Apresentação da Tese do Mauro Cafundó

Dormir bem

Atividade físicaDieta

“An ounce of prevention is worth a pound of cure” – Benjamin Franklyn

Prevenção

Rastreamento de substâncias naturais ou sintéticas para a quimioprevenção

do câncer

Programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia

aplicadas à Farmácia Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Araraquara UNESP

Candidato: Mauro C. Cafundó de MoraisOrientadora: Profa. Dra. Christiane P. Soares

Produtos naturais e sintéticos para tratamento e prevenção do câncer

A quimioprevenção do câncer envolve prevenção, atraso ou reversão do processo

de carcinogênese através da ingestão de compostos na dieta ou fármacos.

Sporn et al., Carcinogenesis, 2000, 21(3), 525

N C S

SO

CH3

OH

HO

OH

Vitis spp.

Brassica spp.

trans-resveratrol

sulforafano

Enzimas de fase 1

Enzimas de fase 2

Indutores bifuncionais

Indutores monofuncionais

Enzimas e Indutores

4’-bromoflavona

Song et al., Cancer Res., 1999, 59(3), 578

β-naftoflavona

O

O

Br

O

O

Keap1 Nrf2

SH SH

Indutor

Keap1

S

Indu

tor

S

Indu

tor

+

+ Nrf2

Nrf2Nrf2

Genes de fase 2ARE

Small Maf Núcleo

Citoplasma

TGACnnnGC

Dinkova-Kostova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99(18), 11908

O fator NF-κB e a oncogênese Fator de transcrição nuclear responsável por vários genes

Dímeros relacionados por domínios homólogos altamente

conservados (RH)

Gilmore, Oncogene, 2006, 25(51), 6680

IκB

TNFα

PNF-κB

IκB

IKK

U Proteassomo 26S

NF-κB

+

IκB P

UU

NF-κB

P

U

NF-κBP

PKA

c-IAP1 & 2Traf 1 & 2A1/Bfl-1Bcl-xL

DNA

Núcleo

Intracelular

Extracelular

NF-κBP

GenesAnti-

apoptóticos

Baldwin, J. Clin. Invest., 2001, 107, 241

O papel da inflamação no câncer O uso regular de anti-inflamatórios reduz significativamente o

aparecimento de câncer Enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) é expressa em

diversos tipos de câncer Óxido nítrico (NO), produto de iNOS, exerce efeitos pró-

carcinogênicos

SINGH et al., Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2011, 67(6), 1211

L-Arginine

Inibição da aromatase Enzima do complexo citocromo P450 (CYP19)

Biossíntese de hormônios estrogênios

↑ estrogênios » ↑ chance de câncer de mama

O

H

OH

HH

3O2 3H2O

3NADPH 3NADP+

H

OH

HH

HO

Testosterona EstradiolAromatase

+ HCO2H

Endringer et al., J. Nat. Prod., 2008, 71(6), 1082

Morte celular – apoptose e necrose

Genotoxicidade

Moller, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2005, 96, 1

O acúmulo de mutações está relacionado com o

desenvolvimento da maioria dos tumores malignos e desordens

degenerativas

Identificar agentes genotóxicos e diminuir exposição a eles, e

aumentar a exposição a agentes antigenotóxicos

Biodiversidade

Áreas de prioridade para restauração da biodiversidade em SP

Mercado mundial de fármacos de origem vegetal: US$ 12,4 bilhões (2006)25% do faturamento da Indústria farmacêutica

Joly et al., Science, 2010, 328(5984), 1358

Plantas do cerrado com propriedades medicinais

Pterogyne nitens T.Fabaceae

Alchornea glandulosa P. & E. Euphorbiaceae

Lorenzi, Árvorez Brasileiras, 2000, v.2, 3ed.

2. Objetivo geral

O presente estudo teve como objetivo fazer um rastreamento de substâncias puras isoladas ou sintéticas, avaliando sua atividade citotóxica. Definir um perfil genotóxico, e avaliar a indução de apoptose ou potencial quimiopreventivo dessas substâncias.

Objetivos específicosI. Avaliar a citotoxicidade de substâncias isoladas ou sintéticas através de

ensaio de MTT em linhagem HepG2 e ensaio de SRB em linhagem MCF-7 e MDA-MB-231 e determinar a concentração inibitória de 50% das células (IC50).

II. Avaliar a genotoxicidade do AG e G1 das substâncias através do ensaio do cometa.

III. Avaliar o efeito de indução de apoptose de alcalóides guanidínicos (NTA e NTB) e bioisostero (NTT) através do ensaio de coloração com Hoechst 33342 e iodeto de propídio.

IV. Avaliar o efeito de quimioprevenção da coleção de substâncias, através do ensaio de inibição do fator de transcrição NF-κB, inibição da produção de nitrito, inibição de aromatase e indução de quinona-redutase.

V. Avaliar o efeito inibitório de 2OICh sobre a expressão de produtos do fator de transcrição NF-κB (iNOS e COX-2) em níveis de mRNA e proteína por RT-PCR e western blot.

3. Metodologias Substâncias avaliadas nos ensaios (70 substâncias – 6 grupos) Cultura de células (HepG2, Hepa 1c1c7, MCF-7, MDA-MB-231,

HEK293/luc, RAW 264.7) Citotoxicidade (MTT e SRB) Ensaio do cometa (Eletroforese) Ensaio de apoptose (Hoechst e iodeto de propídio) Ensaio de indução de QR (Redução de MTT) Inibição da aromatase (in vitro) Ensaio de NF-κB/Luciferase (gene relator luc) Ensaio de inibição da produção de nitrito (estímulo com LPS) Análise de expressão de iNOS e COX2 (RT-PCR e western blot) Análise estatística

4. Resultados e discussão

O O

O OH

OH O

O

OH

HO

OH

NH2

OCl

NH

S O

O

O

O

Br

O

OH

OOH

OHO

OH

NH2

NHNH2

N

DOXMCF-7 IC50 = 0,5 ± 0,07 µM

4BFCD = 0,01 µM

NARIC50 = 2,0 ± 0,5 µM

TPCKIC50 = 5,1 ± 1,5 µM

L-NMMAIC50 = 29,5 ± 1,2 µM

Grupos de substânciasO

OH

OH

O RO

OH

OH

O R

OH

OH

O

NH

R

R

R

R

R

R

O

O OH

OH

R

R

R

O

O

R

R

R

R R

R

Derivados do ácido gálico (GA) e ácido protocatecuíco (PA)

Derivados do ácido fenâmico

O

R

R

Derivados da xantona

Derivados da flavona (Fla) e chalcona (Ch)

O

Derivados da (+)-carvona (C+)

N NR

X

R

R

R

alcalóidesguanidínicose bioisóstero

Atividade de substâncias derivadas do ácido gálico e ácido protocatecuíco

Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR

OH

OH

OHO

OHOH

OHOH

O

ácido gálico (GA) ácido protocatecuíco (PA)

Atividade de substâncias derivadas do ácido gálico e ácido protocatecuíco

1,1 3,3 10,0 30,0 90,00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100G4

G5

NAR *

concentração (M)

inib

ição

de

CY

P19

(%

)

Inibição in vitro da enzima aromatase (CYP19) pelas substâncias G4 ( ), ▲ G5 ( ) e ■ NAR (●). Os dados referem-se às médias de dois experimentos independentes e erro padrão (M ± EP); * P<0,05 em relação ao controle (DMSO 0,5%), One-way ANOVA.

O O

OH

OHHO

R

Esterificação foi crucial para atividade

inibitória da aromatase

Lipofilia interfere nessa atividade

↑ da cadeia » ↓ viabilidade celular

Hidroxilas livres não foram essenciaisHidroxilas nas posições 3, 4 e 5 foram essenciais

OH

OH

OHO

OOH

OH

OHO

O

galato de butila (G4)CYP19 IC50 = 34,6 µM

galato de pentila (G5)CYP19 IC50 = 28,1 µM

Relação estrutura atividade inibição de CYP19

1,5 4,4 13,3 40 1200

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100GA

G1

G2

*

*

concentração (M)

inib

ição

de

NF-

B

(%

)

Inibição da atividade de NF-κB ativado por TNFα 50 ng/mL em células HEK293/Luciferase em relação ao controle (DMSO 0,5%), por GA ( ), ▲ G1 ( ) e ■ G2 (●). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de dois experimentos independentes; * P<0,05 em relação ao controle, One-way ANOVA.

LPS 0,6 1,8 5,6 16,7 50,00.0

2.5

5.0

7.5

10.0LPS

G4

G3

*

*

*

*

*

**

concentração (M)

Co

nce

ntr

ação

de

nit

rito

(

M)

Inibição da produção de NO estimulado por LPS 1 µg/mL, em células RAW 264.7 em relação ao controle (DMSO 0,5%) por G3 e G4. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos independentes; * P<0,05 em relação ao estímulo (LPS 1 µg/mL), One-way ANOVA e pós teste de Tukey

Genotoxicidade do ácido gálico e galato de metila

Ctrl H2O2 0,15 0,45 1,35 4 12 40 0,07 0,22 0,67 2 8 250

50

100

150

GAG1

ácido gálico galato de metila

*

*

concentração (M)

Tai

l mo

me

nt *

Genotoxicidade do ácido gálico (GA) e galato de metila (G1) pelo ensaio do cometa em células HepG2 tratadas por 24h. Ctrl: controle (DMSO 1%); H2O2: peróxido de hidrogênio 100 µM. Os dados referem-se à média da contagem de 50 nucleóides ± erro padrão (M±EP), * P<0,05 em relação ao controle, Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn.

Atividade de substâncias derivadas do ácido fenâmico

OH

O

NH

ácido fenâmico

Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR

Atividade de substâncias derivadas do ácido fenâmico

OH

O

NH

O

O

O

AB4inibição de NF-κB: 73,0 ± 5,2%

OH

O

NH

O

O

OO

OAB5inibição de NF-κB: 72,6 ± 1,6%inibição de NO (IC50): 28,2 ± 3,1 µM

Atividade de análogos da xantona

O

O OH

OH

benzoxantona (X9)CD = 41,0 ± 6,1 µM

Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR

O

O

xantona

Atividade de (+)-carvona e análogos

Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR

(+)-carvona

IR = 1,1O

Atividade de (+)-carvona e análogos

(+)-carvona66,8±4,3%

(-)-carvona61,4±6,1%

epoxido carvona69,7±7,1%

(+)-hidroxicarvona56,4±9,9% (-)-hidroxicarvona

0,0±7,9%

Inibição de NF-κB (%) a 50 µMO O

OO

OO

Atividade de produtos naturais e análogos prenilados

Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR O

ONH

N NR

4

R3

R2

R1

Atividade de produtos naturais e análogos prenilados

O

O

OH

Hidroxila livre essencial para indução de QR

6-hidroxiflavona (6Fla )CD = 6,5 ± 0,8 µM

O

O

OH

OH

O

OH

OH

pedalitina (PED)inibição de CYP19

IC50 = 0,3 ± 0,01 µM

Alcalóides guanidínicos de P. nitens e análogo sintético

10 20 30 40 500

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100NTA *

NTB *

NTT *

DOX *

Concentração (M)

cels

. viv

as (

%)

Ensaio de viabilidade celular por MTT em células de HepG2 tratadas por 24h com NTA ( ), ▲NTB ( ), ■ NTT (●) e DOX ( ). Os dados referem-se às médias de três experimentos ♦

independentes e erro padrão (M±EP); * P<0,05 em relação ao controle (DMSO 0,5%), One-way ANOVA e pós-teste de Tukey.

4BF Ctrl 0,6 1,7 5 15 450

1

2

3

4

0

25

50

75

100

125*

concentração de NTT (M)

IR (

trat

ame

nto

/ co

ntr

ole

)ce

lls. vivas

(%)

Indução da enzima quinona-redutase em células Hepa 1c1c7 pela substância NTT (tratamento / controle) e relação com sobrevivência celular (%) pelo ensaio de violeta cristal (●) tratadas por 48h. Os dados referem-se às médias de três experimentos independentes e erro padrão (M ± EP); * P<0,05 em relação ao controle (Ctrl)(DMSO 0,5%), One-way ANOVA e pós-teste de Tukey.

X

NNH

R2 R1

NH > S

R1 = H ou geranila não foi crucial para atividade inibitória da aromatase

bioisósteros

Inibição de CYP19NTA: 67,0 ± 6,7%NTB: 68,2 ± 5,1%

Relação estrutura atividade inibição de CYP19

Indução de apoptose por alcalóides guanidínicos

Ctrl DOX NTA NTB NTT0

10

20

30

40

50

Apoptose total

Necrose

*

*

A

% d

e c

els

. (tr

atam

en

to /

tota

l de

ce

ls.)

Ctrl DOX NTA NTB NTT0

10

20

30

40

50

Apoptose inicial

Apoptose tardia*

B

% d

e c

els

. (tr

atam

en

to /

tota

l de

ce

ls.)

Apoptose pelo ensaio de HO/IP em células HepG2 após tratamento com NTA, NTB e NTT por 24 h. A: Comparação entre apoptose total e necrose. B: Comparação entre apoptose inicial e apoptose tardia. Ctrl: controle (DMSO 0,5%); DOX: doxorrubicina 50 µg/mL. Resultados estão expressos como média de três experimentos independentes ± erro padrão (M±EP). * P<0,05 em relação ao controle, one-way ANOVA e pós-teste de Tukey.

Atividade de chalconas e derivados prenilados

Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR

O

R1

R2

Ch: R1 = H, R2 = H2OICh: R1 = O-isoprenila, R2 = H3OFCh: R1 = H, R2 = O-farnesila2OFCh: R1 = O-farnesila, R2 = H

R1 = O-isoprenila pode ↑ efeito indutor de QR

Indução de QR (CD)Ch: N.S.3OFCh: N.S.2OICh: 1,3 µM2OFCh: 14,6 µM

Inibição do NO (CI50)Ch: 50,6% a 50 µM3OFCh: 17,6 µM2OICh: 7,9 µM2OFCh: 7,2 µM

Inibição do NF-κBCh: 22,8 µM3OFCh: 16,2 µM2OICh: 10,8 µM2OFCh: 9,3 µM

O

R1

R2

Ch: R1 = H, R2 = H3OFCh: R1 = H, R2 = O-farnesila2OICh: R1 = O-isoprenila, R2 = H2OFCh: R1 = O-farnesila, R2 = H

Atividade de chalconas e derivados prenilados

LPS 0,6 1,8 5,6 16,7 500

2

4

6

8

10 3OFCh

2OICh

2OFCh

*

*

* *

*

*

concentração (M)

con

cen

traç

ão d

e n

itri

to (

M)

Inibição da produção de NO estimulado por LPS 1 µg/mL, em células RAW 264.7 em relação ao controle (DMSO 0,5%) por 3OFCh, 2OICh e 2OFCh. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos independentes; * P<0,05 em relação ao estímulo (LPS 1 µg/mL), One-way ANOVA e pós teste de Tukey.

5016.75.61.80.60.20

20

40

60

80

100

3OFCh *

2OICh *

2OFCh *

concentração (M)

inib

ição

de

NF-

B

(%

)

Inibição da atividade de NF-κB ativado por TNFα 50 ng/mL em células HEK293/Luciferase em relação ao controle (DMSO 0,5%), por 3OFCh ( ), ▲ 2OICh ( ) e ■ 2OFCh (●). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos independentes; * P<0,05 em relação ao controle, One-way ANOVA e pós-teste de Tukey.

Estudo do mecanismo de ação da 2-O-I-chalcona

iNOS (130 kDa)

COX2(72 kDa)

β-actina (43 kDa)

2OICh (µM)

LPS 1 µg/mL

1.8 5.6 16.7 0 0

++ + + –

Efeito inibitório de 2OICh na expressão de proteína iNOS e COX2 após 20 horas de tratamento.

Conclusões Produtos naturais são uma fonte de moléculas bioativas e

pequenas alterações me suas estruturas podem aumentar consideravelmente a atividade.

↑ cadeia lateral de derivados de GA e PA » ↓ proliferação celular.

GA exerce efeito genotóxico a 12 µM e 40 µM. O G1 não apresenta efeito genotóxico nas concentrações

testadas. G4 apresenta efeito de inibição da aromatase e produção de

nitrito. Supressão da atividade de NF-κB por ésteres de GA pode

desempenhar um papel quimiopreventivo no câncer.

AB4 e AB5, com metoxilas nas posições 4’, 5’ e 6’, apresentam atividade de quimioprevenção do câncer por inibição de NF-κB.

benzoxantona (X9) possui atividade quimiopreventiva induzindo enzima QR em células Hepa 1c1c7.

Alcalóides guanidínicos (NTA e NTB) e bioisóstero (NTT) apresentaram efeito citotóxico em todos os modelos celulares.

NTT induz QR de maneira bifuncional. NTB apresentou indução de apoptose tardia em células

HepG2 após tratamento de 24 horas. Chalconas preniladas possuem efeito de quimioprevenção por

inibição da produção de NO em células estimuladas por LPS e inibição do fator de transcrição nuclear NF-κB ativado.

2-O-isoprenilchalcona é capaz de mediar um grande número de atividades biológicas relevantes para a saúde humana.

Agradecimentos Laboratório de Citologia

• Profa. Dra. Christiane P. Soares• Profa. Dra. Valéria Valente• Roberta A. Duarte, Ph.D.• Maísa Giocondo, M.Sc.• Isabel C. Silva, M.Sc.• Tarsia Giabardo, M.Sc.• Thaís O. R. Falcoski, M.Sc.• Elaine Mello, M.Sc.• Juliana M. Sorbo, M.Sc.• Aline Miranda• Camila Araki• Daniele Agustoni• Felipe O. Souza• Flávio Monteiro• Maria Isabel Feliciano

Instituto de Química de Araraquara (NuBBE)• Profa. Dra. Dulce H. S. Silva• Profa. Dra. Vanderlan S. Bolzani• Luis Octávio Regasini, Ph.D.• Fernando P. Maiello• Maicon S. Petrônio

Laboratório de Farmacognosia• Prof. Dr. André G. Santos• Gabrielle Alexandre

UH Hilo, College of Pharmacy• John M. Pezzuto, Ph.D.• Tamara P. Kondratyuk, Ph.D.• Eun-Jung Park, Ph.D.• Suaib Luqman, Ph.D.• Laura Marler• Beau Rostama• NooJa Acharavadee• Talysa O. Hoover• Elizabeth Ryan

Agencias de fomento à pesquisa• FAPESP (processo n. 2010/12579-5)• CAPES (PDEE n. 0087-11-4)

Mahalo nui loa!