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CULTURA DE TECIDOS: HISTÓRICO, CONCEITOS, APLICAÇÕES, ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO E MEIOS DE CULTURA

Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi

AF060 – BIOTECNOLOGIA VEGETAL

CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS

1.HISTÓRICO

2.CONCEITOS

3.APLICAÇÕES

4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO

5.MEIOS DE CULTURA

1.HISTÓRICO

-Haberlandt (1902) - 1º cultivo de células em soluçãonutritiva.

Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen.Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien., Math. – Naturwiss. K., Abt. (1):111, 69-92. 1902.

“Experiments on the culture of isolated plant cells”. The BotanicalReview, Berlin, 35(1):68-88, 1969. (Tradução para inglês).

-Hannig (1904) - 1º cultivo de embriões imaturos-Knudson (1922) - 1º cultivo de embriões de orquídeas-White (1934) - Cultivo de ápices radiculares de tomate em meio líquido-Kogh et al. (1934) - Descoberta do AIA

Gottlieb Haberlandt

-Miller et al. (1955) - Descoberta da cinetina

-Skoog e Miller (1957) - Experimento clássico com calo de fumo – Balanço auxina/citocinina

-Skoog e Tsui (1948) - Formação de partes aéreas e raízes em calos de fumo

Folke Skoog

-Morel e Martin (1952) - Obtenção de dália livre de vírus.

Carlos Miller

Skoog, F. and Miller, C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental

Biology, 11, 118-131. 1957.

Morel, G. and Martin, C. Guerison de dahlias atteints d’ une maladie a virus. Comptes Rendus de l’ Académie des Sciences, 235:1324-1325, 1952.

-Steward et al. (1958) e Reinert (1959) - Obtenção de embriões somáticos em calos de cenoura-Morel (1960) - Obtenção de orquídeas livre de vírus-Cocking (1960) - Obtenção de protoplastos

-Murashige e Skoog (1962) - Meio de cultura MS-Takebe et al. (1971) - Obtenção de plantas a partir de protoplastos-Murashige et al. (1972) - Microenxertia em Citrus

Toshio Murashige

-Carlson et al. (1973) - Primeira hibridação somática em fumo.-Larkin e Scowcroft (1981) – Variação somaclonal

Biologia molecularTransformação genética de plantas

DESENVOLVIMENTO

Alterações que ocorrem no organismo ao longo do seu ciclo de vida nos níveis morfológico, fisiológico e bioquímico.

Ex: evolução da fase embrionária para planta.Ex: mudança da fase vegetativa para reprodutiva.

CRESCIMENTO

Mudanças quantitativas irreversíveis.Ex: aumento de biomassa.Ex: aumento de comprimento.

DIFERENCIAÇÃO

Mudanças qualitativas. Processo pelo qual as células adquirempropriedades metabólicas, estruturais e funcionais distintas daquelas iniciais.

DIFERENCIAÇÃO OCORRE PELA REGULAÇÃO NA ESPRESSÃO GÊNICA

2.CONCEITOS

MORFOGÊNESE

Origem da forma da planta e sua organização que pode ser estudada nos níveis:

*Estrutural (organização funcional da célula)*Tecidos*Órgãos*Planta inteira

ENVOLVE CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO

A morfogênese é o resultado de um complexo controle hormonal múltiplo, espacial e temporal, por meio da regulação e expressão gênica.

Mudanças quantitativas

Mudanças qualitativas

INTEGRAÇÃO ENTRE OS PROCESSOS DE DIVISÃOE ESPECIALIZAÇÃO CELULAR

TOTIPOTÊNCIA

HABERLANDT (1902)

●“As plantas são agregados de seresindividuais e independentes, denominadosde células”●“Células dão origem aos tecidos”

●“As células são as unidades funcionais detodos os seres viventes”

●“Toda a célula nasce de outra célula”

Rudolf Virchow (1858)

Schleiden (1838) & Schwann (1839)

“Toda célula vegetal íntegra possuicapacidade para reproduzir um organismointeiro”.

“TEORIA CELULAR”

(Ideias ainda incompletas)

DETERMINAÇÃO

Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma célulatorna-se limitado a uma rota específica de morfogênese.

COMPETÊNCIA

Capacidade das células reagiram a sinais específicos dedesenvolvimento.

EPIGÊNESE

Ativação seletiva e diferencial de genes, envolvendo célulasreceptivas ou tecidos responsivos.

MORFOGÊNESE IN VITRO:

*Organogênese DiretaIndireta

*Embriogênese somática DiretaIndireta

Explante

Novos órgãos(organogênese)

Novos embriões(embriões)

Calo

Indireta

Direta

ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE ABACATEIRO

ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS CAULINARES DE MARACUJAZEIRO

ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS RADICULARES DE CAQUIZEIRO

Segmento radicular

Segmentos foliares

ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE CAQUIZEIRO

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM TANGERINEIRA ‘PONKAN’

•Produção de mudas em larga escalaMicropropagação (organogênese e embriogênese)

•Produção de material de propagação sadio (livre de virus)Cultura de meristemas + TermoterapiaMicroenxertiaCrioterapia (técnica nova)

•Resgate de embriões de cruzamentos difíceisCultivo de embriões zigóticos

•Conservação de germoplasmaConservação in vitro

Criopreservação

•Obtenção de duplo haploides Cultura de anteras + duplicação cromossômica

•Obtenção de híbridos somáticosFusão de protoplastos

3.APLICAÇÕES

•Produção de material de propagação sadio (livre de virus)

Cultura de meristemaMicroenxertia

•Produção de mudas em larga escala

CARTES R, P. et al. Encapsulated Somatic Embryos and Zygotic Embryos for Obtaining Artificial Seeds of Rauli-Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst.). Chilean J. Agric. Res., v.69, n.1, p. 112-118, 2009.

Embriogênese e produção de sementes sintéticas

•Resgate de embriões de cruzamentos difíceis

Resgate de embriões de videira

Ohnishi et al. (Plant and Cell Physiology 52(7):1249-57. 2011).

Resgate de embriões de arroz

Buttibwa et al. African Journal of Biotechnology. 14(27):2191-2201. 2015

Resgate de embriões de mandioca

•Conservação de germoplasma

Embrapa Clima Temperado

Rayssa Natasha Barros Mafra & Victor Spieshttp://www.ebah.com.br/content/ABAAAfW-EAF/criopreservacao

Conservação in vitro

Fayos et al. Frontiers in Plant Science. 6:384. 2015.

Produção de duplo-haplóide de alho

•Obtenção de duplo haploides

Fig. 1 Plant regeneration from protoplast fusion experiment of a grass cultivar with a wild species. http://en.phytowelt.com/phytodiversity.html

• Obtenção de híbridos somáticos

Cultura e fusão de protoplastos

Fig. 2 Tubers of different somatic hybrids in comparison to the fusion partners (cultivar: upper lines, wild species: lower lines, hybrids: in-between).

ESTRUTURA BÁSICA DE UM LABORATÓRIO DE CULTURA DE TECIDOS

1.Sala de preparo de meio de cultura2.Sala para manipulações assépticas3.Sala de crescimento climatizada4.Sala de lavagem de vidraria5.Escritório6.Banheiro

AMBIENTES ADICIONAIS

1.Antecâmara2.Almoxarifado3.Sala de microscopia4.Sala de biologia molecular

ESTRUTURAS EXTERNAS

1.Ambiente para transferência ex vitro2.Casa-de-vegetação3.Telados4.Depósitos

4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO

EQUIPAMENTOS BÁSICOS

1.Sala de preparo de meio de cultura*Balança*pHmetro*Agitador magnético*Microondas*Destilador ou Deionizador*Refrigerador*Freezer

2.Sala para manipulações assépticas*Câmara de Fluxo Laminar*Microscópio Estereoscópico

3.Sala de crescimento climatizada*Ar condicionado*Timer para controle de fotoperíodo

4.Sala de lavagem de vidraria*Autoclave

1. SALA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA

2. SALA DE MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA

3. SALA DE CRESCIMENTO CLIMATIZADA

*CONTROLE DE LUZ:- Fotoperíodo: 16 horas- Intensidade luminosa: 20 a 50 µmol.m-2.s-1

- Tipos de lâmpadas: -Fluorescentes-LED

*CONTROLE DE TEMPERATURA:- Geralmente 25° C- Ar condicionado

*EQUIPAMENTOS:-BOD-Agitadores

NOVAS ALTERNATIVAS: Uso da luz naturalSistemas autotróficos

-Aumento do CO2-Aumento da Intensidade luminosa-Redução da sacarose

4. SALA DE LAVAGEM DE VIDRARIA

AMBIENTE PARA TRANSFERÊNCIA EX VITRO

CASA-DE-VEGETAÇÃO PARA ACLIMATIZAÇÃO

COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA:

1. SAIS MINERAIS:-Macronutrientes:

-Nitrogênio:-Amônio-Nitrato*Concentração de amônio deve ser no máximo até 1/3 do N total.

-Fósforo: H2PO4-

-Potássio: íon livre-Cálcio: deficiência causa necrose apical-Magnésio:-Enxofre:

-Micronutrientes:-Ferro: absorvido na forma de quelato com EDTA-Manganês:-Zinco:-Boro:-Cobre:-Molibdênio-Cobalto e Iodo: ????

5.MEIOS DE CULTURA

2. SUBSTÂNCIAS ORGÂNICAS:-Vitaminas: tiamina (B1), ácido nicotínico (niacina), piridoxina (B6)-Aminoácidos: glicina-Mio-inositol-Adenina

3. CARBOIDRATOS:-Sacarose (mais utilizado)-Outros carboidratros: sorbitol; dextrose (glicose); maltose; galactose.

4. AGENTES SOLIDIFICANTES-Agar: polissacarídeo de algas marinhas (6 a 7%)-Gomas: polímeros produzidos por bactérias (2 a 3%)

*Gelrite® - Kelco Division of Merck & Co*Phyta-gel® - Sigma Chemical Co

5. ÁGUA-Destilada; deionizada-Sistema ‘Milli-Q’: filtros de carvão ativado, colunas de troca iônica e filtros de

acetato de celulose.

6. REGULADORES VEGETAIS

-Auxinas

*Ácido indolacético (AIA)*Ácido indolbutírico (AIB)*Ácido naftalenoacético (ANA)*2,4-D*Picloran

-Citocininas

*Cinetina*Benziladenina (BAP)*Zeatina*2iP

-Giberelinas

*Ácido giberélico (GA3)

AUXINAS: Divisão celularAlongamento celularDiferenciação celular

REGULADORES VEGETAIS

Auxinas naturais Auxinas artificiais

CITOCININAS: Divisão celularDiferenciação celular

Citocininas naturais

Citocininas artificiais

GIBERELINAS: Alongamento celular Divisão celular

OUTROS REGULADORES:

Brassinosteróides:-Mais de 60 conhecidos-Alongamento de caules; crescimento do tubo polínico; desenrolamento defolhas de gramíneas

Poliaminas:-Encontradas em plantas e animais-Tipos: putrescinas;espermidinas; esperminas-Divisão e alongamento celular; enraizamento; formação de tubérculos

Ácido jasmônico:-Formação de tubérculos; amadurecimento de frutos; formação depigmentos; sinalizador de estresse

Ácido salicílico:-Estimula a floração; floração em plantas termogênicas; mecanismo dedefesa.

959,25

4,63

306

0,010,103

Água Sacarose

Ágar Sais

Substâncias orgânicas Reguladores de crescimento

Composição de 1 litro do meio de cultura MS em gramas.

Proporção entre os componentes do meio de cultura em g / litro.

Componentes MS NN WPM QL

Macronutrientes mg L-1 μM mg L-1 μM mg L-1 μM mg L-1 μM

NH4NO3 1650 20612,12 720 8994,39 400 5000,00 400 5000,00

KNO3 1900 18791,41 950 9396,64 - - 1800 17802,36

K2SO4 - - - - 990 5680,40 - -

KH2PO4 170 1249,17 68 499,67 170 1249,70 270 1983,96

Ca(NO3)2.4H2O - - - - 556 2354,40 1200 5080,80

CaCl2.2H2O 440 2992,59 - - 96 652,93 - -

CaCl2 - - 166 1495,30 - - - -

MgSO4.7H2O 370 1501,01 185 750,51 370 1501,10 360 1460,45

Micronutrientes

Fe2SO4.7H2O 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00

Na2EDTA 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20

H3BO3 6,20 100,26 10,00 161,71 6,20 100,26 6,20 100,26

MnSO4.H2O - - 18,90 111,83 - - - -

MnSO4.4H2O 22,30 99,97 - - 22,30 99,97 1,00 4,48

ZnSO4.7H2O 8,60 29,91 10,00 34,77 8,60 29,91 8,60 29,91

KI 0,83 5,00 - - - - 0,08 0,4 8

Na2MoO4.2H2O 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03

CoCl2.6H2O 0,025 0,10 - - - - 0,025 0,10

CuSO4.5H2O 0,025 0,10 0,025 0,10 0,25 1,00 0,025 0,10

Composição de alguns meios de cultura.

MS – Murashige & Skoog (1962)NN – Nitsch & Nitsch (1969)WPM – Lloyd & McCown (1986)QL – Quoirin & Lepoivre (1977)