Marcadores

Moleculares

Luis De Stefano BeltránLuis De Stefano Beltrán

Departamento de Ciencias Biológicas y FisiológicasUniversidad Peruana Cayetano Heredia

Marcadores Moleculares

Un gen o secuencia de ADN que se puede usar paraidentificar a un organismo, a una especie, a una cepao a una característica fenotípica asociada con él

Un señal usada en el aislamiento de genes eucarióticos:una sonda de RFLP o un lugar de unión de partidor para amplificación

Secuencias de ADN que pueden ser identificadas mediante un simple ensayo:

tan pequeño como un SNP o un fragmento de ADN generado por ER’s.

Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos de cromosoma que no codifican necesariamente alguna característica, que no están afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera Mendeliana (2006).

Marcadores Moleculares

Isozimas y Alozimas

• El “abuelo” de los marcadores moleculares

• Lewontin y Hubby, 1966 - Las substituciones de amino ácidos cambian la movilidad de la enzima en el gel: -plegamiento y/o carga

• Aún en uso en estudios de Genética de Poblaciones que necesitan identificar bajos niveles de variación genética.

Isozimas

• Pros:Protocolos bien desarrollados con moderado

grado de dificultad. No se necesita información genómica. Existen décadas y décadas de datos acumulados

(“mining”).

•Contras:Poca variación.Se necesita abundante tejido fresco.Loci son una muestra no aleatoria del genoma y

muchos están bajo fuerte selección.Puede ser considerado un “arte”.Muchos reactivos, químicos peligrosos.

Marcadores Moleculares

Southern blots

• Aislamiento del ADN • Digestión del ADN con enzimas

de restricción • Separación de los fragmentos de

ADN de acuerdo a su tamaño• Desnaturalización del ADN• Transferencia de las cadenas

simples de ADN a la membrana

Metodología

• Preparación de la sonda– Marcaje – Desnaturalización

• Hibridación de la sonda a la membrana

• Enjuague de la membrana• Autoradiografía

sondasonda

ubicaciubicación de los sitios de restricciónón de los sitios de restricción

ADNADNAnemiaAnemia

FalciformeFalciforme

ADNADNAnemiaAnemia

FalciformeFalciformeADNADN

NormalNormalADNADN

NormalNormalAA BB

A + BA + B

A + BA + B

AA

BB

1. Cortar 1. Cortar concon

MstIMstI2. Gel2. Gel

1. Cortar 1. Cortar concon

MstIMstI2. Gel2. Gel

ADN ADN ββ-Globina-GlobinaNormalNormal

ADN AnemiaADN AnemiaFalciformeFalciforme

HibrididaciHibrididaciónónSouthernSouthern

ElectroforesisElectroforesisen geles de en geles de

AgarosaAgarosa

Southern

Blot

Desventajas

•Es tediosa y trabajosa •Puede durar varios días •Costosa •Usa radioisótopos

Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)

“PCR is the practice of Biology without a permit”

“RAPD allows analysis without a clue”

Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)

• 1990, Welsh & McCleland and Williams et al.

• Usa partidores muy cortos (10 pb) para amplificar fragmentos aleatorios de ADN.

• No se necesita ninguna información acerca del genoma en estudio

• Marcador dominante: presente o ausente

• Muy desacreditado, pero probablemente no es tan malo como algunos podrían pensar

Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)

Amplified Fragment Length Polymorphism

AFLPs

Pros:-Muchos loci estudiados al mismo tiempo-No se necesita ninguna información anterior-Alta variabilidad

Contras:-Homoplasia en el tamaño de los fragmentos -Problemas con reproducibilidad-Protocolo es muy largo-Marcador dominante anónimo-Demasiados loci…..!!

ADN Repetitivo

Microsatélites o Secuencias Simples Repetidas(Simple Sequence Repeats, SSRs)- Mono-, di-, tri-, y tetra-nucleótidos

Minisatélites o Short Tandem Repeats (STRs)- 5-10 bp

Variable Number of Tandem Repeats- 14-100 bp

Microsatélites

Rearreglos en los tándem repetidos debido a un crossover desigual

Microsatélites

•Pros: -Altamente variable-Muchos alelos por locus-Marcador co-dominante

•Contras:-Dinámica evolutiva desconocida- “Stutter y alelos nulos complican el “scoring”-Alta inversión inicial para desarrollar loci

Single Nucleotide Polymorphism: SNPs

• Pueden representar hasta 90% de la VariaciónGenética Humana.

• 1.5 millon de posiciones presentan variabilidad

• Puede ser la base de la susceptibilidad a enfermedades comunes (cáncer, diabetes, etc).

• Farmacogenética: busca identificar la posiblerespuesta a las terapias con drogas.

• Métodos para identificación, dependen, si es un SNPdesconocido o conocido.

Marcadores No Polimórficos

• STSs (Sequence Tagged Sites) Secuencia corta de ADN (200 – 500 bp)

con una ubicación cromosómica conocida que ocurre una vez en el genoma.

• ESTs (Expressed Sequence Tags) STSs derived from ADNc’s

Conclusiones

• No todos los MM’s son iguales.

• Ninguno de ellos son ideales.

• Algunos son mejores para algunos propósitos que otros.

• Sin embargo, todos son preferibles a los marcadores morfológicos para propósitos de

mapeo