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CITOMETRIA DE CITOMETRIA DE FLUXOFLUXO
Aplicações práticasAplicações práticas
Patrícia Cisneiros dos SantosPatrícia Cisneiros dos SantosBióloga- UCSALBióloga- UCSAL
Mestranda do curso de Imunologia-UFBaMestranda do curso de Imunologia-UFBa
PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO
CITO METRIA FLUXO
Célula Medida Movimento
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
ANTICORPOS MONOCLONAIS
ANTICORPOS MONOCLONAIS
CITÔMETRO DE FLUXO
CITÔMETRO DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO SISTEMA ÓTICO
SISTEMA ELETRÔNICO
SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO
SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.
SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.
FOCO DO LASERFOCO DO LASER
CÂMARA DE FLUXOCÂMARA DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA
Low Sample Pressure12µl/min
Sample
LaminarFlow
LOW DIFFERENTIAL PRESSURE
Sheath SheathSample
LaminarFlow
Sheath Sheath
FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH”
HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE
High Sample Pressure60µl/min
SISTEMA ÓPTICOSISTEMA ÓPTICO
SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.
A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER.
UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.
FACSCaliburFACSCaliburFL1
Red Diode LaserRed Diode Laser~635 nm~635 nm
SSC
FL3
FL4
670LP
661/16
585/42
488/10
90/10 Beam Splitter
DM 560SP
FluorescenceCollection Lens
DM 640LP
Half Mirror
488/10
.488 nm488 nm
Blue LaserBlue Laser FSC Diode
FocusingLens
FL2
530/30
Beam CombinerFlowCell
FlowCell
SISTEMA ÓTICO
Filtros Ópticos – coletar sinais de luz
Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido.Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido.Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda específico.
SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/30BP500/30
Longpass Shortpass Bandpass
460 500 540 460 500 540460 500 540
Filtro
Detector – célula fotoelétrica
ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
SISTEMA ELETRÔNICOSISTEMA ELETRÔNICO
CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.
A medida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro
• Parâmetro 1 FSC• Parâmetro 2 SSC• Parâmetro 3 FL1• Parâmetro 4 FL2 • Parâmetro 5 FL3
SISTEMA ELETRÔNICOSISTEMA ELETRÔNICO
FLUORESCÊNCIA
O que é a fluorescência ?Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da
luz do laser
Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior
comprimento de onda
Fluoresceína
= 530 nm
Luz Incidente de maior energía Fluorocromo
CO2H
OOH = 480 nm
FLUORESCÊNCIASFLUORESCÊNCIAS
O detector de O detector de FL-1FL-1 (Fluorescência 1) capta (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda luz de comprimento de onda 530 nm, que 530 nm, que corresponde à luz verde.corresponde à luz verde.
O detector de O detector de FL-2 FL-2 (Fluorescência 2) capta (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda luz de comprimento de onda 570 nm, o que 570 nm, o que corresponde à luz laranja.corresponde à luz laranja.
O detector de O detector de FL-3 FL-3 (Fluorescência 3) capta (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda luz de comprimento de onda 650 nm, o que 650 nm, o que corresponde à luz vermelha.corresponde à luz vermelha.
SISTEMA ELETRÔNICO
DISPERSÃODISPERSÃO
POLIMORFONUCLEARES
LINFÓCITOS
MONÓCITOS
DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS
BLASTOSV
OLU
ME
(F
S)
VO
LUM
E (
FS
)
GRANULOSIDADE (SS)GRANULOSIDADE (SS)
DISPERSÃO:DISPERSÃO:
Sid
e S
catt
er
Forward Light Scatter
0 200 400 600 800 1000
02
00
40
06
00
80
01
00
0
Linfócitos
Monócitos
Neutrófilos
Visão dos dados coletadosS
ide S
catt
er
Forward Light Scatter
0 200 400 600 800 1000
02
00
40
06
00
80
01
00
0
CD3 FITC
CD
4 P
E
0 200 400 600 800 1000
0
200
400
600
800
1000
•DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2
ALGUNS MARCADORESALGUNS MARCADORESCD3CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos - presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos
timócitos.timócitos.
CD4CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo - 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticasauxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas
CD8CD8-- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica. 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica.
CD19CD19- presente em mais de 95% das células B.- presente em mais de 95% das células B.
CD20CD20-- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico.tecido linfóide e sangue periférico.
CD45- CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.
CD56CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou - marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.granulócitos.
CD10
CD2
CD20
CD3
CD7
CD19
CD22
CD23
CD26
CD5
Leucemias Linfociticas ou
Enfermidade residual mínima
CD3
CD7
HLA DR
CD 42a
CD 61
CD19
CD33
CD13
CD14
CD34
Leucemias mielóides
CD3
CD7
CD2
CD19
CD5
CD56
Linfomas e Mielomas
LEUCEMIAS
APLICAÇÕES CLÍNICAS
- Análise da subpopulação linfocítica
- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas
- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo
- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas
- Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima- Análise de reticulócitos
- Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna
- Detecção de anticorpos antiplaquetários
- Análise do conteúdo de DNA- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)- Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusãolinfocitária
OBRIGADA A TODOS!OBRIGADA A TODOS!
OBRIGADA A TODOS!
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