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Prof. Valmir F. Juliano
QUI624INTRODUÇÃO AOS MÉTODOSINTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOSCROMATOGRÁFICOS
Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAISBaseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos )
Chamados de métodos de via úmida
Gravimetria Volumetria Eletroanalítico
Propriedades Propriedades elétricaselétricas
Espectrométrico
Propriedades Propriedades ópticasópticas
Cromatográfico
Propriedades Propriedades mistas*mistas*
**SeparaçãoSeparação: interações físico-químicas.: interações físico-químicas. Identificação/quantificaçãIdentificação/quantificaçãoo: propriedades ópticas ou : propriedades ópticas ou elétricas.elétricas.
HistóricoHistóricoCromatografiaCromatografia
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos e solventes variados.éter depetróleo
CaCO3
mistura depigmentos
pigmentosseparados
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
Definição - Princípio BásicoDefinição - Princípio Básico
Cromatografia é um método físico-químico de Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. quantificação de seus componentes.
• A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária.
• A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.
• A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias.
• A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas.
CromatografiaCromatografia
Classificação das técnicas cromatográficasClassificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com o sistema cromatográficoDe acordo com o sistema cromatográfico
• Em ColunaEm Coluna• Cromatografia Líquida• Cromatografia Gasosa• Cromatografia Supercrítica
• PlanarPlanar• Centrífuga (Chromatotron®)• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)• Cromatografia em Papel (CP)
CromatografiaCromatografia
Classificação das técnicas cromatográficasClassificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com a fase móvelDe acordo com a fase móvel
• Utilização de GásUtilização de Gás• Cromatografia Gasosa (CG)• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
• Utilização de LíquidoUtilização de Líquido• Cromatografia Líquida Clássica (CLC)• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
• Utilização de Gás PressurizadoUtilização de Gás Pressurizado• Cromatografia Supercrítica (CSC)
CromatografiaCromatografia
Classificação das técnicas cromatográficasClassificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com a Fase EstacionáriaDe acordo com a Fase Estacionária
• Líquida• Sólida• Quimicamente Ligadas
• De acordo com o modo de separaçãoDe acordo com o modo de separação
• Por Adsorção• Por Partição• Por Troca Iônica• Por Afinidade
CromatografiaCromatografia
Classificação das técnicas cromatográficasClassificação das técnicas cromatográficasCromatografiaCromatografia
TécnicaTécnica PlanarPlanar ColunaColuna
FMFM
FEFE
LíquidoLíquido
LíqLíq SólSól
GásGás LíquidoLíquido
LíqLíq SólSól
CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CECP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
ExclusãoExclusãoFaseFaseLigadaLigada
TrocaTrocaIônicaIônica
SólSólLíqLíq AfinidadeAfinidade
Tipo de Tipo de cromato-cromato-
grafiagrafia
AnalogiaAnalogiaO processo cromatográfico pode ser comparado a um O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa
região.região.Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre
as moscas e abelhas.as moscas e abelhas.
CromatografiaCromatografia
Fase estacionária Analitos
AnalogiaAnalogia
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar estacionária pode ser suficiente para alterar
completamente a ordem de eluição de componentes da completamente a ordem de eluição de componentes da mistura.mistura.
CromatografiaCromatografia
Fase estacionária Analitos
CromatografiaCromatografiaPrincípio BásicoPrincípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seuscomponentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
Cromatografia em papel - CPCromatografia em papel - CPA mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!Fase estacionária líquida suportada na
celulose.
Fase móvel Separação
CromatografiaCromatografia
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de
cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.azul e amarela.
Cromatografia em papel - CPCromatografia em papel - CPA mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
CromatografiaCromatografia
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos
polares hidrossolúveis.
Cromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCDTeve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.iônica.
CromatografiaCromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCDTermos e parâmetros técnicosTermos e parâmetros técnicos
CromatografiaCromatografia
solvente
manchaf ΔS
ΔSR
saR
af
sbR
bf
scR
cf
c
b
a
s
CromatografiaCromatografiaCromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCD
FASES ESTACIONÁRIASFASES ESTACIONÁRIAS
Sílica (SiOSílica (SiO22))
Alumina (AlAlumina (Al22OO33))
CeluloseCelulose
PoliamidaPoliamida
Ativação de 30 a 60 minAtivação de 30 a 60 minde 105 a 110 de 105 a 110 ooCC
Ativação de 10 minAtivação de 10 mina 105 a 105 ooCC
CromatografiaCromatografiaCromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCD
ANÁLISE QUALITATIVAANÁLISE QUALITATIVA
- Comparação com valores de RComparação com valores de Rff tabelados tabelados
- Comparação com padrão eluído em conjuntoComparação com padrão eluído em conjunto
- Extração e aplicação de métodos instrumentaisExtração e aplicação de métodos instrumentais
CromatografiaCromatografiaCromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCD
AA BB Após Eluição
Amostra não contém a espécie BAmostra não contém a espécie B
Amostra pode conter a espécie AAmostra pode conter a espécie A
Para se certificar da presença, Para se certificar da presença, eluir em outros solventeseluir em outros solventes
Conclusões:Conclusões:
Amostra
CromatografiaCromatografiaCromatografia de Camada Delgada - CCDCromatografia de Camada Delgada - CCD
Solvente 1 Solvente 2
CromatografiCromatografia Bi-a Bi-
dimensionaldimensional
Cromatografia planarCromatografia planarCromatografiaCromatografia
Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode substituir pequenas
colunas e HPLC.
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
PROCESSOS DE SEPARAÇÃOPROCESSOS DE SEPARAÇÃO
ExclusãoExclusão
AdsorçãoAdsorção
PartiçãoPartição
Troca IônicaTroca Iônica
AfinidadeAfinidade
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
ADSORÇÃOADSORÇÃO
- Fase Móvel Líq. ou Gás- Fase Móvel Líq. ou Gás
- Fase Estacionária Sólida- Fase Estacionária Sólida
Processos de Processos de Adsorção/DessorçãoAdsorção/Dessorção
Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
Diferença entre AbAbsorçãosorção e AdAdsorçãosorção
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
ADSORÇÃOADSORÇÃO
Fase Estacionária Sólida:Fase Estacionária Sólida:PolarPolar
Aumento da Atividade
-CO-CO22H > -OH > -NHH > -OH > -NH22 > >
-SH > -CHO > -C=O >-SH > -CHO > -C=O >
-CO-CO22R > -OCHR > -OCH33 > -CH=CH- > -CH=CH-
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < Ácido Acético
SOLVENTES: Polaridade em Ordem CrescenteSOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente
A função das fases móveis na cromatografia por A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo:adsorção tem sentido amplo:a) Função solvente
• Solubilizar os componentes • Ter baixo ponto de ebulição
b) Função eluente• Conduzir os componentes da mistura pela coluna• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
Usos:Usos:a) Laboratórios de química orgânica separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese.b) Laboratórios de produtos naturais escala preparativa e analítica.c) Laboratórios de análises clínicas separação de esteróides de urina ou de sangue, etc.
ADSORÇÃOADSORÇÃO
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
PARTIÇÃOPARTIÇÃOFase Móvel GasosaFase Móvel Gasosa
Fase Estacionária LíquidaFase Estacionária Líquida
Processos de Processos de SolubilidadeSolubilidade
O processo de partição é intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel depende da sua volatilidadevolatilidade.
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
PARTIÇÃOPARTIÇÃOFase Móvel LíquidaFase Móvel Líquida
Fase Estacionária LíquidaFase Estacionária Líquida
Processos de Processos de SolubilidadeSolubilidade
O processo de partição é intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel depende da sua solubilidadesolubilidade.
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
TROCA IÔNICATROCA IÔNICA
Fase Móvel LíquidaFase Móvel Líquida
Fase Estacionária SólidaFase Estacionária Sólida
Processos de Troca Processos de Troca IônicaIônica
Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo
trocador da matriz
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio
químico de extraordinário valor em processos analíticos.
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
Maior InteraçãoMaior Interação
• Íons de alta carga
• Íons de menor tamanho
TROCA IÔNICATROCA IÔNICAResinas Catiônicas Resinas Catiônicas
e Aniônicase AniônicasFE altamente carregada
Flux
o da
FM
A diferença de afinidade A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser entre os íons da FM pode ser
controlada por pH e força controlada por pH e força iônicaiônica
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
EXCLUSÃOEXCLUSÃOFase Móvel LíquidaFase Móvel Líquida
Fase Estacionária em GelFase Estacionária em Gel
Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo
eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
EXCLUSÃOEXCLUSÃOA propriedade que distingue a cromatografia de A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.que neles são insolúveis.- Separação de tamanhos específicos
- Separação de polímeros e proteínas- Determinação de Massa Molar
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
EXCLUSÃOEXCLUSÃOCaracterísticas
desejáveis para os Géis-Inércia Química:Inércia Química:
Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto.-Estabilidade:Estabilidade:O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH.-Baixo teor de íons:Baixo teor de íons:Grupos carregados interferem no processo de separação.
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
EXCLUSÃOEXCLUSÃO
Tipos de Géis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
Ágar e Agarose
Flux
o da
FM
CromatografiaCromatografiaCromatografia em ColunaCromatografia em Coluna
Fase Móvel LíquidaFase Móvel Líquida
Fase Estacionária SólidaFase Estacionária Sólida
Propriedades
Biológicas e
Funcionais
AFINIDADEAFINIDADE
CromatografiaCromatografiaTeoria BásicaTeoria Básica
SOLUTOSOLUTO
FASE FASE ESTACIONÁRIAESTACIONÁRIA
FASE FASE MÓVELMÓVEL ⇌
⇌⇌Sem Sem
importância importância na CG, mas na CG, mas com grande com grande importância importância
na CLAEna CLAE
Teoria BásicaTeoria BásicaCromatografiaCromatografia
Coluna cromatográficaColuna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase
estacionária e na fase móvel:
FM
FEC A
AK
KC = Constante de Distribuição[A]FE = concentração do analito na FE[A]FM = concentração do analito na FM
Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM.
MENOR MENOR RETENÇÃO !!!RETENÇÃO !!!
Volatilidade
[A]FM
Afinidade pela FE
[A]FE
Quantificação da eficiênciaQuantificação da eficiênciaCromatografiaCromatografia
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:
Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO
TEÓRICOO número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:
Coluna mais eficiente
tR
wbN
Quantificação da eficiênciaQuantificação da eficiênciaCromatografiaCromatografia
ALTURA EQUIVALENTE A UM ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICOPRATO TEÓRICO (H) (H)
“Tamanho” de cada estágio de equilíbrio
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior
tipicamente elas são mais eficientes
(L = comprimento da coluna)
Valores típicos de H e N:dC df H N
0,10 0,25 0,081 3703700,25 0,25 0,156 1923080,32 0,32 0,200 1500000,32 0,50 0,228 1315790,32 1,00 0,294 1020410,32 5,00 0,435 689660,53 1,00 0,426 704230,53 5,00 0,683 439242,16 10% 0,549 36432,16 5% 0,500 4000
Capilares, L = 30 m
Empacotadas, L = 2 m
ddcc = diâmetro da coluna em mm = diâmetro da coluna em mmddff = espessura da fase estacionária em = espessura da fase estacionária em mm
Cromatografia em fase gasosaCromatografia em fase gasosa
Fase estacionária
Fase móvel Separação
CromatografiaCromatografia
Detecção
Cromatografia em fase gasosaCromatografia em fase gasosaCromatografiaCromatografia
Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à
temperaturas controladas
Fase móvel: gás
inerte
Detector: submetido à temperatura controlada
Injetor: submetido à temperatura controlada
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaAplicabilidadeAplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejamVOLÁTEISVOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos
parcialmente, nesse gás.
DE FORMA GERAL:CG é aplicável para separação e análise de misturas CG é aplicável para separação e análise de misturas
cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300300ooC e que sejam termicamente estáveis.C e que sejam termicamente estáveis.
Requisitos - Gás de arraste (FM)Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidrolisa algumas
FEincompatíveis com DCE
H2O, O2
hidrocarbonetos
ruído no sinal de DIC
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)Requisitos - Gás de arraste (FM)
CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito
caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:
He , H2DCTDIC N2 , H2
DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4
CUST
O
PUREZA
AB
CA = 99,995 % (4.5)B = 99,999 % (5.0)C = 99,9999 % (6.0)
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
InjetorInjetor
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
Injeção instantânea:
Injeção lenta:
t = 0
t = x
t = 0
t = x
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
Injetor “on column”Injetor “on column”1
2
3
4
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de gás de arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna cromatográfica
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
Injetor “on column”Injetor “on column”
1 2 3 1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna.2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna.3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
Parâmetros de injeçãoParâmetros de injeçãoCromatografia GasosaCromatografia Gasosa
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.Regra GeralRegra Geral: Tinj = 50oC acimaacima da temperatura de ebulição do componente menos volátil.VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra.
COLUNA AmostrasGasosas
AmostrasLíquidas
empacotada = 3,2 mm
(1/4”)0,1 mL ... 50 mL0,2 L ... 20
L
capilar = 0,25 mm 1 L ... 100 L0,01 L ... 3
L
SólidosSólidos: convencionalmente se dissolve em
um solvente adequado e injeta-se a
solução
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)Microsseringa
de 10 L:
Microsseringa de 1 L (seção ampliada):
corpo
guiaêmbolo (fio de aço soldado ao
guia)
agulha
Microsseringas para injeçãoMicrosseringas para injeção
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaColunasColunas
EMPACOTADA = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 mRecheada com sólido
pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as
partículas do recheio)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida ou sólida
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaTemperatura da colunaTemperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).
p0 = fEstrutura química do
analitoTemperatura da coluna
Temperaturada
colunaPressão
devapor
Velocidadede
migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃOMENOR RETENÇÃO)
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaTemperatura da colunaTemperatura da coluna
AUM
ENTO
DA
TEMPERATU
RA DA
COLU
NA
CONTROLE CONFIÁVEL CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CGSEPARAÇÃO EM CG
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaProgramação linear de temperaturaProgramação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:
- Componentes mais voláteis são separados- Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis não são separados- Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaProgramação linear de temperaturaProgramação linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separaçãoseparação::
Consegue-se boa Consegue-se boa separação dos separação dos
componentes da componentes da amostra em menor amostra em menor
tempotempo
TEMPO
TEM
PERA
TUR
A
tINI tFIM
TINI
TFIM
R
TINI - Temperatura InicialTFIM - Temperatura FinaltINI - Tempo Isotérmico InicialtFIM - Tempo Final do ProgramaR - Velocidade de Aquecimento
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
Programação linear de Programação linear de temperaturatemperatura
a) Isotérmico a 45 ºC;b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180
ºC
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaProgramação linear de temperaturaProgramação linear de temperatura
VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.
viscosidade
vazão
DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE: Devido ao aumento de volatilização de FE líquida
Possíveis problemas associados à Possíveis problemas associados à PLT:PLT:
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaFase EstacionáriaFase Estacionária
REGRA GERALREGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível : a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar,
aromático ...)aromático ...)FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.
FE Seletiva:separação adequada dos constituintes da amostra
FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaFase estacionária sólidaFase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃOADSORÇÃO
A adsorção ocorre na A adsorção ocorre na interface entre o gás de interface entre o gás de
arraste e a FE sólidaarraste e a FE sólida
• Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)
• Solutos polares
• Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
ADSORÇÃO
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaFase estacionária líquidaFase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃOABSORÇÃO
A absorção ocorre no A absorção ocorre no interior do filme de FE interior do filme de FE
líquida (fenômeno líquida (fenômeno INTRAfacial)INTRAfacial)
• Filmes espessos de FE líquida
• Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste
• Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)
ABSORÇÃO
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaFase estacionária quiraisFase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES FE convencionais FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros não interagem diferencialmente com os isômeros óticosóticos.
FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.
PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaDetectoresDetectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás
de arraste.de arraste.Características ideaisCaracterísticas ideais:1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC.5.Tempo de resposta curto e independente da vazão.6.Alta confiabilidade e facilidade de uso.7.Similaridade de resposta para todos os solutos.8.Não destrutivo.
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaDetectoresDetectores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece como um PICO no
cromatograma.
REGISTRODE
SINAL
ANALÓGICORegistradores
XY DIGITALIntegradore
sComputador
es
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaDetectoresDetectores
UNIVERSAIS:Geram sinal para
qualquersubstância eluída.
SELETIVOS:Detectam
apenas substâncias
com determinada propriedade
físico-química.
ESPECÍFICOS:Detectam
substâncias quepossuam
determinado elementoou grupo
funcional em suas
estruturas
DCT DCE
DNP
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaDetectores - FuncionamentoDetectores - Funcionamento
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste.DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.
DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P.
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaDetectores – Limites de detecçãoDetectores – Limites de detecção
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): SeletivoSeletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade até ng. (104)
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): UniversalUniversal. Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de g (104).DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universalQuase-universal. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4 (X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108).
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): EspecíficoEspecífico. Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaDetectores – Espectrometria de massasDetectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / EspecíficoUniversal / Seletivo / Específico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z.
DetecçãoDetecção
TICUniversalUniversal
Similar a DCTSimilar a DCTSIM
SeletivoSeletivoMaior Maior
SensibilidadeSensibilidade
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / EspecíficoUniversal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CON
TAG
ENS
MASSA / CARGA
CON
TAG
ENS
Cromatograma de íons totais: TIM ou TICTIM ou TICEm cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa.
Detectores – Espectrometria de massasDetectores – Espectrometria de massas
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / EspecíficoUniversal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CON
TAG
ENS
Cromatograma de íons selecionados: SIMSIMEm cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada.
MASSA / CARGA
CON
TAG
ENS
Oferece a Oferece a vantagem de vantagem de
registrar somente registrar somente o sinal do o sinal do
constituinte de constituinte de interesse, sendo interesse, sendo “cego” para os “cego” para os
demaisdemais.
Detectores – Espectrometria de massasDetectores – Espectrometria de massas
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EMInterface CG-EM.
CG
EM
Vácuo
Separador MolecularO gás de arraste leve
(He) difunde mais rapidamente que o
analito e tende a ser drenado para o vácuo.
Câmarade
IonizaçãoColuna
Capilar
Interface Capilar Direta
Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser
drenada pelo sistema de vácuo.
Detectores – Espectrometria de massasDetectores – Espectrometria de massas
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaAnálise qualitativaAnálise qualitativa
tR
tM
tR’ = tR - tM
TEMPO
SIN
AL
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico
cromatográfico)tM = Tempo de Retenção do
Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE
atravesse a coluna)tR’ = Tempo de Retenção
Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaAnálise qualitativaAnálise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mDetector FID: 250 ºCInjetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 L Como se explica esta
ordem de eluição?Mistura de benzeno, n-Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-propanona, n-propanol, n-
butanol, isobutanol e n-butanol, isobutanol e n-pentanol.pentanol. 1. A n-propanona elui primeiro
devido à sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor ).
3. Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaAnálise quantitativaAnálise quantitativa
TEMPO
SIN
AL
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:
• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica.• Área da banda cromatográfica.
AlturaAlturaÁreaÁrea
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaAnálise quantitativaAnálise quantitativa
tempotempo
ConcentraçãoConcentração
Área
Áreaamostraamostra
Cromatografia GasosaCromatografia GasosaAnálise quantitativaAnálise quantitativa
MASSA
ÁREA
A partir de certo ponto o
sinal não aumenta mais linearmente
O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear:
MASSA
ÁREA
/ M
ASSA
0,95 S
1,05 S
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa
tempotempo
amostraamostra
Concentração AdicionadaConcentração AdicionadaÁr
eaÁr
ea
concentraçãoconcentraçãona amostrana amostra
Análise quantitativaAnálise quantitativa
Cromatografia em fase líquidaCromatografia em fase líquidaCromatografia LíquidaCromatografia Líquida
Cromatografia Líquida - CLAECromatografia Líquida - CLAEAplicabilidadeAplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por
CLAE ?
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.molar de 32 até 4000000.
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.
DE FORMA GERAL:CL é aplicável para separação e análise de misturas CL é aplicável para separação e análise de misturas
cujos constituintes sejam solúveis na FM. cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmicavolatilidade ou de estabilidade térmica..
Cromatografia LíquidaCromatografia Líquida
Tipos e Tipos e Aplicações da Aplicações da Cromatografia Cromatografia
LíquidaLíquida
Insolúvel em água Solúvel em águaAumento de polaridadeAumento de polaridade
Polar não iônicoApolar Iônico
Mas
sa
mol
ecul
ar
102
103
104
105
106
Troca iônic
a
Partição
PartiçãPartição em o em fase fase
reversareversa
PartiçãPartição em o em fase fase
normalnormal
ExclusãoPermeaçPermeaç
ão em ão em gelgel
FiltraçãFiltração em o em gelgel
Adsorção
Componentes típicos - CLAEComponentes típicos - CLAECromatografia LíquidaCromatografia Líquida
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaEsquema de um equipamento para CLAEEsquema de um equipamento para CLAE
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaRequisitos dos sistemas de Requisitos dos sistemas de
bombeamentobombeamento1 – Geração de pressões até 6.000 psi2 – Saída com ausência de pulsos3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor5 – Componentes resistentes à corrosão
Bomba recíprocaBomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de
diafragma)
Cromatografia LíquidaCromatografia Líquida
Suportam pressões de até 7.000 psiVolumes típicos: 5 a 500 LMicroamostragem: 0,5 a 5 L
Sistemas de injeção de amostrasSistemas de injeção de amostras
• Eluição isocrática:Eluição isocrática:• Quando a separação é feita utilizando um único
solvente de composição constante.
• Eluição com gradienteEluição com gradiente:• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que
diferem bastante entre si em polaridade.• Depois que a eluição começa, a razão entre os
solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos.
Cromatografia LíquidaCromatografia Líquida
A eluição com gradiente produz efeitos similares A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura aos produzidos pela programação de temperatura
na CG.na CG.
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação.polaridade requerida na separação.
Fase móvel para Fase móvel para CLAECLAE
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaEluição com Eluição com gradientegradiente
Coluna C18, 5 m, fase reversaDetector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaColunas para CLAEColunas para CLAEAs colunas geralmente são
construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam
encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são
restritos a pressões mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na
fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaColunas para CLAEColunas para CLAE
Pré-coluna •Remoção de material particulado•Contaminantes do solvente•Contaminantes da amostra•Saturar a FM com a FE
Aumenta a vida útil da colunaAumenta a vida útil da colunaCOLUNAS TÍPICASCOLUNAS TÍPICAS
•MaterialMaterial: aço inox•ComprimentoComprimento: 10 a 30 cm•DiâmetroDiâmetro: 4 a 10 mm•FEFE: Partículas de 5 a 10 m•EficiênciaEficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaSeparação isocrática de alta velocidadeSeparação isocrática de alta velocidade
1– p-xileno1– p-xileno2- anisol2- anisol3- acetato de 3- acetato de benzilabenzila4- dioctil-ftalato4- dioctil-ftalato5- dipentil-ftalato5- dipentil-ftalato6- dibutil-ftalato6- dibutil-ftalato7- dipropil-ftalato7- dipropil-ftalato8- dietil-ftalato8- dietil-ftalato
- 4 cm de comprimento- 0,4 cm d.i.- FE: spherisorb 3 m
Coluna de alta
velocidade e alta
eficiênciaFM: 4,1% EtAc em n-Hexano
100.000 pratos/metro
• Pelicular:Pelicular:• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de:
• Sílica• Alumina• Resina de poliestireno-divinil-benzeno• Resina trocadora de íons
• Partícula porosaPartícula porosa:• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m. As partículas são constituídas dos As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicularmesmos materiais do recobrimento pelicular.
Cromatografia LíquidaCromatografia Líquida
Basicamente são dois tipos de FE:Basicamente são dois tipos de FE:Fase estacionária para CLAEFase estacionária para CLAE
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaDetectoresDetectores
As características desejáveis para os As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG.daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores: Existem dois tipos de detectores: • Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica).• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).
Características ideaisCaracterísticas ideais:1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.6.Similaridade de resposta para todos os solutos.7.Não destrutivo.8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaDetectoresDetectores
• AbsorbânciaAbsorbância• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV• FluorescênciaFluorescência – – S: 10S: 10-9-9 a 10 a 10-12-12 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 1033
• Índice de refraçãoÍndice de refração (universal) (universal) ––S: 10S: 10-7-7 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 1044
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaDetectoresDetectores
• EletroquímicosEletroquímicos: : existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
• Amperométricos• Coulométricos• Condutométricos – S: 10Condutométricos – S: 10-8-8 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 1044
• Polarográficos – S: 10Polarográficos – S: 10-12-12 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 1066
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaDetectoresDetectores
• Espectrometria de massaEspectrometria de massa - universal - universal• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
Interface CL-EM
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaDetectoresDetectores
• Espectrometria de massaEspectrometria de massa
TEMPO
CON
TAG
ENS MASSA / CARGA
CON
TAG
ENS
TEMPO
CON
TAG
ENS
MASSA / CARGA
CON
TAG
ENS
TICTIC SIMSIM
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaTipos de CLAETipos de CLAE
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o como um gás ideal e não contribui para o
processo de separação, a FM líquida da CLAE processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os interage tanto quanto a FE com os
componentes da amostra.componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos métodos Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.em CLAE um tanto mais complexo que na CG.
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaTipos de CLAETipos de CLAE
• PARTIÇÃOPARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento Adsorção e Adsorção e ligação químicaligação química. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversaFase normal e Fase reversa.Fase normalFase normal: : FE de natureza fortemente polar (ex. água)
FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel.
Fase reversaFase reversa: : FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaTipos de CLAETipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia Crecobrimentos é uma cadeia C88 (n-octil) ou C (n-octil) ou C1818 (n- (n-octadecil)octadecil)
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaTipos de CLAETipos de CLAE
Campo Misturas típicasFarmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicosBioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos,
lipídiosProdutos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivosProdutos químicos Aromáticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriaisPoluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB
(bifenilas policloradas)Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no
sangue, narcóticosClínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas,
extratos de urina, estrógenos
Cromatografia LíquidaCromatografia LíquidaTipos de CLAETipos de CLAE
• ADSORÇÃOADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou aluminaFE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC.• TROCA IÔNICATROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com FE resina com capacidade de troca iônicacapacidade de troca iônica. • EXCLUSÃOEXCLUSÃO: líquido-gel. FE gelFE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas EXCLUSÃO DE TAMANHOEXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONSEXCLUSÃO DE ÍONS.
Para refletir e responder:Para refletir e responder:Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas?
CromatografiaCromatografia
Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam com o aumento da concentração. A área sob a banda cromatográfica de duas substâncias diferentes dependerá da resposta do detector para aquele tipo de substância, independentemente do tipo de detector utilizado.
Para refletir e responder:Para refletir e responder:A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito?
A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre?
CromatografiaCromatografia
F I MF I M
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