Animais transgênicos e Xenotransplantes - …. Dr. Vinicius Farias Campos Disciplina de...

Animais transgênicos e Xenotransplantes

Prof. Dr. Vinicius Farias Campos Disciplina de Transgênese Animal

Graduação em Biotecnologia - UFPel

1. Histórico e contextualização

2. Animais transgênicos e xenotransplantes

3. Métodos de geração e controle da expressão

4. Minisuínos transgênicos

6. Aplicações dos xenotransplantes

Abordagens da aula...

Autotransplante (auto = próprio) – transplante de tecido de uma parte para outra do corpo da mesma pessoa – sem rejeição Ex. ponte de safena

Alotransplantes (alo = outro) – transplante entre indivíduos de uma mesma espécie mas geneticamente diferentes. Ex. transplante de coração a partir de um doador compatível

Xenotransplante (xeno = extranho) – transplante entre espécies diferentes. Ex. suíno para um humano

Contextualização e classificação dos transplantes

Tipo mais comum de transplante

Alotransplantes

Revolucionaram a medicina década de 50

Atualmente são realizados cerca de 30.000 transplantes por ano no Brasil

Set/2013 – haviam 28.337 pessoas na fila de espera no Brasil

Escassez de órgãos

Busca de novas fontes de órgãos

Dados: ABTO, 2012

ABTO, 2013

Novas fontes de órgãos para transplantes

Órgãos robóticos ou mecânicos

Engenharia de tecidos – células tronco

Xenotransplantes

• 1682 – Transplante de parte do crânio de um cão para um homem na Rússia

• 1800 – Transplante da pele de sapo para feridos na guerra inglesa

• 1965 – Transplante de rins de chimpanzé para um homem

• 1992 – Transplante de um fígado de babuíno para um homem

• 2012 – Testes pré-clínicos com transplante de ilhotas pancreáticas de suínos transgênicos para humanos

Histórico dos Xenotransplantes

Por que gerar animais transgênicos para os xenotransplantes?

Nos alotransplantes barreiras genéticas imunológicas precisam ser superadas

Busca de doadores geneticamente compatíveis e uso de imunossupressores

O que nem sempre é bem sucedido!

E causa redução da resposta imune no paciente transplantado

Nos xenotransplantes isto ocorre também!

Por que gerar animais transgênicos para os xenotransplantes?

Com o desenvolvimento da transgênese animal

Modificação os animais doadores para remover as barreiras imunológicas

Fornecendo uma solução genética para um problema genético!

Quais espécies podem ser usadas para os xenotransplantes?

Macacos Suínos

– Animal com maior semelhança ao humano;

– Transmissão de vírus patogênicos (HIV);

– Problemas éticos;

– Não é mais usado

Macacos

Suínos

Humano (9 semanas) Suíno (4 semanas)

• Não-primata mais semelhante fisiologicamente ao homem;

• Órgãos com tamanho semelhante aos órgãos humanos;

• Ciclos reprodutivos curtos e proles grandes;

• Crescimento rápido;

• Espécie domesticada e já utilizada no consumo humano – Menos problemas éticos;

• Métodos para a transgênese bem estabelecidos.

Suínos

Modelo ideal para xenotransplantação

Qual o papel da transgênese nos xenotransplantes?

1. Superar barreiras imunológicas

2. Superar barreiras fisiológicas

3. Evitar xenozoonoses

• Remoção dos genes (knockout) dos principais antígenos causadores da rejeição hiperaguda;

• Adição de genes (knockin) para proteínas imunomoduladoras do sistema imune humano – rejeição crônica;

1. Suínos transgênicos para superar barreiras imunológicas

– O epítopo α1, 3-galactosiltransferase (αGal)

• Glicoproteína de membrana das células suínas;

• Presente em quase todas as células suínas;

• Principal responsável pela rejeição hiperaguda;

• Atacado por antícorpos humanos anti-αGal;

• Principalmente em órgãos vascularizados.

D’ápice & Cowan, 2009

Quais genes devem ser removidos

(nocauteados) nos suínos transgênicos?

– Reguladores do sistema complemento

• Função de bloquear o sistema complemento humano

– Reguladores da coagulação e trombose

• Inibir a formação de coágulos e trombos nos órgão xenotransplantados

– Moléculas imunossupressivas

• Atuam bloqueando a resposta imune no órgão xenotransplantado

Quais genes devem ser inseridos (knockin)

nos suínos transgênicos?

Os suínos transgênicos são utilizados nos xenotransplantes para:

1. Superar barreiras imunológicas

2. Superar barreiras fisiológicas

3. Evitar xenozoonoses

• Órgãos complexos como FÍGADO e RIM produzem muitas proteínas circulantes;

• As proteínas suínas podem ser incompatíveis com os receptores humanos devido à diferenças estruturais

Suínos transgênicos para superar barreiras fisiológicas

D’ápice & Cowan, 2009

Proteína Humana Proteína Suína

D’ápice & Cowan, 2009

Genes para proteínas humanas devem ser inseridos em suínos

transgênicos

Garantindo a funcionalidade completa do órgão

Suínos transgênicos para superar barreiras fisiológicas

Os suínos transgênicos são utilizados nos xenotransplantes para:

1. Superar barreiras imunológicas

2. Superar barreiras fisiológicas

3. Evitar xenozoonoses

• Retrovírus endógeno suíno (PERV)

– Integrado no genoma suíno

– Transmitido junto com as células transplantadas

– Risco de ser ativado

Suínos transgênicos para evitar xenozoonoses

Remoção do PERV por nocaute do

genoma viral

PERV em células suínas

Como gerar os suínos transgênicos para xenotransplantes?

Tran

sfer

ênci

a G

ênic

a

Embriões

Gametas

Células

Microinjeção de DNA

Transferência gênica mediada por espermatozoides (SMGT)}

Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)

Métodos de geração de suínos transgênicos

SCNT Nocaute Ex. αGal

Inserção Ex. hDAF

Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)

Suínos transgênicos para xenotransplantes

Multi-SMGT

Embriões suínos expressando três proteínas fluorescentes

EBFP DsRED GFP

Como controlar a expressão dos transgenes?

Métodos de controle da expressão gênica em animais transgênicos

Construção do vetor (cassete gênico)

Promotores tecido-específicos ou constitutivos

Realizar a expressão tecido-específica dos imunoreguladores; Essencial para prevenir rejeição dos órgãos xenotransplantados

Promotores tecido-específicos;

Evitar o uso de promotores virais e constitutivos;

Genoma suíno (2012) – novas regiões regulatórias devem ser descobertas.

Controle da expressão do transgene em suínos para xenotransplantes

Expressão do imunomodulador CD4 células β

das ilhotas

Klymiuk et al. (2012)

Insulina hCD4

Células β - ilhotas

Controle da expressão do transgene em suínos para xenotransplantes

Minisuínos Transgênicos

Minipigs transgênicos para o estudo da xenotransplantação

Tamanho Reduzido

Fácil manipulação em experimentos

Baixo custo de manutenção

Minipigs nocaute αGal

Aplicações atuais dos xenotransplantes

Aplicações atuais dos xenotransplantes

Transplante de órgãos sólidos

• Ex. Fígado, Rim, Coração

Transplante de células e tecidos

• Ex. Ilhotas pancreáticas

Transplante de ilhotas pancreáticas de

suínos para portadores de

diabetes

Aplicações atuais dos xenotransplantes

Aplicações atuais dos xenotransplantes

Em 2010 foi aprovado o xenotransplante de

ilhotas pancreáticas de súínos para humanos na

Rússia

Outros órgãos suínos para

xenotransplantação

• Não há doadores suficientes para alotransplantes

• Xenotransplantes

• Suínos transgênicos para tornar os xeno-órgãos compatíveis geneticamente com os humanos

– Nocaute do αGal

– Inserção de genes imunomoduladores

• Geração dos suínos transgênicos por SCNT e SMGT

• Controle da expressão por promotores tecido-específicos

• Minipigs

Recapitulando...

Prof. Dr. Vinicius Farias Campos Graduação em Biotecnologia fariascampos@gmail.com vcampos_ib@ufpel.edu.br