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Projeto de Pós-doutorado
APLICAÇÃO DA ANÁLISE MULTIVARIADA PARA
CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA ALCOÓLICA DESTILADA A
PARTIR DE DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS POR
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Dr. José Carlos Pires Penteado
Projeto submetido e aprovado pelo Instituto de Química – USP
São Paulo, Brazil
Junho/2006
RESUMO DO PROJETO
As bebidas alcoólicas têm sido estudadas principalmente devido ao
impacto social causado pelo consumo excessivo, embora vários produtos
secundários presentes possam contribuir também para agravar a saúde pública
devido a sua toxicidade. Esse agravamento aumenta com a falsificação ou
adulteração das bebidas alcoólicas colocando em maior risco a saúde humana.
Este projeto tem como objetivo classificar e diferenciar a cachaça que é a
principal bebida alcoólica-fermento destilada brasileira usando a técnica
quimiométrica de análise de componentes principais e cluster. Essa avaliação
será realizada através da quantificação de componentes que podem ser
produzidos na fabricação e no armazenamento da bebida, tais como compostos
carbonílicos, álcoois e ésteres entre outros componentes voláteis. Tem-se como
premissa investigar os componentes que possam classificar e diferenciar
podendo se obter os denominados marcadores moleculares, visando fornecer
subsídios para controle de padronização. O desenvolvimento da metodologia
analítica a ser utilizada para compostos carbonílicos tem como objetivos obter
maior sensibilidade, rapidez e minimização de resíduos.
INDICE
1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 4
2 JUSTIFICATIVA............................................................................................ 12
3 OBJETIVOS.................................................................................................. 13
4 ESTRATÉGIA DE TRABALHO..................................................................... 14
4.1 Critério para escolha das bebidas alcoólicas......................................... 14
4.2 Otimização das condições analíticas para compostos carbonílicos ...... 14
4.3 Parâmetros de validação ....................................................................... 14
5 MATERIAL E MÉTODO................................................................................ 16
5.1 Metodologia de análise.......................................................................... 16
5.2 Análise de metanol, álcoois superiores e ésteres por GC ..................... 16
5.3 Análise de carbonílicos por SPME-GC (C1~C8)..................................... 17
5.4 Análise de compostos carbonílicos por HPLC....................................... 17
5.5 Compostos voláteis por SPME-GC/MS-FID .......................................... 18
6 ANÁLISE DE RESULTADOS ....................................................................... 18
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 19
Projeto de Pesquisa de Pós-Doutorado
Criado por: JCPP jocapen@iq.usp.br 4
1 INTRODUÇÃO
Bebida alcoólica é definida como produto refrescante, aperitivo ou
estimulante, destinado à ingestão humana no estado líquido, sem finalidade
medicamentosa e contendo mais de meio grau Gay-Lussac de etanol1. Na
literatura há o relato do provável uso de alguma bebida alcoólica pelo Homus
erectus desde aproximadamente 250.000 anos e também no período paleolítico
tardio (30.000 AC)2. Dependendo da dose, a bebida pode ser benéfica ou
bastante maléfica. O primeiro efeito benéfico do álcool ao homem foi mostrado
em 1772 para doenças da artéria coronária, e mais recentemente estudos
epidemiológicos sugerem que qualquer tipo de bebida alcoólica pode
proporcionar esse benefício devido aos compostos minoritários3. Por outro lado,
deve ser enfatizado que o álcool juntamente com o fumo aumenta em muito o
risco de desenvolvimento de câncer no pulmão devido ao seu efeito sinérgico4.
O abuso de bebidas alcoólicas tem causado grande custo social. Dados
recentes mostram que as ocorrências policiais na Inglaterra estimam que o álcool
seja responsável por 40% dos crimes violentos, 78% dos assaltos e, uma em
cada quatro entradas nos hospitais. Na Alemanha há cerca de 6,5 milhões
alcoólatras com 42.000 mortes por ano, a um custo de 20 bilhões de euros
anuais5.
A característica de uma bebida alcoólica é o fato de ser obtida a partir da
fermentação de fontes naturais próprias de açúcar e amiláceos tais como uva,
milho, centeio, arroz, cana, cevada, aveia e mesmo de raízes e folhas. No
processo de fermentação utilizam-se diferentes leveduras tais como
Saccharomyces cerevisae, como as do gênero Kloeckera, Cândida, Hansenula,
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Hanseniopora, Pichia, Zigossacharomyces, entre outras. O crescimento dessas
leveduras durante a fermentação é influenciado por diferentes fatores como pH,
concentração de nitrogênio e açúcar, concentração de dióxido de enxofre,
conteúdo de álcool e temperatura. Dependendo da bebida o processo de
fermentação pode ocorrer em etapas e as leveduras do gênero Kloeckera,
Candida, Hanseniospora, Hansenula, Pichia, Zigossacharomyces participam
apenas do início da fermentação, produzindo compostos secundários que
proporcionam aroma, que tem grande importância para os caracteres
organolépticos da bebida6. A proporção harmônica dessas substâncias
(compostos voláteis) que se formam durante a produção influenciam na
qualidade da bebida e são responsáveis pelas propriedades organolépticas, ou
seja, aroma, gosto e sabor. Estes compostos podem chegar a centenas, dentre
os quais pode-se mencionar aldeídos, álcoois, ácidos e ésteres, entre outros. A
concentração desses compostos pode ser bastante variada, na ordem de mg.L-1
a µg.L-1, como no caso de ésteres e ácidos graxos que são formados durante a
fermentação, destilação, maturação e estão diretamente relacionados com a
matéria prima utilizada7. Para os compostos carbonílicos a literatura apresenta
vários métodos de determinação, sendo que os métodos cromatográficos com
derivatização utilizando os reagentes 2,4 dinitrofenilhidrazina (DNPH)8 e o
O-(2,3,4,5,6 pentaflúorfenil) hidroxilamina (PFBHA)9 são os mais empregados
devido a sensibilidade e seletividade. Ambos reagentes, PFBHA e DNPH,
reagem seletivamente com aldeídos e cetonas em meio aquoso (Figura 1).
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Criado por: JCPP jocapen@iq.usp.br 6
C
R2
R1
O
F
FF
F
F
O
NH3Cl
N2O
NO2
N
H
N
F
FF
F
F
O NC
R2
R1
PFBHA
DNPH
C
R2
R1
N2O
NO2
N
NH2
H
+
derivado do PFBHA
derivado do DNPH
composto
carbonílico
Figura 1. Reação de derivatização dos compostos carbonílicos com os
reagentes PFBHA e DNPH.
A cromatografia em fase líquida (HPLC) no modo de fase reversa tem sido
preferencial quando utilizado o derivatizante DNPH para compostos
carbonílicos10. As principais vantagens da HPLC para aplicações analíticas
quantitativas vêm a ser facilidade de uso, pois o produto derivado não precisa ser
isolado, boa reprodutibilidade e recuperação, com limite de detecção de
50,0 µg.L-1 para cetonas. Por outro lado, quando se realiza esta análise por
HPLC, é necessária a utilização de detector de UV-vis com capacidade de
monitorar dois comprimentos de onda simultâneos (390 nm aldeídos furânicos e
365 nm para outros aldeídos)11 ou o detector de arranjo de diodos12, além de
coeluições de isômeros13 e interferência de artefatos (ozônio) devido a
reatividade dos compostos carbonílicos insaturados14.
Com o derivatizante PFBHA para análise de compostos carbonílicos tem-se
usado a cromatografia a gas com o detector de captura de elétrons (ECD) por
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formar o derivados halogenados, obtendo-se níveis de limite de detecção de
ng.mL-1 para estes compostos em bebidas alcoólicas15. Este produto derivado
necessita ser isolado antes de se submetido à análise cromatográfica. Para se
isolar o derivado, efetuando a extração e a pré-concentração, se tem utilizado
técnicas clássicas tais como extração líquido–líquido (LLE) ou extração em fase
sólida (SPE). A LLE requer aparelhagem simples e de baixo custo, porém
apresenta eficiência baixa, consumo elevado de solvente, geração significativa de
resíduo e baixo isolamento de interferentes. A SPE proporciona níveis altos de
recuperação com um isolamento do analito superior a LLE, e ainda consome
menor quantidade de solvente. Em ambos métodos de isolamento, LLE e SPE, o
consumo de solventes tóxicos e a geração de resíduos vêm a ser um dos
empecilhos. Com o desenvolvimento da técnica Solid Phase Microextraction
(SPME), ou seja, micro extração em fase sólida, tem-se a vantagem de preparo
de amostra sem o uso de solvente. O custo de análise por SPME vem a ser outro
benefício, sendo cerca de 50% menor que o de SPE16. A essas vantagens se
soma também a agilização da análise em decorrência da automatização do
preparo da amostra, etapa que pode comprometer 75% do tempo de análise17,18
quando as técnicas clássicas de LLE são utilizadas. A SPME está consolidada
nos diversos campos da química analítica com aplicações em ambiental, forense,
fluídos biológicos e na análise de alimentos19. A possibilidade de extração e pré-
concentração em uma única etapa traz grandes avanços na performance
analítica. O processo SPME está baseado em equilíbrios simultâneos em
sistemas multifásicos, onde o sorvente é colocado em contado com a amostra e
os analitos são retidos (adsorção ou absorção), e então transferidos para o
instrumento analítico20. A escolha do sorvente depende da natureza química do
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analito tais como polaridade e volatilidade, assim as fibras polares tem maior
afinidades a compostos polares e o mesmo princípio acontece com as fibras
apolares21. A técnica SPME22 tem sido aplicada para análise de compostos
carbonílicos em água potável com derivatização com PFBHA, tendo apresentado
bons resultados (limite quantificação abaixo de µg.L-1). Na determinação de
compostos carbonílicos em bebidas alcoólicas os níveis de detectabilidade por
SPME chegam a ser cerca de 50 vezes menores em relação a LLE para o
formaldeído (LQ = 0,23 µg.L-1 LLE e 0,005 µg.L-1 SPME)23.
A combinação de SPME com cromatografia a gás acoplada a espectrometria
de massas (SPME-GC/MS) utilizando sorbente com característica polar também
tem sido utilizada na identificação de compostos orgânicos voláteis presentes no
mezcal, bebida destilada típica mexicana24. A partir desse estudo foi avaliado que
dois compostos, limoneno e o pentil butanoato, podem ser utilizados como
marcadores de autenticidade do mezcal. Os constituintes voláteis também vêm
sendo investigados na diferenciação de origem de uísque irlandês e escocês25.
Estudos preliminares para marcadores de envelhecimento têm sido propostos
para a cachaça26. Estes compostos são atribuídos à hidrólise da lignina dos
tonéis de madeira que se transferem para bebida no envelhecimento27. Em outro
estudo foi possível diferenciar a cachaça do run através da análise de álcoois
(propanol, iso propanol e isopentanol) e cátions (Ca, Mg e Mg) com ferramentas
quimiométricas28. No Estado de São Paulo, o monitoramento para a autenticidade
das bebidas alcoólicas tem sido realizado a partir da comparação de
componentes voláteis encontrados no produto autêntico e no falsificado29.
A quimiometria a partir da análise de compostos voláteis em bebidas tem
permitido extrair um número maior de informações relevantes, tais como
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diferenciação e classificação de vinhos30, uísque31 e cidra32. A utilização da
análise de componentes principais (PCA) entre outras ferramentas
quimiométricas, mais a praticidade da análise por SPME, têm demonstrado
resultados interessantes para caracterização de detergentes,33 café34 e óleos
comestíveis35. A técnica quimiométrica aplicada ao método de índice de difração
por análise em Fluxo (FIA) tem sido proposto com ferramenta alternativa na
adulteração de bebidas alcoólicas destiladas tais como cachaça, run, vodca 36.
As bebidas alcoólicas em geral podem ser divididas em dois grupos. As
bebidas fermentadas tais como vinho, cerveja, jeropiga, entre outros
fermentados, e as destiladas, que também passam por um processo fermentativo
e posterior destilação, tais como aguardente, conhaque, run, uísque, gim, arac,
mezcal, tequila, tiquira, pisco, vodca, etc. As bebidas alcoólicas fermentadas
possuem graduação alcoólica de 3 a 5% (v/v) para cervejas e de 5 a 7% para
vinhos. As bebidas destiladas possuem uma concentração mais elevada de
etanol, entre 38 a 54% (v/v). No Brasil a principal e genuína bebida destilada
denomina-se cachaça ou aguardente com fabricação no período colonial a partir
de 1534. A cachaça ocupa o terceiro lugar em bebida destilada a nível mundial
de produção com 1,3 bilhões de litros no Brasil. Cerca de 1 bilhão de litros
denomina-se cachaça de coluna e é produzida industrialmente e os alambiques
artesanais produzem o restante. As exportações da bebida são para mais de
50 países com volume de 15 milhões de litros com crescimento de 10% ao ano. A
meta a ser atingida é estar presente em todos os países do globo até 2010 com
um volume de 40 milhões de litros de acordo com Brazilian Program for the
Development of Cachaça (BPDAC) 37. A produção da cachaça é distribuída em
5 mil marcas, 30 mil produtores gerando 450 mil empregos diretos e 1300000
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indiretos de acordo com Associação Brasileira de Bebidas Alcoólicas
(ABRABE)38. Essa pulverização na produção da cachaça faz com que seu sabor,
aroma e cor sejam os mais variados. Outras bebidas alcoólicas em destaques
são as cervejas com volume de consumo anual de 8,41 bilhões de litros (2002) e
o vinho com 300 milhões de litros. Independente do tipo da bebida alcoólica, tão
importante quanto a concentração de etanol vem a ser a concentração de
produtos secundários, que são regulamentados pela portaria nº 55 de 27 de julho
de 2004 e a instrução normativa nº 13 de 29 de junho de 2005 de
responsabilidade do Ministério da Agricultura e Abastecimento, que estabelece a
composição química e seus requisitos de qualidade para bebidas alcoólicas
destiladas com graduação alcoólica entre 38 a 54 % (Tabela 1).
Verifica-se na Tabela 1 que os principais compostos carbonílicos
regulamentados são acetaldeído, acroleína e furfural, sendo que estes dois
últimos são admitidos na concentração menor de 5 mg.100 mL-1 de álcool anidro.
Outros compostos carbonílicos estão ausentes da regulamentação, mas são
freqüentemente encontrados nas bebidas destiladas devido a oxidação do álcool
nos vários estágios da produção tais como formaldeído, propionaldeído,
valeraldeído, isovaleraldeído e o crontonaldeído39. Com base em efeitos de
exposição a cobaias e seus efeitos no DNA existem evidencias que o formaldeído
vem a ser desde irritante a carcinogênico40,41 e o acetaldeído um provável agente
carcinogênico ao humano42,43,44. Em trabalhos realizados para a cachaça foram
encontrados níveis de concentração média de 12,7 mg de aldeídos totais para
100mL-1 de etanol absoluto, sendo que o acetaldeído apresentou a maior
concentração entre os carbonílicos ( 20 mg.100 mL-1 etanol absoluto)48.
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Tabela 1- Concentração (mg.100 mL-1) dos compostos orgânicos secundários
regulamentados para bebidas alcoólicas destiladas com etanol de 38 a 54% (v/v).
Conhaque Bagaceira Pisco Cachaça
min. max. min. max. min. max. min. max.
esteresa 200 300 200 200
furfuralb 5 5 5 5
aldeídoc 3 40 3 80 20 30
álcoold 150 400 5 600 120 300
Metanol 300 700 200 20
isobutanol 360
acroleína 5
sec-butanol 10
n-butanol 3
a acetato de etila; b furfural e hidroxifurfural c acetaldeído; álcoois superiores
expresso pela soma de n-propanol, isopropanol e isoamílico
Em um outro estudo foi avaliado a cachaça proveniente do destilador de inox
apresenta concentração superior de álcool amílico e acetato de etila em relação
ao destilador de cobre45. No caso das cetonas em 34 marcas de cachaça
analisadas foram encontrados valores máximos de 23 mg.L-1 para a propanona12.
Nesses trabalhos o método analítico para determinação dos compostos
carbonílicos foi baseado na derivatização com o DNPH e posterior análise por
HPLC. O emprego de um método de análise mais rápido, com maior
sensibilidade analítica, possibilidade de automação, e finalmente podendo tirar
outras informações, seria desejável para o aperfeiçoamento do controle de
qualidade de bebidas alcoólicas.
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2 JUSTIFICATIVA
A produção das bebidas alcoólicas depende de uma matéria prima complexa
sob ação de processos fermentativos nos quais existe a importância vital de
microorganismos. Embora modernos métodos de biotecnologia sejam aplicados
na fabricação de bebidas, há uma dificuldade em manter um padrão de
qualidade uniforme, o que tem dificultado no aumento de exportação. Essa
complexidade está atrelada a inúmeras variáveis do processo. As bebidas
destiladas, por conterem mais etanol na sua composição, sofrem um processo
fermentativo mais intenso e conseqüentemente geram mais produtos secundários
que dificultam sua separação no processo de destilação. Inúmeros compostos
orgânicos podem ser produzidos e são ingeridos diretamente pelo consumidor.
Muitos desses compostos não são regulamentados e podem caracterizar um tipo
de bebida alcoólica. Com o uso de uma metodologia analítica mais abrangente
será possível trazer novas informações da composição das bebidas. O
conhecimento maior da cachaça juntamente com a análise quimiométrica poderá
caracterizar o tipo de bebida alcoólica, seja ela adulterada ou não, que está
disponível para consumo.
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3 OBJETIVOS
Objetivo Geral
Caracterizar e diferenciar os diferentes tipos e procedências de cachaça,
bem como a adulteração através de quantificação de várias famílias de
compostos químicos.
Objetivo Específico
• Otimização da metodologia analítica para determinação de compostos
carbonílicos utilizando microextração em fase sólida juntamente com
cromatografia em fase gasosa após de derivatização com PFBHA e
detecção com captura de elétrons;
• Validação do método acima comparando com determinação por
cromatografia em fase líquida e detecção na região do Uv-vis após
derivatização com DNPH;
• Quantificação de outros compostos minoritários como álcoois e ésteres por
injeção direta;
• Investigar as possíveis correlações entre os compostos a serem
quantificados e as procedências e tipos de cachaça aplicando a
ferramenta quimiométrica;
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4 ESTRATÉGIA DE TRABALHO
4.1 Critério para escolha da bebida alcoólica
Será estudada a cachaça, de diferentes procedências e tipos tais como
envelhecida, transparente, amarela46, tipo exportação, por ser a principal
representante e de grande preferência do mercado de bebidas destiladas
nacional38.
4.2 Otimização das condições analíticas para compostos carbonílicos e
outros voláteis
A técnica SPME de extração e pré-concentração deve ser utilizada
juntamente com cromatografia a gás para os compostos carbonílicos (C1~C8) e
outros compostos voláteis. Para a análise de carbonílicos deve-se utilizar o
sorvente polimetilsiloxano (PDMS) com característica apolar empregando o
detector de captura de elétrons (ECD), enquanto para outros compostos voláteis
será utilizados outro sorvente o poliacrilato (PA) com característica polar e o
detector de ionização de chama (FID) e/ou espectrometria de massas (MS).
4.3 Parâmetros de validação
As estratégias de validação de um método dependem entre outros fatores
da instrumentação disponível e dos propósitos analíticos. Nesse trabalho serão
avaliados parâmetros tradicionais tais como determinação de repetibilidade,
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linearidade, limites de detecção e quantificação para todas as classes de
compostos orgânicos analisados. Devido a ausência de material de referência
certificado para análise de compostos orgânicos em bebidas alcoólicas
destiladas, a exatidão dos métodos propostos será avaliada por procedimentos
de recuperação. A adição de padrão interno ou adição de padrão se torna uma
alternativa interessante no processo de validação. Na análise de álcoois e
ésteres serão analisados por cromatografia a gás utilizando o padrão interno 3
pentanol 32. No caso da análise de carbonílicos com o método com HPLC será
utilizados a adição de padrão em triplicata com três níveis de concentração na
amostra para que sejam determinados os níveis de recuperação47. A equivalência
analítica será realizada entre a análise de compostos carbonílicos com o método
SPME proposto comparada com o método usual com HPLC para bebidas
alcoólicas48. Os resultados obtidos a partir das duas metodologias serão tratados
estatisticamente a fim de se avaliar suas variâncias ( 2
1s e 2
2s )49. A razão entre 2
1s e
2
2s nos fornece o teste estatístico F que é comparado com o valor de F crítico
(Fcrít) em um determinado nível de confiança. Caso seja F < Fcrít poderemos
concluir que as duas metodologias fornecem precisões equivalentes50,51.
A qualidade do desempenho dos cromatógrafos utilizados será
constantemente avaliada a partir de soluções padrão de álcoois para análise no
GC/FID, carbonílicos derivados com DNPH para HPLC, pesticidas (aldrin e
lindane) para GC/ECD e perfluortributilamina para GC/MS. A partir dos resultados
obtidos será construído um gráfico de controle estabelecendo os limites de
variação que são permissíveis para cada medida52.
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5 MATERIAL E MÉTODO
5.1 Metodologia de análise
Para a análise dos compostos de interesse serão utilizadas as seguintes
técnicas:
• Cromatografia a gás com injeção direta para análise de álcoois e ésteres
• Cromatografia a gás acoplada a SPME e cromatografia a líquido para
análise de compostos carbonílicos (C1~C8)
• Cromatografia a gás acoplada a SPME para análise de outros compostos
voláteis
Todos os equipamentos a serem utilizados estão disponíveis no
Departamento de Química Fundamental do IQ-USP.
5.2 Análise de metanol, álcoois superiores e ésteres por GC
Na análise de metanol, álcoois superiores (isopropanol, isobutanol, 3 metil 1
butanol) e ésteres (acetato de etila) serão utilizadas as condições descritas na
literatura53 para a cromatografia a gás com a coluna capilar de polietilenoglicol
com o detector de ionização de chama (FID). As condições, se necessário, serão
otimizadas para melhorar a separação das espécies estudadas.
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5.3 Análise de carbonílicos por SPME-GC (C1~C8)
Inicialmente serão empregadas as condições de análises para compostos
carbonílicos (formaldeído, acetaldeído, acetona, acroleína, propionaldeído,
crotonaldeído, butiraldeído, benzaldeído e valeraldeído) derivatizados com o
agente PFBHA54 extraídos em sistema headspace com microextração em fase
sólida (HS-SPME)55,, utilizando o sorvente polidimetilsiloxano. Para a
quantificação será utilizado o cromatógrafo a gás com a coluna capilar 5% fenil e
95 % dimetilpolisiloxano com detector de captura de elétrons. Estas condições
devem ser avaliadas para análise de cetonas (ciclopentanona, 2,3 butanodiona e
acetofenona), aldeídos furânicos (5 hidroxi furfural e furfural) e, se necessário,
serão otimizadas para melhorar o método de análise.
5.4 Análise de compostos carbonílicos por HPLC
Para a avaliação da performance analítica da metodologia de análise de
compostos carbonílicos por SPME-GC/ECD e análise dos outras cetonas
(ciclopentanona, 2,3 butanodiona e acetofenona)12 e aldeídos furânicos (5 hidroxi
furfural e furfural)56, será empregada cromatografia líquida (HPLC) em fase
reversa. Os compostos carbonílicos serão derivatizados com o agente DNPH e
quantificados por HPLC com a fase estacionária octadecilsilano (C18) com o
detector Uv-vis.
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5.5 Compostos voláteis por SPME-GC/MS-FID
Os compostos voláteis das bebidas destiladas serão extraídos diretamente
pela técnica de headspace associada a microextração em fase sólida (HS-SPME)
com o sorvente poliacrilato57. Para a separação será utilizado o cromatógrafo a
gás com a coluna capilar de polietilenoglicol com o detector de espectrometria de
massas (GC-MS) no modo scan e ionização de chama. A identificação dos
compostos será realizada através da comparação dos espectros de massas com
a biblioteca NIST 98 (National Institute of Standards and Technology). Estas
condições, se necessário, serão otimizadas para melhorar o método de análise.
6 ANÁLISE DE RESULTADOS
Os resultados obtidos serão submetidos a métodos quimiométricos tais como
PCA e cluster para sua interpretação. Será utilizado o programa Statistica versão
6.0 (Statsoft Inc., Tulsa-Ok, USA ) que permite analisar parâmetros de estatística
básica a avançada, bem como análise multivariada. Pretende-se fazer um
possível agrupamento entre as diferentes cachaças e sua composição química58.
Esse possível agrupamento poderá servir de ferramenta na diferenciação dos
tipos de cachaça, e na possível avaliação de adulteração.
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8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Bional. Chem., 2005, 381, 1619. 11 Rodríguez, D.M.; Wrobel, K.; Wrobel, K., Eu. Food Res. Techonol., 2005, 221,
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