- Enzimas oxidativas envolvidas na degradação

de lignina: estrutura, função, como determinar

e aplicações no branqueamento de polpas

- Lacase usada na funcionalização de fibras

(seminário)

André Ferraz

Departamento de Biotecnologia

Escola de Engenharia de Lorena

Universidade de São Paulo

Lorena, SP

Enzimas em conversão de biomassa

Outline - LiP, MnP e VP (peroxidases) - Lacases - Determinação experimental - Aplicações em branqueamento de polpas - Aplicação de lacases na funcionalização de fibras (artigo para discussão no terço final da aula)

Ref. básicas:

1. T Teerii and G Henriksson. 2009 Enzymes degrading wood components. In:

In: Pulp and Paper Chemistry and Technology Volume 1, Wood Chemistry

and Wood Biotechnology

Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar Henriksson

cap. 11, pp. 245-270

2. Kenneth E Hammel and Dan Cullen, 2008. Role of fungal peroxidases in

biological ligninolysis. Current Opinion in Plant Biology 11:349–355

3. seminário: Jordi Garcia-Ubasart, Josep F. Colom, Carlos Vila, Nuria

Gómez Hernández, M. Blanca Roncero, Teresa Vidal . 2012. A new procedure

for the hydrophobization of cellulose fibre using laccase and a hydrophobic

phenolic compound. Bioresource Technology 112: 341–344.

Revisando sobre o modo de ação dos organismos degradadores de lignina

A hifa do fungo habita o lúmen da célula; a degradação ocorre no interior da parede celular

Enzimas

envolvidas na

degradação de

lignina

princípio do

modo de ação

Lógica de

fragmentação,

independente

da ação

enzimática,

dos radicais

inicialmente

gerados por

envolvidas

oxidativas

Lacase (Cu2+)

Lacase red. (Cu1+)

O2

H2O PhOH

PhO•

Enzimas oxidativas (lacases) (EC 1.10.3.2) (AA1_1)

Quem são as enzimas envolvidas na degradação de

lignina??

grupo 1: Lacases

Cupro-proteínas que recebem elétrons dos fenóis a partir da redução do Cu2+ a Cu1+. A Lac-Cu1+ é então oxidada por O2 que é reduzido à água

Lacases de Trametes versicolor 52J listada no CAZy

(white-rot fungi)

Visão geral dos 4 íons Cobre. Os

íons denominados T1 realizam a

oxidação do substrato; T2/T3

reduzem o O2

A estequeometria da reação envolve mais de 1 molécula fenólica

por O2 reduzido, pois há 4 cobres na molécula de lacase

Cada O-H fenólico perde 1 e-, gerando um radical fenoxila que se decompõe, por várias vias, conforme mostrado anteriormente

A enzima atua somente sobre compostos com hidroxilas fenólicas

(de fato, também pode atuar sobre aminas aromáticas), pois a

capacidade oxidativa é baixa

Potencial redox do Cu2+ (T1) varia de acordo com o tipo de lacase O. V. Morozova, G. P. Shumakovich, M. A. Gorbacheva, S. V. Shleev, and A. I. Yaropolov (2007) Blue” Laccases. Biochemistry (Moscow) 72:1136-1150.

11

A capacidade oxidativa pode ser aumentada se a ação é

inicialmente realizada sobre mediadores sintéticos (ABTS ou

HBT). Nestes casos a oxidação pode ocorrer mesmo em

substratos não fenólicos de lignina

Fonte: Reproduzido de Bourbonnais et al. (1999).

Oxidação de ABTS em dois estágios, que podem ser iniciados por lacase

Mediadores naturais já descritos para lacases

Quem são as enzimas envolvidas na degradação de

lignina??

a) Fenoloxidases

b) Enzimas que produzem peróxido de hidrogênio

C0 CI

CII

S

S+•

S

S+•

H2O2

H2O H 2 O

C 0 C I

C II

H 2 O 2

Mn3+

Mn2+

PhOH PhO

.

Mn3+

Mn2+

ou

LiP (EC 1.11.14) (AA 2) MnP (EC 1.11.1.13) (AA2)

Enzimas oxidativas (peroxidases) - visão simplista

Lip e MnP de Phanerochaete chrysosporium (white-rot fungi). Estruturas similares em todas as peroxidases (grupo heme é o sítio ativo).

No caso da MnP, há um sítio de ligação de Mn2+ que funciona como um co-fator para a ação da enzima

http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Wood4.html

Ciclo de oxi-redução no sítio catalítico das peroxidases

Forma nativa da enzima Forma oxidada da enzima

oxidação do substrato

oxidação do substrato. Se for uma MnP: Mn2+>>Mn3+

Mn3+ ou .OH

.

Mn2+ ou H2O

COOH

O2

COOH.

COOH

OO.

Abstração de H de um doador

COOH

O OH

COOH

COOH

COOH.(etapa de propagação)

(etapa de iniciação)

B

OCH3

OOCH3

OH

HO

OC2H5

ROO.

ROOH

OCH3

OOCH3

OH

HO

OC2H5

.O2

OCH3

OOCH3

OH

HO

OC2H5

.OO

HOO.

OC2H5

OH

OCH3O

OCH3

O

OCH3O.

+

OC2H5

HO

OH

OCH3

OCH3

OH

OC2H5

O

AB

Figura 5. (A) Reação de peroxidação de ácido linoleico iniciada por íons Mn3+

ou radicais

hidroxila. (B) Degradação de um composto modelo de lignina (não fenólico) iniciada por radical

organoperoxila (ROO) gerado in situ pelo sistema MnP, ácido linoleico e H2O2. O modelo

proposto explicaria a via de oxidação C-alfa (A) e a clivagem beta-O-4 (B). Ambas reações

seriam iniciadas pela abstração do um hidrogênio benzílico do composto modelo através da ação

de um radical peroxila gerado pelo sistema MnP/ácido linoleico/H2O2

Fonte: Reproduzido com modificações de Kapich et al. (1999).

Ação de MnP, mediada por ácidos graxos

insaturados, sobre modelos não fenólicos de lignina

Peroxidação de ácido graxo iniciada por Mn3+

Degradação de modelo não fenólico por ROO gerado por MnP

Fonte: Reproduzido com modificações de Kapich et al. (1999).

Degradação in vitro de

lignina contida em um

material lignocelulósico

pelo sistema MnP/ácido

linoleico

G.G.S. Cunha et al. / Enzyme and

Microbial Technology 46 (2010) 262–

267

Enzimas oxidativas (Peroxidase versátil - VP)

(EC 1.11.1.16) (AA2)

Híbrido estrutural de LiP e MnP. Combina as propriedades catalíticas das 2 enzimas, oxidando substratos de LiP e MnP.

Versátil Peroxidase de Pleurotus eryngii

VPL has the three acidic amino acid residues required for Mn2+ binding, and a catalytic efficiency (kcat/Km) for Mn2+ oxidation in the general range exhibited by typical MnPs. In addition, VPL has a tryptophan residue, trp164, analogous to the LiPA trp171 that participates in electron transfer from aromatic donors and consequently enables the enzyme to oxidize nonphenolic lignin-related structures The catalytic efficiency of P. eryngii VPL on veratryl alcohol is relatively low the same reaction catalyzed by P. chrysosporium LiP

Celobiose desidrogenase (EC 1.1.99.18) (AA3) Oxida polissacarídeos, reduzindo Fe3+, O2 ou mesmo coopera com o ciclo catalítico das LPMOs (AA9)

glicose oxidase

(EC 1.1.3.4) (AA3)

(intracelular)

glioxal oxidase

(AA5_1)

(extracelular)

aril-álcool oxidase

(EC 1.1.3.7) (AA3)

(extracelular)

Enzimas que produzem peróxido

(são acessórias às peroxidases)

Enzimas que produzem peróxido

Também MnP pode gerar H2O2 a partir da oxidação de

ácidos orgânicos como o malônico e oxálico.

O=O

H-O-O. + CO2

Doador de H

HO-(C=O)-(C=O)-OH

Mn3+ Mn2+

O=C=O + H+ + HO-C.=O

H2O2

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Biobranqueamento com o sistema Lacase/mediador

Exemplo do efeito da ação do sistema lacase/HBT sobre polpa kraft não branqueada

Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997)

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Figura 8. Linha de branqueamento piloto composta das etapas L-E-Q-P Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997).

Figura 9. Número kappa e alvura das polpas tratadas em planta piloto após os tratamentos com

lacase/mediador (L) e lacase/mediador seguido de extração alcalina (L-E). Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997).

Lacase/HBT em linha piloto de biobranqueamento

Incluindo a etapa final de branqueamento (QP), polpa atingiu 76.5% ISO de alvura.

Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997)

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Figura 13. Estrutura de mediadores alternativos testados no sistema lacase/mediador. O

mediador de referência foi o HBT, mostrado na figura “L”. Fonte: reproduzido de Camarero et al. (2007).

Mediadores alternativos ao HBT

HBT

Fonte: Reproduzido de Camarero et al. (2007)

AS

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Mediadores alternativos ao HBT

Fonte: Reproduzido de Camarero et al. (2007)

HBT

AS

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Eficiência da MnP em função do tipo de ácido graxo insaturado presente no meio reacional Kappa inicial = 8,5

Fonte: Reproduzido de Bermeck et al. (2002)

Alvura inicial = 39,3%

Biobranqueamento com o sistema MnP/mediador

Lacase usada na funcionalização de fibras (seminário)

Garcia-Ubasart et al., 2012. A new procedure for the hydrophobization of cellulose fibre using laccase and a hydrophobic phenolic compound. Bioresource Technology 112: 341-344