Cromatografia - UnB

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Apostila sobre Cromatografía em Coluna (CC) e Camada Delgada (CCD). Universidade de Brasília

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    UNIVERSIDADE DE BRASLIA INSTITUTO DE QUMICA LABORATRIO DE QUMICA ORGNICA

    EXPERIMENTO 5. INTRODUO A MTODOS CROMATOGRFICOS CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA E EM COLUNA

    OBJETIVOS

    Estudar o comportamento de substncias orgnicas em termos da partio cromatogrfica - estrutura qumica versus fenmeno adsoro cromatogrfica.

    Demonstrar experimentalmente princpios fundamentais da cromatografia. Empregar a tcnica de cromatografia em camada delgada na anlise uma amostra e

    utilizar o Rf na identificao de compostos orgnicos usualmente presentes em diversas formulaes farmacuticas.

    Empregar a tcnica de cromatografia em coluna na purificao de compostos orgnicos. LEITURA RECOMENDADA

    Mtodos de separao, cromatografia, fator de reteno, em livros de Qumica Analtica ou Qumica Orgnica. INTRODUO

    Os termos cromatografia, cromatograma e mtodo cromatogrfico so atribudos ao

    botnico russo Mikhael S. Tswett, que em 1906 utilizou estes termos em dois trabalhos descrevendo suas experincias na separao dos componentes de extratos de folhas e gema de ovo. Tswett usou colunas de vidro recheadas com vrios slidos finamente divididos e arrastou os componentes dos extratos com ter de petrleo. O nome deriva-se das palavras gregas chrom (cor) e graphe (escrever), embora o processo no dependa da cor, exceto para

    facilitar a identificao dos componentes separados. Existem vrias tcnicas cromatogrficas que vo das mais simples como cromatografia

    de coluna e camada fina at as mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE).1 De modo geral, entre os mtodos modernos de anlises, as tcnicas cromatogrficas, ocupam um lugar de destaque na qumica e bioqumica, na pesquisa e na indstria, devido a sua facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao das espcies qumicas presentes em uma amostra, mesmo em misturas muito complexas. O ponto comum entre as vrias tcnicas cromatogrficas existentes e que caracteriza o mtodo o fato de os componentes da mistura, ou amostra serem distribudos entre duas fases. A cromatografia , portanto, um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes entre duas fases, que esto em contato ntimo. Uma das fases permanece estacionria enquanto a outra se move atravs dela. Durante a passagem da fase mvel pela fase estacionria, os componentes da mistura so distribudos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes

    1 Degani, A. L. G.; Cass, Q. B.; Vieira, P. C.; Cromatografia um breve ensaio. Qumica Nova na Escola,

    1998, No. 7.

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    seletivamente retido pela fase estacionria, resultando em migraes diferenciais destes componentes.

    Uma delas permanece fixa e por isso chamada de fase estacionria enquanto outra percola atravs da fase estacionria sendo ento chamada de fase mvel. Esta situao dinmica resulta numa migrao diferencial, ou seja, os componentes da amostra tm diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionria. A cromatografia de adsoro baseia-se no grau de partio relativa dos compostos, entre uma dada fase lquida mvel (eluente) e uma determinada fase slida estacionria, geralmente slicagel (SiO

    2.xH

    2O) ou alumina (Al

    2O

    3). Outros materiais que so usados incluem

    Florisil (silicato de magnsio, carvo ativo, magnsia, carbonato de clcio, amidas e acar). O grau de adsoro depende da quantidade de gua presente na fase slida (esta ser mais reativa quanto menos gua estiver presente), da estrutura do composto (presena de grupos funcionais polares, capacidade de formar ligaes hidrognio, etc.), da adsoro do solvente ao ocupar os stios ativos da fase slida e da fora atrativa entre o soluto e o solvente (Figura 1). Os componentes da amostra so, posteriormente, detectados individualmente por meios qumicos ou fsicos.

    N

    Al2O3

    HH

    R

    O Al

    O

    O H O

    R

    C

    R

    RO

    O Al

    C

    O

    ORHOAl

    Figura 1. Algumas formas de visualizar as interaes entre alumina e componentes orgnicos

    de uma amostra. Estruturas similares poderiam ser escritas para a slicagel.

    Cromatografia em Camada Delgada A cromatografia em camada delgada (ccd), um caso particular da cromatografia de adsoro, tem vrias aplicaes importantes em qumica orgnica, tais como: estabelecer se dois compostos so idnticos, verificar a pureza de um composto (complexidade e muitas vezes a natureza), determinar o nmero de componentes em uma mistura, determinar o solvente apropriado para separao em uma coluna cromatogrfica, monitorar a separao de uma mistura em uma coluna cromatogrfica ou acompanhar o progresso de uma reao. um mtodo extremamente conveniente, pois uma tcnica rpida, reproduzvel e necessita

    apenas uma quantidade muito pequena de amostra (1-100g). Existem comercialmente folhas pr-recobertas por alumina ou slicagel para

    cromatografia em camada delgada, muitas incorporando material fluorescente. Quando no se tem folhas ou lminas cromatogrficas comerciais, pode-se preparar com facilidade as placas de vidro. A fase slida espalhada em camada fina sobre uma placa de vidro ou folha de alumnio. Para fixar o adsorvente superfcie da lmina usa-se sulfato de clcio (gesso) ou um polmero orgnico. Uma pequena quantidade de uma amostra orgnica colocada em um ponto numa das extremidades da placa, sendo adsorvida pela fase slida. A placa cromatogrfica colocada em uma cmara fechada contendo um eluente que percorre a fase fixa em movimento ascendente por ao capilar, carreando consigo a amostra orgnica. Diferentes compostos ascendem a diferentes alturas dependendo de suas estruturas moleculares. Este procedimento especialmente til no caso de compostos que so sensveis ao calor ou no so volteis, ou seja, no caso de compostos que no so apropriados determinao de ponto de ebulio ou cromatografia em fase gasosa. A distncia percorrida por cada composto em uma amostra, dividida pela frente do solvente conhecido como o Rf

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    (fator de reteno). Comparaes do valor de Rf da amostra com o de um padro um mtodo

    qualitativo usado na identificao de um composto.

    Instrues Gerais para Execuo da Tcnica de Cromatografia em Camada Delgada

    Para se fazer a escolha do solvente de desenvolvimento pode-se proceder da seguinte maneira: preparam-se vrios tubos capilares e recolhe-se a amostra dissolvida nos vrios solventes que se deseja testar, as amostras so recolhidas por ao capilar. Faz-se o toque da pelcula cromatogrfica pelo tubo (Figura 2). Quando o crculo do solvente tiver atingido a

    posio final, o solvente apropriado aquele que tiver arrastado a cerca de 0,3 a 0,5 do raio do crculo do solvente.

    Figura 2. Escolha de solvente para a cromatografia em camada delgada

    (a) Bom desenvolvimento. (b) Superdesenvolvimento. (c) Subdesenvolvimento.

    Na Tabela 1 encontramos uma relao dos solvente mais usuais para a cromatografia em ordem crescente de polaridade. Podem ser usadas misturas de dois ou mais solvente como eluente em cromatografia. Talvez, a mistura mais usada seja acetato de etila em ter de petrleo ou hexano, por ser constituda de solventes razoavelmente baratos, volteis e de regular ou baixa toxicidade. Tabela 1: Solventes cromatogrficos em ordem crescente de polaridadea.

    ter de petrleo Ciclohexano Tetracloreto de carbono Benzeno Cloreto de metileno Clorofrmio ter etlico Acetato de etila Piridina Acetona lcool n-proplico Etanol gua cido actico

    a A polaridade, neste contexto, s tem sentido para a cromatografia e no coincide, necessariamente, com a polaridade medida, por exemplo, pela constante dieltrica.

    Uma vez escolhido o eluente adequado, as amostras so aplicadas nas cromatoplacas na forma de solues (1-10%), em solventes bastante volteis por meio de um tubo capilar. O tubo capilar introduzido na soluo da amostra e em seguida toca-se a ponta do capilar na cromatoplaca, cerca de 1cm da base inferior (Figura 3.1), permitindo que a amostra seja

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    adsorvida pela fase estacionria. Alguns cuidados devem ser tomados para evitar que a camada de adsorvente seja alterada ou que o halo de difuso da amostra seja maior que 2 mm. Um mesmo ponto de aplicao poder sofrer vrias aplicaes, se necessrio uma maior concentrao da amostra. Aps cada aplicao deve-se esperar a evaporao do solvente. Mais de uma amostra pode ser aplicada em uma mesma placa mantendo-se uma distncia de 1 cm para evitar contato entre os pontos de cada amostra. Em seguida, a placa introduzida cuidadosamente em uma cuba fechada (cmara) contendo o solvendo indicado, com a extremidade semeada para baixo. O nvel do solvente dever ficar abaixo dos pontos de aplicao das amostras (Figura 3.2). Durante a corrida do solvente o sistema fica fechado para que a atmosfera esteja saturada pelo vapor do solvente. Facilita-se a saturao colocando-se um pedao de papel de filtro na parede interna da cmara. A cromatoplaca dever ser retirada da cuba somente quando a frente do solvente atingir um limite pr-determinado na parte superior da placa (cerca de 1 cm). Aps o desenvolvimento as cromatoplacas so secadas e reveladas. Esta ltima etapa consiste em tornar visveis as substncias incolores presentes na amostra. A visualizao pode ser feita atravs de mtodos fsicos ou qumicos. Muitos compostos podem ser visualizados atravs de luz ultravioleta, por se tornarem fluorescentes quando excitados por essas radiaes (cuidado!) vem-se manchas negras nos pontos onde a

    fluorescncia obstada. Estas manchas (e quaisquer outras detectadas pelos mtodos alternativos mencionados abaixo) devem ser marcadas por um pequeno crculo. Para a maior parte dos compostos orgnicos muito utilizado a exposio da cromatoplaca aos vapores de io