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- Enzimas oxidativas envolvidas na degradação
de lignina: estrutura, função, como determinar
e aplicações no branqueamento de polpas
- Lacase usada na funcionalização de fibras
(seminário)
André Ferraz
Departamento de Biotecnologia
Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo
Lorena, SP
Enzimas em conversão de biomassa
Outline - LiP, MnP e VP (peroxidases) - Lacases - Determinação experimental - Aplicações em branqueamento de polpas - Aplicação de lacases na funcionalização de fibras (artigo para discussão no terço final da aula)
Ref. básicas:
1. T Teerii and G Henriksson. 2009 Enzymes degrading wood components. In:
In: Pulp and Paper Chemistry and Technology Volume 1, Wood Chemistry
and Wood Biotechnology
Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar Henriksson
cap. 11, pp. 245-270
2. Kenneth E Hammel and Dan Cullen, 2008. Role of fungal peroxidases in
biological ligninolysis. Current Opinion in Plant Biology 11:349–355
3. seminário: Jordi Garcia-Ubasart, Josep F. Colom, Carlos Vila, Nuria
Gómez Hernández, M. Blanca Roncero, Teresa Vidal . 2012. A new procedure
for the hydrophobization of cellulose fibre using laccase and a hydrophobic
phenolic compound. Bioresource Technology 112: 341–344.
Revisando sobre o modo de ação dos organismos degradadores de lignina
A hifa do fungo habita o lúmen da célula; a degradação ocorre no interior da parede celular
Enzimas
envolvidas na
degradação de
lignina
princípio do
modo de ação
Lógica de
fragmentação,
independente
da ação
enzimática,
dos radicais
inicialmente
gerados por
envolvidas
oxidativas
Lacase (Cu2+)
Lacase red. (Cu1+)
O2
H2O PhOH
PhO•
Enzimas oxidativas (lacases) (EC 1.10.3.2) (AA1_1)
Quem são as enzimas envolvidas na degradação de
lignina??
grupo 1: Lacases
Cupro-proteínas que recebem elétrons dos fenóis a partir da redução do Cu2+ a Cu1+. A Lac-Cu1+ é então oxidada por O2 que é reduzido à água
Lacases de Trametes versicolor 52J listada no CAZy
(white-rot fungi)
Visão geral dos 4 íons Cobre. Os
íons denominados T1 realizam a
oxidação do substrato; T2/T3
reduzem o O2
A estequeometria da reação envolve mais de 1 molécula fenólica
por O2 reduzido, pois há 4 cobres na molécula de lacase
Cada O-H fenólico perde 1 e-, gerando um radical fenoxila que se decompõe, por várias vias, conforme mostrado anteriormente
A enzima atua somente sobre compostos com hidroxilas fenólicas
(de fato, também pode atuar sobre aminas aromáticas), pois a
capacidade oxidativa é baixa
Potencial redox do Cu2+ (T1) varia de acordo com o tipo de lacase O. V. Morozova, G. P. Shumakovich, M. A. Gorbacheva, S. V. Shleev, and A. I. Yaropolov (2007) Blue” Laccases. Biochemistry (Moscow) 72:1136-1150.
11
A capacidade oxidativa pode ser aumentada se a ação é
inicialmente realizada sobre mediadores sintéticos (ABTS ou
HBT). Nestes casos a oxidação pode ocorrer mesmo em
substratos não fenólicos de lignina
Fonte: Reproduzido de Bourbonnais et al. (1999).
Oxidação de ABTS em dois estágios, que podem ser iniciados por lacase
Mediadores naturais já descritos para lacases
Quem são as enzimas envolvidas na degradação de
lignina??
a) Fenoloxidases
b) Enzimas que produzem peróxido de hidrogênio
C0 CI
CII
S
S+•
S
S+•
H2O2
H2O H 2 O
C 0 C I
C II
H 2 O 2
Mn3+
Mn2+
PhOH PhO
.
Mn3+
Mn2+
ou
LiP (EC 1.11.14) (AA 2) MnP (EC 1.11.1.13) (AA2)
Enzimas oxidativas (peroxidases) - visão simplista
Lip e MnP de Phanerochaete chrysosporium (white-rot fungi). Estruturas similares em todas as peroxidases (grupo heme é o sítio ativo).
No caso da MnP, há um sítio de ligação de Mn2+ que funciona como um co-fator para a ação da enzima
http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Wood4.html
Ciclo de oxi-redução no sítio catalítico das peroxidases
Forma nativa da enzima Forma oxidada da enzima
oxidação do substrato
oxidação do substrato. Se for uma MnP: Mn2+>>Mn3+
Mn3+ ou .OH
.
Mn2+ ou H2O
COOH
O2
COOH.
COOH
OO.
Abstração de H de um doador
COOH
O OH
COOH
COOH
COOH.(etapa de propagação)
(etapa de iniciação)
B
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
ROO.
ROOH
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
.O2
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
.OO
HOO.
OC2H5
OH
OCH3O
OCH3
O
OCH3O.
+
OC2H5
HO
OH
OCH3
OCH3
OH
OC2H5
O
AB
Figura 5. (A) Reação de peroxidação de ácido linoleico iniciada por íons Mn3+
ou radicais
hidroxila. (B) Degradação de um composto modelo de lignina (não fenólico) iniciada por radical
organoperoxila (ROO) gerado in situ pelo sistema MnP, ácido linoleico e H2O2. O modelo
proposto explicaria a via de oxidação C-alfa (A) e a clivagem beta-O-4 (B). Ambas reações
seriam iniciadas pela abstração do um hidrogênio benzílico do composto modelo através da ação
de um radical peroxila gerado pelo sistema MnP/ácido linoleico/H2O2
Fonte: Reproduzido com modificações de Kapich et al. (1999).
Ação de MnP, mediada por ácidos graxos
insaturados, sobre modelos não fenólicos de lignina
Peroxidação de ácido graxo iniciada por Mn3+
Degradação de modelo não fenólico por ROO gerado por MnP
Fonte: Reproduzido com modificações de Kapich et al. (1999).
Degradação in vitro de
lignina contida em um
material lignocelulósico
pelo sistema MnP/ácido
linoleico
G.G.S. Cunha et al. / Enzyme and
Microbial Technology 46 (2010) 262–
267
Enzimas oxidativas (Peroxidase versátil - VP)
(EC 1.11.1.16) (AA2)
Híbrido estrutural de LiP e MnP. Combina as propriedades catalíticas das 2 enzimas, oxidando substratos de LiP e MnP.
Versátil Peroxidase de Pleurotus eryngii
VPL has the three acidic amino acid residues required for Mn2+ binding, and a catalytic efficiency (kcat/Km) for Mn2+ oxidation in the general range exhibited by typical MnPs. In addition, VPL has a tryptophan residue, trp164, analogous to the LiPA trp171 that participates in electron transfer from aromatic donors and consequently enables the enzyme to oxidize nonphenolic lignin-related structures The catalytic efficiency of P. eryngii VPL on veratryl alcohol is relatively low the same reaction catalyzed by P. chrysosporium LiP
Celobiose desidrogenase (EC 1.1.99.18) (AA3) Oxida polissacarídeos, reduzindo Fe3+, O2 ou mesmo coopera com o ciclo catalítico das LPMOs (AA9)
glicose oxidase
(EC 1.1.3.4) (AA3)
(intracelular)
glioxal oxidase
(AA5_1)
(extracelular)
aril-álcool oxidase
(EC 1.1.3.7) (AA3)
(extracelular)
Enzimas que produzem peróxido
(são acessórias às peroxidases)
Enzimas que produzem peróxido
Também MnP pode gerar H2O2 a partir da oxidação de
ácidos orgânicos como o malônico e oxálico.
O=O
H-O-O. + CO2
Doador de H
HO-(C=O)-(C=O)-OH
Mn3+ Mn2+
O=C=O + H+ + HO-C.=O
H2O2
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Biobranqueamento com o sistema Lacase/mediador
Exemplo do efeito da ação do sistema lacase/HBT sobre polpa kraft não branqueada
Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997)
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Figura 8. Linha de branqueamento piloto composta das etapas L-E-Q-P Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997).
Figura 9. Número kappa e alvura das polpas tratadas em planta piloto após os tratamentos com
lacase/mediador (L) e lacase/mediador seguido de extração alcalina (L-E). Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997).
Lacase/HBT em linha piloto de biobranqueamento
Incluindo a etapa final de branqueamento (QP), polpa atingiu 76.5% ISO de alvura.
Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997)
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Figura 13. Estrutura de mediadores alternativos testados no sistema lacase/mediador. O
mediador de referência foi o HBT, mostrado na figura “L”. Fonte: reproduzido de Camarero et al. (2007).
Mediadores alternativos ao HBT
HBT
Fonte: Reproduzido de Camarero et al. (2007)
AS
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Mediadores alternativos ao HBT
Fonte: Reproduzido de Camarero et al. (2007)
HBT
AS
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Eficiência da MnP em função do tipo de ácido graxo insaturado presente no meio reacional Kappa inicial = 8,5
Fonte: Reproduzido de Bermeck et al. (2002)
Alvura inicial = 39,3%
Biobranqueamento com o sistema MnP/mediador
Lacase usada na funcionalização de fibras (seminário)
Garcia-Ubasart et al., 2012. A new procedure for the hydrophobization of cellulose fibre using laccase and a hydrophobic phenolic compound. Bioresource Technology 112: 341-344
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