Cromatografia e os jogos olímpicos de 2016: uma corrida...

Cromatografia e os jogos

olímpicos de 2016:

uma corrida contra o doping

Prof. Helvécio Costa Menezes

Conteúdo

Doping no esporte

Substâncias proibidas e seus efeitos

Agências de controle antidoping

Métodos de análise

Cromatografia a gás

Princípios

Componentes

Acoplamento com espectrometria de massas

GCxGC.

Preparo de amostras para GC/MS

Aplicações da GC/MS no controle antidoping.

2

Doping

3

Presença de qualquer substância ou método que

tenha o potencial para aumentar o desempenho

desportivo, que ofereça risco desnecessário a

atletas, ou atue de forma contrária ao espírito

desportivo.

WADA, 2016

Ideal Olímpico

4 Barão de Coubertin, 1896

A coisa mais importante não é vencer, mas participar,

assim como a coisa mais importante da vida não é a

vitória, mas a luta. O essencial não é conquistar e sim lutar

bem”

Motivação

Movere (latim): mover para realizar determinada ação.

Energia que nos impulsiona em direção a um determinado objetivo a fim de satisfazer uma necessidade pessoal.

5

Tipos de indivíduos

Tarefa

Prazer em realizar tarefas

corretamente

(reconhecimento próprio)

Referencial interno

Dificuldades e obstáculos são

desafios

Os fins não justificam os

meios

Realizar uma tarefa de forma

correta encerra a recompensa

Ego

Prazer em conquistar algo ou

vencer alguém

(reconhecimento social)

Referencial externo

Dificuldades e obstáculos não

são desafios

Os fins justificam os meios

Só a vitória é a recompensa

6

Fatores que favorecem o doping

Motivação pessoal

Excesso de cobrança (social, empresarial, e familiar)

Necessidade financeira

Força da mídia

Impunidade

7

Fatores que favorecem o doping

8

O medo da detecção e consequente desgraça e perda de

rendimentos é o maior desincentivo a dopagem para os atletas.

Mais do que o dano pessoal. Em estudo patrocinado pela Sports

Illustrated, 195 de 198 atletas disseram que “TOMARIAM”

drogas promotoras de desempenho se eles tivessem a garantia

de vencer e não serem flagrados.

50% declararam que fariam isso mesmo se MORRESSEM de

efeitos colaterais da droga após 5 ANOS de uma vitória em

competição.

Histórico do uso de substâncias proibidas

9

China (2737 aC)

Efedra, mandragora

Arábia (1000 aC)

Cannabis, Haxixe

Grécia (300 aC)

Cogumelos, ópio

América precolombiana

Coca, mescalina

Europa (1810 dC)

Cafeína, morfina

Japão (1919 dC)

Anfetaminas

Histórico do uso de substâncias proibidas

10

Áustria (1910)

Primeiro teste anti doping

Jogos Olímpicos

de Roma (1960)

heroína

1940

Primeiros métodos por GC

e TLC

Tóquio (1964)

Primeiras Leis e punições

Décadas 60 e 70

Anfetaminas

Década de 80

Anabolizantes

Altetas flagrados no exame antidoping

11

ATLETISMO 2003

Maurren Maggi

(Clostebol -pomada

dermatológica)

VOLEI 2003

Giba

(Maconha)

NATAÇÃO 2007

Rebeca Gusmão,

(Testosterona)

FUTEBOL 2008

Romário

(Finasterida)

MMA 2015

Anderson Silva

(Esteróides)

Altetas flagrados no exame antidoping

12

ATLETISMO 1988

Bem Johnson

(Estanozolol)

VELOCISTA 2007

Marion Jones

(Esteróides)

CICLISMO 1999

Lance Amostrong

(EPO)

FUTEBOL 1994

Maradona

(Efedrina)

CICLISMO, 2006

Floyd Landis

(Testosterona)

13

14

Anabolizantes (S1)

15

Esteróides Anabólicos Androgênicos (EAA)

A testosterona é o principal esteróide anabolizante, é produzida nos testículos,

assim como pelo córtex supra renal em homens e mulheres. Ao atingir o núcleo

celular estimula o DNA a sintetizar proteínas. Quanto mais intenso for o esforço

maior será a produção de testosterona.

Promove o aumento da massa muscular, aumento da hemoglobina, aumento

da deposição de cálcio nos ossos.

Efeitos colaterais

Impotência sexual, e esterilidade

testosterona

Anabolizantes (S1)

16

Esteróides Precursores da testosterona

Desidroepiandrosterona (DHEA)

Androstenediona

Oximetolona,

Oxandrolona,

Metandostrenolona

Estanozolol.

Decanoato de nandrolona (Deca)

Fenilpropinato de nandrolona

Cipionato de testosterona

Undecilenato de boldenona

Meia vida: 10 a 20 minutos

Metabolizados: fígado

Eliminação: urina

Deca

Estanozolol.

Hormônios Peptídicos (S2)

17

São substâncias reguladoras de diversas funções do organismo. Sua origem se

dá pelo estímulo inicial do SNC, que gera reações químicas para a sua

secreção.

Hormônio de Crescimento (GH)

Secretado pelas glândulas pituitárias, possui função anabólica de diversos

tecidos e sua secreção é ampliada em circunstâncias anaeróbias. A meia vida

sérica do GH é de 20 minutos após secretado ou injetado, o pico de

concentração dá-se de 1 a 3 horas após injetado, tornando-se indetectável

após 24 horas.

Efeitos Colaterais: pode causar o surgimento da síndrome do túnel do carpo,

acromegalia, cardiomegalia, diabetes II e hipertensão arterial

GH acromegalia

Hormônios Peptídicos (S2)

18

Fator de Crescimento tipo Insulina 1 (IGF-1)

possui função estimulante do DNA para a síntese protéica, causando também o

anabolismo muscular, tendo efeitos colaterais similares ao GH .

Eritropoetina (EPO)

Este hormônio é naturalmente secretado pelas glândulas supra-renais (90%) e

pelo fígado (10%). É responsável pelo aumento da proliferação de células

tronco, precursoras da produção de glóbulos vermelhos do sangue, através da

ligação a sítios específicos na medula óssea. Sua meia vida é de 6 a 8 horas.

Efeitos colaterais:

Eleva a densidade sanguínea, pode causar hipertensão, infarto, lesões renais e

doenças cardiovasculares.

Hormônios Peptídicos (S2)

19

Gonadotrofina (hCG)

Glicoproteina hormonal produzida durante a gravidez nos líquidos maternos.

Garante a manutenção da gestação, inibindo a menstruação e a ausência de

uma nova ovulação.

Efeitos colaterais:

Tumores hepáticos, retenção de líquidos e de sódio, sobrecarga cardíaca,

diabetes e maior incidência leucemias.

Beta-2 Antagonistas (S3)

20

Atuam nos receptores beta-2 de diversos tecidos, inclusive da

musculatura esquelética. Possuem efeitos broncodilatadores, atuam na

oxidação dos tecidos adiposos.

Diminuem a frequência cardíaca e a pressão arterial, normalmente

usados em esportes que requerem precisão e concentração como tiro e

arco e flecha.

Efeitos Colaterais

Taquicardias,nervosismo, dores de cabeça, tremores, insônia,

hipertensão, patologias morfológicas e funcionais no coração.

Clenbuterol Salbutamol

Moduladores hormonais e metabólicos (S4)

21

Inibidores de aromatase: impedem a formação de hormona estrogénica

Moduladores seletivos de receptores de estrogênios (SERMs): inibição

ou ativação do estrogênio em vários tecidos.

Insulinas: aumento da queima de glicose

Efeitos Colaterais

Dor nos músculos e nas junções

Osteoporose, ossos frágeis e fracturas

Confusão da memória

Hipoglicemia

Aminoglutetimida

Exemestano

Diuréticos (S5)

22

Agem na redução da secreção de renina pelas células dos rins. A renina

tem função precursora na conversão de enzimas que aumentam o volume

de água do organismo.

Redução de peso antes das competições

Camuflagem de outras substâncias na urina

Efeitos colaterais

Redução dos sais minerais e outros nutrientes estocados no tecido muscular,

e redução da capacidade física do atleta.

Furosemida Hidroclorotiazida

Estimulantes (S6)

23

Agem no sistema nervoso central, aumentam o estado de

alerta e capacidade física.

Efeitos

Dilatação das pupilas

Inibição da secreção das glândulas salivares

Aumento da frequência respiratória

Inibição dos movimentos peristálticos

Aumento da glicogenólise

Contração do esfíncter da uretra

Estimulantes (S6)

24

Mecanismo de ação

Estimulantes (S6)

25

Aumenta a secreção de catecolaminas, o que aparentemente

potencializa a capacidade neural muscular.

Provas de longa duração

Ajuda a reduzir ou retardar a fadiga

Aprimora e amplia o desempenho

Estimulantes (S6)

26

Catecolaminas endógenas

Estimulantes (S6)

Efeitos Colaterais

Palpitações

Perda de apetite

Hipertensão

Sobrecarga do coração e fígado

Problemas renais

27

Narcóticos-Analgésicos (S7)

28

Agem no SNC, ligando-se a receptores específicos, o que impede a

liberação de neurotransmissores responsáveis pela mensagem da dor.

Não melhoram o desempenho físico, mas aliviam e retraem a

sensação de dor como a fadiga. Atletas de maratona e triatlo.

Efeitos Colaterais

Causam entorpecência e perda de sensibilidade, lesões músculo

esqueléticas, náuseas, vômitos, insônia, depressão e dependência.

química.

Papaver somniferum

Canabinóides (S8)

29

São substâncias derivadas da Canabis sativa e atuam como depressores do

SNC. A Canabis sativa possui cerca de 420 substâncias, dentre estas destaca-

se o Δ9THC (Delta 9 Tetra Hidrocanabinol).

Reduz a ansiedade antes e durante a competição.

Efeitos Colaterais: pode causar dependência química, aparente destruição

irreparável de receptores neurais, redução da memória, e da capacidade

intelectual

Δ9THC

Glicocorticóides (S9)

30

São hormônios esteróides que se ligam com o receptor do cortisol.

Afetam o metabolismo dos carboidratos, são usados como anti-inflamatórios,

reduzem a dor, imunosupressores, e provocam euforia.

Efeitos Colaterais: hemorragias, úlceras, glaucoma, e diabetes.

Cortisol

Manipulação do Sangue e seus componentes

(M1)

31

Promove o aumento da concentração de hemoglobina para o melhor

transporte de oxigênio.

Transfusões de sangue

Aplicações intravenosas de perfluorcarbonos

Hemoglobina bovina

Efeitos Colaterais

Reações alérgicas, transmissões virais, choques metabólicos e

sobrecarga de circulação

Manipulação Química e Física (M2)

32

Manipular visando alterar a integridade e validade das amostras

coletadas no Controle de Dopagem.

Infusões intravenosas e/ou injeções maiores que 50 mL por um período

de 6 horas exceto aquelas administradas de forma legítima durante

ocasiões de admissões hospitalares, procedimentos cirúrgicos ou

investigações clínicas.

Manipulação da urina

33

Uso de Probenecida bloqueador da secreção de testosterona e

camuflador de agentes dopantes.

Doping genético (M3)

34

Alteração dos genes responsáveis pela síntese de proteínas.

Dentre os genes capazes de alterar a força e a resistência física destacam-se:

Enzima Conversora de Angiotensina (ECA): agente vasoconstritor

Eritropoetina (EPO): estímulo para a produção de hemácias

Miostatina: proteína bloqueadora da síntese protéica muscular , e

desenvolvimento da musculatura esquelética

Álcool (P1)

35

O etanol atua no SNC e em pequenas doses reduz o nervosismo, tremor,

sensibilidade às lesões, aumenta a sensação de relaxamento e confiança.

Limite: 0,1 g L-1

Efeitos Colaterais

Diminui a capacidade visual, a concentração, e os reflexos motores.

Alterações cardíacas, cirrose, pancreatites, dependência, e teratogênese.

Proibido para as modalidade

Aeronáutica, tiro com arco, automobilismo, karatê, pentatlo, motociclismo,

e motonáutica

Beta bloqueadores (P2)

36

Melhora as arritimias cardiácas.

Reduzem os batimentos cardíacos,

Estabilizam mãos e braços

Precisão nos movimentos

Efeitos Colaterais

Insuficiência cardíaca descompensada

Doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC)

Asma brônquica

Proibido para as modalidade

Arco e flecha, automobilismo, bilhar, dardos, desportos subaquáticos,

golfe, e tiro.

Agências de controle antidoping

37

World Anti-Doping Agency – WADA

(Agência Mundial Antidoping - AMA)

Fundada em 1999 na Suiça

Agentes de controle

38

Fonte: ABCD, 2016

Como é feito o controle antidoping

39

Seleção dos atletas

Fonte: ABCD, 2016

Como é feito o controle antidoping

40

Coleta das amostras

Na Estação de Controle de Dopagem Oficial de Controle de Dopagem (DCO)

informa os direitos e deveres, e registra as informações do atleta.

Urina

O atleta escolhe um copo de coleta, e com a supervisão do DCO faz a coleta

de 90 mL.

O atleta recebe 3 frascos selados, e escolhe 2 para transferir a amostra

(frasco A 60 mL, e frasco B 30 mL)

Após o DCO checar a densidade da urina, o atleta acondiciona as amostras

para o transporte e confere o formulário de controle..

Fonte: ABCD, 2016

Como é feito o controle antidoping

41

Amostra A: análise imediata

Amostra B: armazenada

Se A for um Resultado Analítico

Adverso (positivo para dopagem) o

atleta decide se pede a análise da

amostra B para contestar o resultado.

Suspensão mínima de 4 anos, Banimento dos Reincidentes

Fonte: ABCD, 2016

Resultados analíticos adversos

42 WADA, 2013

Processo Analítico

Amostragem

(sa)

Armazenamento e transporte

Tratamento da amostra (sp)

Análise (sm)

Resultados

Fonte: Bartley, 1990

sg2

= sm

2 + sa2 + sp

2

sg2

= variância global

sm2 = variância do método

sa2 = variância da amostragem

sp2 = variância do preparo da amostra

Erro em função da concentração do analito

44

Fonte: Horowitz, Anal. Chem., 1982.

Espectro de Massas

Isotopológos

27 28 29 30

CO

13 CO

Int.

+

+

27 28 29 30

CO

13 CO

Int.

+

+

Mesma espécie, com os mesmos elementos mas diferentes isótopos.

Espectros de Massas Isótopos

Elemento Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa

Carbono 12 C 100 13 C 1.1

Hidrogênio 1 H 100

2 H 0.016

Nitrogênio 14

N 100 15

N 0.38

Oxigênio 16

O 100 17

O 0.04 18

O 0.2

Enxofre 32

S 100 33

S 0.78 34

S 4.4

Cloro 35 Cl 100 Â 37 Cl 32.5

Bromo 79

Br 100 81

Br 98

Geralmente o isótopo mais leve é o mais abundante

Espectro de Massas

abundância isotópica

Pico do Carbono 13

Pico monoisotópico

Para se estimar o número de

carbonos em uma molécula:

dividir a intensidade de A+1

por 1.1 (abundância do

Carbono 13 na natureza).

25 / 1.1 = 23,7

~ 24 átomos de

carbono na molécula

Espectro de Massas

Abundância isotópica

Br - CH3 15 u

79Br-CH3 = 94 81Br-CH3 = 96

Informações:

• Relação m/z

• Presença dos isótopos

• Diferença de massa entre os sinais

Espectro de Massas

Abundância isotópica

Espectro de Massas

Abundância isotópica

Cloro

MM = 35,453 u

Isótopos: 75,77 % de 35Cl e 24,23 % de 37Cl

Ciantoxina 7

40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61mass0

100

%

Dani_07 (0.046) Is (1.00,1.00) CH3Cl 1: TOF MS ES+ 7.49e1250.0

52.0

35Cl

37Cl

Espectro de Massas

Regra do Nitrogênio

válida apenas para o modo EI

Número ímpar de átomos de N

Íon molecular [M]+• terá massa ímpar!!

Número par de átomos de N ou não contém átomos de N

Íon molecular [M]+• terá massa par!!

Espectro de Massas

Medida da Massa Molecular

• m/z 249

» C20H9+

» C19H7N+

» C13H19N3O2+

• m/z 249 » C20H9

+ 249.0700

» C19H7N+ 249.0580

» C13H19N3O2+ 249.1479

Sistemas de

Baixa resolução

Sistemas de

Alta resolução

Massa nominal Massa de um íon de uma determinada fórmula empírica calculada através do isótopo mais abundante. Ex : M = 249 C20H9

+ ou C19H7N+ ou C13H19N3O2

+

Massa exata Massa de um íon de uma determinada fórmula empírica calculada através da massa exata do isótopo mais abundante da cada elemento. Ex : M = 249 C20H9

+ 249.070 C19H7N

+ 249.0580 C13H19N3O2

+ 249.1479 Faixa de massas Limite superior e inferior de m/z observáveis por um dado analisador de massas.

Espectro de Massas

Medida da Massa Molecular

Espectro de Massas

Resolução

249 249.0700 249.0580 249.1479

3 compostos diferentes

Mesma massa nominal

Baixa Resolução

3 compostos diferentes

3 massas exatas diferentes

alta resolução

C20H9+

C19H7N+

C13H19N3O2+ C20H9

+ C19H7N+ C13H19N3O2

+

Medida da capacidade de um analisador de massas de separar íons adjacentes.

Espectro de Massas

Resolução

FWHM = Full Width at Half Maximum

Espectro de Massas

Resolução

319.8 319.9 320.0 320.1 Mass

%

0

20

40

60

80

100

Resolução = 1.000

319.8 319.9 320.0 320.1 Mass

%

0

20

40

60

80

100 319.8965 319.9329

Resolução = 10.000

Espectros de Massas

Alta Resolução

57

C11H12Cl2N2O5: C11 H12 Cl2 N2 O5 pa Chrg 0

322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rela

tive A

bundance

322,0123

324,0094

323,0157 326,0064325,0127

327,0098 328,0107 329,0140 330,0174 331,0183 332,0216

C11H12Cl2N2O5

Cloranfenicol

Massa Nominal = 322

Massa Exata Monoisotópica = 322,0123

Espectros de massas

Alta Resolução

58

Espectro de Massas

Exatidão de massas

Exatidão da informação de massa fornecida pelo espectrômetro de massas

mexatidão = mreal - mmedida

ppm = 106 * mexatidão/ mmedida

Auxilia na eterminação da fórmula molecular de compostos

desconhecidos

Pode indicar a presença de um íon particular em um

composto conhecido

mexatidão

Espectro de Massas

Exatidão e Resolução

Espectro de Massas

Sensibilidade e Resolução

Diminuição da resolução implica em aumento de sensibilidade!

Análise qualitativa Identificação de Eluatos

TEMPO

CO

NTA

GE

NS

MASSA / CARGA

CO

NT

AG

EN

S

1 Seleção manual ou automática do espectro de massa correspondente a um eluato.

2 Interpretação manual do espectro e / ou comparação automática com biblioteca de espectros padrão do equipamento.

Busca automática em bibliotecas de espectros: comparação

estatística ( Probability Based Matching )

BIBLIOTECA DE ESPECTROS

ESPECTRO DESCONHECIDO

PBM

Lista com possíveis

candidatos + porcentagem de confiabilidade

# NOME FÓRM. %

1 1-dodeceno C12H24 99

2 1-dodecanol C12H26O 91

3 ciclododecano C12H24 91

4 2-dodeceno C12H24 66

5 1-undeceno C11H22 35

6 8-metil-3-undeceno C12H24 32

PBM de um eluato

“desconhecido” (1-dodeceno)

LIMITAÇÕES:

Identificação pouco confiável de espectros muito simples

Limitada pelo tamanho da base de dados (NIST = 66.000

espectros)

Diferenças entre espectros gerados por diversos EM

Espectrometria de Massas no Controle Antidoping

Critérios de identificação

WADA , 2016

Diferença máxima de ± 0,5 Da entre as massas do íon

alvo e a massa do mesmo íon adquirido a partir de

uma amostra enriquecida.

A razão sinal/ruído (S/N) dos íons de identificação

deve ser maior do que 3

Em MS1 usar pelo menos três íons de identificação.

Em MSn usar pelo menos dois íons precursores.

Espectrometria de Massas no Controle Antidoping

Critérios de identificação

WADA , 2016

Abundância Relativa (%)

no MR*

Tolerância máxima para a Abundância Relativa na

amostra

Exemplos

Abundância Relativa (%)

No MR

Tolerância Máxima

50 – 100 ±10 (absoluto) 60 50 - 70

25 – 50 ±20 (relativo)

40 32 - 48

1- 25 ±5 (absoluto)

10 5 - 15

* MR = material de referência analisado nas mesmas condições

Espectrometria de Massas no Controle Antidoping

Critérios de identificação

=

MR = material de referência

Am = amostra

(MR)

MDMA= metiletilenodioximetanfetamina

(Ecstasy)

(Am)

Espectrometria de Massas no Controle Antidoping

Critérios de identificação

MR = material de referência

Am = amostra

(MR)

MDMA= metiletilenodioximetanfetamina

(Ecstasy)

(Am)

Técnicas de separação no controle antidoping

68

Separação

SPE LLE SPME

Extração em Fase Sólida (Solid Phase Extraction - SPE)

Woolfenden E. J. Chrom. A. 1217(16): 2674-2684, 2010. 69

Princípio: passagem da amostra por sorventes adequados, onde ocorre partição entre duas fases (solido-liquido).

Mecanismos de retenção: Força de van der Waals, ligações dipolo-dipolo, ligações de hidrogênio, e interações iônicas.

Modos:

ATIVO: bombeamento;

PASSIVO: difusão.

Extração em Fase Sólida

70

Amostra bruta

Amostra após

extração com SPE

Extração em Fase Sólida

71

Sorventes comerciais para extração em fase sólida

SORBENTE COMPOSIÇÃO APLICAÇÕES

Tenax TA

Poli (oxido de 2,6-difenil-p-fenileno)

Aromáticos exceto Benzeno, apolares PE < 100°C e polares PE < 150°C

Chromosorb 106 Estireno-divinilbenzeno Compostos oxigenados.

C5 a C12

Porapak N Polivinilpirrolidona Nitrilas, piridina e álcoois. C5 a C8

Carbotrap C Carbono grafitizado Hidrocarbonetos até C20 , alquil benzenos

Carbotrap X Carbono grafitizado BTEX

Spherocarb

Pirólise de PVC

Óxido de etileno, CS2 , CH2Cl2 , metanol, etanol, acetona

Carboxen 1000 Pirólise de PVC Hidrocarbonetos ultra-voláteis, C2 a C3

Ras, M.R. et al. Trends in Analytical Chemistry, Vol. 28, No. 3, 2009. 72

Sorventes suportados em sílica para SPE

73 Rodriguez et al. Intech, 2013

Carbono grafítico para SPE

Ferenc et al. Polish J. of Environ. Stud, 2006

Area superficial específica: 100 m2 g-1

Funcionalização: grupos oxigenados

Nomes comerciais: Carbopack, Carbograph

Aplicações: espécies neutras, ácidas e básicas.

Carbono grafítico Poroso para SPE

Ferenc et al. Polish J. of Environ. Stud, 2006

Area superficial específica: 120 m2 g-1

Diâmetro médio dos poros: 250 Å

Porosidade: 75%

Funcionalização: grupos oxigenados

Nome comerciaL Carb GR

Aplicações: espécies polares e apolares

Grafenos para SPE

Wang et al. J. Chromatogr. A, 2014

Nanocompósitos de Grafeno

Wang et al. J. Chromatogr. A, 2014

Nanocompósitos de Grafeno com sílica

Zhang et al. J. Chromatogr. A, 2013

1-(3-dimetilaminopropil)-

3-etilcarbodiimida hidrocloreto (EDC)

N-hidroxisuccinamida (NHS)

Nanotubos de carbono para SPE

Multi-walled carbon nanotubes (MWCNT)

Elevada área superficial específica (200 a 400 m2 g-1)

Elevados fatores de enriquecimento (2000 a 4000 vezes)

Estabilidade química

Estabilidade térmica

Hidrofobicidade

Funcionalização

Funcionalização não covalente dos CNT

Forças envolvidas:

Interações pi

Van der Walls

Eletrostáticas

Grupos:

Polímeros

Surfactantes

Carboidratos

Proteínas

Enzimas

DNA

Estratégias

Mistura física em solução

Polimerização na superfície dos CNT

Funcionalização covalente dos CNT

Forças envolvidas

Ligações covalentes

Grupos

Halogênios

Radicais(alquila, arila)

Ciclicos

Hidroxila

Carboxila

Estratégias

Tratamento dos CNT com agentes oxidantes fortes a temperaturas elevadas

Oxidação em fase gasosa (hidroxila e carbonila)

Oxidação em fase líquida(carboxila)

Funcionalização covalente dos CNT

MWCNT não oxidado MWCNT após tratamento com NaClO 7% m/v

Socas et al. J, Chrom. A, 2014

Extração dispersiva em fase sólida (Dispersive solid-phase extraction - DSPE)

Rastkart, et al. J, Chrom. A, 2013 Análise

Mecanismos em SPE

Fase Normal

Fase Reversa

Analito

Polar Apolar

Sorvente

Polar Apolar

Solvente (matriz) Apolar Moderadamente Polar

Solvente (Eluição)

Polar Apolar

Interações (Analito/sorvente)

Dipolo-dipolo

Van der Walls

84

Extração com cartuchos SPE

Cartuchos de 1 a 50 mL.

Diâmetro médio das partículas 40 a 60 μm

Volume médio da amostra 500 mL

Eluição sequencial em SPE

86

Extração SPE automatizada

Gerstel, 2015

Extração com discos SPE

88

Sorvente impregnado em fibra de vidro ou PTFE

com espessura média de 0,5 mm.

Diâmetro médio das partículas 8 a 40 μm

Diâmetro médio dos discos 5 a 93 mm.

Extração em fase sólida com ponteira descartável (Disposable Pipette Extraction – DPX)

89

Eluição: 0,1 a 0,5 mL

Tempo: 1 a 2 min

Extração DPX de drogas em urina equina e determinação por GC/MS

90

amostra eluato Lerch et al . Gerstel, 2012

Extração em fase sólida com ponteira descartável (Disposable Pipette Extraction – DPX)

91

Vantagens

Mínimo uso de solventes

Baixos LD e LQ

Elevada precisão

Uso em diversas matrizes

Descartável

Baixo custo

Automação

Vantagens e desvantagens SPE

Vantagens

Baixo custo

Simples operação

Grande variedade de sorventes

Elevada seletividade

Potencial para automação

Desvantagens

Restrições de vazão

Entupimentos

Uso de solventes

Exposição a solventes.

Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS

93 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009

Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS

5,0 mL de urina

1,0 mL de tampão pH=5,2

50,0 μL β-glucuronidase

55 °C por 2 h

KOH até pH=9,0

Centrifugação

Extração SPE

Lavagem com 2,0 mL MeOH

E 2,0 mL água e 1,0 mL tampão pH=4,0

Eluição com 2,0 mL

CHCl3/i-propanol 4:1

100,0 μL MSTFA, 60 °C por 5 min

Secagem com N2

20,0 μL MBTFA 60 °C por 10 min

GC/MS

MBTFA = N-metil-bis-(trifluoroacetamida)

MSTFA= N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida

Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS

95 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009

Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS

96 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009

Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS

97 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009

Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS

98 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009

Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS

99 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009

Matrizes biológicas e tempo de detecção

100 Bulcão et al, 2011

Estrutura do cabelo

101 Pragst & Baliková, 2006

Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS

102

50 mg cabelo

SPE

Condicionamento

SPE

Lavagem

SPE

Eluição

Derivatização

GC/MS

Pantaleão,L.N., 2012

Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS

103

A: Diazepan

B: Diazepan-d5

C: Nordiazepan

D: Oxazepan

E: Aminoclonazepan

F: Clordiazepóxido

G: Temazepan

Cromatograma dos benzodiazepínicos no cabelo após extração por SPE

Pantaleão,L.N., 2012

Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS

104

Limites de detecção e quantificação

Pantaleão,L.N., 2012

Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS

105

Pantaleão,L.N., 2012

Resultados para amostras de cabelo (6 a 9 cm) de usuários de benzodiazepínicos.

Amin: aminoclonazepan, Dzp: diazepan, Nzp: nordiazepan

Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextraction – SPME)

Princípio: equilíbrio do analito entre uma micro fase de coleta e a matriz.

19

Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextraction – SPME)

Modos

Fibra exposta

Fibra recolhida

19

Fibras para SPME

Sorbente ESP.

(μm)

T(°C) USO

100 200-270 COV

PDMS 30 200-270 COSV ap

7 200-270 COSV semi-p

PDMS/DVB 65 200-270 V p

CX/PDMS 75 240-300 COV traço

CW/DVB 65 200-260 p

DVB/CX/PDMS 50/30 230-270 p

CW/TPR 50 - p

PA 85 220-310 COSV p

Parreira, F.V.; Cardeal, Z. L. Química Nova, 28, 646-654, 2005 108

Tabela 4. Características das principais fibras comerciais

Escolha da Fibra para SPME

Parreira, F.V.; Cardeal, Z. L. Química Nova, 28, 646-654, 2005 109

Tabela 4. Características das principais fibras comerciais

Reuso das fibras para SPME

Parreira, F.V.; Cardeal, Z. L. Química Nova, 28, 646-654, 2005 110

Tabela 4. Características das principais fibras comerciais

PDMS/DVB Após 20 ciclos de

extrações em suco de uva

PDMS Após 100 ciclos de

extrações em suco de uva

Bojko, et al. Anal. Chim. Acta, 2012

Extração com SPME no modo Headspace (HS-SPME)

111

Extração com SPME no modo de Imersão Direta (DI-SPME)

112

Aplicações da SPME em química Forense

Furton, K. G. J. Chrom. Sci., 2000

Extração de Drogas ilícitas por HS-SPME em diversas matrizes e determinação por GC/MS

Fujii.. H. J. Forensic. Toxicol., 2015

100 μm PDMS

Extração a 300°C de 30 s a 7 min

Extração de Drogas ilícitas por HS-SPME em diversas matrizes e determinação por GC/MS

α-PVP: alfa-Pirrolidinapentiofenona

PV9: 1-Fenil-2-(pirrolidina-1-il)octan-1-one

MN18: N-1-Naftalenil-1-pentil-1H-indazol-3-carboxamida

Fujii.. H. J. Forensic. Toxicol., 2015

Determinação de anfetaminas em urina por SPME-GC/MS

116

Souza, D.Z. et al., 2011

1,5 mL urina

75 mg Na2CO3 + 150 mg Na2SO4 + 5 μL PRCL

Vortex

SPME

PDMS 30μm, 1200 rpm por 20 min

GC/MS

PRCL= propilcloroformato

Determinação de anfetaminas em urina por SPME-GC/MS

117 Souza, D.Z. et al., 2011

DIE: dietilpropion

AMP: anfetamina

MET: metanfetamina

FEN: fenproporex

MPH: metilfenidato

PROPYL: propilcarbamato (derivatizante)

Determinação de anfetaminas em urina por SPME-GC/MS

118 Souza, D.Z. et al., 2011

Extração Líquido-Líquido (Liquid-Liquid Extraction - LLE)

Equilíbrio de distribuição ou partição

KD = [A(org)] / [A(aq)]

Concentração do Analito que permanece na fase aquosa [A(aq)]i

Onde:

[A(aq)]o = conc. Inicial do A

Vaq = volume da fase aquosa

Vaq = volume da fase organica

i = número de extrações

119

Extração Líquido-Líquido (Liquid-Liquid Extraction - LLE)

Vantagem

Baixo custo

Desvantagens

Elevado consumo de solvente

Risco de contaminações

Baixo fator de concentração

120

Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS

121

Wójtowicz ,M. et al., 2015

2-etilamino-1-fenilbutane (EAPB)

Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS

122

5,0 mL urina

20 μL Difenilamina 150 mg L-1 (P.I)

Ajuste pH = 9

1,3 mL

T-butil-metil éter

LLE

GC/MS

PI= padrão interno, Wójtowicz ,M. et al., 2015

Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS

123

Cromatograma do EAPB após extração LLE

Padrão

Interno

EAPB

Wójtowicz ,M. et al., 2015

Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS

124

Espectro de massas do EAPB

Wójtowicz ,M. et al., 2015

Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS

125

Concentração de EAPB em urina de voluntário após a ingestão de 10,8 μg de EAPB em um suplemento alimentar

Wójtowicz ,M. et al., 2015

Microextração com gota (Single Drop Microextraction - SDME)

126

Headspace (HS-SDME) Imersão direta (DI-SDME)

1 a 8 μL

Microextração com gota (Single Drop Microextraction - SDME)

127

Fatores

Tipo e volume do solvente de extração

Temperatura e tempo de extração

Força iônica

pH

Agitação

Vantagens

Baixo custo

Simplicidade

Elevada recuperação

Elevado fator de enriquecimento

Desvantagens

Baixa seletividade

Baixa precisão

Cinética lenta

Microextração em fase líquida (Liquid phase microextraction - LPME)

Diâmetro interno = 600 µm

Espessura das paredes = 200 µm

Poros = 0,2 µm

128 10:24

Microextração em fase líquida (Liquid phase microextraction - LPME)

Psillakis, E., Kalogerakis, N. TrAC, 2003

Solução aceptora (organica)

Paredes da fibra Agulhas

Fibra imersa na solução

aquosa (doadora)

Solução doadora

129 10:24

Determinação de anfetaminas em urina e sangue por LPME-GC/MS

130 Lorena, 2012

Propriedades das principais anfetaminas

131 Pragst & Baliková, 2006

Determinação de anfetaminas em urina e sangue por LPME-GC/MS

Biotransformação do MDMA

Determinação de anfetaminas em urina e sangue por LPME-GC/MS

132

1,0 mL da amostra em pH 13

Extração com tolueno em HF de 4 cm

por 15 min a 30°C e 500 rpm100 μL

LD: 0,5 a 3 ng/mL

Methamphetamine hydrochloric (MA),

Amphetamine sulfate (AM),

3,4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloric (MDMA),

3,4-methylenedioxyamphetamine hydrochloric (MDA),

Methcathinone hydrochloric (MACT),

Ketamine hydrochloric (K),

Meperidine hydrochloric,

Methadone hydrochloric.

Meng, L. et al. J. Chromatogr. B. 2015

Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS

133

Propriedades das principais anfetaminas

Pantaleão,L.N., 2012

134 Pragst & Baliková, 2006

Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS

Biotransformação do MDMA

Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS

135

50 mg cabelo

HF-LPME

Derivatização

GC/MS

Pantaleão,L.N., 2012

Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS

136

Pantaleão,L.N., 2012

Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS

137

Espectro de massas da anfentamina derivatizada

Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS

138

Lorena, 2012

Espectro de massas do diazepan

Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS

139

Limites de detecção e quantificação

Pantaleão,L.N., 2012

Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS

140

Resultados para amostras de cabelo (6 a 9 cm) de usuários de anfetaminas.

Anf: anfetamina, Femp: femproporex Pantaleão,L.N., 2012

141 Website: http://cmca.qui.ufmg.br/

Obrigado!

A Consciência é um singular para o qual não existe plural.

[Erwin Schrödinger]

142