Pascual morales 2013 cap 3. mecanismos

CAPÍTULO 3Mecanismos del crecimiento unidireccional

de estructuras celulares

La polaridad es un prerrequisito en el establecimiento de formas celulares particulares que participan en el movimiento direccional y en consecuencia en la diferenciación durante

el desarrollo de órganos. Por lo tanto, un gran esfuerzo ha sido destinado al entendimiento de los procesos fisiológicos que dan lugar al establecimiento de un eje de polaridad y a la consiguiente división celular asimétrica que subyace al desarrollo de organismos multicelulares. Numerosos sistemas modelo que permiten el análisis de la polaridad celular a nivel de células individuales han sido establecidos en los diferentes reinos que incluyen animales, hongos y células vegetales. Ejemplos extremos del crecimiento polar comprenden las dendritas, hifas fúngicas, protonema de musgos, pelos radiculares y tubos polínicos. Este tipo de crecimiento se caracteriza porque una zona de la célula llamada punta, dicta la dirección de la elongación celular. Son numerosos los factores implicados en la regulación de este tipo de crecimiento, los cuales van desde un tráfico vesicular altamente controlado en la punta de crecimiento, así como un control dinámico del citoesqueleto y la pared celular. Todos estos procesos son coordinados mediante una red genética de regulación, así como por otras moléculas involucradas en el desarrollo tales como los fosfoinosítidos, esteroles y proteínas de unión a la actina, además de cascadas de señalización. En este capítulo se abordan algunos de los mecanismos propuestos para explicar el crecimiento polarizado.

Mecanismos del crecimiento unidireccional de estructuras celularesEdgar J. Pascual-Morales, Ma. Elena Mellado-Rojas y Elda Beltrán-Peña

Capitulo 3. Mecanismos del crecimiento unidireccional de estructuras celulares

29

3.1. IntroducciónEl crecimiento en punta o anisotrópico se caracteriza porque se favorece el crecimiento específico en una zona de la célula (Libault et al., 2010). El establecimiento de dicha punta se obtiene con la selección de la zona de formación, seguido del abultamiento y formación de la punta y maduración (Pei et al., 2012). Estos procesos presentan una gran regulación genética (Parker et al., 2000; Ishida et al., 2008; Libault et al., 2010). Además de que múltiples componentes de la membrana plasmática como fosfolípidos (Kusano et al., 2008; Thole et al., 2008; Lee et al., 2010) y esteroles estructurales han sido implicados en el establecimiento del punto de selección y la elongación (Ovecka et al., 2010).

El crecimiento también está determinado por una dinámica altamente controlada de vesículas, tanto de procesos endocíticos como exocíticos para cada zona en la punta de crecimiento (Zonia y Munnik, 2008). Además, el movimiento de vesículas regula la distribución de proteínas con funciones esenciales en el crecimiento (Thole et al., 2008; Duan et al., 2010; Lee et al., 2010). La dinámica del citoesqueleto es otro proceso altamente coordinado en la punta de crecimiento, el cual es controlado por las proteínas de unión a actina que determinan el sitio donde se iniciará el crecimiento, la velocidad y la finalización de la elongación celular (Pei et al., 2012).

3.2. Control genético del crecimiento

3.2.1. Regulación genética del crecimiento de pelos radiculares

Existen algunos modelos que explican cómo se regula genéticamente el crecimiento, sin embargo, el más conocido se refiere al control del desarrollo de pelos radiculares en donde una señal producida en las células corticales de la raíz (hasta el momento desconocida) es detectada por el receptor SCRAMBLED (SCM) localizado en las células epidérmicas H (tricoblastos), el cual regula negativamente la expresión del factor de transcripción WEREWOLF (WER). En las células N (atricoblastos), el gen WER no está representado y la proteína WER al interaccionar con las proteínas GLABRA3 (GL3), ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3) y TRANSPARENT TESTA GLABRA (TTG), regula positivamente la expresión de CAPRICE (CPC) y GLABRA 2 (GL2). El transporte de CPC desde las células N a las H

evita la formación del complejo WER-GL3/EGL3-TTG1 en los tricoblastos y consecuentemente reprime la expresión de GL2. Además de esta regulación, la expresión de GL2 también depende de modificaciones epigenéticas como las acetilaciones de la histona K9. El movimiento de GL3 de las células H a las N es necesario para mantener la formación del complejo WER–GL3/EGL3–TTG1, el cual regula negativamente la expresión de GL3 y EGL3 en las células N. Además, SCM se acumula preferentemente en las células H por retroalimentación positiva bajo el control del complejo CPC–GL3/EGL3–TTG1 y otra negativa en las células N regulada por el complejo WER–GL3/EGL3–TTG1 (Fig. 3.1) (Lilbaul et al., 2010).

Algunos fenotipos que manifiestan la interacción genética entre tricoblastos y atricoblastos son los que presentan las líneas mutantes cpc y glb2. La primera muestra un número reducido de pelos radiculares, debido a que CPC, regula negativamente la activación de GLABRA2 (GLB2). Como GLB2 no se regula, se obtiene un fenotipo de pelos radiculares escasos; en cambio la línea de sobre expresión de CPC, al igual que las mutantes glb2, dan como resultado fenotipos con un número incrementado de pelos radiculares, al igual que las líneas ttg y wer. El comportamiento de estas últimas mutantes, se debe a que las proteínas TTG y WER están implicadas en la identidad de las células N (Wada et al., 2002) (Fig. 3.2).

Figura 3.1. La diferenciación de los pelos radiculares es dependiente de la comunicación intercelular. El proceso se inicia con una señal -hasta ahora desconocida- producida por las células corticales de la raíz que es detectada por el receptor SCRAMBLED (SCM). Las células H se diferencian en trichoblastos y dan origen a los pelos radiculares, células epidérmicas de la raíz especializadas en la captación de agua y nutrientes (Modificada de Libault et al., 2010).

Células N

Células H

Células Epidérmicas

Células corticales

30

3.2.2. Regulación de la formación de tricomas

Los genes que participan en la determinación del destino final de las células epidérmicas de la raíz incluyen TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1), GLABRA 1, 3 (GL1; 3), ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3) y WEREWOLF (WER). GLABRA1 (GL1) promueve la iniciación de tricomas y WER regula la diferenciación de las células carentes de pelos. TTG1 codifica a la proteína WD40, GL3/EGL3, a un factor de transcripción (bHLH) y GL2 a un factor de transcripción con un homeodominio de leucinas. GL1 y WER codifican para factores de transcripción tipo Myb R2R3 funcionalmente redundantes. Mutaciones en estos genes reducen el número de tricomas y/o causan formación ectópica de pelos radiculares. GL2 es expresada en tricomas y tricoblastos. Estudios de expresión con genes reporteros indican que WER, GL3, EGL3 y TTG1 actúan rio arriba de GL2 (Ishida et al., 2008).

3.3. Participación de las auxinas en la elongación celularLas mutaciones en el gen AXR1, que codifica para proteínas relacionadas con la enzima E1 del proceso de ubiquitinación de los represores transcripcionales relacionado con elevadas concentraciones de auxinas, conllevan a un desarrollo vegetal aberrante (Leyser et al., 1993). Otra mutante, la axr3 de Arabidopsis mostró alteraciones en el crecimiento y la cruza entre la mutante axr1 y axr3, axr3-3 axr1-3, presentó ausencia de pelos radiculares (Leyser et al., 1996).

En estudios genéticos y fisiológicos se han implicado a las auxinas y al etileno en el desarrollo de los pelos radiculares (Masucci y Schienfelbein, 1996). Pitts et al. (1998) mostraron que tanto las mutantes resistentes a auxinas aux1 y axr1, como de respuesta a etileno etr1 y ein2 presentaron defectos en el crecimiento de los pelos radiculares, mas no en su iniciación. Dichos autores observaron que plántulas silvestres (Wt) y las mutantes axr1 y etr1 tratadas con 2,4-D o el precursor de etileno ACC, presentaban pelos radiculares más largos respecto a las no tratadas. Por otra parte, las mutantes axr1 en presencia de ACC produjeron pelos radiculares ectópicos, al igual que un patrón inusual de pelos largos seguido por regiones que carecían de ellos. Este mismo grupo de investigadores, señalaron que la mutante axr12 presentaba distribuciones fluctuantes en la longitud de los pelos radiculares. Los autores sugirieron que las auxinas y el etileno estaban implicados en el alargamiento normal de los pelos radiculares. Por otra parte, Lee y Cho (2006), reportaron mediante el uso de líneas de sobreexpresión de la cinasa PINOID (PID) (regulador de eflujo de auxinas a través de la fosforilación de las proteínas PIN) que dicha proteína influye en el crecimiento de pelos radiculares de Arabidopsis.

La iniciación del crecimiento de los pelos radiculares está regulada en gran medida por la expresión de genes relacionados con la señalización de auxinas (Cho y Cosgrove, 2002). Benková et al. (2003) propusieron que el flujo local de auxinas modula la formación de algunos órganos en plantas; Cho et al. (2007) propusieron un modelo donde PINOID activa a los transportadores de eflujo de auxinas, causando fluctuaciones en la elongación de los pelos radiculares. Además, indicaron que niveles bajos de auxinas inducen la iniciación del pelo radicular, mientras que concentraciones más altas promueven el crecimiento de estas células. En dicho estudio también mostraron que la glicoproteína 4, presenta una función comparable a los transportadores de auxina en los pelos radiculares en Arabidopsis. Jones et al. (2009) mostraron que el transporte de auxinas a través de los atricoblastos sostiene el crecimiento de los pelos radiculares. Además de las auxinas requeridas para el crecimiento de estas células, se ha sugerido que los esteroles están involucrados en el crecimiento unidireccional (Ovecka et al., 2010). Recientemente, Ganguly et al. (2010) reportaron que la sobreexpresión de los transportadores de

Figura 3.2. Estructura de las raíces de Arabidopsis. (A) Dibujo de una sección transversal mostrando la organización celular. (B) Meristemos de la raíz de plantas silvestres, (C) Mutantes caprice (cpc). (D) Fenotipo de mutantes wer y línea de sobre expresión 35S::CPC (Modificado de Wada et al., 2002).


31

eflujo PIN1, 2, 3, 4, 7 y 8 inhibe el crecimiento de los pelos radiculares debido a la gran disminución de auxinas en dichos órganos y que dicha inhibición era restaurada mediante la suplementación externa de AIA, lo que indica que la auxina es necesaria para el crecimiento de los pelos.

3.4. Movimiento vesicular en la zona de crecimientoEl movimiento de las vesículas en la zona de crecimiento se ha estudiado en tubos polínicos observando que dicho movimiento es altamente coordinado y dinámico. Se ha reportado que las vesículas siguen principalmente tres rutas; a) la endocítica, donde la entrada de vesículas se establece principalmente a partir de la punta de crecimiento con vesículas de tamaños pequeños principalmente de alrededor de 150 a 400 nm. b) la exocítica, determinada en la zona circundante a la endocítica, donde las vesículas presentan tamaños entre los 400 a 500 nm y finalmente por debajo de ésta se localiza la zona endo-exocítica (c), en la cual la dinámica del movimiento de vesículas presenta menor recambio y las vesículas pueden converger en su localización en compartimentos intracelulares. Las vesículas de esta última zona, son de mayor tamaño con un rango desde 600 a 1000 nM (Fig. 3.3) (Zonia y Munnik, 2008).

3.5. Componentes de la membrana plasmática involucrados en el crecimiento de los pelos radicularesUn fosfolípido de la membrana implicado en el crecimiento de los pelos radiculares y del tubo polínico es el fosfatidilinositol 4,5-difosfato (PtdIns(4,5)P), el cual es producto de la fosfatidil inositol fosfato 5 cinasa 3 (PIP5K3). PtdIns(4,5)P funciona como una señal sitio especifica en la membrana para promover la reorganización y el tráfico de membranas. La localización del PtdIns(4,5)P, determinada mediante la línea reportera PIP5K3-YFP en los ápices de crecimiento y su paulatina desaparición coincidió con una disminución en la tasa de elongación de los pelos radiculares y tubos polínicos. Lo anterior sugiere que este fosfolípido juega un papel importante en el crecimiento. Dicha interpretación fue reforzada, por las observaciones en las mutantes de inserción de T-DNA, las cuales presentan una expresión reducida

de PIP5K3 y cuyo fenotipo mostró pelos radiculares significativamente más cortos que la planta silvestre. En contraste, las líneas de sobreexpresión de PIP5K3, mostraron pelos radiculares largos y múltiples sitios de ramificación en un solo tricoblasto (Kusano et al., 2008). La función de la fosfatasa fosfatidilinositol-4-fosfato (PI(4)P fosfatasa) cuyo producto es el PI(3)P, también ha sido implicada en el desarrollo de pelos radiculares, debido a que la mutante ROOT HAIR DEFECTIVE4 rhd4, presentó defectos en el establecimiento del polo de crecimiento y la posterior elongación de los pelos radiculares, dando como resultado un fenotipo de pelos cortos y formación de abultamientos a lo largo de toda su longitud (Thole et al., 2008). Mediante microscopía de fluorescencia, en los pelos radiculares de la mutante rhd4-1, se analizó la dinámica membranal después de etiquetar con RabA4b -un marcador de tráfico membranal polarizado- a los pelos radiculares. Este análisis reveló en la mutante rhd4 una pérdida estocástica y recuperación de los compartimentos

Figura 3.3. Incorporación de vesículas y recuperación de la membrana plasmática en la región apical de los tubos polínicos en crecimiento. (A) El tubo polínico dirige fuertemente su crecimiento y las regiones incorporadas recientemente en la punta y determinan la zona de expansión celular. (B) ilustración sobre la dinámica de vesículas durante el crecimiento del tubo polínico. La recuperación endocítica de membrana plasmática ocurre a lo largo del domo apical. La exocitosis se lleva a cabo en la región adyacente (Modificado de Zonia y Munnik, 2008).

Crecimiento

Endocitosis

Exocitosis

Endocitosis

32

de RabA4b en las puntas de los pelos radiculares en crecimiento, consistente con el papel de la proteína RDH4 en la regulación del tráfico membranal en estas células. El gen RHD4, se encontró que codifica para una fosfatasa de fosfoinosítidos tipo Sac1. En estudios in vitro, dicha enzima mostró preferencia por el fosfatidil inositol-4-fosfato PI(4)P, mientras que in vivo, las raíces de las mutante rhd4-1 acumularon altos niveles de PI(4)P. Se ha observado que en pelos radiculares de plántulas silvestres, el PI(4)P se acumula principalmente en la zona de crecimiento, mientras que en las mutantes rhd4-1 se detectaron niveles significativos de PI(4)P en las membranas internas. La fusión de la proteína verde fluorescente con RHD4 determinó su localización en la membrana de las puntas de los pelos radiculares en crecimiento. Los autores proponen que RHD4 es reclutada selectivamente por RabA4b, el cual está involucrado en la expansión polarizada de los pelos radiculares y que en conjunto con la fosfoinosítido cinasa PI-4Kb, RHD4 regula la acumulación de PI(4)P en los compartimentos membranales de las zonas de crecimiento de los pelos radiculares (Thole et al., 2008).

Además de los fosfoinosítidos, otros componentes abundantes de la membrana plasmática son los esteroles, que se acumulan particularmente en el ápice de los pelos radiculares. En Arabidopsis thaliana, esta acumulación es especifica en los tricoblastos, durante las etapas anteriores a la formación del abultamiento y en la punta de crecimiento durante la elongación del pelo radicular, mostrando una distribución uniforme en los pelos radiculares maduros. Así, estos esteroles estructurales pueden servir como un marcador para la iniciación del crecimiento de los pelos radiculares. Además dichas moléculas, también señalan los eventos de ramificación en mutantes con pelos radiculares ramificados. Los esteroles se detectan usando a la flipina (fluorocromo que forma complejos con esteroles estructurales de la membrana) y mediante tal técnica se detectó que su localización ocurre en la zona de crecimiento. Lo anterior sugiere que la distribución y acumulación apical de esteroles puede regular el tráfico vesicular y las propiedades de la membrana plasmática durante la formación del abultamiento de la zona de crecimiento de los pelos radiculares en Arabidopsis (Ovecka et al., 2010).

Otros componentes de la membrana plasmática también participan en el mantenimiento de los sitios de crecimiento de los pelos. En Arabidopsis

se ha observado que ROOT HAIR DEFECTIVE 2, reduce la oxidasa del nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (RHAD2 NADPH), lo que incrementa las especies reactivas de oxigeno (ROS) y estimula el influjo de Ca2+ al citoplasma. Se sabe que este último es requerido para el crecimiento de los pelos radiculares y se ha determinado que el Ca2+ a su vez, puede activar a la RHD2 NADPH para producir ROS en la punta del pelo radicular, juntos estos componentes establecen una retroalimentación positiva que mantiene un sitio activo de crecimiento en las células en expansión (Takeda et al., 2008).

3.6. Cascadas de señalización implicadas en el crecimiento direccional Se ha demostrado que la movilización de vesículas es un proceso importante en el crecimiento de los pelos radiculares, a partir de zonas de la membrana ricas en fosfolípidos (Lee et al., 2010; Kusano et al., 2008; Thole et al., 2008; Lee et al., 2008 a, b). La formación de vesículas está estrechamente relacionado con la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS). La inactivación de la cinasa PI3K (cuyo producto es Ptdlns3P) mediante el inhibidor LY294002, ocasionó una disminución en la cantidad de ROS en la zona de crecimiento del pelo radicular, así como también una disminución de vesículas que contienen ROS (Lee et al., 2008a). Lo anterior sugiere que las balsas lipídicas producto de la actividad de PI3K actúan como una señal para la movilización de NADPH y ROS. Los autores proponen que dicha movilización podría efectuarse de tres formas: primera, a través de la ruta de recirculación endocítica que afectaría la actividad o distribución de la NADPH oxidasa (NOX) localizada en la membrana plasmática, cambiando la producción de ROS fuera de la célula. Segunda, PI3K alteraría el importe al citosol de las ROS producidas exógenamente. La difusión de ROS a través de la membrana lipídica es baja y la endocitosis mediada por PI3P podría contribuir a la transferencia de las ROS hacia el interior de las células. Finalmente, NOX podría ser reclutada a los endosomas donde se localiza el PI3P y producir ROS dentro de los endosomas (Fig. 3.4) (Lee et al., 2010).

Otro ejemplo de cascadas de señalización implicadas en el crecimiento polarizado es la ruta MAPK, reportada por Samaj et al. (2002), donde los autores analizaron la función de SIMK de alfalfa (homólogo a la AtMAPK6) durante la formación


33

de los pelos radiculares. Los autores observaron que en células epidérmicas, la localización de SIMK es predominantemente nuclear y durante la formación de los pelos radiculares se redistribuye al citoplasma en los extremos del crecimiento de pelos radiculares, donde se ensambla con una red densa de F-actina. La despolarización de actina por latrunculina B, permitió la relocalización de SIMK al núcleo e inversamente la estabilización de la actina por jasplacinólido (estabilizador de las hebras de F-actina), provocó que SIMK co-localizara con las hebras densas de actina en el citoplasma. También se observó que latrunculina B y el jasplacinólido activaron a SIMK en un cultivo celular derivado de raíz. La pérdida de la función de SIMK en la extremidad de pelos radiculares y de actina, inducida por el inhibidor (UO 126) específico de la cinasa MAPKK, resultó en la formación de pelos radiculares aberrantes debido a que UO 126 inhibió los blancos de las vesículas de tráfico y polarizó el crecimiento de los pelos radiculares. En contraste, la sobrexpresión de SIMK indujo un crecimiento rápido en las puntas de los pelos radiculares; todas estas observaciones, permitieron a los autores sugerir que SIMK juega un papel crucial en la elongación de dichas células.

Por otra parte, análisis de la expresión de MPK4 mediante la línea reportera proMAP4:GUS, revelaron que el patrón de expresión se localiza en mayor medida en las células epidérmicas y particularmente en los zonas de formación de pelos radiculares, mientras que la inhibición de MAPKK (con el

inhibidor de las cinasas, PD98059), causó efectos negativos en los microtúbulos detectados en la línea reportera 35S:GFP:MBD. Los resultados antes mencionados permitieron proponer que la MAPK4 regula la organización de los microtúbulos durante el crecimiento polarizado (Beck et al., 2010). La cinasa blanco de la rapamicina (TOR), es un regulador del crecimiento evolutivamente conservado que forma un complejo ternario con la proteína FKP12 y la rapamicina. Recientemente se analizó el efecto de la rapamicina en líneas de baja expresión de FKP12 (fkp12-1 y fkp12-1) insensibles al inhibidor rapamicina y de sobrexpresión de HsFKP12. Los resultados mostraron que en las líneas de baja expresión, el crecimiento de los pelos radiculares inducido con glucosa y tratadas con rapamicina no se veía afectado; en tanto que el mismo tratamiento en las líneas de sobreexpresión mostró que estas carecían por completo de pelos, lo que sugirió que el crecimiento de tales estructuras depende de TOR (Xiong y Sheen, 2012).

3.7. Cinasas implicadas en la morfogénesis de las dendritasEl crecimiento de las dendritas es de tipo polarizado y se encuentra regulado por varias vías de señalización como de las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK). Esta vía transduce señales extracelulares de la membrana celular hacia eventos nucleares, regulando múltiples procesos como la formación de

Figura 3.4. Posibles mecanismos que modulan la generación de ROS dependientes de PI3K en los pelos radiculares. Primero, la ruta de recirculación endocítica puede afectar la actividad o distribución de la NOX localizada en la membrana plasmática, cambiando la producción de ROS fuera de la célula (1). PI3K puede afectar el importe al citosol de ROS producidas exógenamente (2). Finalmente, NOX puede ser reclutada a los endosomas donde se localiza el PI3P, y producir ROS dentro de los endosomas (3) (Lee et al., 2010).

34

ramificaciones en dendritas, mediante la síntesis de proteínas de unión a actina (Wu et al., 2001; Koh et al., 2002).

La ruta de señalización PI3K/Akt (fosfatidil inositol 3 cinasa) ha sido implicada en la regulación del tamaño celular a través de la coordinación de la plasticidad de la sinapsis (Tang et al., 2002; Cammalleri et al., 2003). Además, se ha reportado que la ruta Ras-PI3K-Akt-mTOR juega un papel relevante en la regulación de una gran cantidad de procesos involucrados en la formación de dendritas. PI3K-Akt-mTOR controlan el cuerpo y el tamaño de las dendritas mediante la activación coordinada con la ruta Ras-MAPK. Al inhibir PI3K o mTOR se reduce el cuerpo, tamaño y complejidad de las dendritas, además de presentarse una menor densidad de filopodios (proyecciones citoplasmáticas delgadas de las neuronas precursoras de las dendritas), mientras que las células que expresan constitutivamente a Ras, PI3K o Akt, mostraron un aumento en la ramificación, lo que sugiere que dichas cinasas son clave para el desarrollo, tamaño y forma de las dendritas (Kumar et al., 2005).

3.8. El citoesqueleto en el crecimiento de los pelos radicularesEl desarrollo de los pelos radiculares comprende cuatro estados: selección del sitio de formación de abultamiento, formación del abultamiento, crecimiento unidireccional y maduración. El citoesqueleto de actina está involucrado en todos estos estadios y en los diferentes eventos del crecimiento. Además de la actina, sus isoformas también juegan distintos roles en los diferentes procesos. El citoesqueleto de actina está regulado por proteínas de unión a actina, tales como la formina, el complejo Arp2/3, la profilina, el factor de despolimerización de actina y la villina; así como por algunas señales río arriba como el calcio, los fosfolípidos y las GTPasas que regulan la actividad de estas proteínas de unión a actina para producir la configuración apropiada. El modelo propuesto para la dinámica del citoesqueleto muestra que en las puntas de los pelos radiculares, la polimerización de actina está facilitada por el complejo ARP2/3, activado por las GTPasas y la profilina; esta última es regulada por la cinasa de la fosfatidilinositol 4,5 difosfato. Mientras tanto, la despolimerizacion de actina y su entrega está estrechamente mediada por

la villina y el factor de despolimerización de actina el cual es activado por el calcio, en tanto que las fibras de actina son producidos por la formina y la villina (Fig. 3.5).

El citoesqueleto de actina tiene una función dinámica durante el desarrollo de los pelos radiculares y tiene afectaciones en las células epidérmicas de la mutante rhd4-1 de Arabidopsis, en las mutantes Sac1 de levaduras (Foti et al., 2001), y Sac1 de Arabidopsis (Zhong et al., 2005). En Arabidopsis, la mutante rhd4 que codifica a una fosfatasa causa defectos similares en la organización de actina, observados con el uso del marcador de filamentos de actina GFP-FABP2 (Voigt et al., 2005). Después de la migración y la reorganización del citoesqueleto de los tricoblastos, uno de los indicios detectables de la iniciación del pelo radicular es la alcalinización del citoplasma y la acidificación en la pared celular en el área de protrusión del futuro pelo radicular (Bibikova et al., 1998). La acidificación apoplástica local se ha determinado experimentalmente y es necesaria para el crecimiento del pelo radicular, ya que en tratamientos con soluciones amortiguadoras se evita la iniciación del pelo de una manera rápida, aunque esto puede ser reversible. Sin embargo, no se detectaron gradientes de pH después del establecimiento de la punta de crecimiento del pelo, sino que se observaron pHs citoplásmicos altos que inhibieron el crecimiento, mientras que los bajos causaron la formación del pelo (Bibikova et al., 1998). Por otra parte, Schiefelbein et al. (1992) encontraron que el calcio extracelular es requerido para el crecimiento del pelo (0.3-3.0 μM Ca2+) y un gradiente extracelular de calcio fue detectado en la punta del pelo, dicho gradiente no fue detectado en células vecinas que no están en crecimiento. La generación artificial de gradientes de Ca2+, indicó que el establecimiento de tal gradiente, es suficiente para iniciar el crecimiento del pelo.

Los microfilamentos de actina han sido observados in vivo en pelos radiculares con el uso de la proteína verde fluorescente (GFP). La F-actina forma una malla densa en el domo del pelo y en el ápice de la punta de crecimiento y presenta fibras menos densas que aparecen en el área basal del pelo radicular (Baluska et al., 2000). La ruptura de los micro filamentos de F-actina por el fármaco latrunculina B que secuestra a la G actina, arresta el crecimiento de los pelos de Arabidopsis y maíz (Bibikova et al., 1999; Baluska et al., 2000). Las células de los pelos de Arabidopsis que crecen en


35

ÁpiceBase Sub ápice

Núcleo

Núcleo

Núcleo

Activación

Inhibición

Cables de actina

Filamentos de actina

Fragmentos de actina

G-actina

Calcio

PI(4,5)P2

Canal de calcio

Figura 3.5. Modelo para el control del citoesqueleto de actina en diferentes estados del desarrollo de los pelos radiculares. (A) Esquema de la arquitectura y su regulación en los estados de iniciación de los pelos radiculares. ROPs contribuyen a la polimerización de actina en la zona de iniciación. (B) Esquema de la arquitectura y su regulación en el estado de elongación. El calcio facilita el desensamble de actina entre las ROPs y la PI(4,5)P2, lo que resulta en la despolimerización de la actina en la punta. (C) Esquema de la arquitectura de actina y su regulación en los pelos radiculares maduros. El calcio, PI(4,5)P2 y ROPs desaparecen en la punta y las uniones de actina están distribuidas en el pelo radicular (Modificado de Pei et al., 2012).

presencia de bajas concentraciones de latrunculina B son rectas y se extienden perpendicularmente al eje de la raíz (Bibikova et al., 1999). Los resultados anteriores sugieren que la actina es esencial en el mantenimiento del crecimiento localizado de las células del pelo. Sin embargo, cuando la F-actina está ausente en la membrana plasmática, el abultamiento del pelo es inestable y la punta se deforma ligeramente (Baluska et al., 2000).

3.9. Regulación del citoesqueleto en el crecimiento neuronalEl crecimiento neuronal depende de los cambios en el citoesqueleto de las dendritas constituido por los microfilamentos y microtúbulos, estos componentes están formados por polímeros dinámicos de actina y tubulina. El balance entre la polimerización y despolimerización es un proceso altamente controlado donde los microtúbulos inician la polimerización en

36

el centro de nucleación localizado en la parte central de la dendrita (Kirshner y Mitchison, 1986). Estos microtúbulos son transportados desde el cuerpo de la célula dentro de la dendrita en desarrollo, usando las proteínas motoras CHO1/MKLP1 (Sharp et al., 1997). Durante el crecimiento rápido los microtúbulos son dinámicamente inestables, pero pueden volverse más estables si el final del polímero en crecimiento es cubierto por proteínas asociadas a microtúbulos –MAPs- (Matus, 1988), MAP2 es el sustrato de la cAMP cinasa de calmodulina dependiente de calcio (Mitchison y Kirshner, 1988) la fosforilación en estas MAPs disminuye la capacidad de promoción de la polimerización.

3.10. Conclusiones El crecimiento polarizado o unidireccional está ampliamente conservado en múltiples organismos y tipos celulares como tricomas, tubo polínico, pelos radiculares, rizoides de algas, hifas fúngicas y dendritas neuronales. Además, los procesos que determinan este tipo de crecimiento presentan gran homología en la dinámica del movimiento de vesículas o del rearreglo del citoesqueleto. También han sido implicados en dicho crecimiento, la localización polar de componentes de membrana como los fosfoinosítidos y los esteroles estructurales. La sensibilidad que presenta el modelo de crecimiento polarizado y la sencillez en la identificación de patrones anormales de crecimiento, los cuales están determinados por el rearreglo del citoesqueleto y el movimiento vesicular han permitido entender en parte, cómo se regulan dichos procesos y los mecanismos que determinan el crecimiento unidireccional.

3.11. ReferenciasBaluska F., Volkmann D. y Barlow P.W. 2000. Actin-

based domains of the ‘cell periphery complex’ and their associations with polarized ‘cell bodies’ in higher plants. Plant Biol. 2: 253-267.

Beck M., Komis G., Muller J., Menzel D. y Samaj J. 2010. Arabidopsis homologs of nucleus-and phragmoplast-localized kinase 2 and 3 and Mitogen-Activated Protein Kinase 4 are essential for microtubule organization. Plant Cell 22:755-771

Benkova E., Michniewicz M., Sauer M., Teichmann T., Seifertova D., Jurgens G. y Friml J. 2003. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell 115: 591–602

Bibikova T.N., Jacob T., Dahse I. y Gilroy S. 1998.

Localized changes in apoplastic and cytoplasmic pH are associated with root hair development in Arabidopsis thaliana. Development 125:2925–2934

Cammalleri M., Lutjens R., Berton F., King A.R., Simpson C., Francesconi W. y Sanna P.P. 2003. Time-restricted role for dendritic activation of the mTOR-p70S6K pathway in the induction of late-phase long-term potentiation in the CA1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100:14368 –14373.

Cho H.T. y Cosgrove D.J. 2002. The regulation of Arabidopsis root hair initiation and expansin gene expression. Plant Cell 14: 3237–3253

Cho M., Lee O.R., Ganguly A. y Cho H.T. 2007. Auxin-signaling: short and long. J. Plant Biol. 50: 79–89

Duan Q., Kita D., Li C., Cheung A.Y. y Wu H.M. 2010. FERONIA receptor-like kinase regulates RHO GTPase signaling of root hair development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 41: 17821–17826

Foti M., Audhya A. y Emr S.D. 2001. Sac1 lipid phosphatase and Stt4 phosphatidylinositol 4-Kinase regulate a pool of phosphatidylinositol 4-phosphate that functions in the control of the actin cytoskeleton and vacuole morphology. Mol. Biol. Cell 12:2396-2411

Ganguly A., Lee S.H., Cho M., Lee O.R., Yoo H. y Cho H.T. 2010. Differential auxin-transporting :activities of PIN-FORMED proteins in Arabidopsis root hair cells. Plant Physiol. 153: 1046-1061

Ishida T., Kurata T., Okada K. y Wada T. 2008. A genetic regulatory network in the development of trichomes and root hairs. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 365–386

Jones A.R., Kramer E.M., Knox K.,Swarup R., Bennett M.J., Colin M.L., Leyser H.M. y Grierson C.S. 2009. Auxin transport through non-hair cells sustains root-hair development. Nat. Cell Biol. 11: 78–84

Kirshner M. y Mitchison T. 1986. Beyond self-assembly: from micro-tubules to morphogenesis. Cell 45:329-342

Koh Y.H., Ruiz-Canada C., Gorczyca M. y Budnik V. 2002. The Ras1-mitogen activated protein kinase signal transduction pathway regulates synaptic plasticity through fasciclin II-mediated cell adhesion. J. Neurosci. 22: 2496 –2504.

Kumar V., Zhang M.X., Swank M.W., Kunz J. y Wu G.Y. 2005. Regulation of dendritic morphogenesis by Ras–PI3K–Akt–mTOR and Ras–MAPK signaling pathways. J. Neurosci. 49:11288 –11299

Kusano H., Oka A., Testerink C., Munnik T., Vermeer J.E., Aoyama M., Tsuge T. y Shimada H. 2008. The Arabidopsis phosphatidylinositol phosphate 5inase PIP5K3 is a key regulator of root hair tip growth. Plant Cell 20: 367–380

Lee Y., Teun M. y Lee Y. 2010. Plant Phosphatidylinositol 3-Kinase. In: Lipid Signaling in Plants. T. Munnik (Ed.), (Vol. 16, pp. 95-106): Springer Berlin Heidelberg.

Lee Y., Bak G., Choi Y., Chuang W.-I., Cho H.-T. y Lee Y. 2008a. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase in root hair growth. Plant Physiol. 147:624–635.


37

Lee Y., Kim E.-S., Choi Y., Hwang I., Staiger C.J., Chung Y.-Y. y Lee Y. 2008b. The Arabidopsis phosphatidylinositol-3-kinase is essential for pollen development. Plant Physiol. 147:1886–1897

Lee S.H. y Cho H-T. 2006. PINOID positively regulates auxin efflux in Arabidopsis root hair cells and tobacco cells. Plant Cell 18:1604-1616

Leyser O.H.M., Lincoln A.C., Timpte C., Lammer D. Turner J. y Estelle M. 1993. Arabidopsis auxin-resistance gene AXR1 encodes a protein related to ubiquitin-activating enzyme E1. Nature 364:161-16

Leyser O., Pickett B.F., Dharmasiri S. y Estelle M.1996. Mutations in the AXR3 gene of Arabidopsis result in altered auxin response including ectopic expression from the SAUR-AC1 promoter. Plant J. 10: 403-413.

Libault M., Brechenmacher L., Cheng J., Xu D. y Stacey G. 2010. Root hair system biology. Trends Plant Sci. 15: 641–650.

Masucci J.D. y Schiefelbein J.W. 1996. Hormones act downstream of TTG and GL2 to promote root hair outgrowth during epidermis development in the Arabidopsis root. Plant Cell 8:1505–1517.

Matus A. 1988. Microtubule associated Proteins: Their Potential role in determining neuronal morphology. Annu. Rev. Neurosci. 11:29-44

Mitchison T. y Kirshner M. 1988. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1:761-772

Ovecka M., Lichtscheidl I. K,. Berson T., Beck M., Derksen J., Samaj J. y Baluska F. 2010. Structural sterols are involved in both the initiation and tip growth of root hairs in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 22: 2999–3019

Parker J.S., Cavell A.C., Dolan L., Roberts K. y Grierson C.S. 2000. Genetic interactions during root hair Morphogenesis in Arabidopsis. Plant Cell 12:1961-1974

Pei W., Du F, Zhang Y., He T. y Ren H. 2012. Control of the actin cytoskeleton in root hair development. Plant Sci. 187:10–18

Pitts R.J., Cernac A. y Estelle M. 1998. Auxin and ethylene promote root hair elongation in Arabidopsis. Plant J. 16: 553–560.

Samaj J., Ovecka M., Hlavacka A., Lecourieux F., Meskiene I., Lichtscheidl I., Lenart P., Salaj J., Volkmann D., Brögre L., Baluska F. y Hirt H. 2002. Involvement of the mitogen-activated protein kinase SIMK in regulation of root hair tip growth. EMBO J. 21: 3296-3306.

Sharp D.J., Yu W., Ferhat L., Kuriyama R., Rueger D.C. y Bass P.W. 1997. Identification of a microtubule-associated motor protein essential for dentritic

differentiation. J. Cell. Biol.138:8833-843Schiefelbein J., Galway M., Masucci J. y Ford S. 1993.

Pollen tube and root hair tip growth is disrupted in a mutant of Arabidopsis. Plant Physiol. 103:979–985.

Tang S.J., Reis G., Kang H., Gingras A.C., Sonenberg N., y Schuman E.M. 2002. A rapamycin-sensitive signaling pathway contributes to long-term synaptic plasticity in the hippocampus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:467– 472.

Takeda S., Gapper C., Kuchitsu K., Dolan L., Kaya, H. y Bell E. 2008. Local positive feedback regulation determines cell shape in root hair cells. Science 319: 1241-1244

Thole J.M. Vermeer, J.E.M. Yanling Z. Gadella Jr., T.W.J. y Nielsen E. 2008. ROOT HAIR DEFECTIVE4 encodes a phosphatidylinositol-4-phosphate phosphatase required for proper root hair development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 20: 381–395

Voigt B., Timmers A.C.J., Šamaj J., Hlavacka A., Ueda T., Preuss M., Nielsen E., Mathur J., Emans N., Stenmark H., Nakano A., Baluška F. y Menzel D. 2005. Actin-based motility of endosomes is linked to the polar tip-growth of root hairs. Eur. J. Cell Biol. 84: 609-621

Wada T., Kurata T., Tominaga R., Koshino-Kimura Y., Tachibana T., Goto K., Marks M.D. Shimura Y. y Okada K. 2002. Role of a positive regulator of root hair development, CAPRICE, in Arabidopsis root epidermal cell differentiation. Development 129: 5409-5419

Wu G.Y., Deisseroth K., y Tsien R.W., 2001. Spaced stimuli stabilize MAPK pathway activation and its effects on dendritic morphology. Nat. Neurosci. 4:151–158

Xiong Y. y Sheen J. 2012. Rapamycyn and glucose-target of rapamicin (TOR) protein signaling in plants. J. Biol. Chem. 287:2836-2842

Zhang X., Dyachokb J., Krishnakumara S., Smith L.S. y Oppenheimer D.G. 2005. IRREGULAR TRICHOME BRANCH1 in Arabidopsis encodes a plant homolog of the actin-related protein 2/3 complex activator Scar/WAVE that regulates actin and microtubule organization. Plant Cell 17:2314-2326

Zhong R., Burk H.D., Naim C.J., Wood-Jones A., Morrison I.W.H. y Ye Z.-H. 2005. Mutation of SAC1, an Arabidopsis SAC domain phosphoinositide phosphatase, causes alterations in cell morphogenesis, cell wall synthesis, and actin organization. Plant Cell 17: 1449-1466

Zonia L. y Munnik T. 2008. Vesicle trafficking dynamics and visualization of zones of exocytosis and endocytosis in tobacco pollen tubes. J. Exp. Bot. 4:861–873.

38