3 : Obtenção de anticorpos policlonais [3]

Anticorpos monoclonais

Figura 4:Obtenção de anticorpos policlonais [4]

Histórico

• 1ª evidência do uso de anticorpos: imunoglobulinas utilizadas para neutralizar toxina diftérica.

Figura 5: Emil Adolf von Behring. Prize nobel: 1/1 [5]

Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1901

Histórico

• 1ª Técnica de utilização de hibridomas para produção de anticorpos monoclonais

Figura 6: Cientistas laureados pelo desenvolvimento da técnica do hibridoma [6]

Prêmio Nobel de Medicina 1984

Concepção geral da técnica • Obtenção de anticorpos monoclonais

Figura 7: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]

Concepção geral da técnica • Obtenção de anticorpos monoclonais

Figura 8: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]

Concepção geral da técnica • Obtenção de anticorpos monoclonais

Figura 9: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]

Expectativas de:

• Tratamento para muitas doenças

• Cura do câncer

Então... • Os problemas foram resolvidos?!

Não foi o que aconteceu...

Existia uma limitação!

O que é um anticorpo?

O anticorpo

Figura 10: Imunoglobulina de Superfície [8]

Processo de humanização

Figura 11: Processo de humanização [9]

• Definição

Anticorpo monoclonal total

• Resposta HAMA: Anticorpo humano anti-murino, do inglês human anti-mouse antibody.

Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]

Anticorpo monoclonal quimérico • Resposta HACA: Anticorpo humano anti-quimérico (Human

anti-chimeric antibody).

• Região variável humana é trocada pela do murino.

Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]

Anticorpo monoclonal humanizado • Resposta HAHA: Anticorpo humano anti-humano( do inglês

Human anti-human antibody).

• Regiões hipervariáveis murinas são cortadas da Ig Humana

Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]

Humano Total

Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]

• Sem resposta imune contra o anticorpo. • Sem proteínas dos murinos.

A técnica hoje:

• Primeiramente, o animal a ser selecionado deve ser livre de patógenos e geneticamente selecionado. Geralmente, utiliza-se animais singênicos.

• Para a produção em escala comercial, animais como camundongos, coelhos e aves, normalmente galinhas, são utilizados. No entanto, os camundongos são os mais utilizados.

A técnica hoje:

• Produção de anticorpos monoclonais

• Seleção dos hibridomas

• Clonagem dos hibridomas

• Teste de seleção de anticorpos

Produção de anticorpos monoclonais

• Imuniza-se o animal com epítopo desejado.

• Retira-se os linfócitos B, principalmente do baço.

• Funde-se os linfócitos B obtidos com células do mieloma (hibridoma) com auxílio de um surfactante PEG (Polietileno glicol).

Produção de anticorpos monoclonais

Figura 13: Esquema de produção de anticorpos monoclonais [11]

A técnica hoje:

• Produção de anticorpos monoclonais

• Seleção dos hibridomas

• Clonagem dos hibridomas

• Teste de seleção de anticorpos

Seleção dos hibridomas

• Células do mieloma tem enzimas deficientes: 1. Hipoxantina guanina fosforibosil transferase

(HGPRT) 2. Timidina quinase. • A carência dessas enzimas leva a célula à morte

em meio HAT.

• Meio HAT: contém hipoxantina, timidina e aminopterina. Seleciona as células fusionadas.

Seleção dos hibridomas

• Células fusionadas são capazes de sobreviver a esse meio por suprirem a sua carência enzimática pela fusão com os linfócitos B.

• Os linfócitos B não fusionados morrem após um certo período visto que as células do mioloma são “imortalizadas”.

A técnica hoje:

• Produção de anticorpos monoclonais

• Seleção dos hibridomas

• Clonagem dos hibridomas

• Teste de seleção de anticorpos

Clonagem dos hibridomas

• Com a identificação da cultura celular fusionada as células são diluídas de forma que tenha apenas uma célula por poço.

• Cada célula isolada irá proliferar-se formando colônias individuais.

Figura 14: Anticorpos monoclonais crescendo isoladamente [12]

Clonagem dos hibridomas

• Após duas semanas já há anticorpos secretados suficientes .

• As amostras são transferidas para placas de 24 poços.

Figura 15 : Placa de ELISA [13]

A técnica hoje:

• Produção de anticorpos monoclonais

• Seleção dos hibridomas

• Clonagem dos hibridomas

• Teste de seleção de anticorpos

Teste de seleção de anticorpos

• Técnicas que definem colônias que secretam anticorpos de alta especificidade.

• Testes de seleção devem ser realizados com o antígeno em sua forma original, na qual o anticorpo foi desenvolvido.

Teste de seleção de anticorpos

• ELISA é o mais utilizado

Figura 16: Imagem ilustrativa de um poço de ELISA [14]

Métodos indiretos e diretos

Figura 17: Imagem ilustrativa e comparativa da técnica ELISA [15]

Pontos positivos e negativos

• Positivos:

o Muitas amostras analisadas rapidamente

o Não requer muitos equipamentos

o Reagentes e marcadores de fácil acesso

• Negativos: reações cruzadas.

o Direto: <1% falsos negativos, baixa sensibilidade

o Indireto: 50% falsos negativos

Quais as aplicações dos anticorpos monoclonais?

• Tratamento da Asma

• Tratamento para linfoma

Asma

• IgE – importante mediador de reações alérgicas

• Omalizumabe: 1º e único aprovado pela Food and Drug Administration desde 2003 (Cook,M.S.;Bochner,B.S.2010)

• anti-IgE (-umabe) previne interação entre IgE e receptores FcεRII (Low affinity receptor) e FcεRI (High affinity receptor) nas células dendríticas e inibe outros receptores de IgE em basófilos.

Mecanismo

Figura 18: Mecanismo de atuação do anti-IgE [16]

Teste de eficácia

• 419 pacientes com asma grave receberam Omalizumab ou placebo aleatoriamente por 28 semanas.

• Redução de exacerbações clinicamente significantes em 26% em relação ao grupo que recebeu placebo. [17,18]

Quais as aplicações dos anticorpos monoclonais?

• Tratamento da Asma

• Tratamento para linfoma

Linfoma

• Linfoma não Hodgkin (mais agressivo).

• Tratamento interrompe a proliferação das células neoplásicas.

Mecanismo

• No tumor a via do NF-κB está ativa inibindo apoptose.

• Bortezomibe inibe a via do NF-κB permitindo que ocorra a apoptose inibindo a proliferação.[19]

Referências Bibliográficas • [1] Disponível em < http://www.tebu-

bio.com/userfiles/image/Corporate/Antibody%20Taskforce/ANTICORPS%20simple.png >. Acessado em : 12.mar.2015.

• [3] Disponível em: < http://www.ptglab.com/blog/wp-content/uploads/2010/08/41.jpg >. Acessado em: 12.mar.2015.

• [4] Disponível em: < http://upload.wikimedia.org/wikibooks/en/a/a1/Biochem-polyclonal.jpg >. Acessado em: 12.mar.2015.

• [5] Disponível em: < http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1901/ >. Acessado em: 10.mar.2015.

• [6] Disponível em: < http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1984/ >. Acessado em: 12.mar.2015.

• [7] ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILAI, S. Imunologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Elsevier, 7ª edição, 2012.

• [8] ACTOR,J.K. Imunologia básica. Rio de Janeiro : Elsevier.2007.

Referências Bibliográficas • [9] Anticorpos monoclonais no tratamento da asma, Revista Brasileira de Alergia e Imunopatologia; São

Paulo, ASBAI, 03.09.2012;25.10.2012

• [10] MURPHY, K. ; TRAVERS, P. & WALPORT, M. Imunobiologia de Janeway. 7ª Edição. Editora ArtMed, 2014.

• [11] LINDBLAD, E. B. Aluminium Adjuvantes. In: STEWARTTULL, D. E. S. (ed). The theory and pratical application of adjuvantes. Hohn Wiley & Sons, 1995. p. 21-25.

• [12] Disponível em:< http://img3.wikia.nocookie.net/__cb20130414003422/aia1317/pt-br/images/a/ac/Figura5_9.JPG >. Acessado em: 14.mar.2015.

• [13] Disponível em:< http://i01.i.aliimg.com/photo/v24/514740447/24_wells_PS_culture_plate.jpg >. Acessado em: 14.mar.2015

• [14] Disponível em:< http://i.ytimg.com/vi/6Ue1Hd3dyaQ/maxresdefault.jpg >. Acessado em: 14.mar.2015.

• [15] Disponível:< http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/en/ch/25/orgentec/graphics/elisa_en_swf_altref.jpg >. Acessado em:13.mar.2015.

• [16] COOK,M.S.;BOCHNER,B.S. Update on Biological Therapeutics for Asthma. World Allergy Organization Journal 2010, 3:188-194

Referências Bibliográficas

• [17]Cook, M. L. , Bochner, B. S. Update on Biological Therapeutics for Asthma. World Allergy Organization Journal 2010, 3:188-194 .

• [18] Humbert M, Beasley R, Ayres J, Slavin R, Hébert J, et al.: Benefits of omalizumab as add-on therapy in patients with severe persistent asthma who are inadequately controlled despite best available therapy (GINA 2002 step 4 treatment): INNOVATE. Allergy 2005, 60:309-316.

• [19] Disponível em:< http://www.tmobr.com.br/artigos/artigo_novidade_imprimir.html >. Acessado em: 14.mar.2015.