Crescimento Microbiano - UNESP: Câmpus de Jaboticabal · e no tamanho celular 28. Ciclo de...

Crescimento Microbiano

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Cultivo e Crescimento de Micro-organimos

Everlon Cid Rigobelo

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Objetivos

• Cultivo laboratorial de Micro-organismos

– Técnica asséptica

• Meios de cultura

• Meios sólidos

• Meios Líquidos

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Objetivos

• Crescimento de micro-organismos

– Crescimento de bactérias

– Crescimento de Fungos

– Multiplicação dos vírus

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Objetivos

• Métodos utilizados para a contagem do

crescimento de micro-organismos

– Contagem em placas

– Contagem em lâmina

– Turbidimetria

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Micro-organismos

Escherichia coli Aspergillus niger

Bacteriófago Fonte: www.hyperscience.com 6

Finalidade de cultivo

• Isolar e identificar

• Testes utilizados:

– Tintoriais, morfológicos, bioquímicos

sorológicos e moleculares

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Morfologia dos Micro-organismos

Vírus animal

Bactérias do solo

Micorrizas Fonte: www.hyperscience.com 8

Testes de Identificação

Teste Tintorial Teste Bioquímico

Teste Molecular Teste Sorológico

Fonte: www.rehagro.com.br

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Importância dos micro-organismos

Doenças de Planta Álcool e Bebidas Bactericidas

Produtos Láctios Probióticos

Antibióticos

Fonte: www.brasilescola.com.br

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Cultivo laboratorial de micro-

organismos

• Cultura com um único micro-organismo

– Ausência de contaminantes

– Meios sólidos crescimento das colônias

– Uniformidade das colônias

Cultura Pura

Fonte: www.worldespress.com 11

Cultivo laboratorial de micro-

organismos

• Técnica asséptica

– Meios esterilizados

– Câmara de fluxo laminar

– Uso da chama do bico de Bunsen

Esterilização calor úmido

Fonte: www.worldespress.com

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Técnicas Assépticas

Fluxo Laminar Bico de Bunsen

Fonte: www.worldespress.com13

Cultivo de micro-organismos

• Meios de Cultura

– Soluções nutrientes que promovem o

crescimento microbiano

• Classes de meios de cultura

– Meios definidos e meios complexos

Agar Sangue

Fonte: www.biomedicinamicro.com 14

Meios Definidos

• Quantidades precisas de compostos:

– Orgânicos e inorgânicos

– Fonte de Carbono

– Origem e a concentração da fonte de Carbono

• Depende

– Do micro-organismos cultivado

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Meios Complexos

• Digestos de produtos animais ou vegetais

– Caseína (proteína do leite)

– Carne (extrato de carne)

– Soja (caldo tríptico de soja)

– Células de leveduras (extrato de leveduras)

Agar Trípico Soja

Fonte: www.biomedicinamicro.com 16

Meios Complexos

• Possuem substâncias altamente nutritivas

• Porém impuras

• Comercializados na forma de pó

– Pesados e dissolvidos em água destilada

Agar Seletivo

Fonte: www.biomedicinamicro.com17

Meios Complexos

caseína Extrato de carne

Trípico de soja Extrato de Levedura

Fonte: www.biomedicinamicro.com

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Meios Seletivos

• Inibem seletivamente o crescimento de

micro-organismos

– Presença de compostos

Agar Baird Parker

Fonte: www.pvl.pt

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Meio Diferencial

• Possui um indicador

– Permite a diferenciação de reações químicas

– Específicas que ocorrem durante o crescimento

• Alguns microrganismos realizam:

– Reações particulares outros não

– São úteis na distinção e espécies bacterianas

Agar TSI

Fonte: www.pvl.pt

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Meio Sólido

• Adição de um agente gelificante aos meios

líquidos

• Vantagens

– Imobilizam as células

– Crescem em massas isoladas e visíveis

Agar NI

Fonte: www.mkldiagnostic.com 21

Agar

Alga da classe RodophytaAgar

Agar Mitis SalivariusFonte: www.mkldiagnostic.com 22

Crescimento de Bactérias

• Fase elongação

– Podem atingir o dobro do comprimento

• Formação do septo

– Crescimento da membrana plasmática

– Parede celular no interior da célula

• Divisão

– Formam partição que divide a célula em duas

Fonte: www.mkldiagnostic.com

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Fissão Binária

• Geração

• Tempo de geração

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Crescimento de bactérias

• Culturas de batelada

– Sistema fechado

– Sofre alterações contínuas

– Atividades metabólicas dos micro-organismos

– Alterações drásticas na composição química e

física dos meios de culturas

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Culturas de Batelada

Fermentação Alcoólica

Fonte: www.shared.com

Usina Sucro alcooleira

Fermentação Acoólica26

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Ciclo de Crescimento Microbiano

• Fase Lag

– Pouca ou ausência de divisão celular

– Síntese enzimática e de moléculas variadas

– Pode ser curta ou longa dependendo das condições

fisiológicas do inóculo

– Aumento da quantidade de proteínas no peso seco,

e no tamanho celular

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Ciclo de Crescimento Microbiano

• Fase Exponencial

– Crescimento Exponencial das células

– Tempo de geração constante

• Taxa de Crescimento Exponencial

– Número de gerações por Unidade de Tempo

– Será curto ou longo dependendo da

disponibilidades de nutrientes

– Estudos enzimáticos são realizados nesta fase

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Ciclo de Crescimento Microbiano

• Fase Estacionária

– Não se observa crescimento microbiano

– Podem prosseguir o metabolismo energético e

processos biossintéticos

– Consumo de um nutriente essencial

– Acúmulo de um produto de excreção do organismo

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Ciclo de Crescimento Microbiano

• Fase Morte

– Número de células mortas excede o de células

vivas

– A taxa de morte pode ser inferior a taxa de

crescimento exponencial

– A contagem total permanece constante, enquanto

que a taxa de células viáveis cai lentamente

– Pode ocorrer lise celular32

Cultura contínua: quimiostato

• Culturas são mantidas constantes

– Longo período de tempo

– Sistema aberto

– Mantém um volume constante

– Adicionado um meio de cultura fresco a uma taxa

constante

– Remove-se o mesmo volume de meio usado

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Cultura contínua: quimiostato

• Cultura contínua

– Sistema em equilíbrio

• O volume do quimiostato

– Número de células e a quantidade de nutrientes

– Permanecem constantes

Fonte: www.podcastmicro.com

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Quimiostato

• Permite o controle

– Taxa de crescimento populacional da cultura

– Densidade populacional da cultura

• Fatores importantes para esse controle

– Taxa de diluição

– Concentração de um nutriente limitante C - N

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Crescimento em Fungos

– Crescimento e disseminação de filamentos de

hifas

– Produção assexuada de esporos

– Produção esporos sexuais

– Simples divisão celular - brotamento

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Micorrizas

Fonte: www.infoescola.com

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Crescimento de vírus

• Vírus

– Parasitas obrigatórios

– Crescimento utilizando a maquinaria celular da

célula hospedeira

Fonte: www.infoescola.com

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Multiplicação dos Vírus

• Multiplicação do vírus

– Culturas de células – Hela, Vero, BHK, IBRS2

Células de Fibroblastos

Fonte: www.infoescola.com

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Multiplicação dos Vírus

• Inoculação em ovos embrionados

Fonte: www.infoescola.com

Vias de Inoculação Lesões Virais

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Multiplicação Viral

• Animais de Laboratório

Fonte: www.infoescola.com

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Medidas do Crescimento Microbiano

Contagem de Células Totais

Contagem de Viáveis Verificação da Turbidez

Medidas do Crescimento Microbiano

Diretas Indiretas

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Medidas de Crescimento

• Contagem Direta

– No número de células viáveis

– Alterações na concentração de algum

componente celular

– Proteínas, ácidos nucleicos e peso seco das

próprias células

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Medidas de Crescimento

• Contagem de Células Totais

– Contagem microscópica células

– Amostras secas ou líquidas

• Amostras secas

– Podem ser coradas para aumentar o contraste em

as células e o fundo

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Medidas Diretas do Crescimento

Microbiano

• Contagem em placas

– Contagem das células viáveis

– Cada colônia é originada de uma única bactéria (UFC)

– Inóculo original é sempre homogêneo

– Não existe agregação de células

• Desvantagem: precisa de 24 horas de incubação

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Contagem de Células Viáveis

• Viável – capaz de se dividir

• Contagem do número de células em uma

placa

– Capazes de formar colônias

– Contagem de placa

• Método da semeadura por espalhamento

• Método da semeadura em profundidade46

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Método da Semeadura por

Profundidade

– Volume de 0,1 – 1mL

– Pipetado em uma placa de meio estéril

– Adiciona-se meio de cultura fundido

– Mistura-se com movimentos delicados

• Formação de colônias por toda a placa

– Não somente na superfície do ágar

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Método de Semeadura

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Medidas Diretas do Crescimento

Microbiano

• Contagem em Lâmina

– Utilização de câmaras de contagem (Neubauer)

– Lâmina quadriculada de área conhecida (grid)

– Lamínula sobre a superfície da lâmina de vidro

Fonte: www.infoescola.com

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Limitações da Contagem

Microscópica

• Apesar de serem rápidas e simples

• Limitações são:

– Não se distingue células vivas e mortas sem

coloração especial

– Células pequenas são de difícil visualização

– Técnica pouco precisa

– Células móveis precisam ser fixadas

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Método da Semeadura por

Espalhamento

– Volume de 0,1mL

– Espalhado sobre a superfície do meio sólido com

o auxílio de alça

– Incubação da placa e crescimento

– Contagem do número de colônias

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Contagem por Turbidimetria

• Medição do aumento de componentes

celulares

– Proteínas, DNA e peso seco de uma cultura

• Medidas de turbidez

– Suspensão celular – aspecto turvo

– Quanto maior o número de células – maior a luz

dispersa

– Avaliação da massa total de células proporcional

ao número de células

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Turbidimetria

Fonte: www.infoescola.com

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Número Mais Provável

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Contagem de Vírus

• Placas de Lise

– Inoculação do vírus em culturas celulares

– Contagem de células lisadas

– Cada célula equivale a um vírion

• Teste de Elisa

– Número de ligações entre os vírus e o anticorpo

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Contagem de Vírus em Placas de

Lise

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Teste de Elisa

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Temperatura e Crescimento

Microbiano

• Temperatura

– Fator mais importante que afeta o crescimento

microbiano

– Temperaturas muito frias ou muitos quentes os

micro-organismos não são capazes de crescer

– As temperaturas máximas e mínimas refletem a

variação da temperatura média de seus hábitats.

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Classes Térmicas de Micro-

organismos

• Psicrófilos

– Temperaturas baixas

• Mesófilos

– Temperaturas medianas

• Termófilos

– Temperaturas altas

• Hipertermófilos

– Temperaturas muito elevadas

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Fatores que influenciam a atividade

enzimática

• Temperatura

– Em altas temperaturas, as enzimas sofrem

desnaturação e perdem suas propriedades

catalíticas

– Em baixas temperaturas, a taxa de reação diminui

• pH

– pH no qual a atividade enzimática é máxima é

conhecido como pH ótimo

• Concentração do substrato

– Dentro de limites, a atividade enzimática aumenta

com o aumento da concentração do substrato63

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Literatura Consultada

Microbiologia de Brook, Michael T. Madigan,

2010.

Pelczar, Jr., Joseph Michael. Microbiologia,

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Muito Obrigado!

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