Ap8 - Imunofluorescencia

Aula 8

Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e

Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert

Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA.

Atualizado em julho de 2003

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Princípio da técnica:

Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo

covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando

excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.

Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo

conjugado pode ser usado para detectar um determinado

antígeno e vice-versa. A reação é feita em lâminas de mi-

croscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a obser-

vação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio

de fluorescência).

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluo-

resceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil

rodamina – TRICT).

Principais modalidades: Imunofluorescência direta e indireta

Microscópio de fluorescência com epiluminação

(modificado de Stites, Terr e Parslow, 2000)

luz UV atinge o ma- terial examinado

fluorescência emitida chega ao observador

Tecido ou esfregaço(com Ag)

Imunofluorescência Direta

Lavagem para retirada dos conjugados não fixados:

Tecido ou esfregaço (com Ag)

Adição de anticorpos (em geral monoclonais), conju- gados com um fluo- rocromo.

lâmina

Montagem da lâmina e observação microscópica

Utilização da técnica: muito usada para a detecção direta de mi-crorganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de

tecidos etc. Também bastante utilizada na fenotipagem de célulastumorais

Imunofluorescência Indireta

Tecido ou esfregaço (com Ag)

Lavagem para retirada de anticorpos não fixados:

Adição de anti-Ac conjugado com fluorocromo:

Tecido ou esfregaço (com Ag)

Adição de soro teste, contendo anticorpos específicos contra o Ag em questão.

REAÇÃO POSITIVA

A lâmina usada possuicírculos impressos no vidro,em geral conforme o esque-ma acima, onde estão os an-tígenos. Neles são coloca-dos os controles (positivo enegativo) e os soros testes devidamente diluídos (di-luição seriada).

Lâmina

Lavagem para retirada do conjugado não fixado:

Tecido ou esfregaço (com Ag)

Montagem da lâmina e observação emmicroscópio de imunofluorescência

de uma reação positiva.

REAÇÃO NEGATIVA

Tecido ou esfregaço (com Ag)

Adição de soro teste que não contem anticorpos específicos para o antígeno em questão

Lavagem para retirada de anticorpos não fixados:

Adição de anti-Ac conjugado com fluorocromo:

Tecido ou esfregaço (com Ag)

Lavagem para retirada dos conjugados não fixados:

Montagem da lâmina e observação microscópica

Tecido ou esfregaço (com Ag)

de uma reação negativa

Utilização da técnica: a imunofluorescência indireta é muito usada para o diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites etc. É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade e especificidade. Apesar de poder detectar anticorpos IgM espe- cíficos, ela é muito útil para o diagnóstico de doenças crônicas, onde a de- tecção de anticorpos IgG ou IgA confirma a suspeita clínica, como na refe- rida Doença de Chagas. Tem como maior desvantagem o uso do microscó- pio de imunofluorescência, cuja a luz é UV, além do fato de ser um teste qualitativo ou semi-quantitativo e nunca quantitativo (quem detecta a reação é o olho humano).

Visualização pela imunofluorescência

Larvas de S. mansoni após reação de imuno- fluorescência direta

imunofluorescência com FITC

fotografia preto–e-branco de uma cercária,contra a qual se dirigiu anticorpos fluores- ceinados

Ac contra Ag tecidual conjugado com rodamina (TRICT)

Ac contra Ag tecidual, conjugadocom fluoresceína ( FITC )

Anticorpos contra antígenos teciduais conjugados comrodamina e com fluoresceína (obviamente dirigidoscontra antígenos diferentes).

Mais algumas fotos de imunofluorescência:

FIM