Aula 6 reagentes marcados - t cnicas · Reagentes Marcados Detectam / quantificam diretamente a...

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Reagentes MarcadosDetectam / quantificam diretamente a ligação Ag – Ac

Pro. Fernando Ananias

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

substrato (incolor)

� Qualitativos� Quantitativos

� Direto = Ag� Indireto = Ac

Ac marcados com Enzimas + + = CORAg

Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase

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ELISA

ELISA Indireto (detectar Ac)

ELISA Direto ou Sanduíche (detectar Ag)

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ELISA Competitivo

� Aplicações do ELISA:� Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesq uisa

� Vantagens:� Teste de alta sensibilidade� Permite quantificar Ag ou Ac das amostras� Seguros e de baixo custo

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Imunofluorescência

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luzλ

Ac + fluorocromo Ac + Fluorocromo

λ

rrrrghtghtghtght

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Reagentes secundários:

�Anticorpo secundário marcado com fluorocromo�proteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs

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Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE Ficoeritrina (FE) VERMELHA

Aplicações:

• Identificar subpopulações de linfócitos• Identificar espécies bacterianas• localização de hormônios• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes

•Detecção anticorpos anti-DNA• Teste qualitativo

Fc

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Citometria de Fluxo

� Separação de células ativadas por fluorescência� Anticorpos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)� Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente� Teste qualitativo e quantitativo

CD 4

CD 18

CD 125

CD 147

� Tamanho� Granulosidade� Fluorescência

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CD4

CD8

CD20

Aplicações:

� Determinar o tipo e n o de céls. sanguíneas brancas

� isolar populações celulares

� distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ag

� o tamanho celular.

� Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes

HIV , Leucemias

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2) Transferência para membrana de nitrocelulose

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5) Revelação

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Western Blotting

• Eletroforese de proteínas• Diferença de tamanho (PM)• Mobilidade da proteína• Detecção Ag ou Ac

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